Em formação

O que faz com que as bandas de eletroforese em gel de DNA girem?


Recentemente, apliquei um gel em um novo sistema e saí com algo que nunca tinha visto antes.

Carreguei os três primeiros poços com uma escada no primeiro e um plasmídeo não cortado nos dois seguintes. Não há bandas, apenas espirais por todo o gel.

É um gel de 10 cm, 0,7%, e passei a 80 v por 1,5 horas. Parte do novo sistema é o buffer, borato de lítio, com o qual nunca trabalhei antes.

Alguma idéia de por que isso está acontecendo?

Edit: obrigado por suas respostas. Segui de perto o protocolo regular e usei o mesmo frasco de tampão para fazer e executar o gel. Eu fiz isso duas vezes e obtive resultados semelhantes nas duas vezes.

Testei a fonte de alimentação e descobri que a tensão pode ter oscilado entre 77 e 83 volts durante a operação. Isso poderia ter causado isso?


Pode ser um de dois problemas:

  1. Ou o gel mal preparado, na medida em que foi resfriado por muito tempo, resultando em partes que solidificaram antes de despejá-lo no molde.

  2. Isso eu já vi antes, o pH do tampão de eletroforese e o tampão usado para fazer o gel não eram os mesmos. Deve ser o mesmo em todo o gel para garantir que o DNA se mova uniformemente para o eletrodo positivo.

Você talvez tenha uma imagem de gel do bio-transiluminador? Isso poderia fornecer mais informações.

Espero que isto ajude


Parece que o gel não foi preparado de maneira adequada e não tem uma textura homogênea como deveria, o que afeta seus poros e impede a passagem da amostra (portanto, ausência de bandas).


O potencial elétrico (voltagem) deve ser aplicado igualmente em todo o gel. Isso não deve fazer com que o DNA funcione de maneira irregular. Na eletroforese em gel, as forças elétricas afetam todas as moléculas de DNA (carregadas negativamente) e o fluxo na mesma direção.

O que causa diferenças em seu fluxo é o resistência à difusão ou fluxo de moléculas de DNA pelo gel. Moléculas maiores são mais propensas a colidir com a matriz polimérica e, portanto, se moverão mais através do gel lentamente. Se você tiver DNA preparado em tamanhos variados, eles devem formar bandas bem definidas. Existem vários parâmetros que você pode otimizar, dependendo dos tamanhos das bandas que deseja distinguir:

  • concentração do gel: um gel mais denso irá desacelerar mais as moléculas de DNA e é útil para evitar que moléculas menores escapem do final do gel

  • tempo ou voltagem: moléculas menores rodando em um gel mais denso levarão mais tempo para se separar, então você pode precisar ajustar o tempo de corrida ou voltagem de acordo.

É possível que o gel ou o DNA de entrada não tenham sido preparados corretamente. Um gel precisa ser misturado e derramado enquanto ainda está líquido (antes de esfriar) para garantir que o polímero se forme uniformemente. No entanto, a ausência de um controle positivo ou escada de DNA mesmo nos poços mostra que o DNA não está presente neste gel: ele escorreu em qualquer uma das extremidades do gel. Portanto:

  • o DNA correu por todo o gel: foi executado por muito tempo ou o polímero não era um concentrado alto o suficiente. Prepare um gel com uma concentração mais alta ou execute-o por menos tempo.

  • o DNA funcionou de maneira errada: verifique se os eletrodos foram conectados na orientação correta (negativo nos poços e positivo na outra extremidade). Devem ser codificados por cores (geralmente vermelho e preto).


Este é um método comumente usado para separar fragmentos de DNA e RNA por tamanho. Os ácidos nucléicos são carregados negativamente, portanto, com a ajuda de uma corrente elétrica, os fragmentos de ácido nucléico migram mais rápido ou mais devagar pela matriz do gel, dependendo de seu tamanho.

Curiosidade: o brometo de etídio migra para o outro lado.

Tampão TBE ou TAE

A função do buffer é fornecer os íons para transportar a corrente e fazer com que as moléculas de ácido nucléico migrem.

O tampão tris-borato é melhor para resolver fragmentos de DNA menores de até 2kb em géis de agarose. O TAE, por outro lado, é melhor para resolver fragmentos de DNA maiores. Tudo isso é descrito aqui. A vantagem adicional de usar o buffer TAE é que você pode fazer uma solução de estoque maior e ela durará por mais tempo. TAE também é mais barato.

Supondo que você não seja o único no laboratório executando géis, sugiro que você consiga um garrafão para armazenar o buffer. Além disso, é possível reutilizar o buffer de corrida, então pode fazer sentido pegar outro garrafão para o buffer de execução usado.

Brometo de etídio ou outra coisa?

