Em formação

Que vantagem teria recebido o 'doador' inicial na transferência horizontal de genes por conjugação?


Estou lutando para pensar por que a transferência horizontal de genes entre bactérias teria persistido durante o curso da evolução, uma vez que certamente colocaria o "doador" em desvantagem?

Por exemplo, considere uma situação hipotética em que apenas uma espécie de bactéria tem um gene para resistir a um novo antibiótico (quase) onipotente. Ao crescer neste meio, esta espécie de bactéria não tem competição interespecífica pelos recursos de que necessita. No entanto, se ele passar o plasmídeo contendo o gene de resistência por meio de conjugação a indivíduos de uma espécie bacteriana diferente, eles também serão capazes de crescer no meio e potencialmente superar a competição da primeira espécie - assim, a conjugação pode ser extremamente prejudicial para o sobrevivência da população original.

Obviamente estou perdendo algo como o recurso tem persistiu, então qual é a vantagem para a espécie doadora de conjugação?


A bactéria doadora, vista como uma unidade, pode muito bem não ganhar nenhuma vantagem em compartilhar seus genes. Os genes que são compartilhados, no entanto, podem ganhar uma vantagem reprodutiva muito substancial por serem capazes de se espalhar para outras linhagens. Se alguns dos genes que são capazes de ser compartilhados também promovem o compartilhamento, eles podem ser selecionados pela evolução.

Este é um bom exemplo do princípio básico da visão da evolução centrada no gene, notoriamente popularizada por Richard Dawkins em seu livro O Gene Egoísta: a evolução seleciona genes que são bons em se espalhar. Isso pode, mas nem sempre, implicar em ajudar o organismo que contém o gene a sobreviver e se reproduzir.


Demonstrando a transferência horizontal de genes baseada em plasmídeos em matrizes ambientais complexas: uma abordagem prática para uma revisão crítica

Nós examinamos três métodos para avaliar a transferência de plasmídeo em matrizes ambientais.

O isolamento de transconjugantes por cultura é prejudicado por antibiorresistências de base.

A detecção de transferência de plasmídeo por fluorescência é inadequada para amostras ambientais.

Os métodos baseados em moléculas permitem a detecção de eventos raros de transferência de plasmídeo com sucesso.

A predação eucariótica tanto promove quanto limita a transferência de plasmídeos em comunidades naturais.


Fundo

A recombinação do material genético que leva à criação de características novas e benéficas é obtida por diferentes meios em diferentes organismos. Em procariotos e suas comunidades, é obtido por meio de conjugação bacteriana, transdução viral e transformação. Todos esses processos podem levar à transferência horizontal de genes, um modo proeminente de recombinação entre genomas bacterianos [1,2,3]. Essa transferência ocorre tanto entre espécies estreitamente relacionadas quanto entre espécies altamente divergentes [4], e pode conferir novas características que ajudam os micróbios a se adaptarem a uma ampla gama de ambientes [5,6,7]. A transferência horizontal de genes pode envolver moléculas de DNA que são circulares ou lineares, de fita simples ou dupla, auto-replicantes ou não [3, 8,9,10]. Essas moléculas podem ser integradas ao genoma do hospedeiro por meio de recombinação baseada em homologia ou ilegítima [11], cujos subprodutos podem incluir duplicações de genes [12] e mudanças genômicas estruturais em grande escala [13, 14]. A recombinação homóloga é o meio mais comum de integração genômica de genes adquiridos horizontalmente [15]. Geralmente requer a enzima RecBCD [16], que é altamente conservada entre as bactérias [17]. Embora a recombinação homóloga possa ter se originado como um mecanismo de reparo do DNA [18], ela desempenha um papel importante na evolução adaptativa, por exemplo, inserindo ou substituindo clusters de genes que facilitam a adaptação local [19]. No E. coli, a recombinação não é menos frequente do que a mutação espontânea [20,21,22], sugerindo que a recombinação contribui substancialmente para a evolução do genoma.

A transferência horizontal de genes ajuda a aumentar a diversidade genética de uma população ou comunidade microbiana ao embaralhar os genes no “genoma flexível” [23], uma parte do genoma cujos genes são frequentemente privados de uma cepa localmente adaptada. Estudos comparativos recentes de 2000 E. coli genomas indicam que o genoma flexível pode compreender milhares de famílias de genes diferentes, o que pode ajudar E. coli ocupar uma ampla gama de nichos ecológicos [24].

Genes transferidos horizontalmente normalmente têm funções diferentes dos genes de manutenção do núcleo. Eles são perdidos e ganhos mais prontamente do que os genes centrais [25,26,27], e podem dotar seu receptor com novas características que facilitam a adaptação a um ambiente em mudança [28, 29]. Por exemplo, a transferência horizontal de tais genes ajudou os micróbios marinhos a se adaptarem a uma variedade de fontes de carbono [19, 30], ajudou as bactérias a se adaptarem a ambientes extremos [31, 32] e ajudou as comunidades microbianas do intestino ou patógenos a se adaptarem para hospedeiros humanos [33, 34]. Um estudo comparativo recente de 53 E. coli genomas mostraram que pelo menos 10% das adaptações a novos ambientes podem ter sido alcançadas por transferência horizontal de genes [35].

A maioria das evidências de transferência horizontal de genes em comunidades procarióticas vem de estudos comparativos de genômica ou reconstruções filogenéticas [36,37,38]. Freqüentemente, eles se concentram na transferência horizontal entre organismos fenotipicamente diferenciados da mesma espécie, como cepas patogênicas e não patogênicas [36, 39]. Esses estudos podem ajudar a identificar os principais genes transferidos horizontalmente que conferem novas características, mas eles são inconclusivos sobre o benefício imediato da aptidão (se houver) de um evento de transferência horizontal de genes, que pode transferir um ou alguns genes condutores juntamente com vários genes passageiros que podem impor custos de fitness no host [40]. Essas informações de aptidão podem ser fornecidas por experimentos de evolução de laboratório [41, 42]. No entanto, existem poucos experimentos que estudam a transferência horizontal de genes [43,44,45,46,47,48,49], e menos ainda que não se concentrem na transferência de plasmídeos [46,47,48], mas de cromossômicos genes [41,42,43]. Em um dos últimos experimentos [43], E. coli K12 adaptado a um ambiente mínimo constante de glicose enquanto se recombina com E. coli B REL606. Embora a recombinação conferisse maior diversidade genética, ela não melhorou o crescimento significativamente. Em um experimento mais recente, a substituição de genes codificadores de proteínas ribossômicas de Salmonella typhimurium com ortólogos de outras eubactérias, leveduras ou arquéias resultou em malformações devido à expressão subótima desses genes estranhos [44]. No entanto, após 40-250 gerações de evolução laboratorial, a aptidão melhorou por meio da amplificação dos genes afetados. Em um terceiro experimento [45], Salmonella transformado com fragmentos de DNA cromossômico aleatório de Bacteroides fragilis, Proteus mirabilis, e os fagos intestinais humanos mostraram aptidão reduzida em um ambiente constante de glicose mínima, sugerindo que a transferência horizontal de genes pode ser cara. Nenhum desses experimentos demonstrou uma vantagem direta da transferência horizontal de genes observada em populações naturais [5, 50].

