Em formação

8: Replicação de DNA - Biologia


Capítulo 8 Resultados de Aprendizagem BSC 3271

  • Descreva a estrutura do DNA, incluindo fitas antiparalelas, estrutura de nucleotídeos (arranjo de três componentes), regra de par de bases, ligação e composição de “backbone” e ligação entre bases em “degraus”.
  • Esboce a estrutura de um nucleotídeo de DNA, marcando o fosfato, a desoxirribose e a base nitrogenada (não precisa de estrutura detalhada); indicar qual grupo funcional está ligado aos carbonos 3 'e 5' da desoxirribose
  • Dado um diagrama de uma molécula de DNA, identifique: fosfato, desoxirribose, purina, pirimidina, ligações de hidrogênio, ligação fosfodiéster, extremidade 5 ', extremidade 3'
  • Descreva a estrutura dos cromossomos e plasmídeos bacterianos e o tipo de informação que eles carregam.
  • Explique o propósito da replicação do DNA em uma célula
  • Explique o processo de replicação do DNA, incluindo as funções das enzimas primase, helicase, DNA polimerase e ligase, a direção da replicação e o significado da replicação semiconservativa.
  • Dado um diagrama de replicação de DNA, determine a sequência da (s) fita (s) recentemente sintetizada (s) e qual fita é a principal e qual é a última.
  • Explique por que ambas as fitas da molécula de DNA não podem ser sintetizadas continuamente e defina fragmentos de Okazaki.
  • 8.1: A Estrutura e Função dos Genomas Celulares
    Todo o conteúdo genético de uma célula é seu genoma. Os genes codificam proteínas, ou moléculas de RNA estáveis, cada uma das quais desempenhando uma função específica na célula. Embora o genótipo que uma célula possui permaneça constante, a expressão dos genes é dependente das condições ambientais. Um fenótipo são as características observáveis ​​de uma célula (ou organismo) em um determinado ponto no tempo e resultam do complemento de genes atualmente em uso.
  • 8.2: Estrutura e Função do DNA
    Os ácidos nucléicos são compostos de nucleotídeos, cada um dos quais contém um açúcar pentose, um grupo fosfato e uma base nitrogenada. Os desoxirribonucleotídeos no DNA contêm desoxirribose como o açúcar pentose. O DNA contém as pirimidinas citosina e timina e as purinas adenina e guanina. Os nucleotídeos são ligados entre si por ligações fosfodiéster entre o grupo fosfato 5 'de um nucleotídeo e o grupo hidroxila 3' de outro.
  • 8.3: Replicação de DNA
    O processo de replicação do DNA é semiconservador, o que resulta em duas moléculas de DNA, cada uma com uma fita parental de DNA e uma fita recém-sintetizada. Nas bactérias, o início da replicação ocorre na origem da replicação, onde o DNA superenrolado é desenrolado pela DNA girase, tornado em fita simples pela helicase e ligado pela proteína de ligação de fita simples para manter seu estado de fita simples.

Miniatura: adaptado de "Arquivo: replicação bidirecional de DNA em Bacteria.png" por Bootan68 licenciado sob CC BY-SA 3.0


8: Replicação de DNA - Biologia

UMA. Replicação de DNA ocorre durante a fase de síntese (S) do ciclo celular em eucariotos

  • Passo 1: Helicases de DNA desenrole a dupla hélice e quebre as ligações de hidrogênio entre os pares de bases complementares para separar as duas fitas da dupla hélice garfos de replicaçãosão produzidos
  • Passo 2: Polimerases de DNA mover ao longo de cada uma das fitas de DNA, adicionando nucleotídeos complementares às bases de nitrogênio expostas, de acordo com as regras de pareamento de base (A: T, G: C)
  • Etapa 3: Polimerases de DNA continue a copiar até que a dupla hélice do DNA original tenha sido replicada em duas cópias idênticas
  • As polimerases de DNA retrocedem para revisar as fitas recém-sintetizadas
  • remover o nucleotídeo incorreto, substituindo-o pela base complementar correta
  • mutações: taxa de erro de 1 por bilhão de nucleotídeos

Garfos de replicação múltipla aumentam a velocidade de replicação em eucariotos

A. Em bactérias (procariontes), há apenas um ponto de iniciação e duas bifurcações de replicação, uma vez que há tão pouco DNA

B. Como as células eucarióticas contêm muito DNA, cada cromossomo é replicado em cerca de 100 seções, cada uma com 100.000 nucleotídeos de comprimento, para humanos e processo de 8 horas


Conteúdo

Na segunda metade do século 19, o trabalho pioneiro de Gregor Mendel sobre a herança de características em plantas de ervilha sugeriu que “fatores” específicos (hoje estabelecidos como genes) são responsáveis ​​pela transferência de características de organismo entre gerações. [4] Embora inicialmente se presumisse que as proteínas serviam como material hereditário, Avery, MacLeod e McCarty estabeleceram um século depois o DNA, que foi descoberto por Friedrich Miescher, como o portador da informação genética. [5] Essas descobertas abriram caminho para pesquisas que descobriram a natureza química do DNA e as regras para a codificação de informações genéticas e, em última análise, levaram à proposta da estrutura em dupla hélice do DNA por Watson e Crick. [6] Este modelo tridimensional de DNA iluminou mecanismos potenciais pelos quais a informação genética poderia ser copiada de uma maneira semiconservadora antes da divisão celular, uma hipótese que foi posteriormente apoiada experimentalmente por Meselson e Stahl usando a incorporação de isótopos para distinguir os pais dos recém-sintetizados DNA. [7] [8] O subsequente isolamento de DNA polimerases, as enzimas que catalisam a síntese de novas fitas de DNA, por Kornberg e colegas foram os pioneiros na identificação de muitos componentes diferentes da maquinaria de replicação biológica do DNA, primeiro no organismo modelo bacteriano E. coli, mas mais tarde também em formas de vida eucarióticas. [2] [9]