Até cerca de um ano atrás, eu estava usando apenas brometo de etídio. Mas muito esforço foi feito para encontrar alternativas que sejam menos prejudiciais para as pessoas. No último ano, usei Midori Green em vez de EthBr. Embora eu não tenha feito uma comparação direta entre os dois, o Midori Green parece funcionar bem.

A matriz de gel atua como uma malha, através da qual moléculas de ácido nucléico maiores migram mais lentamente do que as menores.

Não tenho uma marca que prefira. A agarose normal, destinada à biologia molecular e eletroforese em gel de ácido nucléico, deve funcionar.

Câmaras de gel

Entre as empresas que fabricam sistemas de gel, Bio Rad e Thermo Fisher são duas das marcas comuns. A BioRad também fabrica boas fontes de alimentação e sistemas de documentação de gel.

A imagem mostra todos os elementos necessários de uma câmara de gel.

Existem algumas coisas a considerar, antes de decidir sobre uma câmara de gel.

Isso determinaria o tamanho do tanque de gel a ser usado.

Dependendo do volume da amostra que você deseja carregar no gel, você deve criar o tamanho dos poços de acordo. Isso determinaria o tamanho do pente. Além disso, em relação à espessura do pente, quanto mais fino o pente, melhor será a resolução da faixa.

Preparando o gel

  • Primeiro você precisa decidir qual a porcentagem de gel (p / v) que você precisa. Quanto menores as moléculas de ácido nucléico, maior deve ser a porcentagem de gel. Para fragmentos entre 300pb e 3kb, eu prepararia um gel a 1% (1g de Agarose em 100ml de tampão). Qualquer coisa abaixo de 300 bp requer pelo menos um gel de 2%. Acima de 3kb, você pode baixar para géis de 0,8%. Eu não iria mais baixo que isso, porque aí fica difícil manusear o gel.
  • Depois de decidir, pese a agarose e transfira o pó para um recipiente de vidro (geralmente um frasco erlenmeyer). O volume do frasco deve ser 5 vezes o volume do gel que você deseja preparar. Em um recipiente menor, o gel provavelmente iria derramar, quando aquecido no micro-ondas.
  • Adicione a quantidade correta de buffer. Não aqueça o tampão antes de adicionar a agarose, caso contrário, o pó se aglutinará e não se dissolverá.
  • Tenha cuidado ao manusear o líquido. Sempre use luvas e um protetor de mão quente ao manusear o recipiente. Mesmo que não pareça que a solução seja & # 8220bubbling & # 8221 quando você tira o frasco do microondas. Agite o frasco suavemente.
  • Após a fervura, a mistura tampão-agarose deve ser límpida / homogênea.
  • Esfrie o gel antes de porá-lo. Isso é necessário porque os corantes usados ​​para rotular o DNA não são resistentes ao calor e, além disso, as bandejas de gel desenvolvem rachaduras se o gel ficar muito quente. Para resfriar, coloco o frasco em água fria corrente, certificando-se de que não entre água no frasco. Quando atingir cerca de 60˚C, prossiga para a próxima etapa.
  • Adicione a quantidade apropriada de corante de ácido nucléico.
  • Pore ​​o gel no recipiente. Evite criar bolhas. Mas se houver bolhas basta movê-las, com a ponta de uma pipeta, para a lateral ou para o fundo do gel, onde não interfiram no escoamento do gel.
  • Deixe o gel solidificar.
  • Adicione o tampão até cobrir a superfície do gel.
  • Adicione o corante de carregamento às suas amostras (eu prefiro OrangeG) o gel.
  • Feche a tampa. Certifique-se de que os cabos estejam conectados corretamente.
  • Execute o gel. Normalmente, eu apenas altero a tensão e e mantenho o ampere constante. A voltagem depende do tamanho do gel e é difícil de descrever. Se a tensão for muito alta, o buffer aquece e pode potencialmente derreter o gel.

As bolhas subindo do cátodo e do ânodo são um indicador de que o gel está funcionando.

A imagem do gel acima mostra amostras de RNA de reações de transcrição. Eu queria ver o quão eficiente foi a reação e se o RNA está degradado.

Se você quiser determinar o tamanho de seus fragmentos de RNA, terá que realizar um gel desnaturante e usar uma escada de RNA específica.

Thermo Fisher compilou um guia de solução de problemas para eletroforese de ácido nucléico.