Aqui, conduzimos experimentos de evolução em laboratório que objetivaram abordar várias questões fundamentais. As vantagens da transferência horizontal de genes podem ser demonstradas nas escalas de tempo curtas da evolução do laboratório? E, em caso afirmativo, qual é a base genética de mudanças adaptativas específicas ocasionadas pela transferência horizontal de genes em experimentos de evolução? Para resolver essas e outras questões relacionadas, conduzimos dois experimentos de evolução que expõem cepas receptoras de DNA de E.coli a várias cepas de doadores que podem transferir DNA para eles e que selecionam a viabilidade do receptor em uma nova fonte de carbono e energia. No primeiro experimento, usamos uma fonte de carbono na qual o doador poderia crescer, mas o receptor não, de modo que a transferência horizontal e a recombinação seriam necessárias para o crescimento do receptor. No segundo experimento, usamos uma fonte de carbono na qual nem doador nem receptor poderiam crescer, de modo que uma combinação de recombinação e mutações pontuais pode ser necessária para garantir a viabilidade do receptor.

No final dos experimentos de evolução, medimos os fenótipos de crescimento de populações em evolução e analisamos os genomas completos de 65 clones dessas populações. Nossas observações mostram que a vantagem da transferência horizontal de genes depende criticamente do ambiente de crescimento, e menos ainda da cepa doadora. A transferência horizontal de genes foi o principal motivador para a adaptação no HPA, enquanto uma combinação de mutações pontuais e eventos de transferência horizontal pode ter facilitado a adaptação no ácido butírico.


3. Resultados

3.1 Validação do sistema experimental - teste das suposições do modelo

O modelo assume que a posição das células segue um processo de Poisson, de forma que as distâncias intracelulares têm uma função de distribuição dada pela Eq. 1 acima. As comparações com as distâncias experimentais não revelaram desvios significativos deste modelo (Fig. 1). O número de células determinado experimentalmente e o raio da colônia aumentaram exponencialmente durante o período de incubação de 9 horas. As taxas de crescimento específicas, bem como as taxas de crescimento específico radial da colônia, não foram significativamente diferentes entre as cepas doador e receptor (P& gt0,05) e os valores médios para cada taxa de crescimento foram usados ​​como constantes do modelo (Tabela 1).

Distâncias intercelulares experimentais (barras) e funções de densidade previstas pelo modelo (linhas) para intensidades de (células μm −2): 0,06 × 10 −3 (A), 0,17 × 10 −3 (B), 1,92 × 10 −3 ( C) e 1,65 × 10 −3 (D). n= 33, 49, 67 e 84 respectivamente. Os testes de qui-quadrado indicaram que as distâncias experimentais e do modelo não diferiram significativamente (P& gt0.05).

Distâncias intercelulares experimentais (barras) e funções de densidade previstas pelo modelo (linhas) para intensidades de (células μm −2): 0,06 × 10 −3 (A), 0,17 × 10 −3 (B), 1,92 × 10 −3 ( C) e 1,65 × 10 −3 (D). n= 33, 49, 67 e 84 respectivamente. Os testes de qui-quadrado indicaram que as distâncias experimentais e do modelo não diferiram significativamente (P& gt0.05).

A influência da motilidade na expansão e conjugação da colônia foi avaliada comparando as mudanças no diâmetro da colônia e transferência de plasmídeo usando o P. fluorescens Sistema MON787 e mutantes não móveis das cepas doador e receptor. As taxas de expansão da colônia ou mudanças nos números de doadores, receptores ou transconjugantes não foram significativamente diferentes (P& gt0,05, dados não mostrados). Portanto, os efeitos da motilidade foram considerados insignificantes para o nosso sistema experimental.

3.2 Teste de modelo 1: comparação de experimentos de simulação de computador e previsões de modelo

Simulações de computador de colônias bacterianas se desenvolvendo em filtros foram realizadas para testar modelos de predições a respeito do estabelecimento de contato entre colônias (aglomeração) e conjugação. A aproximação que define a probabilidade de aglomerados de n a ocorrência de colônias (Eq. 2) era boa quando o número de colônias por unidade de área era baixo (baixo λ), de modo que o tamanho médio do aglomerado era pequeno, ou seja, inferior a cinco (Tabela 2). As simulações deram uma probabilidade maior de colônias únicas por causa da área finita (as colônias na borda não podem ter vizinhos em um lado). Os tamanhos médios teóricos dos aglomerados foram precisos para λ, mas como λ aumentou o tamanho médio teórico do aglomerado e os resultados da simulação diferiram. A aproximação funcionou bem para valores de λ até 0,2, quando a área dos discos for 60% da área da superfície. Em nosso sistema experimental, isso corresponde a inóculos inferiores a 1,8 × 10 7 células por filtro, o que era geralmente o caso, exceto para os níveis de inóculo mais altos nos experimentos 1–5 (ver Seção 3.3).

Comparação de estimativas de tamanho de aglomerados (ou seja, número de colônias que se encontram em um determinado momento) usando a teoria aproximada do modelo com aquelas obtidas por experimentos de simulação de computador

Intensidade a (λ) Probabilidade de colônia em touceira de tamanho um Tamanho médio da touceira
Teoria Simulação Teoria Simulação
0.01 0.882 0.882 1.07 1.07
0.02 0.778 0.780 1.14 1.13
0.05 0.533 0.537 1.39 1.38
0.1 0.285 0.292 2.00 1.94
0.2 0.0810 0.0966 4.51 3.95
0.5 0.00187 0.00821 85.1 74.5
Intensidade a (λ) Probabilidade de colônia em touceira de tamanho um Tamanho médio da touceira
Teoria Simulação Teoria Simulação
0.01 0.882 0.882 1.07 1.07
0.02 0.778 0.780 1.14 1.13
0.05 0.533 0.537 1.39 1.38
0.1 0.285 0.292 2.00 1.94
0.2 0.0810 0.0966 4.51 3.95
0.5 0.00187 0.00821 85.1 74.5

Os resultados são baseados em colônias hipotéticas de raio unitário colocadas em um filtro com raio 150. Os resultados da simulação são baseados em 1000 repetições.

a O número de colônias por unidade de área em uma distribuição de Poisson.

Comparação de estimativas de tamanho de aglomerados (ou seja, número de colônias que se encontram em um determinado momento) usando a teoria aproximada do modelo com aquelas obtidas por experimentos de simulação de computador

Intensidade a (λ) Probabilidade de colônia em touceira de tamanho um Tamanho médio da touceira
Teoria Simulação Teoria Simulação
0.01 0.882 0.882 1.07 1.07
0.02 0.778 0.780 1.14 1.13
0.05 0.533 0.537 1.39 1.38
0.1 0.285 0.292 2.00 1.94
0.2 0.0810 0.0966 4.51 3.95
0.5 0.00187 0.00821 85.1 74.5
Intensidade a (λ) Probabilidade de colônia em touceira de tamanho um Tamanho médio da touceira
Teoria Simulação Teoria Simulação
0.01 0.882 0.882 1.07 1.07
0.02 0.778 0.780 1.14 1.13
0.05 0.533 0.537 1.39 1.38
0.1 0.285 0.292 2.00 1.94
0.2 0.0810 0.0966 4.51 3.95
0.5 0.00187 0.00821 85.1 74.5

Os resultados são baseados em colônias hipotéticas de raio unitário colocadas em um filtro com raio 150. Os resultados da simulação são baseados em 1000 repetições.

a O número de colônias por unidade de área em uma distribuição de Poisson.

Quando a suposição de conjugação instantânea foi abandonada, as previsões do modelo matemático concordaram com os resultados de experimentos de simulação de computador quando a intensidade era muito baixa (λ& lt0.1), e deu resultados qualitativamente semelhantes com λ entre 0,1 e 0,2. Quando λ= 0,2 o número previsto de transconjugantes superestimou os resultados simulados em cerca de 15%.