Um pré-requisito chave para a replicação do DNA é que ela deve ocorrer com extrema fidelidade e eficiência exatamente uma vez por ciclo celular para evitar o acúmulo de alterações genéticas com consequências potencialmente deletérias para a sobrevivência celular e viabilidade do organismo. [10] Eventos de replicação de DNA incompletos, errôneos ou inoportunos podem dar origem a mutações, poliploidia cromossômica ou aneuploidia e variações no número de cópias do gene, cada uma das quais, por sua vez, pode levar a doenças, incluindo câncer. [11] [12] Para garantir a duplicação completa e precisa de todo o genoma e o fluxo correto de informações genéticas para as células descendentes, todos os eventos de replicação de DNA não são apenas rigidamente regulados com pistas do ciclo celular, mas também são coordenados com outros eventos celulares, como transcrição e reparo de DNA. [2] [13] [14] [15] Além disso, as sequências de origem geralmente têm alto conteúdo de AT em todos os reinos, uma vez que as repetições de adenina e timina são mais fáceis de separar porque suas interações de empilhamento de base não são tão fortes quanto as de guanina e citosina. [16]

A replicação do DNA é dividida em diferentes estágios. Durante a iniciação, as máquinas de replicação - chamadas de replissomos - são montadas no DNA de maneira bidirecional. Esses loci de montagem constituem os locais de início da replicação do DNA ou origens de replicação. Na fase de alongamento, os replissomos viajam em direções opostas com as bifurcações de replicação, desenrolando a hélice de DNA e sintetizando fitas de DNA complementares usando ambas as fitas parentais como modelos. Uma vez que a replicação é concluída, eventos de terminação específicos levam à desmontagem dos replissomos. Desde que todo o genoma seja duplicado antes da divisão celular, pode-se supor que a localização dos locais de início da replicação ainda não importa, pois foi demonstrado que muitos organismos usam regiões genômicas preferidas como origens. [17] [18] A necessidade de regular a localização de origem provavelmente surge da necessidade de coordenar a replicação do DNA com outros processos que atuam no molde de cromatina compartilhado para evitar quebras de fita de DNA e danos ao DNA. [2] [12] [15] [19] [20] [21] [22] [23]

Mais de cinco décadas atrás, Jacob, Brenner e Cuzin propuseram a hipótese do replicon para explicar a regulação da síntese de DNA cromossômico em E. coli. [24] O modelo postula que um difusível, trans-fator atuante, um chamado iniciador, interage com um cis- o elemento DNA, o replicador, para promover o início da replicação em uma origem próxima. Uma vez ligados aos replicadores, os iniciadores (frequentemente com a ajuda de proteínas co-carregadoras) depositam helicases replicativas no DNA, que subsequentemente conduzem o recrutamento de componentes replissomos adicionais e a montagem de todo o mecanismo de replicação. O replicador, portanto, especifica a localização dos eventos de iniciação da replicação e a região do cromossomo que é replicada de uma única origem ou evento de iniciação é definida como o replicon. [2]

Uma característica fundamental da hipótese do replicon é que ela depende da regulação positiva para controlar o início da replicação do DNA, o que pode explicar muitas observações experimentais em sistemas bacterianos e fágicos. [24] Por exemplo, é responsável pela falha de DNAs extracromossômicos sem origens para replicar quando introduzidos nas células hospedeiras. Ele racionaliza ainda mais as incompatibilidades de plasmídeos em E. coli, onde certos plasmídeos desestabilizam a herança uns dos outros devido à competição pela mesma maquinaria de iniciação molecular. [25] Por outro lado, um modelo de regulação negativa (análogo ao modelo replicon-operador para transcrição) falha em explicar os achados acima. [24] No entanto, pesquisas subsequentes à proposta de Jacob, Brenner e Cuzin do modelo de replicon descobriram muitas camadas adicionais de controle de replicação em bactérias e eucariotos que compreendem elementos reguladores positivos e negativos, destacando a complexidade e a importância de restringir a replicação do DNA temporalmente e espacialmente. [2] [26] [27] [28]

O conceito do replicador como uma entidade genética tem se mostrado muito útil na busca para identificar sequências de DNA replicadoras e proteínas iniciadoras em procariotos e, em certa medida, também em eucariotos, embora a organização e a complexidade dos replicadores difiram consideravelmente entre os domínios da vida. [29] [30] Embora os genomas bacterianos normalmente contenham um único replicador que é especificado por elementos de sequência de DNA de consenso e que controla a replicação de todo o cromossomo, a maioria dos replicadores eucarióticos - com exceção da levedura em brotamento - não são definidos no nível de DNA em vez disso, eles parecem ser especificados combinatorialmente por pistas estruturais de DNA e cromatina locais. [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] Os cromossomos eucarióticos também são muito maiores do que suas contrapartes bacterianas, aumentando a necessidade de iniciar a síntese de DNA de muitos origens simultaneamente para garantir a replicação oportuna de todo o genoma. Além disso, muito mais helicases replicativas são carregadas do que ativadas para iniciar a replicação em um determinado ciclo celular. A definição orientada ao contexto de replicadores e seleção de origens sugere um modelo de replicon relaxado em sistemas eucarióticos que permite flexibilidade no programa de replicação de DNA. [29] Embora replicadores e origens possam ser fisicamente espaçados nos cromossomos, eles frequentemente colocalizam ou estão localizados em estreita proximidade para simplificar, portanto, nos referiremos a ambos os elementos como "origens" ao longo desta revisão. Em conjunto, a descoberta e o isolamento das sequências de origem em vários organismos representam um marco significativo no sentido de obter uma compreensão mecanicista da iniciação da replicação. Além disso, essas realizações tiveram profundas implicações biotecnológicas para o desenvolvimento de vetores de transporte que podem ser propagados em bactérias, leveduras e células de mamíferos. [2] [41] [42] [43]