Conteúdo

Um ensaio de mudança de mobilidade é a separação eletroforética de uma mistura de proteína-DNA ou proteína-RNA em um gel de poliacrilamida ou agarose por um curto período (cerca de 1,5-2 horas para um gel de 15 a 20 cm). [4] A velocidade com que diferentes moléculas (e combinações das mesmas) se movem através do gel é determinada por seu tamanho e carga e, em menor grau, por sua forma (ver eletroforese em gel). A faixa de controle (sonda de DNA sem proteína presente) conterá uma única banda correspondente ao DNA não ligado ou fragmento de RNA. No entanto, assumindo que a proteína é capaz de se ligar ao fragmento, a faixa com uma proteína que se liga presente conterá outra banda que representa o complexo maior e menos móvel da sonda de ácido nucleico ligada à proteína que é "deslocada" para cima no gel (uma vez que se moveu mais lentamente).

Sob as condições experimentais corretas, a interação entre o DNA (ou RNA) e a proteína é estabilizada e a proporção de ácido nucleico ligado a não ligado no gel reflete a fração de moléculas de sonda livres e ligadas conforme a reação de ligação entra no gel. Esta estabilidade é em parte devido a um "efeito de enjaulamento", em que a proteína, rodeada pela matriz de gel, é incapaz de se difundir para longe da sonda antes de se recombinar. [5] Se as concentrações iniciais de proteína e sonda forem conhecidas, e se a estequiometria do complexo for conhecida, a afinidade aparente da proteína para a sequência de ácido nucleico pode ser determinada. [6] A menos que o complexo tenha uma vida muito longa em condições de gel, ou a dissociação durante a eletroforese seja levada em consideração, o número derivado é um Kd aparente. Se a concentração da proteína não for conhecida, mas a estequiometria complexa, a concentração da proteína pode ser determinada aumentando a concentração da sonda de DNA até que incrementos adicionais não aumentem a fração da proteína ligada. Por comparação com um conjunto de diluições padrão de sonda livre executada no mesmo gel, o número de moles de proteína pode ser calculado. [4]

Um anticorpo que reconhece a proteína pode ser adicionado a esta mistura para criar um complexo ainda maior com uma mudança maior. Este método é conhecido como ensaio supershift, e é usado para identificar inequivocamente uma proteína presente no complexo proteína-ácido nucleico.

Freqüentemente, uma pista extra é executada com um oligonucleotídeo competidor para determinar a sequência de ligação mais favorável para a proteína de ligação. O uso de diferentes oligonucleotídeos de sequência definida permite a identificação do local de ligação preciso por competição (não mostrado no diagrama). Variantes do ensaio de competição são úteis para medir a especificidade da ligação e para medir a cinética de associação e dissociação. Assim, o EMSA também pode ser usado como parte de um experimento SELEX para selecionar oligonucleotídeos que realmente se ligam a uma determinada proteína. [ citação necessária ]

Uma vez que a ligação DNA-proteína é determinada em vitro, uma série de algoritmos pode restringir a busca pela identificação do fator de transcrição. Os oligonucleotídeos da sequência de consenso para o fator de transcrição de interesse serão capazes de competir pela ligação, eliminando a banda deslocada, e devem ser confirmados por supershift. Se a sequência de consenso prevista falhar em competir pela ligação, a identificação do fator de transcrição pode ser auxiliada pelo Concorrente Multiplexado EMSA (MC-EMSA), em que grandes conjuntos de sequências de consenso são multiplexadas em cada reação, e onde um conjunto compete pela ligação, o sequências de consenso individuais deste conjunto são executadas em uma reação adicional. [7]

Para fins de visualização, o fragmento de ácido nucleico é geralmente marcado com um marcador radioativo, fluorescente ou de biotina. A coloração com brometo de etídio padrão é menos sensível do que esses métodos e pode não ter sensibilidade para detectar o ácido nucleico se pequenas quantidades de ácido nucleico ou ácido (s) nucleico (s) de fita simples forem usadas nesses experimentos. Ao usar um marcador de biotina, estreptavidina conjugada a uma enzima, como peroxidase de rábano, é usada para detectar o fragmento de DNA. [8] [9] Embora a marcação isotópica de DNA tenha pouco ou nenhum efeito sobre a afinidade de ligação à proteína, o uso de marcadores não isotópicos, incluindo flurophores ou biotina, pode alterar a afinidade e / ou estequiometria da interação da proteína de interesse. A competição entre a sonda marcada com fluoróforo ou biotina e o DNA não marcado da mesma sequência pode ser usada para determinar se o marcador altera a afinidade de ligação ou estequiometria.


O que é usado para cortar a amostra de DNA antes da eletroforese em gel?

Saiba também, o que é usado para cortar o DNA em fragmentos de diferentes tamanhos para preparar as amostras de DNA antes de realizar a eletroforese? o DNA é cortado por um tipo de enzima chamada enzima de restrição. As enzimas de restrição ocorrem naturalmente no células bacterianas como linha de defesa, semelhante ao nosso sistema imunológico. As enzimas são muito específicas: cada uma reconhecerá apenas um determinado local sobre uma DNA molécula e cortarno esse site.

por que a amostra de DNA deve ser separada por eletroforese em gel?

Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar DNA fragmentos de acordo com seu tamanho. DNA os fragmentos são carregados negativamente, então eles se movem em direção ao eletrodo positivo. Porque tudo DNA fragmentos têm a mesma quantidade de carga por massa, pequenos fragmentos se movem através do gel mais rápido do que os grandes.

Qual é a finalidade do tampão TAE na eletroforese em gel?

Buffer TAE é adicionado para manter o pH da solução de DNA neutro. A eletrólise pode levar à eletrólise das moléculas de água e, portanto, à liberação de íons H +. Esses íons H + podem interagir com o DNA carregado negativamente, neutralizando-o e, portanto, parando eletroforese movimento do DNA.


Dica 3: Escolhendo o buffer de execução ideal para eletroforese

Você deve usar o buffer de execução TAE ou TBE?

  • Fragmentos mais longos são melhor resolvidos quando o buffer TAE é usado (geralmente para fragmentos & gt1 kb)
  • Compatível com reações enzimáticas
  • Recomendado para eletroforese em gel preparativo

Figura 3. Seleção do buffer de funcionamento ideal. Fragmentos de ácido nucleico de fita dupla linear migram aproximadamente 10% mais devagar no tampão TBE.


O que é eletroforese em gel

Este último capítulo de introdução apresentará a eletroforese em gel, um método para separar amostras de fragmentos de DNA por seu tamanho.

o gel (1) é uma substância gelatinosa feita de agarose, um polímero de açúcar extraído de algas marinhas. O gel é imerso em uma solução tampão e possui eletrodos (2 / 3) em ambos os lados, criando um campo elétrico. O gel é fundido com pequenas bolsas próximas ao eletrodo negativo. Estes são chamados poços (4). As amostras, contendo pedaços de DNA de diferentes tamanhos de pares de bases, são pipetadas para os poços.

Em um nível molecular, o gel não é sólido, mas contém muitos pequenos poros. Como a molécula de DNA tem carga negativa, devido à sua estrutura química, quando uma voltagem é aplicada, os fragmentos de DNA são puxados em direção ao eletrodo positivo. A velocidade com que os fragmentos de DNA viajam através do gel depende de seu tamanho: pedaços pequenos viajam rapidamente, pedaços grandes viajam lentamente. Depois de algum tempo, os fragmentos de DNA foram separados e seu tamanho pode ser analisado. Dependendo das amostras utilizadas, o tamanho do fragmento pode fornecer informações sobre sua informação genética.

O gel pode ser infundido com uma coloração de DNA, que se ligará às amostras. Usando o transiluminador, as amostras podem então ser fluorescentes, de modo que se tornem visíveis. Uma imagem típica de gel se parece com a imagem acima. De cada poço, os fragmentos de DNA viajaram em seu faixa foram separados por seu tamanho. Na pista da esquerda, um Escada de DNA foi usado. Trata-se de uma mistura de DNA sintético com fragmentos de tamanhos conhecidos, que serve de régua para as amostras.

The Gel Box & # 8211 A Closer Look

A caixa de gel contém várias peças:

A tampa laranja (1) sela a caixa de gel quando a voltagem é aplicada e também funciona como um filtro para o transiluminador, para tornar o DNA fluorescente visível. A base (2) é usado para lançar e aplicar o gel. Tem o eletrodo positivo vermelho e o negativo preto. Cada um dos eletrodos é feito de um fio fino de platina.

Tenha cuidado ao tocar os eletrodos, pois o fio de platina é muito fino e frágil. Tome cuidado ao limpar a caixa de gel ou ao remover os eletrodos para evitar quebrar o fio.

Duas barragens de borracha são usadas para criar zonas tampão ao redor dos eletrodos durante a moldagem do gel (3). Existem também pentes para criar géis de 9 e 12 poços (4).

Solução de buffer

Tanto para criar o gel quanto para executá-lo, é necessária uma solução tampão. O Biotechnology 101 Kit usa tampão TBE. Mas antes de usá-lo, deve ser diluído na concentração certa.

Você precisará de um recipiente alvo para o tampão TBE 0,5X diluído (1), o concentrado TBE 10X fornecido pelo kit (2), e água destilada ou desionizada (3), que você pode comprar online ou em uma farmácia.

O tampão fornecido é de 50 mL de 10X TBE. Você precisará diluí-lo para uma concentração de 0,5X, já que todos os experimentos no Kit Biotechnology 101 usam tampão TBE 0,5X. Para isso, você precisará de um frasco no qual possa armazenar o tampão. Você pode comprar uma garrafa de vidro de laboratório (1) ou você pode usar uma garrafa de plástico limpa (2). O volume precisa ser um litro.

