Em formação

5.0: Microrganismos Eucarióticos Unicelulares - Biologia


objetivos de aprendizado

  • Resuma as características gerais dos parasitas eucarióticos unicelulares
  • Descrever os ciclos de vida gerais e modos de reprodução em parasitas eucarióticos unicelulares
  • Identifique os desafios associados à classificação de eucariotos unicelulares
  • Explique o esquema taxonômico usado para eucariotos unicelulares
  • Dê exemplos de infecções causadas por eucariotos unicelulares

parte 1

Ao chegar da escola, Sarah, de 7 anos, reclama que uma grande mancha em seu braço não para de coçar. Ela continua coçando, chamando a atenção de seus pais. Olhando mais de perto, eles vêem que é um ponto circular vermelho com uma borda vermelha elevada (Figura ( PageIndex {1} )). No dia seguinte, os pais de Sarah a levam ao médico, que examina o local usando uma lâmpada de Wood. Uma lâmpada de Wood produz luz ultravioleta que faz com que o ponto no braço de Sarah fique fluorescente, o que confirma o que o médico já suspeitava: Sarah tem um caso de micose.

A mãe de Sarah fica mortificada ao saber que sua filha tem um "verme". Como isso pôde acontecer?

Exercício ( PageIndex {1} )

Quais são algumas das formas prováveis ​​de Sarah ter contraído a micose?

Os micróbios eucarióticos são um grupo extraordinariamente diverso, incluindo espécies com uma ampla gama de ciclos de vida, especializações morfológicas e necessidades nutricionais. Embora mais doenças sejam causadas por vírus e bactérias do que por eucariotos microscópicos, esses eucariotos são responsáveis ​​por algumas doenças de grande importância para a saúde pública. Por exemplo, a doença protozoária malária foi responsável por 584.000 mortes em todo o mundo (principalmente crianças na África) em 2013, de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS). O parasita protista Giardia causa uma doença diarreica (giardíase) que é facilmente transmitida por meio de fontes de água contaminada. Nos Estados Unidos, Giardia é o parasita intestinal humano mais comum (Figura ( PageIndex {2} )). Embora possa parecer surpreendente, os vermes parasitas estão incluídos no estudo da microbiologia porque a identificação depende da observação microscópica de vermes adultos ou ovos. Mesmo em países desenvolvidos, esses vermes são parasitas importantes de humanos e de animais domésticos. Existem menos patógenos fúngicos, mas essas também são causas importantes de doenças. Por outro lado, os fungos têm sido importantes na produção de substâncias antimicrobianas como a penicilina. Neste capítulo, examinaremos as características de protistas, vermes e fungos, ao mesmo tempo em que consideramos seus papéis em causar doenças.

Características dos Protistas

A palavra protista é um termo histórico que agora é usado informalmente para se referir a um grupo diverso de organismos eucarióticos microscópicos. Não é considerado um termo taxonômico formal porque os organismos que descreve não têm uma origem evolutiva compartilhada. Historicamente, os protistas foram agrupados informalmente em protozoários “semelhantes a animais”, as algas “semelhantes a plantas” e os protistas “semelhantes a fungos”, como os moldes de água. Esses três grupos de protistas diferem muito em termos de suas características básicas. Por exemplo, as algas são organismos fotossintéticos que podem ser unicelulares ou multicelulares. Os protozoários, por outro lado, são organismos não fotossintéticos, móveis, sempre unicelulares. Outros termos informais também podem ser usados ​​para descrever vários grupos de protistas. Por exemplo, os microrganismos que flutuam ou flutuam na água, movidos por correntes, são chamados de plâncton. Os tipos de plâncton incluem zooplâncton, que são móveis e não fotossintéticos, e fitoplâncton, que são fotossintéticos.

Os protozoários habitam uma grande variedade de habitats, tanto aquáticos quanto terrestres. Muitos vivem livremente, enquanto outros são parasitas, realizando um ciclo de vida dentro de um hospedeiro ou hospedeiros e potencialmente causando doenças. Existem também simbiontes benéficos que fornecem serviços metabólicos aos seus hospedeiros. Durante a fase de alimentação e crescimento de seu ciclo de vida, eles são chamados de trofozoítas; estes se alimentam de pequenas fontes de alimentos particulados, como bactérias. Embora alguns tipos de protozoários existam exclusivamente na forma de trofozoíto, outros podem se desenvolver de um trofozoíto a um estágio de cisto encapsulado quando as condições ambientais são muito severas para o trofozoíto. Um cisto é uma célula com uma parede protetora e o processo pelo qual um trofozoíto se torna um cisto é chamado de encistamento. Quando as condições se tornam mais favoráveis, esses cistos são acionados por sinais ambientais para se tornarem ativos novamente por meio de excistamento.

Um gênero de protozoário capaz de encistamento é Eimeria, que inclui alguns patógenos humanos e animais. A Figura ( PageIndex {3} ) ilustra o ciclo de vida de Eimeria.

Os protozoários têm uma variedade de mecanismos reprodutivos. Alguns protozoários se reproduzem assexuadamente e outros se reproduzem sexualmente; ainda outros são capazes de reprodução sexuada e assexuada. Em protozoários, a reprodução assexuada ocorre por fissão binária, brotamento ou esquizogonia. Na esquizogonia, o núcleo de uma célula se divide várias vezes antes de a célula se dividir em muitas células menores. Os produtos da esquizogonia são chamados de merozoítos e são armazenados em estruturas conhecidas como esquizontes. Os protozoários também podem se reproduzir sexualmente, o que aumenta a diversidade genética e pode levar a ciclos de vida complexos. Os protozoários podem produzir gametas haplóides que se fundem por meio da singamia. No entanto, eles também podem trocar material genético unindo-se para trocar DNA em um processo chamado conjugação. Este é um processo diferente da conjugação que ocorre nas bactérias. O termo conjugação protista refere-se a uma forma verdadeira de reprodução sexual eucariótica entre duas células de diferentes tipos de acasalamento. É encontrado em ciliadoss, um grupo de protozoários, e é descrito posteriormente nesta subseção.

Todos os protozoários possuem uma membrana plasmática, ou plasmalema, e alguns possuem bandas de proteínas logo no interior da membrana que adicionam rigidez, formando uma estrutura chamada película. Alguns protistas, incluindo protozoários, têm camadas distintas de citoplasma sob a membrana. Nesses protistas, a camada externa de gel (com microfilamentos de actina) é chamada de ectoplasma. Dentro desta camada está uma região sol (fluido) do citoplasma chamada endoplasma. Essas estruturas contribuem para formas celulares complexas em alguns protozoários, enquanto outros (como as amebas) têm formas mais flexíveis (Figura ( PageIndex {4} )).

Diferentes grupos de protozoários possuem estruturas de alimentação especializadas. Eles podem ter uma estrutura especializada para a ingestão de alimentos por meio da fagocitose, chamada de citostomo, e uma estrutura especializada para a exocitose de resíduos, chamada de citoproco. As ranhuras orais que levam aos citostomos são revestidas por cílios semelhantes a fios de cabelo para absorver as partículas de alimentos. Os protozoários são heterotróficos. Os protozoários que são holozóicos ingerem partículas inteiras de alimentos por meio de fagocitose. As formas saprozóicas ingerem pequenas moléculas solúveis de alimentos.

Muitos protistas têm flagelos em forma de chicote ou cílios em forma de cabelo feitos de microtúbulos que podem ser usados ​​para locomoção (Figura ( PageIndex {4} )). Outros protistas usam extensões citoplasmáticas conhecidas como pseudópodes (“pés falsos”) para anexar a célula a uma superfície; eles então permitem que o citoplasma flua para a extensão, movendo-se para a frente.

Os protozoários têm uma variedade de organelas exclusivas e, às vezes, não possuem as organelas encontradas em outras células. Alguns têm vacúolo contrátils, organelas que podem ser usadas para mover água para fora da célula para regulação osmótica (equilíbrio de sal e água) (Figura ( PageIndex {4} )). As mitocôndrias podem estar ausentes nos parasitas ou alteradas para cinetoplastídeos (mitocôndrias modificadas) ou hidrogenossomos (consulte Características Únicas das Células Procarióticas para mais discussão sobre essas estruturas).