A maioria dos cromossomos bacterianos são circulares e contêm uma única origem de replicação cromossômica (oriC) Bacteriana oriC regiões são surpreendentemente diversas em tamanho (variando de 250 bp a 2 kbp), sequência e organização [45] [46], no entanto, sua capacidade de conduzir o início da replicação depende tipicamente da leitura específica da sequência de elementos de DNA de consenso pelo iniciador bacteriano, uma proteína chamada DnaA. [47] [48] [49] [50] As origens nas bactérias são contínuas ou bipartidas e contêm três elementos funcionais que controlam a atividade da origem: repetições de DNA conservadas que são especificamente reconhecidas por DnaA (chamadas de caixas de DnaA), uma rica em AT Elemento de desenrolamento do DNA (DUE) e locais de ligação para proteínas que ajudam a regular o início da replicação. [17] [51] [52] As interações do DnaA com as regiões de DnaA-box de fita dupla (ds) e com o DNA de fita simples (ss) no DUE são importantes para a ativação da origem e são mediadas por diferentes domínios no proteína iniciadora: um elemento de ligação ao DNA de hélice-volta-hélice (HTH) e uma ATPase associada a vários domínios de atividades celulares (AAA +), respectivamente. [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] Embora a sequência, o número e o arranjo das caixas de DnaA associadas à origem variem em todo o reino bacteriano, seu posicionamento e espaçamento específicos em um dado espécies são críticas para oriC função e para a formação do complexo de iniciação produtiva. [2] [45] [46] [60] [61] [62] [63] [64]

Entre as bactérias, E. coli é um sistema modelo particularmente poderoso para estudar a organização, o reconhecimento e o mecanismo de ativação das origens de replicação. E. coli oriC compreende um aproximadamente

Região de 260 bp contendo quatro tipos de elementos de ligação do iniciador que diferem em suas afinidades para DnaA e suas dependências no cofator ATP. Caixas de DnaA R1, R2 e R4 constituem locais de alta afinidade que são ligados pelo domínio HTH de DnaA, independentemente do estado de ligação de nucleotídeo do iniciador. [47] [65] [66] [67] [68] [69] Em contraste, os locais I, τ e C, que são intercalados entre os locais R, são caixas DnaA de baixa afinidade e se associam preferencialmente com DnaA ligado a ATP, embora ADP-DnaA possa substituir ATP-DnaA sob certas condições. [70] [71] [72] [63] A ligação dos domínios HTH aos elementos de reconhecimento de DnaA de alta e baixa afinidade promove a oligomerização de ordem superior dependente de ATP dos módulos AAA + do DnaA em um filamento destro que envolve o DNA duplex em torno de sua superfície externa, gerando assim uma torção super-helicoidal que facilita a fusão do DUE rico em AT adjacente. [53] [73] [74] [75] A separação da fita de DNA é adicionalmente auxiliada por interações diretas do domínio AAA + ATPase de DnaA com repetições triplas, chamadas de trios DnaA, na região DUE proximal. [76] O envolvimento de segmentos de trinucleotídeo de fita simples pelo filamento iniciador estende o DNA e estabiliza a bolha de iniciação, evitando o reanimamento. [57] O elemento de origem DnaA-trio é conservado em muitas espécies bacterianas, indicando que é um elemento chave para a função de origem. [76] Após a fusão, o DUE fornece um local de entrada para o E. coli helicase replicativa DnaB, que é depositada em cada uma das fitas simples de DNA por sua proteína carregadora DnaC. [2]

Embora as diferentes atividades de ligação ao DNA do DnaA tenham sido extensivamente estudadas bioquimicamente e várias apo, estruturas ligadas a ssDNA ou dsDNA foram determinadas, [56] [57] [58] [74] a arquitetura exata do DnaA- de ordem superiororiC montagem de iniciação permanece obscura. Dois modelos foram propostos para explicar a organização de elementos essenciais de origem e mediados por DnaA oriC Derretendo. O modelo de dois estados assume um filamento de DnaA contínuo que muda de um modo de ligação dsDNA (o complexo organizador) para um modo de ligação ssDNA no DUE (o complexo de fusão). [74] [77] Por outro lado, no modelo de loopback, o DNA é fortemente dobrado em oriC e dobra-se para trás no filamento iniciador de modo que os protômeros de DnaA engatem simultaneamente as regiões de DNA de fita dupla e simples. [78] Elucidando exatamente como oriC O DNA é organizado pelo DnaA permanece, portanto, uma tarefa importante para estudos futuros. Os insights sobre a arquitetura do complexo de iniciação ajudarão a explicar não apenas como o DNA de origem é derretido, mas também como uma helicase replicativa é carregada direcionalmente em cada uma das fitas de DNA expostas no DUE desenrolado e como esses eventos são auxiliados por interações da helicase com o iniciador e as proteínas específicas do carregador. [2]