Para diluir o tampão TBE, você precisará usar água destilada ou desionizada.

É melhor não usar água da torneira para diluir o TBE, pois a água da torneira contém muitas impurezas e minerais, que irão interferir com o tampão. Água destilada e desionizada estão disponíveis online, na Amazon ou em farmácias. Se você não puder obter água destilada ou desionizada, recomendamos água potável filtrada engarrafada em vez de água da torneira.

Despeje o tampão TBE 10X em seu recipiente. Adicione água destilada ou desionizada até a marca de 1L. A nova solução tampão é agora 0,5X TBE, pois você diluiu 50mL de concentração de 10X para um volume de 1L. Identifique seu tampão diluído com tampão TBE 0,5X e guarde-o em um local fresco e escuro. Você precisará dele para os projetos do Kit 101 de Biotecnologia.

O que é buffer?

Na eletroforese em gel, o tampão fornece íons que carregam uma corrente através do gel e mantêm um pH constante. Há uma variedade de buffers, e um dos mais comuns para separação de DNA é o buffer TBE. O tampão TBE é uma solução tampão contendo uma mistura de base Tris, ácido bórico e EDTA. O ácido bórico e a base Tris ajudam o DNA a se manter solúvel em água. O EDTA protege o DNA contra enzimas degrada o DNA.

Como calcular as concentrações

Você pode planejar diluições calculando a quantidade desconhecida usando a fórmula C1V1 = C2V2, onde:
Concentração 1 * Volume 1 = Concentração 2 * Volume 2

Por exemplo, estamos começando com:
C1 (10X)
V1 (0,05L)
C2 (0,5X)
V2 =?
(10X) (0,05L) = (0,5X) (1L)

Misturando o gel

Depois de criar sua solução tampão TBE 0,5X, você está pronto para misturar seu primeiro gel. Você criará um gel de agarose a 1%.

Freqüentemente, a agarose é fornecida na forma de pó, que você precisa pesar exatamente para criar o gel certo. Mas a agarose no Biotechnology 101 Kit é fornecida na forma de comprimido, então eles já são medidos com exatidão.

1%refere-se à porcentagem de agarose no volume de líquido. A percentagem de gel é calculada como (gramas de agarose / mililitros de tampão) x 100%. Neste gel, estamos misturando 0,5g com 50mL, então o cálculo é 0,5g / 50 mL x 100%, o que nos dá um gel de 1%.

A porcentagem padrão de agarose para um gel é geralmente cerca de 1%. A porcentagem de agarose apropriada depende do tamanho dos fragmentos de DNA que você espera separar. A porcentagem de agarose determina o quão bem o DNA se separa e a resolução do gel final.

Para fazer o gel, você estará dissolvendo um comprimido de agarose (2) no tampão TBE 0,5X (3), Você pode usar o copo de vidro (1) que vem com o Kit 101 de biotecnologia.

Sempre use luvas ao trabalhar com géis. Isso ocorre porque eles geralmente são manchados com uma mancha de DNA, que pode ser tóxica. Embora a mancha fornecida no Biotechnology 101 Kit seja considerada segura, você deve sempre usar luvas ao manusear a mancha ou géis manchados.
Neste protocolo de introdução, você não irá manchar o gel, então as luvas não são necessárias. Mas ainda é uma boa ideia se acostumar a lidar apenas com géis com luvas.

Coloque dois comprimidos de agarose no béquer e, em seguida, preencha com tampão TBE 0,5X até a marca de 50 mL. Espere que a agarose se dissolva. Isso pode demorar alguns minutos. Agite os comprimidos parcialmente dissolvidos no tampão ocasionalmente.

Preparando a caixa de gel para fundição

Nesta etapa, você configurará a caixa de gel para moldar o gel.

Primeiro, abra a caixa de gel.
Certifique-se de que as barreiras de proteção pretas estejam instaladas corretamente e, em seguida, instale o pente de 9 poços.

Aquecimento da solução de gel no microondas

Certifique-se de que os comprimidos de agarose foram totalmente dissolvidos no tampão. Isso pode demorar alguns minutos.

Depois de dissolvidos, aqueça a solução em um micro-ondas na potência máxima por curtos intervalos de 20-30 segundos.

Evite aquecer a solução de gel por muito tempo, ou a água em seu buffer começará a evaporar. Recomendamos que você aqueça em rajadas curtas, pare quando vir bolhas aparecendo e agite a solução. Se você ferver a solução demais, vai acabar com um gel de agarose de maior porcentagem com uma alta concentração iônica.