Exercício ( PageIndex {2} )

Qual é a sequência de eventos na reprodução por esquizogonia e como são chamadas as células produzidas?

Taxonomia de Protistas

Os protistas são um grupo polifilético, o que significa que carecem de uma origem evolutiva compartilhada. Como a taxonomia atual é baseada na história evolutiva (conforme determinado pela bioquímica, morfologia e genética), os protistas estão espalhados por muitos grupos taxonômicos diferentes dentro do domínio Eukarya. Eukarya está atualmente dividido em seis supergrupos que são divididos em subgrupos, conforme ilustrado na (Figura ( PageIndex {5} )). Nesta seção, nos preocuparemos principalmente com os supergrupos Amoebozoa, Excavata e Chromalveolata; esses supergrupos incluem muitos protozoários de importância clínica. Os supergrupos Opisthokonta e Rhizaria também incluem alguns protozoários, mas poucos de significado clínico. Além de protozoários, Opisthokonta também inclui animais e fungos, alguns dos quais discutiremos em Helmintos e Fungos Parasitas. Alguns exemplos de Archaeplastida serão discutidos em Algas. Figura ( PageIndex {6} ) e Figura ( PageIndex {7} ) resumem as características de cada supergrupo e subgrupo e relacionam os representantes de cada um.

Exercício ( PageIndex {3} )

Quais supergrupos contêm os protistas clinicamente significativos?

Amoebozoa

O supergrupo Amoebozoa inclui protozoários que usam o movimento amebóide. Os microfilamentos de actina produzem pseudópodes, para os quais flui o restante do protoplasma, movendo o organismo. O gênero Entamoebainclui espécies comensais ou parasitas, incluindo as medicamente importantes E. histolytica, que é transmitido por cistos nas fezes e é a principal causa da disenteria amebiana. A notória "ameba comedora de cérebro", Naegleria Fowleri, também é classificado dentro dos Amoebozoa. Este parasita mortal é encontrado em água doce e quente e causa meningoencefalite amebiana primária (PAM). Outro membro deste grupo é Acanthamoeba, que pode causar ceratite (inflamação da córnea) e cegueira.

Os Eumycetozoa são um grupo incomum de organismos chamados fungos viscosos, que foram previamente classificados como animais, fungos e plantas (Figura ( PageIndex {8} )). Os fungos viscosos podem ser divididos em dois tipos: fungos viscosos celulares e fungos viscosos plasmódicos. Os fungos viscosos celulares existem como células amebóides individuais que periodicamente se agregam em uma lesma móvel. O agregado então forma um corpo de frutificação que produz esporos haplóides. Os fungos viscosos plasmódicos existem como grandes células amebóides multinucleadas que formam talos reprodutivos para produzir esporos que se dividem em gametas. Um fungo viscoso celular, Dictyostelium discoideum, tem sido um organismo de estudo importante para a compreensão da diferenciação celular, porque tem estágios de vida unicelulares e multicelulares, com as células apresentando algum grau de diferenciação na forma multicelular. A Figura ( PageIndex {9} ) e a Figura ( PageIndex {10} ) ilustram os ciclos de vida dos fungos viscosos celulares e plasmodiais, respectivamente.

Chromalveolata

O supergrupo Chromalveolata é unido por origens semelhantes aos plastídeos de seus membros e inclui os apicomplexanos, ciliados, diatomáceas e dinoflagelados, entre outros grupos (vamos cobrir as diatomáceas e dinoflagelados em algas). Os apicomplexantes são parasitas intra ou extracelulares que possuem um complexo apical em uma extremidade da célula. O complexo apical é uma concentração de organelas, vacúolos e microtúbulos que permite ao parasita entrar nas células do hospedeiro (Figura ( PageIndex {11} )). Os apicomplexos têm ciclos de vida complexos que incluem um esporozoíto infeccioso que sofre esquizogonia para formar muitos merozoítos (veja o exemplo na Figura ( PageIndex {3} )). Muitos são capazes de infectar uma variedade de células animais, de insetos a gado e humanos, e seus ciclos de vida frequentemente dependem da transmissão entre vários hospedeiros. O gênero Plasmodium é um exemplo deste grupo.

Outros apicomplexos também são importantes do ponto de vista médico. Cryptosporidium parvum causa sintomas intestinais e pode causar diarreia epidêmica quando os cistos contaminam a água potável. Theileria (Babesia) microti, transmitido pelo carrapato Ixodes scapularis, causa febre recorrente que pode ser fatal e está se tornando um patógeno comum transmitido por transfusão nos Estados Unidos (Theileria e Babesia são gêneros intimamente relacionados e há algum debate sobre a melhor classificação). Finalmente, Toxoplasma gondii causa toxoplasmose e pode ser transmitida por fezes de gato, frutas e vegetais não lavados ou por carne mal cozida. Como a toxoplasmose pode estar associada a defeitos congênitos graves, as mulheres grávidas precisam estar cientes desse risco e ter cuidado se forem expostas às fezes de gatos potencialmente infectados. Uma pesquisa nacional descobriu que a frequência de indivíduos com anticorpos para toxoplasmose (e, portanto, que presumivelmente têm uma infecção latente atual) nos Estados Unidos é de 11%. As taxas são muito mais altas em outros países, incluindo alguns países desenvolvidos.1 Também há evidências e muitas teorias de que o parasita pode ser responsável por alterar o comportamento e os traços de personalidade de humanos infectados.2

Os ciliados (Ciliaphora), também dentro do Chromalveolata, são um grupo grande e muito diverso caracterizado pela presença de cílios em sua superfície celular. Embora os cílios possam ser usados ​​para locomoção, eles também são frequentemente usados ​​para alimentação, e algumas formas não são móveis. Balantidium coli (Figure ( PageIndex {12} )) é o único ciliado parasita que afeta humanos causando doenças intestinais, embora raramente cause problemas médicos graves, exceto em imunocomprometidos (aqueles com sistema imunológico enfraquecido). Talvez o ciliado mais familiar seja Paramecium, um organismo móvel com um citostômio e citoproco claramente visível que é frequentemente estudado em laboratórios de biologia (Figura ( PageIndex {13} )). Outro ciliado, Stentor, é séssil e usa seus cílios para se alimentar (Figura ( PageIndex {14} )). Geralmente, esses organismos têm um micronúcleo que é diplóide, somático e usado para reprodução sexual por conjugação. Eles também têm um macronúcleo que é derivado do micronúcleo; o macronúcleo torna-se poliplóide (múltiplos conjuntos de cromossomos duplicados) e possui um conjunto reduzido de genes metabólicos.

Os ciliados são capazes de se reproduzir por meio da conjugação, na qual duas células se ligam uma à outra. Em cada célula, os micronúcleos diplóides sofrem meiose, produzindo oito núcleos haplóides cada. Então, todos os micronúcleos haplóides e o macronúcleo, exceto um, se desintegram; o micronúcleo restante (haplóide) sofre mitose. As duas células então trocam um micronúcleo cada, que se funde com o micronúcleo restante presente para formar um novo micronúcleo diplóide geneticamente diferente. O micronúcleo diplóide sofre duas divisões mitóticas, então cada célula tem quatro micronúcleos, e dois dos quatro se combinam para formar um novo macronúcleo. Os cromossomos no macronúcleo então se replicam repetidamente, o macronúcleo atinge seu estado poliplóide e as duas células se separam. As duas células agora são geneticamente diferentes uma da outra e de suas versões anteriores.

Os oomicetos têm semelhanças com os fungos e já foram classificados com eles. Eles também são chamados de moldes de água. No entanto, eles diferem dos fungos em vários aspectos importantes. Oomicetos têm paredes celulares de celulose (ao contrário das paredes celulares quitinosas dos fungos) e são geralmente diplóides, enquanto as formas de vida dominantes dos fungos são tipicamente haplóides. Phytophthora, o patógeno de planta encontrado no solo que causou a fome da batata na Irlanda, é classificado neste grupo (Figura ( PageIndex {15} )).