Origens de replicação de arquea compartilham algumas, mas não todas as características organizacionais de bactérias oriC. Ao contrário das bactérias, Archaea frequentemente inicia a replicação de múltiplas origens por cromossomo (um a quatro foram relatados) [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [46] ainda, arquea as origens também possuem regiões de sequência especializadas que controlam a função de origem. [87] [88] [89] Esses elementos incluem caixas de reconhecimento de origem específicas da sequência de DNA (ORBs ou miniORBs) e um DUE rico em AT que é flanqueado por uma ou várias regiões ORB. [85] [90] Os elementos ORB exibem um grau considerável de diversidade em termos de seu número, arranjo e sequência, tanto entre as diferentes espécies de archaea quanto entre as diferentes origens em uma única espécie. [80] [85] [91] Um grau adicional de complexidade é introduzido pelo iniciador, Orc1 / Cdc6 em archaea, que se liga a regiões ORB. Os genomas arqueados normalmente codificam vários parálogos de Orc1 / Cdc6 que variam substancialmente em suas afinidades por elementos de ORB distintos e que contribuem diferencialmente para as atividades de origem. [85] [92] [93] [94] Em Sulfolobus solfataricus, por exemplo, três origens cromossômicas foram mapeadas (oriC1, oriC2 e oriC3) e estudos bioquímicos revelaram padrões de ligação complexos de iniciadores nesses locais. [85] [86] [95] [96] O iniciador cognato para oriC1 é Orc1-1, que se associa a vários ORBs nesta origem. [85] [93] OriC2 e oriC3 são vinculados por Orc1-1 e Orc1-3. [85] [93] [96] Por outro lado, um terceiro paralógico, Orc1-2, possui pegadas em todas as três origens, mas foi postulado que regula negativamente o início da replicação. [85] [96] Além disso, a proteína WhiP, um iniciador não relacionado a Orc1 / Cdc6, demonstrou se ligar a todas as origens também e impulsionar a atividade de origem de oriC3 na região intimamente relacionada Sulfolobus islandicus. [93] [95] Como as origens de arquea muitas vezes contêm vários elementos ORB adjacentes, vários parálogos Orc1 / Cdc6 podem ser recrutados simultaneamente para uma origem e oligomerizar em alguns casos [94] [97] no entanto, em contraste com o DnaA bacteriano, a formação de um A montagem do iniciador de ordem superior não parece ser um pré-requisito geral para a função de origem no domínio arquea. [2]

Estudos estruturais forneceram insights sobre como o Archaeal Orc1 / Cdc6 reconhece os elementos ORB e remodela o DNA de origem. [97] [98] Parálogos Orc1 / Cdc6 são proteínas de dois domínios e são compostas por um módulo AAA + ATPase fundido a uma dobra em hélice alada C-terminal. [99] [100] [101] Estruturas complexadas com DNA de Orc1 / Cdc6 revelaram que ORBs são ligados por um monômero Orc1 / Cdc6, apesar da presença de sequências repetidas invertidas dentro de elementos de ORB. [97] [98] Ambas as regiões ATPase e hélice alada interagem com o duplex de DNA, mas entram em contato com a sequência de repetição ORB palindrômica assimetricamente, que orienta Orc1 / Cdc6 em uma direção específica na repetição. [97] [98] Curiosamente, os elementos ORB ou miniORB que flanqueiam o DUE geralmente têm polaridades opostas, [80] [85] [94] [102] [103] o que prevê que os subdomínios AAA + de tampa e os domínios de hélice alada de Orc1 / Cdc6 são posicionados em ambos os lados do DUE de uma maneira que fiquem frente a frente. [97] [98] Uma vez que ambas as regiões de Orc1 / Cdc6 se associam com uma helicase replicativa de manutenção de minicromossomo (MCM), [104] [105] este arranjo específico de elementos ORB e Orc1 / Cdc6 é provavelmente importante para carregar dois complexos MCM simetricamente em o DEVIDO. [85] Surpreendentemente, enquanto a sequência de DNA ORB determina a direcionalidade da ligação Orc1 / Cdc6, o iniciador faz relativamente poucos contatos específicos de sequência com DNA. [97] [98] No entanto, Orc1 / Cdc6 prejudica severamente e dobra o DNA, sugerindo que ele se baseia em uma mistura de sequência de DNA e características estruturais de DNA dependentes de contexto para reconhecer as origens. [97] [98] [106] Notavelmente, o pareamento de bases é mantido no duplex de DNA distorcido após a ligação de Orc1 / Cdc6 nas estruturas cristalinas, [97] [98] enquanto estudos bioquímicos produziram descobertas contraditórias sobre se os iniciadores de arquea podem derreter DNA de forma semelhante ao DnaA bacteriano. [93] [94] [107] Embora o parentesco evolutivo de iniciadores arqueaais e eucarióticos e helicases replicativas indiquem que MCM arquea é provavelmente carregado no DNA duplex (consulte a próxima seção), a ordem temporal de fusão de origem e carregamento de helicase, bem como o mecanismo de fusão do DNA de origem, em sistemas de arquea, permanece, portanto, para ser claramente estabelecido. Da mesma forma, como exatamente a helicase MCM é carregada no DNA precisa ser abordada em estudos futuros. [2]