3.3 Teste de modelo 2: teste experimental de laboratório de previsões de modelo

As previsões do modelo de doadores finais, receptores e transconjugantes foram obtidas para vários tamanhos de inóculo de doador e receptor e concentração inicial de nutrientes, usando os valores dos parâmetros do modelo dados na Tabela 1. Testamos essas previsões contra os números finais de doador, receptor e transconjugante no sistema experimental, em uma faixa de concentrações de inóculo (Figs. 2–4). Cada conjunto de condições foi triplicado e os valores são apresentados como médias de triplicados com intervalos de confiança de 95% associados. Usamos o termo "preciso" para as previsões que se enquadram nos limites de confiança de 95% dos dados experimentais. Quando o número de células transconjugantes se aproximou ou ultrapassou os de uma das cepas parentais, os transconjugantes cresceram em meios suplementados com rifampicina ou canamicina a níveis que mascararam os das cepas parentais. Quando era este o caso, não eram apresentados nas figuras quaisquer valores experimentais para células receptoras ou doadoras e, para simplificar, os respectivos valores previstos também foram omitidos das figuras.

Números preditos (pred) e experimentais (obs) de doadores (D), receptores (R,) e transconjugantes (T) após a inoculação com números semelhantes de doadores e receptores no intervalo log 1,03-7,03 para doadores e log 1,24-7,24 para destinatários. Filtros Nuclepore triplicados foram incubados em ágar LB, a 30 ° C, por 9 h. Barras de erro representam limites de confiança de 95% para dados experimentais. O limite de detecção experimental foi log 1,35 (CFU). Predições de modelo para conjugação instantânea (A) e para conjugação que ocorre após 2,25 h de contato (B). As previsões dos doadores permanecem inalteradas e não são apresentadas novamente no painel B.

Números preditos (pred) e experimentais (obs) de doadores (D), receptores (R,) e transconjugantes (T) após a inoculação com números semelhantes de doadores e receptores no intervalo log 1,03-7,03 para doadores e log 1,24-7,24 para destinatários. Filtros Nuclepore triplicados foram incubados em ágar LB, a 30 ° C, por 9 h. Barras de erro representam limites de confiança de 95% para dados experimentais. O limite de detecção experimental foi log 1,35 (CFU). Predições de modelo para conjugação instantânea (A) e para conjugação que ocorre após 2,25 h de contato (B). As previsões dos doadores permanecem inalteradas e não são apresentadas novamente no painel B.

Os números finais previstos e experimentais de doadores, receptores e transconjugantes para os números iniciais de doadores variaram de log 1,77 a 7,77 e os números de receptores iniciais mantidos constantes em log 1,86, com conjugação instantânea (A) ou conjugação ocorrendo após 2,25 h do contato (C) doador inicial os números variaram de log 1,32 a 7,32 e os números iniciais de destinatários mantidos constantes em log 5,2, com conjugação instantânea (B) ou conjugação ocorrendo após 2,25 h de contato (D). As previsões do doador permanecem inalteradas e não são apresentadas novamente nos painéis B e D. Símbolos, barras de erro, detalhes experimentais, conforme descrito na Fig. 2.

Os números finais previstos e experimentais de doadores, receptores e transconjugantes para os números iniciais de doadores variaram de log 1,77 a 7,77 e os números de receptores iniciais mantidos constantes em log 1,86, com conjugação instantânea (A) ou conjugação ocorrendo após 2,25 h de contato (C) doador inicial os números variaram de log 1,32 a 7,32 e os números iniciais de destinatários mantidos constantes em log 5,2, com conjugação instantânea (B) ou conjugação ocorrendo após 2,25 h de contato (D). As previsões do doador permanecem inalteradas e não são apresentadas novamente nos painéis B e D. Símbolos, barras de erro, detalhes experimentais, conforme descrito na Fig. 2.

Os números finais previstos e experimentais de doadores, receptores e transconjugantes para os números de receptores iniciais variaram de log 1,41 a 7,41 e os números de doadores iniciais mantidos constantes em log 4,47, com conjugação instantânea (A) ou conjugação ocorrendo após 2,25 h de contato (C) e inicial o número de receptores variou de log 1,64 a 7,64 e o número inicial de doadores manteve-se constante em log 5,48, com conjugação instantânea (B) ou conjugação ocorrendo após 2,25 h de contato (D). As previsões do doador permanecem inalteradas e não são apresentadas novamente nos painéis B e D. Símbolos, barras de erro, detalhes experimentais, conforme descrito na Fig. 2.

Os números finais previstos e experimentais de doadores, receptores e transconjugantes para os números de receptores iniciais variaram de log 1,41 a 7,41 e os números de doadores iniciais mantidos constantes em log 4,47, com conjugação instantânea (A) ou conjugação ocorrendo após 2,25 h de contato (C) e inicial o número de receptores variou de log 1,64 a 7,64 e os números iniciais de doadores mantidos constantes em log 5,48, com conjugação instantânea (B) ou conjugação ocorrendo após 2,25 h de contato (D). As previsões do doador permanecem inalteradas e não são apresentadas novamente nos painéis B e D. Símbolos, barras de erro, detalhes experimentais, conforme descrito na Fig. 2.

No experimento 1, inoculamos números semelhantes de células do doador e receptoras em filtros (intervalo 1,08 × 10 1 - 1,08 × 10 7 doador e 1,75 × 10 1 - 1,75 × 10 7 células receptoras). Os números finais de células doadoras foram geralmente previstos com precisão, aumentando com o tamanho do inóculo até um valor máximo, equivalente ao rendimento máximo, após a utilização completa de nutrientes (Fig. 2A). Os números finais previstos de células do receptor foram próximos aos números experimentais até um inóculo de 2,78 × 10 4 células, após o qual o modelo prevê um declínio no número de recipientes por considerar que estes estão sendo convertidos em transconjugantes. No entanto, o número de recipientes experimentais foi duas ordens de magnitude maior do que o previsto para um inóculo de 2,78 × 10 5, indicando uma superestimação da conjugação pelo modelo. No nível de inóculo mais baixo (2,78 × 10 1), o número previsto de transconjugantes estava abaixo do nível de detecção do sistema experimental (2,25 × 10 1). Para níveis de inóculo maiores que 2,78 × 10 3, os números de transconjugantes previstos foram maiores do que aqueles detectados experimentalmente, confirmando a superestimação da conjugação pelo modelo. No entanto, a taxa de mudança no número de transconjugantes com o aumento do tamanho do inóculo seguiu de perto a do sistema experimental. O número de transconjugantes aumentou a uma taxa maior do que as células doadoras, devido aos efeitos combinados da aquisição e do crescimento do plasmídeo.

As experiências 2 e 3 investigaram o aumento da razão de doador: inóculo receptor em um número inicial constante de células receptoras. No experimento 2 (Fig. 3A), os inóculos do doador foram variados de 5,87 × 10 1 a 5,87 × 10 7 e os inóculos do receptor foram 7,28 × 10 1 células. As previsões dos doadores foram precisas e as previsões dos recipientes foram geralmente uma subestimação por meia unidade de log. Os números de transconjugantes previstos seguiram de perto as tendências experimentais, mas aqueles para inóculos de doadores de 5,87 × 10 1, 5,87 × 10 4 e 5,87 × 10 7 foram superestimados em meia unidade logarítmica. Conforme o tamanho do inóculo do doador aumentou, a conjugação aumentou, devido ao maior número de encontros entre o doador e as colônias receptoras durante o período de incubação e antes da utilização completa dos nutrientes. A conjugação máxima no sistema experimental ocorreu com um inóculo doador de 5,87 × 10 5. Em inóculos mais elevados, a conjugação foi reduzida devido à exaustão precoce de nutrientes pelo maior número de células doadoras. Esse declínio também é previsto pelo modelo.