Após cada explosão de micro-ondas, pegue o nosso copo e agite a solução. Assim que as bolhas começarem a aparecer, a agarose deve ter se dissolvido. Se você ainda vir pedaços ou fios de agarose visivelmente sólidos, continue até que eles se dissolvam.

Tenha cuidado ao manusear o copo, pois ele pode ficar muito quente. Segure o copo pela borda enquanto o retira do microondas. Toque indiretamente com um pano ou luvas.

Derramando o gel

Nesse ponto, você normalmente adicionaria a coloração de DNA que se ligará ao DNA e o tornará fluorescente. No entanto, nesta primeira introdução, isso não é necessário.

Assim que a agarose estiver totalmente derretida e dissolvida, deixe esfriar até cerca de 55 ° C & # 8211 e deve estar quente, mas não muito quente para ser tocada.

Evite derramar agarose acima de 70 ° C, pois isso levará ao empenamento da caixa de gel e do pente.

Quando a agarose estiver na temperatura certa, despeje-a lentamente na caixa de gel até que 5mm marca. Despeje lentamente para evitar mexer no pente ou derrubá-lo. Se o pente se mover, coloque-o de volta no lugar.

O gel demorará cerca de 30 minutos a solidificar à temperatura ambiente. Para acelerar o processo, você também pode colocar a bandeja de gel na geladeira.

Certifique-se de que a caixa de gel está em uma superfície nivelada até que o gel solidifique. Caso contrário, a espessura do gel não será consistente.

Removendo o pente e barragens de buffer

Assim que o gel solidificar, remova o pente e as barragens do tampão.

Tenha cuidado para não danificar o gel ao remover o pente e as barreiras. Ao remover o pente, certifique-se de não furar o gel.

Tampão de Gel

Nesta etapa, você terminará de configurar o gel adicionando o tampão.

Use a solução tampão TBE 0,5X preparada novamente e despeje-a sobre o gel até que esteja totalmente coberto. O tampão deve atingir cerca de 2-3 mm acima do gel.

Carregando o gel

O gel agora está pronto para carregar.

Para este exercício, você precisará dos corantes do Eletroforese em Gel bolsa dentro do Kits de lançamento Bolsa (1). Estas serão as amostras que você carregará nos poços do gel (2), usando a micropipeta (3).

Carregar amostras em um poço de gel é uma das habilidades de pipetagem mais complicadas que você precisa dominar.

Se você não usou a micropipeta recentemente, dê uma olhada nos materiais do capítulo Introdução à pipetagem.

Se você estiver trabalhando em uma superfície brilhante, os poços do gel podem ser difíceis de detectar. Coloque a bandeja de gel em uma superfície mais escura para aumentar o contraste e ver os poços com mais clareza. O pente também pode ser usado para isso.

Existem nove poços no gel, então você pode carregar cada corante três vezes.

Defina sua pipeta para 20μl. Coloque uma ponta na micropipeta. Você pode usar a mesma ponta para todas as amostras & # 8211, não há necessidade de alterar a ponta.
Desenhe 20μl de um dos corantes da amostra.
Insira lentamente um poço do gel com a ponta da pipeta. Tome cuidado para não perfurar o gel na parte inferior.
Assim que a ponta da pipeta estiver localizada no poço, expulse o corante. Deve afundar e permanecer no poço.
Em seguida, mova lentamente a ponta da pipeta para fora do poço, tomando cuidado para não perturbar a amostra que acabou de depositar no poço.
Certifique-se de não puxar o tampão para a ponta da pipeta acidentalmente e só libere o botão de pipetagem quando a ponta estiver fora do gel.

Para facilitar a pipetagem no poço, coloque os dois cotovelos sobre a mesa. Você também pode apoiar a pipeta com a segunda mão e usá-la para ajudar a guiar a ponta para dentro do poço.

Executando o gel

Depois de carregar todos os poços, você pode aplicar o gel. Para isso, você precisará do seu Bento Lab.

Primeiro, deslize a tampa da caixa de gel.

Agora conecte-o à fonte de alimentação do Laboratório Bento.

Ao mover a caixa de gel, tenha cuidado para não derramar tampão.

No Bento Lab, selecione o módulo de Eletroforese em Gel.

Defina a tensão para 50V (1), em seguida, defina um cronômetro (2) para 40 min (3), e comece a correr (4). O LED entre a saída de energia vermelha e preta no Bento Lab acenderá e bolhas aparecerão ao redor dos eletrodos, indicando eletrólise.

Resultados

Depois que o gel correr, você pode desligar o Bento Lab e desconectar a caixa de gel.

Deslize a tampa laranja para que você possa ver claramente os resultados da eletroforese. A tampa laranja terá alguma condensação.