Explore os procedimentos para detectar a presença de um apicomplexano em uma rede pública de abastecimento de água, neste site.

Este vídeo mostra a alimentação de Stentor.

Excavata

O terceiro e último supergrupo a ser considerado nesta seção é o Excavata, que inclui eucariotos primitivos e muitos parasitas com capacidades metabólicas limitadas. Esses organismos têm formas e estruturas celulares complexas, muitas vezes incluindo uma depressão na superfície da célula chamada de escavação. O grupo Excavata inclui os subgrupos Fornicata, Parabasalia e Euglenozoa. O Fornicata não tem mitocôndrias, mas tem flagelos. Este grupo inclui Giardia lamblia (também conhecido como G. intestinalis ou G. duodenalis), um patógeno disseminado que causa doenças diarreicas e pode se espalhar por meio de cistos de fezes que contaminam o abastecimento de água (Figura ( PageIndex {2} )). Parabasalia são endossimbiontes animais frequentes; eles vivem nas entranhas de animais como cupins e baratas. Eles têm corpos basais e mitocôndrias modificadas (cinetoplastídeos). Eles também têm uma estrutura celular grande e complexa com uma membrana ondulante e geralmente têm muitos flagelos. Os tricomonas (um subgrupo da Parabasalia) incluem patógenos como Trichomonas vaginalis, que causa a tricomoníase humana sexualmente transmissível. A tricomoníase geralmente não causa sintomas em homens, mas os homens são capazes de transmitir a infecção. Nas mulheres, causa desconforto vaginal e corrimento e pode causar complicações na gravidez se não for tratada.

Os Euglenozoa são comuns no meio ambiente e incluem espécies fotossintéticas e não fotossintéticas. Membros do gênero Euglena são tipicamente não patogênicos. Suas células têm dois flagelos, uma película, um estigma (mancha ocular) para detectar a luz e cloroplastos para fotossíntese (Figura ( PageIndex {16} )). A película de Euglena é feito de uma série de bandas de proteínas ao redor da célula; ele apóia a membrana celular e dá forma à célula.

Os Euglenozoa também incluem os tripanossomos, que são patógenos parasitas. O gênero Trypanosoma inclui T. brucei, que causa a tripanossomíase africana (doença do sono africana e T. cruzi, que causa a tripanossomíase americana (doença de Chagas). Essas doenças tropicais são disseminadas por picadas de insetos. Na doença do sono africana, T. brucei coloniza o sangue e o cérebro após ser transmitido pela picada de uma mosca tsé-tsé (Glossina spp.) (Figura ( PageIndex {17} )). Os primeiros sintomas incluem confusão, dificuldade para dormir e falta de coordenação. Se não for tratada, é fatal.

A doença de Chagas teve origem e é mais comum na América Latina. A doença é transmitida por Triatoma spp., insetos geralmente chamados de “percevejos” e afetam o tecido do coração ou do sistema digestivo. Os casos não tratados podem levar à insuficiência cardíaca ou distúrbios digestivos ou neurológicos significativos.

O gênero Leishmania inclui tripanossomos que causam doenças cutâneas desfigurantes e, às vezes, doenças sistêmicas.

parasitas negligenciados

Os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) são responsáveis ​​por identificar as prioridades de saúde pública nos Estados Unidos e desenvolver estratégias para abordar as áreas de preocupação. Como parte desse mandato, o CDC identificou oficialmente cinco doenças parasitárias que considera terem sido negligenciadas (ou seja, não estudadas de forma adequada). Essas infecções parasitárias negligenciadas (NPIs) incluem toxoplasmose, doença de Chagas, toxocaríase (uma infecção por nematóide transmitida principalmente por cães infectados), cisticercose (uma doença causada por uma infecção de tecido da tênia Taenia solium) e tricomoníase (uma doença sexualmente transmissível causada por o parabasálido Trichomonas vaginalis).

A decisão de nomear essas doenças específicas como NPIs significa que o CDC dedicará recursos para melhorar a conscientização e desenvolver melhores testes diagnósticos e tratamento por meio de estudos de dados disponíveis. O CDC também pode aconselhar sobre o tratamento dessas doenças e auxiliar na distribuição de medicamentos que, de outra forma, seriam difíceis de obter.3

Claro, o CDC não tem recursos ilimitados, portanto, ao priorizar essas cinco doenças, está efetivamente despriorizando outras. Dado que muitos americanos nunca ouviram falar de muitos desses NPIs, é justo perguntar quais critérios o CDC usou para priorizar as doenças. De acordo com o CDC, os fatores considerados foram o número de pessoas infectadas, a gravidade da doença e se a doença pode ser tratada ou evitada. Embora vários desses NPIs possam parecer mais comuns fora dos Estados Unidos, o CDC argumenta que muitos casos nos Estados Unidos provavelmente não são diagnosticados e tratados porque muito pouco se sabe sobre essas doenças.4

Que critérios devem ser considerados ao priorizar doenças para fins de financiamento ou pesquisa? Aqueles identificados pelo CDC são razoáveis? Que outros fatores podem ser considerados? As agências governamentais como o CDC devem ter os mesmos critérios que os laboratórios de pesquisa farmacêutica privados? Quais são as implicações éticas de despriorizar outras doenças parasitárias potencialmente negligenciadas, como a leishmaniose?

Conceitos-chave e resumo

  • Protistas são diversos, polifilético grupo de organismos eucarióticos.
  • Os protistas podem ser unicelulares ou multicelulares. Eles variam em como obtêm sua nutrição, morfologia, método de locomoção e modo de reprodução.
  • Estruturas importantes de protistas incluem vacúolos contráteis, cílios, flagelos, películase pseudópodes; alguns não têm organelas, como as mitocôndrias.
  • A taxonomia dos protistas está mudando rapidamente à medida que os relacionamentos são reavaliados usando técnicas mais recentes.
  • Os protistas incluem patógenos e parasitas importantes.

Múltipla escolha

Qual gênero inclui o agente causador da malária?

A. Euglena
B. Paramécium
C. Plasmodium
D. Trypanosoma

C

Qual protista é uma preocupação por causa de sua capacidade de contaminar o abastecimento de água e causar diarreia?

A. Plasmodium vivax
B. Toxoplasma gondii
C. Giardia lamblia
D. Trichomonas vaginalis

C

Preencher a lacuna

A membrana plasmática de um protista é chamada de __________.

plasmalema

Os animais pertencem ao mesmo supergrupo do reino __________.

Fungi

Resposta curta

O que são cinetoplastídeos?

Além do risco de defeitos congênitos, que outro efeito pode ter uma infecção por toxoplasmose?

Qual é a função do macronúcleo ciliado?

Pensamento crítico

O protista mostrado tem qual dos seguintes?

A. pseudopodia
B. flagelos
C. uma concha
D. cilia

(crédito: modificação da obra de Richard Robinson)

A taxonomia protista mudou muito nos últimos anos, à medida que os relacionamentos foram reexaminados usando abordagens mais recentes. Como as abordagens mais recentes diferem das abordagens mais antigas?

Que características podem fazer você pensar que um protista pode ser patogênico? Existem certas características nutricionais, métodos de locomoção ou diferenças morfológicas que podem estar associadas à capacidade de causar doenças?

Notas de rodapé

  1. 1 J. Flegr et al. “Toxoplasmose - uma ameaça global. Correlação de toxoplasmose latente com carga de doença específica em um conjunto de 88 países. ” PloS ONE 9 não. 3 (2014): e90203.
  2. 2 J. Flegr. “Effects of Toxoplasma on Human Behavior.” Touro Esquizofrenia 33, não. 3 (2007): 757–760.
  3. 3 Centros de Controle e Prevenção de Doenças. “Neglected Parasitic Infections (NPIs) in the United States.” http://www.cdc.gov/parasites/npi/. Última atualização em 10 de julho de 2014.
  4. 4 Centros de Controle e Prevenção de Doenças. “Fact Sheet: Neglected Parasitic Infections in the United States.” www.cdc.gov/parasites/resourc..._factsheet.pdf

SISTEMA CINCO REINO

Nesta lição, discutiremos a classificação de cinco reinos.