No experimento 3, os doadores iniciais foram variados de 2,1 × 10 1 a 2,1 × 10 7 e os recipientes mantidos constantes em um inóculo maior (1,58 × 10 5) (Fig. 3B). O modelo subestimou o número de doadores em 0,3–0,9 de uma unidade de log e um declínio é previsto para o número de recipientes para inóculos de doadores maiores que 2,1 × 10 3, o que não é observado experimentalmente. O modelo superestimou os números de transconjugantes, a discrepância entre o modelo e os resultados experimentais variando entre 0,2 e 1,7 de uma unidade de log e sendo maior para inóculos de doadores inferiores. A subestimação dos receptores resulta da superestimação da conjugação. A subestimação dos doadores parece indicar uma taxa de crescimento mais rápida no sistema experimental. Quando o limite de confiança superior de 95% para a taxa de crescimento da população (0,924 células h -1) foi usado, as previsões dos doadores corresponderam aos dados experimentais (dados não mostrados). O número de transconjugantes experimentais atingiu o pico em um inóculo doador de 2,1 × 10 5 –2,1 × 10 6 seguido por uma diminuição para o inóculo mais alto, conforme previsto pelo modelo e explicado no parágrafo anterior.

As proporções crescentes de receptor: doador no inóculo do doador constante foram estudadas nos experimentos 4 e 5. No experimento 4 (Fig. 4A), os números iniciais de doadores foram 2,95 × 10 4 e os receptores foram variados de 2,6 × 10 1 a 2,6 × 10 7. O número de doadores foi previsto com precisão. No sistema experimental, os doadores finais não puderam ser distinguidos dos transconjugantes no inóculo receptor maior do que 2,6 × 10 5. Da mesma forma, os números de doadores previstos para essas condições iniciais foram menores do que os transconjugantes previstos (não mostrados). As mudanças nos recipientes finais foram previstas com precisão até um inóculo do recipiente de 2,6 × 10 4, acima do qual os recipientes previstos recusaram devido à conjugação extensa prevista. No sistema experimental, entretanto, recipientes continuaram a ser detectados, indicando níveis mais baixos de conjugação. Os números de transconjugantes previstos foram uma superestimação de 0,3-1,8 unidades logarítmicas, mas seguiram a tendência experimental geral, aumentando com o aumento das proporções de receptores.

No experimento 5 (Fig. 4B), o número inicial de doadores foi 3,07 × 10 5 e os receptores foram variados de 4,37 × 10 1 a 4,37 × 10 7. Os números de doadores foram em geral subestimados pelo modelo em 0,5 unidade log, no entanto, se o limite de confiança superior de 95% para a taxa de crescimento da população (0,924 células h -1) foi usado, as previsões do doador foram precisas (dados não mostrados). Os números de transconjugantes foram ligeiramente subestimados (em menos de 0,5 unidade log) pelo modelo até um inóculo receptor de 4,37 × 10 5, além do qual foram superestimados em 0,5-1 unidade log. Os números finais dos recipientes não puderam ser determinados experimentalmente, exceto para o inóculo mais alto (4,37 × 10 7), quando eles estavam presentes em um nível muito alto e o modelo prediz que todos teriam se tornado transconjugantes. Isso confirma a superestimação da conjugação com números iniciais elevados de células.

Os efeitos da concentração de nutrientes na conjugação foram examinados por filtros flutuantes em triplicado, inoculados com 3,98 × 10 5 células doadoras e 5,01 × 10 5 células receptoras, em caldo LB, ou diferentes diluições de caldo LB em NaCl 0,85% (p / v), por 9 h a 30 ° C (experiência 6, Fig. 5A). Não foram encontrados transconjugantes no meio líquido abaixo dos filtros flutuantes ao final do experimento, exceto para 0,6% do caldo LB, onde constituíram 0,065% do número total de transconjugantes. Os transconjugantes decorrentes de eventos de conjugação em meios de ressuspensão e em placas durante a incubação foram menos de 2,5% do número total. Os valores dos parâmetros usados ​​no modelo foram dados na Tabela 1. O nível mais baixo de nutriente suportou o crescimento celular e a conjugação no sistema experimental. O aumento da concentração de nutrientes levou ao aumento do número de células à medida que os nutrientes se exauriam mais tarde, aumentando a expansão total da colônia e o número de encontros entre células doadoras e receptoras. Tal como acontece com a maioria dos experimentos anteriores, as previsões do doador foram precisas, mas os transconjugantes foram superestimados em 0,3-1 unidade log. As previsões dos receptores foram menos precisas, com subestimação em várias ordens de magnitude para os níveis mais elevados de nutrientes.

Números finais preditos e experimentais de doadores, receptores e transconjugantes para os números iniciais de doadores e receptores de log 5,6 e 5,67, respectivamente, quando a concentração de nutrientes foi variada experimentalmente. Predições de modelo para conjugação instantânea (A) ou conjugação ocorrendo após 2,25 h de contato (B). As previsões do doador permanecem inalteradas e não são apresentadas novamente no painel B. Filtros Nuclepore triplicados foram flutuados sobre diferentes diluições de caldo LB em 0,85% (p / v) de NaCl ou caldo LB de concentração total e incubados a 30 ° C, por 9 h. Símbolos e barras de erro conforme descrito na Fig. 2.

Números finais preditos e experimentais de doadores, receptores e transconjugantes para os números iniciais de doadores e receptores de log 5,6 e 5,67, respectivamente, quando a concentração de nutrientes foi variada experimentalmente. Predições de modelo para conjugação instantânea (A) ou conjugação ocorrendo após 2,25 h de contato (B). As previsões do doador permanecem inalteradas e não são apresentadas novamente no painel B. Filtros Nuclepore triplicados foram flutuados sobre diferentes diluições de caldo LB em 0,85% (p / v) de NaCl ou caldo LB de força total e incubados a 30 ° C, por 9 h. Símbolos e barras de erro conforme descrito na Fig. 2.

3.4 Consideração do tempo de conjugação pelo modelo

As previsões do modelo apresentadas até agora foram obtidas no pressuposto de que a conjugação ocorreu instantaneamente quando as colônias doadoras ou transconjugantes encontraram as microcolônias receptoras. Um retardo provisório na conjugação foi subsequentemente levado em consideração pelo modelo, de modo que todas as células em uma colônia receptora só se tornaram transconjugantes após o contato por um certo período de tempo. As previsões do modelo para transconjugantes e receptores foram muito melhoradas (geralmente para metade de uma unidade logarítmica dos dados experimentais) por um atraso de 2-3 h, dependendo do experimento. Um atraso de 2,25 h deu o melhor ajuste geral e as previsões correspondentes foram apresentadas nas Figs. 2B, 3C, D, 4C, D e 5B. As previsões dos doadores não foram alteradas pelo atraso e não foram apresentadas novamente. As melhorias mais dramáticas nas previsões foram para receptores no experimento 1 (Fig. 2B), transconjugantes e receptores no experimento 3 (Fig. 3D), transconjugantes e receptores correspondentes a um inóculo receptor de até 2,6 × 10 4 –10 5 no experimento 4 (Fig. 4C) e recipientes na experiência 6 (Fig. 5). Discrepâncias significativas entre transconjugantes experimentais e receptores e respectivas predições pelo modelo ainda foram observadas para condições em que os inóculos receptores eram maiores do que os inóculos doadores. Isso ocorreu para transconjugantes e receptores correspondentes a um inóculo receptor maior do que 2,6 × 10 5 no experimento 4 (Fig. 4C) e para transconjugantes e receptores decorrentes de inóculos receptores maiores do que 4,37 × 10 5 (Fig. 4D).