Você pode jogar fora o buffer. É seguro descartar na pia.

Qual é a aparência do gel? Dependendo de qual corante foi carregado em cada poço, cada pista terá uma cor em uma posição diferente.

Os corantes têm diferentes pesos moleculares e tamanhos, o que se reflete em suas diferentes posições no gel.
Fragmentos moleculares menores viajam rapidamente através do gel e, portanto, estão mais distantes.
Fragmentos moleculares maiores só podem viajar lentamente através do gel e, portanto, estão mais no topo.

O mesmo princípio se aplica a fragmentos de DNA e, portanto, sua posição relativa no gel indica o comprimento da sequência.

Visualização

Quando você executa amostras reais de DNA no gel, como você fará nos experimentos baseados em projeto deste kit, agora você pode visualizar o gel usando o transiluminador do Laboratório Bento.

No entanto, como o foco dessa atividade era moldar e carregar o gel, e as amostras que você estava executando continham apenas corante, não DNA, você não verá nenhuma fluorescência.

Para usar o transiluminador em experimentos posteriores, você colocará a bandeja de gel na superfície azul do transiluminador do Laboratório de Bento.

Na interface, você pode alterar a luz clicando no lâmpada elétrica botão (1).

Para uma visibilidade ideal, isso deve ser feito em uma sala escura. Através da tampa laranja, você poderá ver as bandas de DNA fluorescentes em suas posições no gel. Você pode segurar a tampa laranja sobre a lente da câmera do seu telefone para tirar uma foto e documentar os resultados do seu experimento.

Usar o transiluminador em uma sala escura fornecerá os melhores resultados, mas também é possível ver os resultados à luz do dia. Quanto menos luz atingir a caixa de gel, melhor. Então, se não for possível fechar as cortinas e reduzir a luz em seu quarto, você pode ser criativo para bloquear a luz. Por exemplo, você pode usar um pedaço de papelão preto ou uma jaqueta para bloquear a luz.

Você também pode remover o gel da bandeja e colocá-lo diretamente na superfície do transiluminador do Bento Lab para uma transiluminação ligeiramente melhorada. Se você fizer isso, certifique-se de usar luvas. Seja gentil com o gel para evitar quebrá-lo ao fazer isso.

Limpar

Assim que terminar e documentar seu resultado tirando uma foto, você pode descartar o gel no lixo. Não toque diretamente, mas use luvas.

Se você tocar o gel com a mão acidentalmente, lave as mãos com água imediatamente. No entanto, a mancha fornecida por este kit é segura para manusear.

Se você colocou o gel diretamente na superfície do transiluminador do Bento Lab, limpe-o com um pano seco.


Como a eletroforese em gel se relaciona com a impressão digital do DNA?

Eletroforese em gel é o processo pelo qual pegamos o DNA e aplicamos uma carga elétrica nele; portanto, podemos usá-lo para comparar duas amostras de DNA, daí o nome DNA fingerprinting.

Explicação:

Eletroforese em gel é basicamente o processo pelo qual pegamos o DNA e aplicamos uma carga elétrica nele. O DNA, sendo carregado negativamente por padrão, se moverá para o lado positivo. Quando isso acontecer, o DNA com densidade mais baixa percorrerá menos distâncias. Isso pode criar um padrão único de DNA.

Agora você pode fazer isso com outra amostra de DNA e combiná-la com as frequências da amostra conhecida. Se forem iguais, provavelmente são da mesma origem. Isso é chamado Impressão digital de DNA. Isso é usado principalmente na investigação de crime, onde o DNA encontrado em cenas de crime é comparado ao DNA de suspeitos.


RESULTADOS

Após o isolamento, C. elegans o DNA genômico é analisado por eletroforese em gel de agarose para avaliar a pureza, integridade e concentração do DNA (Fig. 2). O DNA genômico nessas amostras é bastante puro no que diz respeito à presença de RNA, apenas uma pequena quantidade de RNA degradado é visível próximo ao fundo do gel na maioria das pistas. Em algumas preparações, quantidades significativas de contaminação de RNA são visíveis como um esfregaço intenso normalmente executado abaixo do marcador BstEII de 702 pb λ (dados não mostrados). O DNA genômico é visível em todas as pistas como uma banda moderadamente nítida que migra para aproximadamente a mesma posição do DNA λ não cortado, indicando que tem um tamanho maior ou igual a ∼50-kb. A compactação das bandas de DNA genômico indica que o DNA não está degradado. O DNA degradado aparece como uma mancha que segue para as regiões de baixo peso molecular do gel. A concentração do DNA genômico é estimada pela comparação visual das intensidades das bandas do DNA genômico com as intensidades de massas conhecidas de DNA λ não cortado. Por exemplo, a banda presente em 8 μl de DNA genômico N2 (Fig. 2, pista 6) é comparável em intensidade à banda presente na banda de DNA 100-ng λ (Fig. 2, pista 2) Portanto, ∼100 ng de N2 DNA estão contidos em 8 μl, produzindo uma estimativa de concentração de 12,5 ng / μl. As preparações de DNA genômico normalmente têm concentrações na faixa de 12–25 ng / μl para um rendimento total de 3–6 μg de DNA. Finalmente, esta análise também permite a avaliação da técnica de pipetagem do aluno. Um aumento progressivo na intensidade da banda deve ser observado com o aumento da massa de λ DNA e aumento do volume de DNA genômico.