A organização, especificação e ativação da origem em eucariotos são mais complexas do que em domínios bacterianos ou arqueanos e divergem significativamente do paradigma estabelecido para a iniciação da replicação procariótica. Os grandes tamanhos do genoma das células eucarióticas, que variam de 12 Mbp em S. cerevisiae para 3 Gbp em humanos, exige que a replicação do DNA comece em várias centenas (na levedura em flor) até dezenas de milhares (em humanos) de origens para completar a replicação do DNA de todos os cromossomos durante cada ciclo celular. [27] [36] Com exceção de S. cerevisiae e relacionado Saccharomicotina espécies, as origens eucarióticas não contêm elementos de sequência de DNA de consenso, mas sua localização é influenciada por pistas contextuais, como topologia local do DNA, características estruturais do DNA e ambiente de cromatina. [110] [35] [37] No entanto, a função de origem eucariótica ainda depende de um complexo de proteína iniciador conservado para carregar helicases replicativas no DNA durante as fases M e G1 tardias do ciclo celular, uma etapa conhecida como licenciamento de origem. [111] Em contraste com suas contrapartes bacterianas, as helicases replicativas em eucariotos são carregadas no DNA duplex de origem em uma forma duplo-hexamérica inativa e apenas um subconjunto delas (10-20% em células de mamíferos) é ativado durante qualquer fase S , eventos que são referidos como disparo de origem. [112] [113] [114] A localização das origens eucarióticas ativas é, portanto, determinada em pelo menos dois níveis diferentes, licenciamento de origem para marcar todas as origens potenciais e disparo de origem para selecionar um subconjunto que permite a montagem da máquina de replicação e o início de Síntese de DNA. As origens licenciadas extras servem como backup e são ativadas apenas ao diminuir ou travar as bifurcações de replicação próximas, garantindo que a replicação do DNA possa ser concluída quando as células encontram estresse de replicação. [115] [116] Juntos, o excesso de origens licenciadas e o rígido controle do ciclo celular de licenciamento e disparo de origem incorporam duas estratégias importantes para prevenir a sub e superreplicação e para manter a integridade dos genomas eucarióticos. [2]

Primeiros estudos em S. cerevisiae indicaram que as origens de replicação em eucariotos podem ser reconhecidas de uma maneira específica para a sequência de DNA analogamente àquelas em procariotos. Na levedura de brotamento, a busca por replicadores genéticos leva à identificação de sequências de replicação autônoma (ARS) que suportam a iniciação da replicação de DNA extracromossômica eficiente. [117] [118] [119] Essas regiões ARS têm aproximadamente 100-200 bp de comprimento e exibem uma organização multipartida, contendo elementos A, B1, B2 e, às vezes, B3 que, juntos, são essenciais para a função de origem. [120] [121] O elemento A engloba a sequência consenso conservada de 11 bp ARS (ACS), [122] [123] que, em conjunto com o elemento B1, constitui o sítio de ligação primário para o complexo de reconhecimento de origem heterohexamérica (ORC) , o iniciador de replicação eucariótica. [124] [125] [126] [127] Dentro do ORC, cinco subunidades são baseadas em AAA + ATPase conservada e dobras em hélice alada e co-montam em um anel pentamérico que circunda o DNA. [127] [128] [129] Na ORC de levedura de brotamento, os elementos de ligação ao DNA nos domínios ATPase e hélice alada, bem como regiões de patch básicas adjacentes em algumas das subunidades ORC, estão posicionados no poro central do anel ORC de modo que auxiliam no reconhecimento específico da sequência de DNA do ACS de uma maneira dependente de ATP. [127] [130] Em contraste, os papéis dos elementos B2 e B3 são menos claros. A região B2 é semelhante ao ACS em sequência e foi sugerido que funcione como um segundo local de ligação de ORC sob certas condições, ou como um local de ligação para o núcleo de helicase replicativo. [131] [132] [133] [134] [135] Por outro lado, o elemento B3 recruta o fator de transcrição Abf1, embora B3 não seja encontrado em todas as origens de levedura de brotamento e a ligação de Abf1 não parece ser estritamente essencial para a função de origem. [2] [120] [136] [137]

Reconhecimento de origem em eucariotos, exceto S. cerevisiae ou seus parentes próximos não se conformam com a leitura específica da sequência de elementos de DNA de origem conservada. As buscas para isolar sequências replicadoras cromossômicas específicas mais geralmente em espécies eucarióticas, seja geneticamente ou por mapeamento de todo o genoma da ligação do iniciador ou locais de início de replicação, não conseguiram identificar sequências de consenso claras nas origens. [138] [139] [140] [141] [142] [143] [144] [145] [146] [147] [148] [149] Assim, as interações do iniciador de DNA específicas da sequência na levedura de brotamento significam um modo especializado para reconhecimento de origem neste sistema, em vez de um modo arquetípico para especificação de origem em todo o domínio eucariótico. No entanto, a replicação do DNA inicia em locais discretos que não são distribuídos aleatoriamente em genomas eucarióticos, argumentando que meios alternativos determinam a localização cromossômica das origens nesses sistemas. Esses mecanismos envolvem uma interação complexa entre a acessibilidade do DNA, a distorção da sequência de nucleotídeos (tanto a riqueza de AT quanto as ilhas CpG foram ligadas às origens), o posicionamento do nucleossomo, as características epigenéticas, a topologia do DNA e certas características estruturais do DNA (por exemplo, motivos G4), também como proteínas regulatórias e interferência transcricional. [17] [18] [34] [35] [37] [150] [151] [143] [152] É importante ressaltar que as propriedades de origem variam não apenas entre as diferentes origens em um organismo e entre as espécies, mas algumas também podem mudar durante desenvolvimento e diferenciação celular. O locus chorion em Drosófila as células foliculares constituem um exemplo bem estabelecido de controle espacial e de desenvolvimento de eventos de iniciação. Esta região sofre amplificação do gene dependente da replicação do DNA em um estágio definido durante a oogênese e depende da ativação oportuna e específica das origens do córion, que por sua vez é regulada por cis-elementos específicos da origem e vários fatores de proteína, incluindo o complexo Myb, E2F1 e E2F2. [153] [154] [155] [156] [157] Esta especificação combinatória e regulação multifatorial das origens dos metazoários complicou a identificação de características unificadoras que determinam a localização dos locais de início da replicação em eucariotos de forma mais geral. [2]