Métodos Filogenéticos

O uso de análise filogenética na detecção de HGT foi avançado pela disponibilidade de muitos genomas recentemente sequenciados. Os métodos filogenéticos detectam inconsistências na história evolutiva de genes e espécies de duas maneiras: explicitamente, reconstruindo a árvore gênica e reconciliando-a com a árvore de espécies de referência, ou implicitamente, examinando aspectos que se correlacionam com a história evolutiva dos genes em questão, por exemplo, padrões de presença e ausência entre as espécies, ou distâncias evolutivas entre pares inesperadamente curtas ou distantes.

Métodos filogenéticos explícitos

O objetivo dos métodos filogenéticos explícitos é comparar as árvores gênicas com as árvores das espécies associadas. Embora diferenças fracamente suportadas entre árvores de genes e espécies possam ser devidas à incerteza de inferência, diferenças estatisticamente significativas podem ser sugestivas de eventos de HGT (ver Fig 1A). Por exemplo, se dois genes de espécies diferentes compartilham o nó de conexão ancestral mais recente na árvore de genes, mas as respectivas espécies estão espaçadas na árvore de espécies, um evento HGT pode ser invocado. Tal abordagem pode produzir resultados mais detalhados do que abordagens paramétricas porque as espécies envolvidas, o tempo e a direção da transferência podem ser potencialmente identificados.

Conforme discutido em mais detalhes abaixo, os métodos filogenéticos variam de métodos simples que simplesmente identificam discordância entre árvores de genes e espécies a modelos mecanísticos que inferem sequências prováveis ​​de eventos de HGT. Uma estratégia intermediária envolve a desconstrução da árvore gênica em partes menores até que cada uma corresponda à árvore da espécie (abordagens espectrais do genoma).

Os métodos filogenéticos explícitos dependem da precisão do gene enraizado de entrada e das árvores de espécies, mas podem ser difíceis de construir [41]. Mesmo quando não há dúvidas nas árvores de entrada, as filogenias conflitantes podem ser o resultado de processos evolutivos diferentes de HGT, como duplicações e perdas, fazendo com que esses métodos inferam erroneamente eventos de HGT quando a paralogia é a explicação correta. Da mesma forma, na presença de classificação de linhagem incompleta, métodos de filogenia explícita podem inferir erroneamente eventos HGT [42]. É por isso que alguns métodos baseados em modelos explícitos testam vários cenários evolutivos envolvendo diferentes tipos de eventos e comparam seu ajuste aos dados, dados critérios parcimoniosos ou probabilísticos.

Testes de topologias.

Para detectar conjuntos de genes que se ajustam mal à árvore de referência, pode-se usar testes estatísticos de topologia, como o Kishino-Hasegawa (KH) [43], Shimodaira-Hasegawa (SH) [44] e Aproximadamente Imparcial (AU) [45] testes. Esses testes avaliam a probabilidade do alinhamento da sequência do gene quando a topologia de referência é fornecida como a hipótese nula.

A rejeição da topologia de referência é uma indicação de que a história evolutiva dessa família de genes é inconsistente com a árvore de referência. Quando essas inconsistências não podem ser explicadas usando um pequeno número de eventos não horizontais, como perda e duplicação de genes, um evento HGT é inferido.

Uma dessas análises verificou HGT em grupos de homólogos da linhagem γ-Proteobacterial [46]. Seis árvores de referência foram reconstruídas usando as sequências de RNA ribossômico de subunidades pequenas altamente conservadas, um consenso das árvores de genes disponíveis ou alinhamentos concatenados de ortólogos. A não rejeição das seis topologias avaliadas e a rejeição de sete topologias alternativas foram interpretadas como evidências para um pequeno número de eventos HGT nos grupos selecionados.

Os testes de topologia identificam diferenças na topologia da árvore levando em consideração a incerteza na inferência da árvore, mas não fazem nenhuma tentativa de inferir como as diferenças surgiram. To infer the specifics of particular events, genome spectral or subtree pruning and regraft methods are required.

Genome spectral approaches.

In order to identify the location of HGT events, genome spectral approaches decompose a gene tree into substructures (such as bipartitions or quartets) and identify those that are consistent or inconsistent with the species tree.

Removing one edge from a reference tree produces two unconnected subtrees, each containing a disjoint set of nodes—a bipartition. If a bipartition is present in both the gene and the species trees, it is compatible otherwise, it is conflicting. These conflicts can indicate an HGT event or may be the result of uncertainty in gene tree inference. To reduce uncertainty, bipartition analyses typically focus on strongly supported bipartitions such as those associated with branches with bootstrap values or posterior probabilities above certain thresholds. Any gene family found to have one or several conflicting, but strongly supported, bipartitions is considered as an HGT candidate [47,48].

Alternatively, trees can be decomposed into quartets. Quartets are trees consisting of four leaves. In bifurcating (fully resolved) trees, each internal branch induces a quartet whose leaves are either subtrees of the original tree or actual leaves of the original tree. If the topology of a quartet extracted from the reference species tree is embedded in the gene tree, the quartet is compatible with the gene tree. Conversely, incompatible strongly supported quartets indicate potential HGT events [49]. Quartet mapping methods are much more computationally efficient and naturally handle heterogeneous representation of taxa among gene families, making them a good basis for developing large-scale scans for HGT, looking for highways of gene sharing in databases of hundreds of complete genomes [50,51].

Subtree pruning and regrafting.

A mechanistic way of modelling an HGT event on the reference tree is to first cut an internal branch—i.e., prune the tree—and then regraft it onto another edge, an operation referred to as subtree pruning and regrafting (SPR) [52]. If the gene tree was topologically consistent with the original reference tree, the editing results in an inconsistency. Similarly, when the original gene tree is inconsistent with the reference tree, it is possible to obtain a consistent topology by a series of one or more prune and regraft operations applied to the reference tree. By interpreting the edit path of pruning and regrafting, HGT candidate nodes can be flagged and the host and donor genomes inferred [48,53]. To avoid reporting false positive HGT events due to uncertain gene tree topologies, the optimal "path" of SPR operations can be chosen among multiple possible combinations by considering the branch support in the gene tree. Weakly supported gene tree edges can be ignored a priori [54], or the support can be used to compute an optimality criterion [55,56].

Because conversion of one tree to another by a minimum number of SPR operations is NP-Hard [57], solving the problem becomes considerably more difficult as more nodes are considered. The computational challenge lies in finding the optimal edit path, i.e., the one that requires the fewest steps [58,59], and different strategies are used in solving the problem. For example, the HorizStory algorithm reduces the problem by first eliminating the consistent nodes [60] recursive pruning and regrafting reconciles the reference tree with the gene tree and optimal edits are interpreted as HGT events. The SPR methods included in the supertree reconstruction package SPRSupertrees substantially decrease the time of the search for the optimal set of SPR operations by considering multiple localised subproblems in large trees through a clustering approach [61].

Model-based reconciliation methods.