A classificação de cinco reinos é proposta por R.H.Whittaker em 1969. os reinos definidos por ele foram nomeados Monera, Protista, Fungi, Plantae e Animalia.

Nesta lição, mostramos uma breve introdução a esses reinos. Para obter mais informações sobre o reino, visite uma lição específica sobre esse reino.

Os principais critérios usados ​​para esta classificação são estrutura celular, organização do talo, modo de nutrientes, reprodução e relação filogenética. Além dessas características principais, ele também deu importância aos personagens de papéis ecológicos e modo de reprodução.

Critérios principais nos quais a classificação de cinco reinos é baseada

CritérioReino
MoneraProtistaPlantaeFungiAnimalia
Tipo de célulaProcariotaEucarióticaEucarióticaEucarióticaEucariótica
Organização celularUnicelularUnicelularMulticelularMulticelularMulticelular
Modo de nutriçãoVariablePhtotrophic / heterotrophic / chaemoautotrophicFototrófico / heterotróficoAutotrófico (fotossíntese)Heterotrófico (absorção)Heterotrófico (ingestão)
ReproduçãoAssexuadoAssexuado ou sexual sem estágio embrionárioAssexuado ou sexual com estágio embrionárioAssexuado ou sexual com esporoSexual com estágio embrionário
Papel ecológicoVariávelVariávelProdutorDecompositorConsumidor

Ele também tentou estabelecer uma relação filogênica entre vários grupos de diferentes reinos.

Segundo ele, as primeiras formas vivas (progenotas) produziram organismos procarióticos ou monerans. Monera deu origem a protistas provavelmente através da associação de vários tipos de monerans primitivos e avançados. Os protistas em andorinha-do-mar deram origem a fungos, plantas e animais.

As características e membros de cada um dos cinco reinos são brevemente discutidos:


O que você aprenderá:

Uma célula eucariótica típica tem um núcleo ligado à membrana, citoesqueleto, organelas ligadas à membrana, como o retículo endoplasmático, aparelho de Golgi, lisossomas, cloroplastos e mitocôndrias além da membrana plasmática, citoplasma e ribossomos.

Membrana de plasma: Os eucariotos têm uma membrana plasmática de bicamada baseada em fosfolipídios que possui proteínas periféricas, integrais e de transporte embutidas nela. Ele abriga o citoplasma e todas as outras organelas delimitadas por membrana dentro dele. Uma mistura de esteróis também constitui a membrana devido à qual as membranas eucarióticas têm uma fluidez considerável.

Ribossomos: Eles são o local da síntese de proteínas em uma célula e podem estar livres no citoplasma ou ligados à membrana de uma organela. Enquanto os ribossomos procarióticos têm tamanho 70S, os eucariotos têm um ribossomo 80S com subunidades 60S e 40S.

Citoesqueleto: O citoesqueleto é uma matriz de fibras e tubos que fornecem suporte estrutural à célula e auxiliam na movimentação de organismos unicelulares. Microfilamentos, filamentos intermediários e microtúbulos constituem o citoesqueleto nas células eucarióticas.


Taxonomia de Protistas

Os protistas são um polifilético grupo, o que significa que eles não têm uma origem evolutiva compartilhada. Como a taxonomia atual é baseada na história evolutiva (conforme determinado pela bioquímica, morfologia e genética), os protistas estão espalhados por muitos grupos taxonômicos diferentes dentro do domínio Eukarya. Eukarya está atualmente dividido em seis supergrupos que são subdivididos em subgrupos, conforme ilustrado na (Figura 5). Nesta seção, nos preocuparemos principalmente com os supergrupos Amoebozoa, Excavata, e Chromalveolata esses supergrupos incluem muitos protozoários de importância clínica. Os supergrupos Opisthokonta e Rhizaria também incluem alguns protozoários, mas poucos de significado clínico. Além de protozoários, Opisthokonta também inclui animais e fungos, alguns dos quais discutiremos em Helmintos e Fungos Parasitas. Alguns exemplos de Archaeplastida serão discutidos em Algas. A Figura 6 e a Figura 7 resumem as características de cada supergrupo e subgrupo e relacionam os representantes de cada um.

Figura 5. Esta árvore mostra uma classificação proposta do domínio Eukarya com base nas relações evolutivas. Atualmente, o domínio Eukarya está dividido em seis supergrupos. Dentro de cada supergrupo existem vários reinos. As linhas pontilhadas indicam relações evolutivas sugeridas que permanecem em debate.

Componentes de células eucarióticas

UMA célula eucariótica é uma célula que tem um núcleo ligado à membrana e outros compartimentos ou sacos ligados à membrana, chamados organelas, que têm funções especializadas. Animais, plantas e fungos são todos eucariotos. A palavra eucariótico significa "kernel verdadeiro" ou "núcleo verdadeiro", aludindo à presença do núcleo ligado à membrana nessas células. A palavra “organela” significa “pequeno órgão” e, como já foi mencionado, as organelas têm funções celulares especializadas, assim como os órgãos do corpo têm funções especializadas. As células eucarióticas são maiores e mais complexas do que as células procarióticas. Além disso, os organismos eucarióticos podem ser multicelulares, enquanto todos os procariotos são unicelulares.


Métodos

Tensão

A cepa axênica (AX2) de Dictyostelium discoideum foi generosamente oferecido por Peter Devreotes na Universidade Johns Hopkins. Esta coloração foi usada como material principal para experimentos de RNA-seq, ChIP-seq e ATAC-seq. A outra cepa axênica (AX4) e a srfA mutante knock out foi obtido de Dicty Stock Center. Nós cultivamos a cepa a 22 ° C agitada na incubadora a 180 rpm em meio HL5 com 300 μg / ml de estreptomicina.

Anticorpos

Os anticorpos usados ​​para imunoprecipitação de cromatina histona e western blots foram: coelho anti-H3 (Abcam Ab1791), coelho anti-H3K27ac (Abcam Ab4729), coelho anti-H3K4me3 (Abcam Ab8580), coelho anti-H3K9me3 (Abcam Ab8898), coelho anti- H3K27me3 (Abcam Ab6002), anti-H3K36me3 de coelho (Abcam Ab 9050) e anti-H3K4me1 de coelho (Abcam Ab8895). Esses anticorpos têm demonstrado especificidade em eucariotos [53,54,55,56,57,58,59].

Espectrometria de massa quantitativa

Derivatização química de histona e preparação de peptídeo para espectrometria de massa

As histonas foram propioniladas conforme descrito anteriormente [60]. Resumidamente, as proteínas foram diluídas com acetonitrila e neutralizadas com hidróxido de amônio. A derivatização química das lisinas foi realizada duas vezes com anidrido propiônico, as proteínas foram digeridas com tripsina e, em seguida, duas rodadas adicionais de derivatização foram realizadas. Os peptídeos propionilados foram dessalinizados usando um protocolo MCX (cartucho Oasis MCX 1 cc / 30 mg LP, Waters Corporation).

Orbitrap cromatografia líquida-espectrometria de massa

Os peptídeos foram analisados ​​com um Thermo Dionex UPLC acoplado a um espectrômetro de massa em tandem Thermo Q-Exactive HF. Usamos uma coluna puxada interna criada a partir de capilares de sílica fundida de 75 μm de diâmetro interno empacotados com esferas ReproSil-Pur C18 de 3 μm (Dr. Maisch) a 30 cm. O solvente A foi 0,1% de ácido fórmico em água, enquanto o solvente B foi 0,1% de ácido fórmico em 80% de acetonitrila. Para cada injeção, carregamos aproximadamente 1 μg de peptídeos e os separamos usando um gradiente de 47 min de 2 a 35% B, seguido por um gradiente de lavagem de 13 min.

Para a análise de aquisição dependente de dados (DDA), um método dos 20 principais foi usado (estado de carga padrão 2, alvo AGC mínimo 5e4, exclusão de carga 1 e & gt 6 e exclusão dinâmica 4 s) com MS completo (resolução 120.000 AGC 3e6, IT máximo 50 ms) e MS2 dependente de dados (resolução 15.000 AGC 1e6, IT máx. 40 ms, janela de isolamento 2,0 m / z, NCE 27)).