Para facilitar o início da replicação e o reconhecimento da origem, os conjuntos de ORC de várias espécies desenvolveram domínios auxiliares especializados que são pensados ​​para auxiliar o iniciador direcionado para origens cromossômicas ou cromossomos em geral. Por exemplo, a subunidade Orc4 em S. pombe ORC contém vários AT-hooks que preferencialmente ligam DNA rico em AT, [158] enquanto no metazoan ORC o domínio TFIIB-like de Orc6 é pensado para desempenhar uma função semelhante. [159] As proteínas Metazoan Orc1 também abrigam um domínio de homologia adjacente ao bromo (BAH) que interage com os nucleossomos H4K20me2. [109] Particularmente em células de mamíferos, foi relatado que a metilação de H4K20 é necessária para o início da replicação eficiente, e o domínio Orc1-BAH facilita a associação ORC com cromossomos e replicação dependente da origem do vírus Epstein-Barr. [160] [161] [162] [163] [164] Portanto, é intrigante especular que ambas as observações estão mecanicamente ligadas pelo menos em um subconjunto de metazoários, mas essa possibilidade precisa ser mais explorada em estudos futuros. Além do reconhecimento de certos DNA ou características epigenéticas, o ORC também se associa direta ou indiretamente a várias proteínas parceiras que podem auxiliar no recrutamento do iniciador, incluindo LRWD1, PHIP (ou DCAF14), HMGA1a, entre outras. [33] [165] [166] [167] [168] [169] [170] [171] Curiosamente, Drosófila ORC, como sua contraparte de levedura de brotamento, dobra o DNA e superenrolamento negativo foi relatado para aumentar a ligação ao DNA deste complexo, sugerindo que a forma e maleabilidade do DNA podem influenciar a localização dos sítios de ligação ORC nos genomas dos metazoários. [31] [127] [172] [173] [174] Um entendimento molecular de como as regiões de ligação do DNA do ORC podem apoiar a leitura das propriedades estruturais do duplex de DNA em metazoários, em vez de sequências de DNA específicas como em S. cerevisiae aguarda informações estruturais de alta resolução de conjuntos de iniciadores de metazoários ligados ao DNA. Da mesma forma, se e como diferentes fatores epigenéticos contribuem para o recrutamento de iniciador em sistemas de metazoários está mal definido e é uma questão importante que precisa ser tratada com mais detalhes. [2]

Uma vez recrutado para as origens, o ORC e ​​seus cofatores Cdc6 e Cdt1 conduzem a deposição do complexo de manutenção de minicromossomo 2-7 (Mcm2-7) no DNA. [111] [175] Como o núcleo da helicase replicativa arquea, Mcm2-7 é carregado como um hexâmero duplo cabeça-a-cabeça no DNA para licenciar origens. [112] [113] [114] Na fase S, a quinase dependente de Dbf4 (DDK) e a quinase dependente de ciclina (CDK) fosforilam várias subunidades Mcm2-7 e fatores de iniciação adicionais para promover o recrutamento dos coativadores de helicase Cdc45 e GINS, fusão de DNA e, em última instância, montagem de replissomo bidirecional em um subconjunto das origens licenciadas. [28] [176] Tanto na levedura quanto nos metazoários, as origens são livres ou depletadas de nucleossomos, uma propriedade que é crucial para o carregamento de Mcm2-7, indicando que o estado da cromatina nas origens regula não apenas o recrutamento do iniciador, mas também o carregamento da helicase. [144] [177] [178] [179] [180] [181] Um ambiente de cromatina permissiva é ainda mais importante para a ativação da origem e tem sido implicado na regulação da eficiência da origem e do tempo de disparo da origem. As origens eucromáticas geralmente contêm marcas de cromatina ativas, replicam-se precocemente e são mais eficientes do que as origens heterocromáticas de replicação tardia, que, por outro lado, são caracterizadas por marcas repressivas. [27] [179] [182] Não surpreendentemente, vários remodeladores da cromatina e enzimas modificadoras da cromatina foram encontrados para se associar com origens e certos fatores de iniciação, [183] ​​[184], mas como suas atividades impactam diferentes eventos de iniciação de replicação permanece amplamente obscuro . Notavelmente, "elementos de controle de replicação precoce" de ação cis (ECREs) também foram recentemente identificados para ajudar a regular o tempo de replicação e para influenciar a arquitetura do genoma 3D em células de mamíferos. [185] Compreender os mecanismos moleculares e bioquímicos que orquestram essa interação complexa entre a organização do genoma 3D, a estrutura da cromatina local e de ordem superior e o início da replicação é um tópico estimulante para estudos futuros. [2]

Por que as origens de replicação dos metazoários divergem do paradigma de reconhecimento específico da sequência de DNA que determina os locais de início da replicação em procariotos e leveduras de brotamento? Observações de que as origens de metazoários muitas vezes co-localizam com regiões promotoras em Drosófila e células de mamíferos e que os conflitos de replicação-transcrição devido a colisões das máquinas moleculares subjacentes podem levar a danos no DNA sugerem que a coordenação adequada da transcrição e replicação é importante para manter a estabilidade do genoma. [139] [141] [143] [146] [186] [20] [187] [188] Descobertas recentes também apontam para um papel mais direto da transcrição em influenciar a localização das origens, seja pela inibição do carregamento de Mcm2-7 ou por reposicionamento de Mcm2-7 carregado nos cromossomos. [189] [152] Sequence-independent (but not necessarily random) initiator binding to DNA additionally allows for flexibility in specifying helicase loading sites and, together with transcriptional interference and the variability in activation efficiencies of licensed origins, likely determines origin location and contributes to the co-regulation of DNA replication and transcriptional programs during development and cell fate transitions. Computational modeling of initiation events in S. pombe, as well as the identification of cell-type specific and developmentally-regulated origins in metazoans, are in agreement with this notion. [140] [148] [190] [191] [192] [193] [194] [152] However, a large degree of flexibility in origin choice also exists among different cells within a single population, [143] [149] [191] albeit the molecular mechanisms that lead to the heterogeneity in origin usage remain ill-defined. Mapping origins in single cells in metazoan systems and correlating these initiation events with single-cell gene expression and chromatin status will be important to elucidate whether origin choice is purely stochastic or controlled in a defined manner. [2]


Prokaryotes vs. Eukaryotes

DNA replication overall is fairly conserved across life. However, general differences exist in the enzymes and mechanisms used, as well as time required between species. The largest differences are between the domains of prokaryotes (bacteria and archaea) and eukaryotes (all other plant and animal cells).