Reconciliation of gene and species trees entails mapping evolutionary events onto gene trees in a way that makes them concordant with the species tree, given a mechanistic model. Different reconciliation models exist, differing in the types of event they consider to explain the incongruences between gene and species tree topologies. Early methods exclusively modelled horizontal transfers (T) [52,55]. More recent ones also account for duplication (D), loss (L), incomplete lineage sorting (ILS), or homologous recombination (HR) events. The difficulty is that by allowing for multiple types of events, the number of possible reconciliations increases rapidly. For instance, conflicting gene tree topologies might be explained in terms of a single HGT event or multiple duplication and loss events. Both alternatives can be considered plausible reconciliation depending on the frequency of these respective events along the species tree.

Reconciliation methods can rely on a parsimonious or a probabilistic framework to infer the most likely scenario(s), where the relative cost and probability of D, T, and L events can be fixed a priori or estimated from the data [62]. The space of DTL reconciliations and their parsimony costs—which can be extremely vast for large multicopy gene family trees—can be efficiently explored through dynamic programming algorithms [63–65]. In some programs, the gene tree topology can be refined where it was uncertain to fit a better evolutionary scenario as well as the initial sequence alignment [63,66,67]. More refined models account for the biased frequency of HGT between closely related lineages [68], reflecting the loss of efficiency of HR with phylogenetic distance [69], for ILS [70], or for the fact that the actual donor of most HGT belong to extinct or unsampled lineages [71]. Further extensions of DTL models are being developed towards an integrated description of the genome evolution processes. In particular, some of them consider horizontal transfer at multiple scales—modelling independent evolution of gene fragments [72] or recognising coevolution of several genes (e.g., due to cotransfer) within and across genomes [73].

Implicit phylogenetic methods

In contrast to explicit phylogenetic methods, which compare the agreement between gene and species trees, implicit phylogenetic methods compare evolutionary distances or sequence similarity. Here, an unexpectedly short or long distance from a given reference compared to the average can be suggestive of an HGT event (see Fig 1). Because tree construction is not required, implicit approaches tend to be simpler and faster than explicit methods.

However, implicit methods can be limited by disparities between the underlying correct phylogeny and the evolutionary distances considered. For instance, the most similar sequence as obtained by the highest-scoring BLAST hit is not always the evolutionarily closest one [74].

Top sequence match in a distant species.

A simple way of identifying HGT events is by looking for high-scoring sequence matches in distantly related species. For example, an analysis of the top BLAST hits of protein sequences in the bacteria Thermotoga maritima revealed that most hits were in archaea rather than closely-related bacteria, suggesting extensive HGT between the two [37] these predictions were later supported by an analysis of the structural features of the DNA molecule [17].

However, this method is limited to detecting relatively recent HGT events. Indeed, if the HGT occurred in the common ancestor of two or more species included in the database, the closest hit will reside within that clade, and therefore the HGT will not be detected by the method. Thus, the threshold of the minimum number of foreign top BLAST hits to observe to decide a gene was transferred is highly dependent on the taxonomic coverage of sequence databases. Therefore, experimental settings may need to be defined in an ad-hoc way [75].

Discrepancy between gene and species distances.

The molecular clock hypothesis posits that homologous genes evolve at an approximately constant rate across different species [76]. If one only considers homologous genes related through speciation events (referred to as “orthologous" genes), their underlying tree should by definition correspond to the species tree. Therefore, assuming a molecular clock, the evolutionary distance between orthologous genes should be approximately proportional to the evolutionary distances between their respective species. If a putative group of orthologs contains xenologs (pairs of genes related through an HGT), the proportionality of evolutionary distances may only hold among the orthologs, not the xenologs [77].

Simple approaches compare the distribution of similarity scores of particular sequences and their orthologous counterparts in other species HGT are inferred from outliers [78,79]. The more sophisticated DLIGHT (Distance Likelihood-based Inference of Genes Horizontally Transferred) method considers simultaneously the effect of HGT on all sequences within groups of putative orthologs [7]: if a likelihood-ratio test of the HGT hypothesis versus a hypothesis of no HGT is significant, a putative HGT event is inferred. In addition, the method allows inference of potential donor and recipient species and provides an estimation of the time since the HGT event.

Phylogenetic profiles.

A group of orthologous or homologous genes can be analysed in terms of the presence or absence of group members in the reference genomes such patterns are called phylogenetic profiles [80]. To find HGT events, phylogenetic profiles are scanned for an unusual distribution of genes. Isolated occurrence of a gene, i.e., absence of a homolog in other members of a group of closely related species is an indication that the examined gene might have arrived via an HGT event. For example, the three facultatively symbiotic Frankia spp. strains are of strikingly different sizes: 5.43 Mbp, 7.50 Mbp, and 9.04 Mbp, depending on their range of hosts [81]. Marked portions of strain-specific genes were found to have no significant hit in the reference database and were possibly acquired by HGT transfers from other bacteria. Similarly, three phenotypically diverse Escherichia coli strains (uropathogenic, enterohemorrhagic, and benign) shared about 40% of the total combined gene pool, with the other 60% being strain-specific genes and, consequently, HGT candidates [82]. Further evidence for these genes resulting from HGT was their strikingly different codon usage patterns from the core genes and a lack of gene order conservation (order conservation is typical of vertically-evolved genes) [82]. The presence and absence of homologs (or their effective count) can thus be used by programs to reconstruct the most likely evolutionary scenario along the species tree. Just as with reconciliation methods, this can be achieved through parsimonious [83] or probabilistic estimation of the number of gain and loss events [84,85]. Models can be complexified by adding processes, like the truncation of genes [86], but also by modelling the heterogeneity of rates of gain and loss across lineages [87] and/or gene families [85,88].

Clusters of polymorphic sites.

Genes are commonly regarded as the basic units transferred through an HGT event. However, it is also possible for HGT to occur within genes. For example, it has been shown that horizontal transfer between closely related species results in more exchange of ORF fragments [89,90], a type a transfer called gene conversion, mediated by homologous recombination. The analysis of a group of four E. coli e dois Shigella flexneri strains revealed that the sequence stretches common to all six strains contain polymorphic sites, consequences of homologous recombination [91]. Clusters of excess of polymorphic sites can thus be used to detect tracks of DNA recombined with a distant relative [92]. This method of detection is, however, restricted to the sites in common with all analysed sequences, limiting the analysis to a group of closely related organisms.


Sensing Environmental Conditions and Host Cell Physiology

Repressor Inactivation Mediated by the SOS Response

Similarly to the temperate bacteriophage lambda, ICEs contain integrases and excisionases for integration and excision (int/xis in Figure 1B). In SXT, an ICE of Vibrio cholerae, a repressor protein with similarity to the lambda CI repressor, SetR, maintains the OFF status of the integrated conjugative element. The repressor can be inactivated by RecA mediated autocleavage through DNA damaging agents which induce the SOS response. Repressor inactivation is followed by expression of SetC and SetD which act as activators of int/xis e tra genes (Beaber et al., 2004). The low transfer frequency observed for SXT transfer and repressor inactivation is presumably maintained by a subpopulation of cells that inherently express SOS genes (McCool et al., 2004), specific inducers of this system, however, are unknown.