Para análise de aquisição independente de dados (DIA), o Thermo Q-Exactive HF foi configurado para adquirir espectros DIA de janela de isolamento do precursor 25 × 24 m / z (cobrindo 300-900 m / z) (resolução 30.000, alvo AGC 1e6, injeção máxima tempo 60 ms, 27 NCE) usando um padrão de janela escalonada otimizado. Os espectros do precursor (faixa alvo ± 15 m / z em resolução de 60.000, alvo AGC 1e6, tempo máximo de injeção 60 ms) foram intercalados a cada 51 espectros MS / MS. O esquema da janela de isolamento é detalhado na pasta do projeto PanoramaWeb, https://panoramaweb.org/dictyostelium_histones.url

Para monitoramento de reação paralela (PRM), um espectrômetro de massa tríbida Thermo Fusion foi configurado para adquirir m / z alvo usando Orbitrap tMS 2 (resolução de 30.000, padrão de AGC padrão, tempo máximo de injeção 60 ms, 30% CID CE) com espectros de precursor (alvo intervalo 290–910 m / z com resolução de 60.000, alvo AGC 1e6, tempo máximo de injeção 60 ms) intercalado a cada 50 espectros MS / MS. A lista de isolamento está detalhada na pasta do projeto PanoramaWeb, https://panoramaweb.org/dictyostelium_histones.url

Análise de dados DDA

Os arquivos RAW foram convertidos para MZML usando o MSConvert (versão 3.0.18). Byonic (versão 3.10.2) foi usado para pesquisar um foco Dictyostelium FASTA com proteínas histonas e contaminantes (na pasta do projeto PanoramaWeb, https://panoramaweb.org/dictyostelium_histones.url) no Proteome Discoverer (versão 2.4) usando os seguintes parâmetros: digestão arg-c, 2 clivagens perdidas máximas, comprimento mínimo do peptídeo 7 8 modificações máximas carbamidometil fixas em C e U, oxidação variável em M, acetilação variável na proteína N-terminal e K, metilação em R, dimetilação em K e R, trimetilação na proteína N-terminal A e K, fosforilação em S, T e Y, propionilação no terminal N e K do peptídeo, metilação de propionil em K e propionilação GG em K precursor de tolerância de massa de 10 ppm, tolerância de massa do produto 20 ppm fragmentação de HCD.

Análise de dados DIA

Os arquivos de dados de espectrometria de massa foram demultiplexados e convertidos para MZML usando o MSConvert (versão 3.0.18). Os resultados da pesquisa de banco de dados da análise de dados DDA foram construídos em uma biblioteca espectral usando Bibliospec [61] no Skyline-daily (versão 20.1) [62]. Os arquivos DIA foram importados para o Skyline usando IDs de MS / MS na biblioteca espectral (todas as configurações são padrão, exceto as configurações de peptídeo: enzima de digestão ArgC [R | P], proteoma de fundo de Uniprot Dictyostelium FASTA (acessado em 21 de dezembro de 2020, 12742 entradas) Configurações de transição: Filtro para cargas precursoras 1–3, cargas iônicas 1–2, tipos de íons y, b, p do íon 1 ao último íon, filtragem Full-Scan MS1 ​​com picos de isótopos incluídos ( Contagem) e filtragem MS / MS para aquisição DIA, analisador de massa de produto centróide e esquema de isolamento de resultados apenas usam varreduras dentro de 5 minutos de IDs de MS / MS).

Análise de dados PRM

Uma lista de alvos foi construída a partir da combinação de produtos cartesianos de modificações conhecidas e o Dictyostelium proteínas histonas (Uniprot, acessado em 31 de dezembro de 2020, 7 entradas) usando um script Python personalizado. O Skyline-daily (versão 20.1) foi configurado com esses peptídeos alvo (todas as configurações são padrão, exceto as configurações do peptídeo: enzima de digestão ArgC [R | P], proteoma de fundo de Uniprot Dictyostelium histona FASTA (acessado em 31 de dezembro de 2020, 7 entradas) configurações de transição: filtro para cargas precursoras 1–3, cargas iônicas 1–2, tipos de íons y, b, p do íon 1 ao último íon, filtragem Full-Scan MS1 ​​com picos de isótopos incluídos (contagem) e filtragem MS / MS para aquisição direcionada, analisador de massa de produto centróide inclui todas as varreduras correspondentes). Os dados foram importados e os picos foram curados manualmente usando produto escalar isótopo, produto escalar quando as entradas da biblioteca espectral estavam disponíveis e informações de tempo de retenção.

Análise estatística de dados de espectrometria de massa

O recurso Skyline Group Comparison foi usado para calcular abundâncias diferenciais usando os dados DIA processados. Os parâmetros incluíram a configuração do valor do grupo de controle para valor "vegetativo" para comparar como monte, frutificação ou fluxo Método de normalização: Nível de confiança de corrente de íon total: escopo de 95%: método de resumo de peptídeo: polimento mediano de Tukey usando zero para picos ausentes.

RNA-seq

O mRNA foi extraído de células AX2 armazenadas a -80 ° C usando o kit de micro purificação direta de mRNA Dynabeads (Invitrogen). As amostras foram lisadas usando homogeneizador de tecido (Kontes) no tampão de lise. Duas réplicas biológicas foram atribuídas para cada estágio vegetativo, fluxo, monte e frutificação, respectivamente. No total, 8 grupos foram preparados para bibliotecas de RNA-seq com 500 ng de mRNA como materiais de partida usando o kit NEXTflex Illumina qRNA-Seq Library Prep (Bioo Scientific). Resumindo, o mRNA foi fragmentado em um tampão catiônico e submetido à síntese da primeira e segunda fitas, adenilação, ligação do adaptador com índice molecular e amplificação por PCR por 11 ciclos. Os produtos amplificados foram limpos por esferas magnéticas Agencourt AmPure XP (Beckman Coulter) e a qualidade verificada por Agilent 2200 Tapestation D1000. A densidade de cluster ideal foi determinada pelo kit de quantificação da biblioteca KAPA antes de agrupar as amostras em uma biblioteca agrupada (5 nM) e sequenciar por meio da plataforma Nextseq 500.

Os arquivos fastq foram filtrados com pontuação Q 30 ou superior e foram cortados para os adaptadores de sequenciamento usando CutAdapt (versão 2.5). O pipeline de análise começou com o pseudo-alinhamento das leituras usando kallisto [63], seguido pela construção de um índice e processo de quantificação, que gerou arquivos h5 contendo os arquivos binários brutos para a análise diferencial preliminar no detetive [64]. A análise diferencial foi conduzida em EdgeR [65] brevemente, o objeto DEGlist foi criado e os genes foram mantidos que alcançaram pelo menos uma contagem por milhão (cpm) em duas amostras biológicas replicadas. O tamanho efetivo da biblioteca foi calculado usando a normalização Trimmed Mean of M values ​​(TMM). Os genes significativos foram deduzidos pelo cálculo de testes de gênero exato NB com p & lt 0,05. A ontologia do gene (termo GO Gene Ontology Consortium 2015) para análise de sobre-representação e diagramas foram gerados pelo pacote R clusterProfiler (versão 3.18.0) [66]. A matriz de QC de sequenciamento é mostrada no arquivo adicional 9: Tabela S8.

ChIP-seq

10 milhões D. discoideum as células foram colhidas e dissociadas em diferentes estágios do ciclo de vida, conforme descrito em [67] com as seguintes modificações.Após a dissociação, as células foram reticuladas com tampão de ligação 1x (HEPES-NaOH 11 mM, NaCl 110 mM, EDTA 1,1 mM e EGTA 1,1 mM) com formaldeído a 1% por 10 min à temperatura ambiente e extinto por glicina 2 M. As amostras foram fragmentadas pela aplicação de um biorupter por 25 ciclos na câmara fria com 30 segundos ligado e 30 segundos desligado por ciclo. A cromatina pré-limpa foi incubada com pastas de esferas acopladas a anticorpos e giradas a 4 ° C durante a noite. O DNA foi eluído dos grânulos por 200 μl de TE com SDS a 1%.