Minor differences between these groups include faster replication time in prokaryotes and shorter Okazaki fragments in eukaryotes. Additionally, prokaryotes only have a single origin of replication, while eukaryotes have multiple origins of replication. The most noteworthy difference between these groups however, is that prokaryotes have circular DNA while eukaryotes have linear DNA. Linear eukaryotic DNA creates an additional challenge that must be regulated. This brings us to telomeres.

Telômeros

Because eukaryotic DNA is linear, they have ends that create a challenge. For the leading strand, DNA polymerase III can continue down the entire length of DNA. However, in the lagging strand, a primer must be added in front of the Okazaki fragment being synthesized before DNA polymerase III can attach and synthesize the new DNA strand opposite of the replication fork. Once the last Okazaki fragment is synthesized, a small DNA segment is leftover at the tip of the strand. This segment cannot be left unattended. If this DNA isn’t replicated, then genetic material will be lost each time replication occurs. After several replication cycles, this can result in lost information that could be critical for the individual to survive.

To solve this issue, telômeros are present in eukaryotes. Telomeres are short, repeating segments of DNA that are found at the end of each chromosome and do not contain any coding sequences. These telomeres are synthesized by telomerase, which is an enzyme that contains a short RNA template used to extend the length of the lagging strand. Primers are placed on the telomere where DNA polymerase III can attach to synthesize the final portion of DNA leftover on the lagging strand.

Telomere replication on the lagging strand is as follows:

  1. Telomerase attaches to the very end of the lagging strand, overhanging the unreplicated portion of DNA.
  2. Using its own RNA template, telomerase synthesizes the extending telomere, adding additional bases to the 3’ end of the lagging strand.
  3. Primase adds the primer on the telomere.
  4. DNA polymerase III binds to the primer and moves opposite of telomerase to complete the synthesis of the lagging strand.

Telomeres Affect Cell Age

Telomerase is most commonly active in cell types that divide rapidly, such as with embryonic cells, stem cells, sperm cells, and immune cells. In most other cell types, telomerase activity is turned off, and telomeres become shorter with each DNA replication. This means that cells have a limited number of times that they are able to divide via mitosis before signals are sent to prevent further divisions and DNA damage. As a result, cells have age.

Research has found that increasing telomere length can also increase the lifespan of the cell. While this offers a potential treatment to growth limiting cellular diseases, it also unfortunately assists cancer persistence and survival. Approximately 90% of cancer cells have mutated to turn on telomerase activity in cell types where it should be turned off. This causes another mechanism in which cancer cells can continue to divide without control and become immortalized. Research is ongoing to determine if/how deactivating telomerase activity can either slow or stop cancer progression.


Replicação de DNA em procariontes

Prokaryotic DNA is replicated by DNA polymerase III in the 5′ to 3′ direction at a rate of 1000 nucleotides per second.

Objetivos de aprendizado

Explain the functions of the enzymes involved in prokaryotic DNA replication

Principais vantagens

Pontos chave

  • Helicase separates the DNA to form a replication fork at the origin of replication where DNA replication begins.
  • Replication forks extend bi-directionally as replication continues.
  • Okazaki fragments are formed on the lagging strand, while the leading strand is replicated continuously.
  • DNA ligase seals the gaps between the Okazaki fragments.
  • Primase synthesizes an RNA primer with a free 3′-OH, which DNA polymerase III uses to synthesize the daughter strands.

Termos chave

  • Replicação de DNA: a biological process occuring in all living organisms that is the basis for biological inheritance
  • helicase: an enzyme that unwinds the DNA helix ahead of the replication machinery
  • origem de replicação: a particular sequence in a genome at which replication is initiated

Replicação de DNA em procariontes

DNA replication employs a large number of proteins and enzymes, each of which plays a critical role during the process. One of the key players is the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides one by one to the growing DNA chain that are complementary to the template strand. The addition of nucleotides requires energy this energy is obtained from the nucleotides that have three phosphates attached to them, similar to ATP which has three phosphate groups attached. When the bond between the phosphates is broken, the energy released is used to form the phosphodiester bond between the incoming nucleotide and the growing chain. In prokaryotes, three main types of polymerases are known: DNA pol I, DNA pol II, and DNA pol III. DNA pol III is the enzyme required for DNA synthesis DNA pol I and DNA pol II are primarily required for repair.

There are specific nucleotide sequences called origins of replication where replication begins. No E. coli, which has a single origin of replication on its one chromosome (as do most prokaryotes), it is approximately 245 base pairs long and is rich in AT sequences. The origin of replication is recognized by certain proteins that bind to this site. An enzyme called helicase unwinds the DNA by breaking the hydrogen bonds between the nitrogenous base pairs. ATP hydrolysis is required for this process. As the DNA opens up, Y-shaped structures called replication forks are formed. Two replication forks at the origin of replication are extended bi-directionally as replication proceeds. Single-strand binding proteins coat the strands of DNA near the replication fork to prevent the single-stranded DNA from winding back into a double helix. DNA polymerase is able to add nucleotides only in the 5′ to 3′ direction (a new DNA strand can be extended only in this direction). It also requires a free 3′-OH group to which it can add nucleotides by forming a phosphodiester bond between the 3′-OH end and the 5′ phosphate of the next nucleotide. This means that it cannot add nucleotides if a free 3′-OH group is not available. Another enzyme, RNA primase, synthesizes an RNA primer that is about five to ten nucleotides long and complementary to the DNA, priming DNA synthesis. A primer provides the free 3′-OH end to start replication. DNA polymerase then extends this RNA primer, adding nucleotides one by one that are complementary to the template strand.