Activation by Specific Nutrients and Quorum Sensing

Agrobacteria harboring Ti plasmids are not only capable of transforming plant cells by T-DNA transfer but also contain a specific set of DNA transfer genes for conjugation. Tra genes are not transcribed unless a specific transcriptional activator, TraR is expressed. Em primeiro lugar, traR transcription is dependent on opines, amino sugars specifically produced by transformed plant tumor cells. Opines can be taken up and used as nutrients only by agrobacteria harboring the Ti plasmid. Opines, specifically nopalines, inactivate a Ti plasmid encoded repressor (AccR) that controls several genes on the Ti plasmid. Among the genes controlled by AccR is the gene for the transcriptional activator TraR. Secondly, TraR acts as a receptor for𠅊nd is additionally activated by𠅊n N-acyl-L-homoserine lactone (AHL) quorum signaling molecule. A positive feedback loop is constituted by the fact that production of AHL by TraI is also under the control of TraR. As a consequence, Ti plasmid encoded tra genes are only turned ON inside crown galls (where opines are produced by plant cells) at high cell densities (reviewed in White and Winans, 2007). In the Ti plasmid system, induction of tra genes is therefore dependent on signal molecule mediated repressor inactivation and activator production, which, once initiated, is enhanced by a positive feedback loop (provided by AHL synthesis), presumably resulting in a burst of tra gene expression in individual cells harboring the Ti plasmid. The system can be turned OFF by anti-activators (TraM and TrlR under the control of TraR—negative feedback loop) and may be modulated by lactonases that can specifically hydrolyze the AHL molecule in response to plant signals (Haudecoeur and Faure, 2010). Besides the Ti plasmid and two chromosomes, Agrobacterium tumefaciens C58 also harbors another large conjugative plasmid, pAT. Interestingly, conjugation genes of pAT are activated by opines but are independent of AHL (Lang et al., 2013).

Activator Escape and Environmental Cues in F-Like Plasmids

Notwithstanding the lack of obvious signaling molecules involved in F-conjugation module mediated DNA transfer, sensing environmental conditions in combination with the physiological status of the potential donor cell affects the behavior of the cell through a network of regulatory elements (for a detailed description see Frost and Koraimann, 2010). CPs with F-like conjugation modules are mainly found in the Enterobacteriaceae including pathogenic Escherichia, Salmonella, e Klebsiella espécies. Typically, the plasmid encoded transcriptional activator of tra genes, TraJ, is under the negative control of two fertility inhibition elements, FinO and FinP. While FinP is a small regulatory RNA that is produced as a countertranscript to the translation initiation region of the TraJ mRNA, FinO is an RNA chaperone that is required for efficient suppression of TraJ expression (Arthur et al., 2003). In populations of donor cells—under optimal conditions promoting growth and cell division—only in few cells (1� out of 1000 potential donor cells) TraJ escapes this negative FinOP mediated control and promotes transcription of tra genes together with the host encoded transcriptional activator ArcA-P (Strohmaier et al., 1998 Frost and Koraimann, 2010 Wagner et al., 2013). Once initiated, a positive feedback-loop leads to a burst of tra gene expression which ensures the transformation into a transfer competent cell (Dempsey, 1989 Pölzleitner et al., 1997). Similarly to other conjugation systems described in this review, a negative feedback-loop exists that mediates shut-off of tra gene expression via the DNA binding protein TraY which has an activating role at low concentrations but can inhibit tra gene expression at higher concentrations. Other factors that contribute to the shut-off of tra gene transcription or modulate and fine tune this system are extracellular and cellular stress response elements, including the CpxAR two component system, proteases, and the chaperone protein GroEL (Zahrl et al., 2006, 2007 Lau-Wong et al., 2008).


Introdução

Horizontal gene transfer mediated by conjugative plasmids and integrative conjugative elements (ICEs) is a major cause of the rapid spread of bacterial antibiotic resistance [1]. The process starts with a “mating” stage, which depends on contact through sexual pili or cell–cell aggregation proteins followed via a type IV secretion system [2]. Importantly, expression of these conjugation determinants bears a significant fitness cost, reducing the host’s growth rate, implying the existence of a trade-off between the horizontal and vertical modes of plasmid transfer [3]. Indeed, across gram-negative and gram-positive bacteria, plasmid donor populations are generally in a constitutive “off-state,” and only after induction by environmental factors or signaling molecules is conjugation activated [4]. Also, a general feature of these systems is that only a few members of the population activate the response [4]. This property suggests that antibiotic-resistant plasmids and ICEs naturally maintain a high proportion of vertical rather than horizontal transfer. On an evolutionary timescale, under constant low availability of plasmid recipients, plasmid variants with lower conjugation rates are expected to gain a fitness advantage by increasing their vertical inheritance through host proliferation. Contrary to that, evolution is expected to favor plasmid variants with increased conjugation rates under conditions of constant high recipient availability [5]. Therefore, the optimal effort that a plasmid invests on horizontal spread depends principally on the social environment under which conjugation control evolved. However, the primary population parameters determining the potential donor–recipient encounter rates, i.e., the densities of donors and recipients, can vary dynamically at faster timescales through growth, dilution, and migration processes. Intuitively, then, plasmid variants able to dynamically monitor mating likelihood and regulate conjugation effort accordingly could evolve.

Antibiotic-resistant plasmids from Enterococcus faecalis are a major threat to public health [6] because of the efficiency of their pheromone-sensitive conjugation systems [7] and the multiplicity of resistances they can transfer, including those against the last-line antibiotic vancomycin [8]. Plasmids from E. faecalis exhibit the capacity to sense recipient densities [9]. In the pCF10 plasmid and its family members, this mate sensing is achieved with unidirectional signaling based on conserved peptide import–export systems [10–13]. This system is also no exception in terms of the cellular cost of conjugation, given the strong protein expression up-regulation that ensues. Indeed, efficient cell–cell aggregation in this system relies on the high abundance of the aggregation substance from pCF10 (Asc10) protein [14,15], as well as on the expression of >20 pheromone-regulated genes, including the ATP-dependent type IV conjugation machinery [16,17]. Donor populations exposed to a given level of inducer also have the capacity to sort into responding and nonresponding cells—in this case, through a pheromone-dependent bistable switch at the transcriptional level [18].

From an evolutionary perspective, sensing the presence of mates through selection for specificity (Fig 1A, compare left and center panels) is straightforward to interpret because it avoids unproductive donor–donor interactions. Intriguingly, however, in the E. faecalis system, two antagonistic plasmid-encoded, pheromone-sensing systems control conjugation. These integrate information about the presence of potential plasmid recipients (mate-sensing) and about plasmid donors (self-sensing) (Fig 1A, right [16]). Such integration is antagonistic, with recipient-produced cCF10 and donor-produced iCF10 pheromones causing activation and repression of conjugation functions, respectively (Fig 1A, right). Such repressive self-sensing could effectively prevent self-aggregation and unproductive homophilic interactions at high donor densities, in which donor-produced leaky cCF10 (Fig 1A) could accumulate to significant levels. Self-sensing is mediated by basal production of iCF10 during the growth of uninduced donors. This pheromone is essential for keeping the conjugation pathway inactive in donor populations, even if leaky cCF10 accumulates due to growth, as shown by saturated constitutive pathway expression in plasmids carrying a nonfunctional version of iCF10 [19]. We rationalized that the combination of self-sensing and mate sensing could serve another function—namely, conferring to donor cells the capacity to perceive mate availability (ratio sensing) rather than mate concentration only (quorum sensing, [20]). This could enable cells to respond specifically to the population composition (Fig 1B). Intuitively, growth in liquid may increase the rate of accumulation of both cCF10 and iCF10 (Fig 1B, right), but the effects produced by each could balance each other out, producing a response that remains insensitive to fluctuations in the degree of cellular crowding.