Bibliotecas de histona ChIP-Seq foram geradas usando o kit Ovation Ultralow V2 (Nugen, 0344-32) de acordo com as instruções do fabricante. As bibliotecas foram amplificadas por PCR por 13-16 ciclos, dependendo do anticorpo, e a qualidade da biblioteca foi avaliada usando o Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Leituras de setenta e cinco bp foram geradas no Illumina Nextseq 500 (Illumina). O ChIP-seq foi sequenciado a uma profundidade de pelo menos 8 milhões de leituras / amostra totais.

Os arquivos fastq brutos foram aparados para os primeiros e últimos 8 nucleotídeos, o multiqc (versão 1.5) foi usado para resumir os resultados do fastQC (versão 0.11.3) [68], e os arquivos aparados foram mapeados para o Dictyostelium discoideum genoma (versão 2.5) [21] usando bowtie2 (versão 2.3.4.3) [69]. As leituras duplicadas foram removidas por picard e os arquivos bam classificados foram sujeitos a chamadas de pico com MACS2 (versão 2.1.1.20160309) usando H3 como controles [70, 71]. Tanto a entrada de DNA quanto H3 foram usadas como controles. Os picos foram visualizados por Integrative Genomics Viewer (IGV 2.3.44). As análises de ligação diferencial foram realizadas pelo pacote R Diffbind (versão 3.0.14) usando contagens de leitura ChIP log2 normalizadas com FDR & lt 0,05 [72]. A análise do metagene e a distribuição das características genômicas foram conduzidas pelo ChIPSeeker (versão 1.26.2) usando a função anotatePeak com arquivos narrowpeak como entrada [73]. O local de início da transcrição (TSS), exon, íntron e local de terminação da transcrição (TTS) foram determinados usando a função makeTxDbFromBiomart do banco de dados Ensemble BioMart (versão 2.7). Os promotores foram definidos pelas regiões de 1500 bp a montante do TSS e a jusante foi definido como 3000 bp a jusante da extremidade do gene (TTS). Uma vez que algumas anotações podem se sobrepor, adotamos o princípio padrão no ChIPSeeker para priorizar a anotação genômica na seguinte ordem: promotor, exon, intron, downstream e intergênico. A matriz de QC de sequenciamento é mostrada no arquivo adicional 9: Tabela S8.

ATAC-seq

Para avaliar regiões de cromatina aberta, pellets congelados de D discoideum células de vários estágios foram lavadas duas vezes com PBS frio e lisadas com Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), NaCl 10 mM, MgCl 3 mM2, 0,1% Igepal-630. Os núcleos foram transpostos usando o Nextera DNA Library Prep Kit (Illumina, FC-121-1030). As bibliotecas transpostas foram amplificadas por 11 ciclos e o tamanho selecionado para fragmentos variando de 200-1000 pb. Os experimentos ATAC-seq foram sequenciados a uma profundidade mínima de 10 milhões de leituras / amostra. Para preparação de amostras frescas, Dictyostelium foram fisicamente dissociados e lavados duas vezes com PBS com BSA a 0,04% e lisados ​​com Tris-HCL 10 mM (pH 7,4), NaCl 10 mM, MgCl 3 mM2, Tween 20 a 0,5%, NP-50 a 0,5%, digitonina a 0,05% (Promega G944A), BSA a 1% e celulase a 0,5% em gelo ou temperatura ambiente durante 30 min para lisar totalmente as células. A validação da lisina ATACseq equivalente de diferentes estágios foi realizada por coloração com azul de tripano e otimizada por detecção de PCR em tempo real da liberação de RNA ribossômico.

Os arquivos fastq brutos foram aparados para os primeiros e últimos 8 nucleotídeos, o multiqc foi usado para resumir os resultados do fastQC [68], e os arquivos aparados foram mapeados para o Dictyostelium discoideum genoma [21] usando bowtie2 [69], e o genoma da mitocôndria foi removido no processo de alinhamento. As leituras duplicadas foram removidas por picard e os arquivos bam classificados foram sujeitos a chamadas de pico com MACS2 [70, 71]. Os picos foram visualizados no Integrative Genomics Viewer (IGV 2.3.44). Da mesma forma, regiões de cromatina aberta e anotação de pico foram deduzidas com Diffbind [72] e ChIPSeeker, respectivamente [73]. A matriz de QC de sequenciamento é mostrada no arquivo adicional 9: Tabela S8.

Análise de motivos

As regiões de cromatina aberta específicas de estágio / unicelular / multicelular, sítios de ligação de histonas enriquecidos e os promotores de genes enriquecidos significativos foram extraídos como a sequência de entrada para homer (versão 4.11.1) [74]. Todas as sequências do promotor foram obtidas da dictyBase como a sequência de fundo [75]. A descoberta do motivo foi realizada usando o comando “findMotif.pl” do homer.

Análise de gene ortólogo

A árvore filogenética foi construída na árvore da vida interativa (iTOL versão 6) [76]. Os genes ortólogos entre D. discoideum, C.elegans e S.pombe foram obtidos usando metaphOrs (versão 1.0) com base na previsão de ortologia da filogenia em escala genômica [45]. A comparação entre as espécies e regiões de intersecção foram extraídas usando bedtools (versão 2.27.1) [77]. Os gráficos foram gerados em R (versão 4.0.2), excel ou prisma (versão 9).

Ensaio de multicelularidade

o D. discoideum as células foram colhidas na fase mid-log para 5 * 10 8 células. As células foram suspensas em tampão de desenvolvimento (Na 5 mM2HPO4, 5 mM KH2PO4, CaCl 1 mM2, e 2 mM de MgCl2) e lavado 3 vezes. Os ensaios de multicelularidade foram realizados em placas de ágar KK2. Inibidores químicos 100 nM, 500 nM e 1000 nM (Tricostatina A, T8552 BIX 01294 tricloridrato hidratado, B9311 (R) -PFI-2, SML1408p Sinefungina, ab144518) foram adicionados às placas de ágar KK2. Os pontos de tempo de captura de imagem para o ensaio de multicelularidade com tratamento químico foram fixados em 8 h, 16 h, 19 h e 24 h. Os pontos de tempo de captura de imagem para o ensaio de multicelularidade com cepas mutantes foram fixados em 8 h, 16 h, 21 h, 25 h e 41 h.

Quantificação do número de células e medição morfológica

Para quantificar o número de células germinativas nos corpos de frutificação, o ensaio foi realizado como em [78]. O número de células germinativas de corpos de frutificação individuais foi coletado por pipeta e colocado em 20 μl de PBS. As células foram contadas com um hemocitômetro (Hausser Scientific Cat. # 3520). O diâmetro do monte individual e dos corpos de frutificação foram medidos usando microscópio estéreo Discovery V8.

Ensaio de quimiotaxia

Os ensaios de quimiotaxia foram realizados como em [79]. Resumidamente, o protocolo foi modificado da seguinte forma. o D. discoideum as células foram cultivadas em uma densidade de 2 × 10 6 células / ml para o propósito do experimento. As células foram sedimentadas em um tampão 1X KK2 (2,2 g KH2PO4, 0,7 g K2HPO4) As células foram submetidas à fome por 5–8 h em um agitador e ressuspensas a uma concentração de 1 × 10 8 células / ml. Para fazer as placas de quimiotaxia, foram feitos 4 poços nas placas de ágar 1X KK2 (tampão KK2 1X e ágar 1,5 g). 4 pequenos pontos a 6 mm da borda de cada poço foram marcados nas placas de ágar para mostrar a localização da deposição de células. 20 μl de 250 μM de ácido fólico (Millipore Sigma CAS 59-30-3) dissolvidos em NaOH 100 mM foram injetados nos poços por uma pipeta P10 por 20 min absorvendo pelo ágar. 1 μl de D. discoideum foram carregados nos pontos e as placas foram incubadas à temperatura ambiente em câmara umidificada. O movimento das células foi capturado após 5 h usando o microscópio Zeiss steoREO Discovery V8. O número de células foi contado em cada direção (norte, sul, leste e oeste) em uma faixa de ângulo de 30 ° e plotado no Prisma 8 (Versão 8.1.1).