Replicação de DNA em procariontes: A replication fork is formed when helicase separates the DNA strands at the origin of replication. The DNA tends to become more highly coiled ahead of the replication fork. Topoisomerase breaks and reforms DNA’s phosphate backbone ahead of the replication fork, thereby relieving the pressure that results from this supercoiling. Single-strand binding proteins bind to the single-stranded DNA to prevent the helix from re-forming. Primase synthesizes an RNA primer. DNA polymerase III uses this primer to synthesize the daughter DNA strand. On the leading strand, DNA is synthesized continuously, whereas on the lagging strand, DNA is synthesized in short stretches called Okazaki fragments. DNA polymerase I replaces the RNA primer with DNA. DNA ligase seals the gaps between the Okazaki fragments, joining the fragments into a single DNA molecule.

The replication fork moves at the rate of 1000 nucleotides per second. DNA polymerase can only extend in the 5′ to 3′ direction, which poses a slight problem at the replication fork. As we know, the DNA double helix is anti-parallel that is, one strand is in the 5′ to 3′ direction and the other is oriented in the 3′ to 5′ direction. One strand (the leading strand), complementary to the 3′ to 5′ parental DNA strand, is synthesized continuously towards the replication fork because the polymerase can add nucleotides in this direction. The other strand (the lagging strand), complementary to the 5′ to 3′ parental DNA, is extended away from the replication fork in small fragments known as Okazaki fragments, each requiring a primer to start the synthesis. Okazaki fragments are named after the Japanese scientist who first discovered them.

The leading strand can be extended by one primer alone, whereas the lagging strand needs a new primer for each of the short Okazaki fragments. The overall direction of the lagging strand will be 3′ to 5′, while that of the leading strand will be 5′ to 3′. The sliding clamp (a ring-shaped protein that binds to the DNA) holds the DNA polymerase in place as it continues to add nucleotides. Topoisomerase prevents the over-winding of the DNA double helix ahead of the replication fork as the DNA is opening up it does so by causing temporary nicks in the DNA helix and then resealing it. As synthesis proceeds, the RNA primers are replaced by DNA. The primers are removed by the exonuclease activity of DNA pol I, while the gaps are filled in by deoxyribonucleotides. The nicks that remain between the newly-synthesized DNA (that replaced the RNA primer) and the previously-synthesized DNA are sealed by the enzyme DNA ligase that catalyzes the formation of phosphodiester linkage between the 3′-OH end of one nucleotide and the 5′ phosphate end of the other fragment.

The table summarizes the enzymes involved in prokaryotic DNA replication and the functions of each.

Prokaryotic DNA Replication: Enzymes and Their Function: The enzymes involved in prokaryotic DNA replication and their functions are summarized on this table.


DNA Replication - Deep Think Biology 8

A lesson that introduces the mechanism of DNA replication. Students simulate and explore this process by building a paper model that includes DNA polymerase and nucleotides.

'DNA Replication' is a Biology lesson that integrates a four page illustrated and interactive notebook with a thirteen slide PowerPoint with original animated diagrams and answers. Four pages of additional resources, Teacher's Notes and a 'Quick Start Guide' are also included. Students construct their knowledge and understanding of DNA replication by engaging in a range of activities designed to support knowledge acquisition and to promote good thinking skills.

Lesson features include:

Thinking & Learning activities.

All new & original diagrams designed by 'The Natural Scientist'.

Animated PowerPoint slides that fully support each activity (with answers).

Self-evaluation - 'How do I improve?'

Write about topic from different perspectives (completed in class or set as assignment).

Construct a 'Topic-Tree' (lesson activity, assignment or revision task).

Deep Think Biology

'DNA Replication' is the eighth in a series of 'Deep Think Biology' lessons on the Biology of DNA. If you enjoy this lesson please do preview my other lessons in this series. I offer all 8 lessons in a bundle at a substantial discount: $29.99, a saving of over $18 on the list price.

Teaching Philosophy

Presenting information to students is easy, facilitating the development of effective thinking skills is difficult. This ‘DNA Replication’ lesson, like other lessons in the 'Deep Think Biology' series, has been designed to help students acquire such skills whilst immersing them in the exciting science of Biology.

Importantly, Deep Think Biology lessons are designed to enhance your personal pedagogy, not replace it, whilst recognizing and encouraging our role as facilitators.

Interactive Notebook

  • Tasks associated with the ‘Thinking & Learning' section of the interactive notebook form the core of the lesson and are fully supported with PowerPoint slides, printable resources and answers. Students work sequentially through various activities that have been designed to help build confidence and knowledge of the topic always encouraging students to think.
  • During class time, or alternatively set as an assignment, students write about this topic from different perspectives and reconstruct knowledge by building a ‘Topic-Tree’.

PowerPoint Slides

  • Animated diagrams included in PowerPoint slides correspond to those included in the interactive notebook.
  • Integration of PowerPoint slides with the interactive notebook support a combination of teaching styles: from independent work to teacher directed tasks to group and class discussions.

Teacher's Notes

Included in this 'Protein Synthesis' lesson:

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Assista o vídeo: REPLICAÇÃO DUPLICAÇÃO DO DNA. Biologia com Samuel Cunha (Dezembro 2021).