Duas regiões diferentes do unc-93 gene são amplificados a partir do DNA genômico do tipo selvagem e unc-93 cepas mutantes (Fig. 1) e produtos de PCR são analisados ​​por eletroforese em gel de agarose (Fig. 3). Os produtos de PCR esperados são visíveis como as bandas mais intensas em cada pista. Alguns produtos de amplificação não específicos são visíveis, especialmente nas amplificações da região B. Observamos consistentemente mais amplificação inespecífica da região B do que da região A (compare pistas 710 com pistas 25 na Fig. 3) a razão para isso não é conhecida. Todas as pistas contêm uma banda difusa de baixo peso molecular que é presumivelmente dímeros de primer. As expected, PCRs from which genomic DNA was omitted do not contain amplification products, indicating that the bands are products of amplification from the indicated genomic DNA and not from contamination of the reagents used in the PCRs. Deletions are clearly visible in region A for LU55 (Fig. 3, lane 5) and in region B for LU57 (Fig. 3, lane 8) and LU133 (Fig. 3, lane 9) when compared with the wild-type amplification products (Fig. 3, lanes 2 e 7) Molecular weight analysis confirms that the PCR products and deletions match the predicted sizes and locations (Table I). We obtain similar results using the combined lysis/PCR protocol (data not shown).


PART II: Paternity Case: Who is the Father of My Kittens?

Mary has a white cat named &ldquoHoney&rdquo who was lost for two days about three months ago. She now has four kittens (photo 1) and Mary wants to know if the two neighboring cats, &ldquoTom&rdquo or &ldquoButch,&rdquo could be the father of each kitten. To analyze their DNA fingerprint, Mary has collected hair follicles from each adult cat and kitten, extracted DNA, and amplified DNA using the polymerase chain reaction.

Hipótese

Using the photo, complete table 1 with your prediction of the father of each kitten.


How Does Gel Electrophoresis Separate DNA Fragments

During Agarose gel electrophoresis, the DNA samples are mixed with the loading dye and are loaded on the wells of the agarose gel. The loading buffer contains tracking dyes that visualize the movement of the DNA sample on the gel. Then, an electric field is applied to both ends of the gel. The DNA sample migrates toward the positive electrode. The speed of migration on the electric field depends on the size of the DNA fragment. DNA molecules with a large number of base pairs migrate slowly while molecules with fewer base pairs migrate quickly through the gel. Therefore, gel electrophoresis allows the separation of DNA fragments based on their size. This produces a series of DNA fragments with sizes in the descending order. The relationship between the distance of migration and the size of the DNA fragment is shown in Figura 2.

Figure 2: Relationship Between the Distance Migrated and the Size of the DNA Fragment

The agarose gel contains equal-sized pores through which the DNA fragments migrate. Therefore, small DNA fragments migrate quickly through the pore but, large DNA fragments take some time to migrate through them. After running a considerable distance, the agarose gel is visualized under UV. Since the agarose gel is added with a DNA staining substances under UV called ethidium bromide, DNA fragments are entangled with the stain, enabling the visualization. For the determination of the size of the DNA fragment, the samples are run along with a ladder that contains a series of DNA fragments with known size.

Conclusão

Gel electrophoresis is a technique used to separate DNA, RNA or protein molecules based on their size and charge. Agarose gel electrophoresis is the widely-used technique for the separation of DNA based on the size of the molecule. During the migration of DNA molecules through the pores of the agarose gel, they are separated based on the size.

Referência:

1. “Gel electrophoresis.” Khan Academy, Disponivel aqui.

Cortesia de imagem:

1. “DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis” By Rainis Venta – Own work (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. “Gel Electrophoresis” By Mckenzielower – Own work (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia

Sobre o autor: Lakna

Lakna, graduada em Biologia Molecular e Bioquímica, é Bióloga Molecular e tem um grande e intenso interesse na descoberta de coisas relacionadas à natureza


Assista o vídeo: Eletroforese horizontal de DNA em gel de agarose (Novembro 2021).