Anexina V, iodeto de propídio e coloração com azul de tripano

A viabilidade celular foi examinada por azul de tripano (VWR), iodeto de propídio (BD Biosciences) e coloração com anexina V (BD Biosciences). Para a coloração de Anexina V, as células foram lavadas duas vezes com PBS frio e suspensas em tampão de ligação 1X (Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM e CaCl 2,5 mM2) a uma concentração de 1 milhão de células / ml. Cem microlitros da solução foram transferidos para um novo tubo e 5 μl de FITC Anexina V foram adicionados às células e incubados por 15 min em temperatura ambiente no escuro. As amostras foram fotografadas usando um microscópio fluorescente (Nikon Eclipse E600) com filtro 485/535 nm (FITC) e as imagens foram analisadas por ImageJ (1.0).

Para a coloração com azul de tripano, 10 μl de solução de azul de tripano a 0,4% foram misturados com 10 μl de células a 5E5 células / ml. A mistura foi contada em um hemacitômetro imediatamente após a mistura.

Para coloração de PI, 1E6 D. discoideum as células foram tratadas com 1 μM de TSA, 5 μM de sinefungina ou 10 μM de BIX 01294 por 6 h. As células foram subsequentemente lavadas e ressuspensas com PBS frio suplementado com 5% de FBS e coradas com 2 mg / ml de iodeto de propídio (BD Biosciences) à temperatura ambiente por 10 min. As células coradas foram fixadas com PFA a 1%. As amostras foram analisadas por BD LSR Fortessa (BD Biosciences) e a análise de dados foi realizada usando Flow Jo (Tree Star).

Experiência de nocaute CRISPR-Cas9

O sgRNA tudo-em-um e o vetor de expressão de Cas9 pTM1285 foram obtidos do Quantitative Biology Center (QBIC) Riken, Japão. Os sgRNAs foram projetados na ferramenta CRISPOR [80]. sgRNA foram ligados a pTM1285 pré-digerido com BbsI (NEB), e células competentes estáveis ​​foram transformadas com a construção resultante (NEB, C3040). A ligação foi confirmada por PCR e sequenciamento Sanger. Os iniciadores usados ​​foram oligo de sentido para o alvo 5′-AGCAN (1) NNNNNNNNNNNNNNNNNNN (20) -3 ′ e tracrRNA 5′-AAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC-3 ′. O iniciador de sequenciação foi 5′-AAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC-3 ′. Os plasmídeos validados foram transformados nas células usando o método de precipitação com fosfato de cálcio [81]. Resumidamente, 10 μg de DNA de plasmídeo são co-precipitados com 60 μl de 1,25 M de CaCl2 em tampão HBS (4,0 g NaCl, 0,18 g KCl, 0,05 g Na2HPO4, 2,5 g HEPES e 0,5 g D-glicose, pH ajustado para 7,1). A solução de DNA foi adicionada às placas por 30 min e, em seguida, 12,5 ml de Bis-Tris (2,1 g de Bis-Tris, 10 g de proteose peptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de D-glicose em água destilada, pH ajustado para 7,1 com HCl) por 4-8 h. O DNA condensado na superfície da célula foi transformado nas células por 15–18% de glicerol por 5 minutos exatos e incubado com 12,5 ml de solução de Bis-Tris durante a noite para permitir a expressão do marcador de seleção. O meio foi substituído por HL5 com 10-15 μg / ml de G418 após 16 h, e cultivado por mais 3 dias. As células foram semeadas em placas de ágar SM com K. aerogenes e incubado por 3–4 dias até a formação da placa. As células foram transferidas e expandidas em meio HL5 com 300 μg / ml de estreptomicina. As cepas knock-out foram validadas por sequenciamento de Sanger.

Superexpressão Dictyostelium Deformação

cDNA de hdaD e smcl1 foi clonado no plasmídeo de sobre-expressão pJSK123 [82] entre os locais BamHI e AvrII. Os plasmídeos recombinantes foram transformados em células usando o método de precipitação com fosfato de cálcio [81]. Resumidamente, 10 μg de DNA de plasmídeo são co-precipitados com 60 μl de 1,25 M de CaCl2 em tampão HBS (4,0 g NaCl, 0,18 g KCl, 0,05 g Na2HPO4, 2,5 g HEPES e 0,5 g D-glicose, pH ajustado para 7,1). A solução de DNA foi adicionada às placas por 30 min e, em seguida, 12,5 ml de Bis-Tris (2,1 g de Bis-Tris, 10 g de proteose peptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de D-glicose em água destilada, pH ajustado para 7,1 com HCl) foi adicionado durante 4-8 h. O DNA condensado na superfície da célula foi transformado nas células por 15–18% de glicerol por 5 min e incubado com 12,5 ml de solução de Bis-Tris durante a noite para permitir a expressão do marcador de seleção. O meio foi substituído por HL5 com 10-15 μg / ml de G418 após 16 h e cultivado por mais 3 dias. As células foram então semeadas em placas de ágar SM com K. aerogenes e incubado por 3–4 dias até a formação das placas. As células foram transferidas e expandidas em meio HL5 com 300 μg / ml de estreptomicina. As cepas de sobre-expressão foram validadas por PCR em tempo real.

PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)

A expressão diferencial dos genes candidatos foi analisada por qRT-PCR. O RNA total foi extraído de D. discoideum células usando Invitrogen PureLink RNA (Invitrogen, 12183025). A síntese da primeira cadeia de cDNA foi conduzida usando SuperScript III First-Strand Synthesis (Invitrogen, 18080051). qRT-PCR de cDNA foi realizada usando iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, 172-5122) em um CFX96 Real-Time System (Bio-Rad). O ensaio de PCR continha produtos de transcrição reversa diluídos 1: 4, master mix 1X e 200 nM de cada iniciador, e foi realizado com desnaturação inicial de 5 min a 95 ° C seguido por 40 ciclos de 95 ° C por 5 se 60 ° C por 45 s. O mtRNA de D. discoideum foi usado para normalização interna para cada gene. O método Ct comparativo (ΔΔCt) foi usado para calcular a expressão gênica. As sequências de primer dos genes selecionados foram desenhadas usando Macvector (15.5.0). Os seguintes iniciadores específicos de gene foram usados: mtRNA-forward, 5′-gggtagtttgactggggcgg-3 ′, mtRNA-reverse, 5′-cactttaatgggtgaacacc-3 ′ DDB_G0283437-forward, 5′-gagggtgtat′gtac-reverso, 5′-gagggtgtat′ggtac-5tagtac, 5′gtac-reverso -tgggttccaatttcccaatcccaaac-3 'DDB_G02813787-frente, 5'-tccctaacaccaacatcaaccaacga-3', DDB_G02813787-inverso, 5'-tatacatgaccagtttcggaggcaac-3 'DDB_G0288013-frente, 5'-acaagaaatcgattgggagatgt-3', DDB_G0288013-inverso, 5'-tggcatttgttcttggatttttct-3 'DDB_G0279267-frente, 5'-tggctcaccaataccatcacctccat-3', DDB_G0279267-inverso, 5'-cgagttcgaactattgctgttg-3 'DDB_G0274899-frente, 5'-ccagagggaaataatagtcctggt-3', DDB_G0274899-inverso, 5'-ctccaattcgaaccacaaac-3 'DDB_G0267824-frente , 5'-gcagctggtagtagttcatcca-3 ', DDB_G0267824-inverso, 5'-tgtgcatattcttctttaccctcaa-3' DDB_G0277333-frente, 5'-tggcatttctcaggcagtttcgacca-3 ', DDB_G0277333-inverso, 5'-ccaacatcagtgagggtattca-3' DDB_G0293674-frente, 5'- accaacgtgctcttcgtcgtttgag-3 ′, DDB_G0293674-reverse, 5′-ggaacgatgtttgtcattacaccac-3 ′ DDB_G0 294934-forward, 5′- gggtagtttgactggggcgg-3 ′, DDB_G0294934-reverse, 5′- cactttaatgggtgaacacc-3 ′ DDB_G0279267_OE-forward, 5′-tatggatccatgtcattaatggggtgaacaccc-3 ′ DDB_G0279267_OE-forward, 5′-tatggatccatgtcatacaattcatc-3gat_OcdB, 5′- cactttaatgggtgaacacc-3 ′ DDB_G0279267_OE-forward, 5′-tatggatccatgtcatacaattcatc-3gat_Octt13, 5tagt_gt_gt_dbc-reverso-3gat_Octt13 Gtagt_0gat_OcDB2-reverso Gtagt0gat_OcDBc027tgt Gtgt_gat_OcDBc-reverso , 5'-tatggatccatggatattgcacaatcaattca-3 ', DDB_ G0288013_OE-inverso, 5'-tatcctaggctataaagtttttaagaaattttg-3', DDB_G0279267_Cat-frente, 5'-caacaatcatcacaattacc-3 ', DDB_G0279267_Cat-inverso, 5'-tatcctaggttaatcgtcttcgctta-3'.