(A) Possible topological structures of pheromone sensing in pCF10. Plasmids that perceive cCF10 pheromone (blue balls) from either donors or recipients (left) and consequently activate the pathway in proportion to the total population density (QS) are less efficient at mating than variants that minimize the production of endogenous cCF10 (center, MS). The present-day topological structure involves the presence of an antagonistic extracellular pheromone (iCF10, right). Pheromones cCF10 (blue balls) and iCF10 (red triangles) accumulate in proportion to recipients and donors, respectively. (B) The population parameter disentanglement capabilities of pCF10 might provide a function of iCF10 [D] (left), [R] (center), and [R+D] (right) are sensed differently by each one of the signaling schemes. Contrary to QS and MS, only the RS (green) scheme can distinguish specifically meaningful changes in recipient availability from simple fluctuations in crowding. (C) The mating system of E. faecalis. The pCF10 plasmid in donor cells encodes “mating” (preconjugative) functions involved in self-incompatibility (red), which allows avoidance of nonproductive donor–donor interactions in at least three ways. First, by Sec10 (encoded by prgA) activity, which minimizes interactions of the neighboring cell-wall–associated aggregation substance (Asc10, coded by the prgB gene) with LTA in the cell walls of other donors (not shown) by steric hindrance [21] and keeps those interactions specific for the LTA in recipients (shown). Second, by prgY, which restricts production of the cCF10 pheromone (blue) [22], a secreted product of the normal processing of a protein encoded by the ccfA gene, encoded in the genome which serves as the main cue used for activation. Finally, by secreting the iCF10 pheromone, which antagonizes the effect of cCF10 at the signal integration level (yellow) through competitive binding to the PrgX transcription factor. PrgZ is responsible for pheromone binding along with internalization by the native Opp system (gray) [10,11]. In this study, the pathway’s response was quantified by measuring Asc10-dependent phenotypes, such as adherence to surfaces and sexual aggregate formation, and by monitoring the expression of a GFP reporter cotranscribed with the prgB gene [23]. The reporter’s RBS (white box on transcript) is identical to that of prgB. Functions further downstream of prgB (including the conjugation machinery) are not shown. ccfA, cCF10 pheromone gene [D], donor concentration GFP, green fluorescent protein LTA, lipoteichoic acid MS, mate sensing Opp, oligopeptide permease Prg, pheromone responding gene [R], recipient concentration RBS, ribosome binding site [R+D], total population concentration RS, ratio sensing QS, quorum sensing Sec10, surface exclusion from pCF10.

Here, we demonstrate that density-robust ratiometric control over horizontal plasmid transfer allows antibiotic-resistant Enterococcus plasmid donors to estimate the conjugation likelihood in a cost-effective manner, maximizing their fitness. We further suggest that this mechanism robustly stabilizes the population composition in the long term in the face of variation in resource availability.


Transferência horizontal de genes

The second edition of Transferência horizontal de genes has been organized to provide a concise and up-to-date coverage of the most important discoveries in this fascinating field. Written by the most prominent gene transfer and genome analytical scientists, this book details experimental evidence for the phenomenon of horizontal gene transfer and discusses further evidence provided by the recent completion of genomic sequences from Archea, Bacteria, and Eucarya members. The relevance of horizontal gene transfer to plant and metazoan taxonomy, GM foods, antibiotic resistance, paleontology, and phylogenetic reconstruction is also explored. Transferência horizontal de genes is essential for microbiologists, geneticists, biochemists, evolutionary biologists, infectious disease specialists, paleontologists, ecologists, and researchers working in plant/animal systematics and agriculture with an interest in gene transfer. This includes scientific researchers from government and industry concerned with the release of genetically modified organisms.

The second edition of Transferência horizontal de genes has been organized to provide a concise and up-to-date coverage of the most important discoveries in this fascinating field. Written by the most prominent gene transfer and genome analytical scientists, this book details experimental evidence for the phenomenon of horizontal gene transfer and discusses further evidence provided by the recent completion of genomic sequences from Archea, Bacteria, and Eucarya members. The relevance of horizontal gene transfer to plant and metazoan taxonomy, GM foods, antibiotic resistance, paleontology, and phylogenetic reconstruction is also explored. Transferência horizontal de genes is essential for microbiologists, geneticists, biochemists, evolutionary biologists, infectious disease specialists, paleontologists, ecologists, and researchers working in plant/animal systematics and agriculture with an interest in gene transfer. This includes scientific researchers from government and industry concerned with the release of genetically modified organisms.


4. What is LUCA?

The LUCA is a moot point in that it is a theoretical construct designed to explain the origin of especially the Bacteria and Archaea domains, collectively called prokaryotes. It is believed that LUCA existed at the time that these two domains became separate entities in their own right. From this it can be surmised that LUCA may have been a complex and almost fully formed living entity which probably even had DNA as a repository for information, as has been shown by various comparative genomic studies. More to the point, Prof. John Allen (Queen Mary, University of London—see summary report) proposed: what does the word “last” in “last universal common ancestor” signify? There are two lines of thought on this question, ou seja, whether LUCA means the ancestor of all things alive on Earth today. or of all things that have ever lived on Earth. In the case of latter supposition it is suggested that, perhaps, its correct title should be the 𠇏irst universal common ancestor”. Such reasoning raises another question: what came before LUCA? Since RNA acts both as a repository of information and as a catalyst, perhaps there were evolving entities made purely from RNAs. So, what was the nature of LUCA? Some theoretical biologists think that LUCA was only one of several designs for early life, from which a single entity capable of evolving into prokaryotes arose. Others have questioned its existence altogether that is, some scientists maintain that there may not even have been such an entity as the LUCA at all, and that it should no longer be considered as a relevant part of evolutionary theory—this view being the central tenet of the “metabolism first hypothesis” as opposed to the “genes first hypothesis”.

However a middle ground is held by those scientists who believe that the LUCA was not a single entity, but a consortium of many “LUCA-like” entities (as was proposed by Prof. Armen Mulkidjanian—see summary report). Use of the term “LUCA-like” is deliberate because although similar to the single entity, the components of such a consortium would not have been individually 𠇌omplete”—sort of proto-LUCAs, as it were. In order for these entities to move up to the next level and form a complete LUCA, they would have had to exchange genes with each other and therefore exist in close proximity, which could have been encased within “semi-permeable” bubbles of clay on the sea floor and/or floating about in small pools of water, where their concentration would have been sufficiently high enough for interaction. This would have facilitated exchange of genetic material (ou seja, através da HGT). On the balance of probability and based on the evidence derived from the mechanisms used in HGT (see below), I believe it is more than likely that there was a sort of “united nations of LUCAs” in operation at the time.

The explanatory evolutionary tool of LUCA does not, however, explain the presence of viruses, in particular RNA ones. There is evidence to suggest that some viruses arose independently from an RNA-world without the intervention of LUCA and are, thus, not directly connected with the emergence of either Bacteria or Archaea. In this respect some scientists working in the RNA-world hypothesis and comparative genomic studies believe that the word 𠇌ommon” in the acronym LUCA be replaced with �llular”, as it is not in common to viruses. However, it should still be noted that there were extensive exchanges of MGEs between RNA viruses and the LUCA with evolving cellular genomes.


Considerações finais

Our belief is that to understand how virulence mechanisms such as biofilm formation are established, we need to understand social dilemmas raised by microbial interactions. To achieve the above-mentioned goal, it is essential that we gain a better understanding of the molecular mechanisms involved. HGT and MGEs, such as plasmids, are at the very heart of this. In this review, we have argued that the interconnectedness between biofilm formation and plasmid biology may act as a positive loop that promotes both. The perspective extends to an overall interconnectedness between HGT, MGE and social evolution of bacteria.


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