Em formação

QPCR (curva ntc estranha, amplifica antes dos modelos e atinge o platô rapidamente)


Sou novo em qPCR e tenho testado a expressão de AR em tecidos caninos. No momento, estou usando um par de primers que foram testados em outro artigo para caninos. O problema que estou tendo é que tenho uma amplificação muito precoce do AR ntc (antes da amplificação dos modelos de cDNA), mas também esta curva de amplificação parece estranha uma vez que atinge rapidamente a fase de platô (achatada). Este problema persistiu mesmo depois de mudar para um ciclo muito mais específico. Se alguém tiver alguma dica ou ideia de como posso explicar isso, ficarei muito grato.


A causa do sinal no controle sem modelo será a contaminação. Pode ser que a razão para as diferentes posições de platô seja a presença de inibidores de reação, depleção de reagentes ou, possivelmente, diferentes eficiências de ligação entre o molde (e DNA contaminante) e os iniciadores. Não tenho certeza sobre esse último, mas meio que faz sentido na minha cabeça: qualquer DNA contaminante que se liga aos primers provavelmente não se ligará tão eficientemente quanto o modelo para o qual os primers foram projetados, então a reação é inibida por acúmulo de dsDNA mais rápido.

De qualquer forma, a causa será uma contaminação excessiva. Tente usar mais modelos em suas amostras (aumentando a relação sinal / ruído) ou seja mais cuidadoso ao preparar suas amostras.

Existem medidas extraordinárias que podem ser tomadas para remover o DNA contaminante (por exemplo, tratar a água com DNase e, em seguida, desativá-lo), mas muitas vezes não são necessárias e as etapas adicionadas podem realmente aumentar a contaminação, geralmente é melhor mantê-lo simples.


Assista o vídeo: Parou De Emagrecer? Como QUEBRAR o Efeito Platô! (Novembro 2021).