Ensaios de drogas

Células HEK 293 T (ATCC CRL-3216) foram semeadas em placas de 6 poços durante a noite, depois tratadas com 0,25 μM, 0,5 μM, 1 μM ou 5 μM de Tricostatina A (T8552, Millipore Sigma) ou com 0,5 μM, 1 μM, 5 μM ou 10 μM de Sinefungina (ab144518) ou com 1 μM, 10 μM, 20 μM ou 30 μM de BIX 01294 (B0311) por 16 h. Cada concentração foi semeada com três réplicas de 1 milhão de células antes da coleta e análise dos efeitos na metilação e acetilação das histonas por western blotting.

Análise de Western blot

As células foram lisadas com tampão RIPA e quantificadas por ensaio de Bradford (Biorad 5000006). Cinco a 10 μg de proteínas foram carregados para eletroforese em gel e transferidos para membrana de nitrocelulose (Bio rad 1620097) com 100 V por 1,5 h. As membranas foram incubadas em leite a 5% por 1 h em temperatura ambiente e incubadas com anticorpos primários (diluição 1: 1000). Após lavagem com TBST 3 vezes, cada durante 10 min, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário (Millipore 3136001, Rabbit IgG, diluição 1: 3000). Os blots foram reagidos com substrato HRP quimioluminescente (Millipore WBKLS0500) e fotografados em ChemiDoc Touch Imaging System (Bio rad).

Ensaios de desacetilação

A sequência de codificação do domínio catalítico de hdaD foi clonado como uma fusão in-frame com o vetor marcado com His pET28a. A proteína recombinante foi expressa em E. coli BL21. A indução durante a noite da expressão da proteína foi realizada com IPTG 1 mM a 18 ° C. As bactérias foram colhidas a 4000 rpm, 4 ° C e ressuspensas em 10 mL de tampão de lise de purificação de proteína (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 0,25 M, Triton-X 0,1%, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, imidazol 20 mM e inibidores de protease). Depois de congelar o pellet a -80 ° C por 1 h, o lisado foi sonicado com um bioruptor por 5 min em alto nível com 30 s ligado e 30 s desligado. As proteínas foram purificadas com esferas Ni-NTA (Qiagen). As proteínas e contas foram lavadas 3 vezes com tampão de lise de purificação de proteína antes de incubar as contas com tampão de eluição (imidazol 400 mM em tampão de lise de purificação de proteína, pH 8,0) durante 30 min. Os eluatos foram dialisados ​​durante a noite a 4 ° C com tampão de diálise (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, DTT 1 mM e glicerol a 20%). Os ensaios de Bradford e a eletroforese em gel de SDS-page seguida por coloração com Coomassie foram realizados para determinar a integridade e a quantidade de proteínas purificadas. Proteínas histonas foram purificadas a partir de D. discoideum usando o kit de isolamento de histonas de núcleo EZExtract (BioVision). As reações de desacetilação in vitro foram realizadas com 10 μg de proteínas histonas e 5 μg de hdaD proteína ou 5 μg de proteína GST-RPA-2 como um controle. A reação de desacetilação foi realizada em uma solução tampão (50 mM Tris-HCl, 4 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0,2 mM DTT, 1 mM NAD +) e incubada a 30 ° C por 30 min. A análise de Western blot foi realizada conforme descrito anteriormente.

Análise de dados de sequenciamento de RNA de célula única

D. discoideum foi dissociado em células individuais de diferentes estágios por pipetagem física com PBS + BSA 0,04%. Para cada amostra, as células foram contadas e diluídas para 1000 células / μl em 1X PBS com 0,04% de albumina de soro bovino (BSA) antes do carregamento na máquina 10X Genomics Chromium. Os kits de reagentes 10X Chromium Single Cell 3 ′ v3 foram usados ​​de acordo com as instruções do fabricante para gerar bibliotecas de scRNAseq. As bibliotecas foram sequenciadas com extremidades emparelhadas de 150 bp em Illumina Hiseq4000 / Novoseq (Novogene).

Análise de dados de sequenciamento de RNA de célula única

Os arquivos Fastq foram processados ​​com Cell Ranger (versão 3.1.0) (https://support.10xgenomics.com) no construtor de pipeline DolphinNext [83] para gerar a matriz mesclada de gene-código de barras. Matrix foi carregada em R (versão 3.6.3) e analisada principalmente com o pacote Seurat ([84], versão 3.1.5). Células de baixa qualidade ou outliers foram filtrados dos dados pelo seguinte limite: 200 & lt total Gene count & lt 7000, 500 & lt UMI count & lt 30000. Matrizes filtradas foram normalizadas com SCTransform [85] e reduziram a dimensão com análise de componente principal . O efeito batch foi corrigido pela harmonia [86]. Os componentes principais significativos (PCs) são usados ​​para gerar o gráfico UMAP para visualização. O agrupamento foi realizado pelo algoritmo Louvain com base no gráfico K-vizinho mais próximo. O modelo de Hurdle adaptado foi usado para realizar a análise de expressão diferencial dos clusters individuais [87]. A análise de Gene Ontology (GO) foi realizada com clusterProfiler (versão 3.18.0) [66].

Para a análise de inferência de trajetória, as células dos estágios vegetativo, lesma e frutificação foram amostradas e mescladas. Os genes não informativos foram filtrados mantendo os genes que expressam 3 UMIs por célula por pelo menos 10 células.As matrizes filtradas foram normalizadas com normalização de quantis completa e reduziram a dimensão com PCA. Os primeiros 3 PCs foram usados ​​para agrupamento de k-means e análise subsequente. O estilingue foi realizado para prever a linhagem da multicelularidade [88]. O modelo aditivo generalizado foi usado para identificar o gene expresso temporalmente por meio do pseudotime.

Microscópio eletrônico

Dictyostelium as células foram sincronizadas de acordo com métodos publicados anteriormente [89, 90]. Resumidamente, as células foram cultivadas até a fase estacionária com uma densidade de 1,2 x 10 7 / ml. Estas células foram diluídas em meio HL5 fresco a uma densidade de 10 6 / ml. Em seguida, as células foram transferidas para 11,5 ° C de incubação por 20 h em placas de 6 poços. Neste momento, 1 μM de TSA foi adicionado às células de controle positivo. As células sincronizadas foram fixadas em fixador (2,5% de glutaraldeído 1,25% paraformaldeído e 0,03% de ácido pícrico em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (4,28 g de cacodilato de sódio, 25 g de cloreto de cálcio, 2,5 ml de ácido clorídrico 0,2 N em 200 ml de água destilada, pH 7.4) com diluição 1: 1 de meio celular por 16 h a 4 ° C. Em seguida, as células foram lavadas em tampão cacodilato 0,1 M e pós-fixadas com tetróxido de ósmio 1% (OsO4) / 1,5% de ferrocianeto de potássio (KFeCN6) por 1 h. As células foram lavadas duas vezes em água e uma vez em tampão maleato (MB) (ácido maleato 50 mM, NaOH 0,2 N) e incubadas em acetato de uranila a 1% por 1 h seguido por 2 lavagens em água e subsequente desidratação em graus de álcool ( 10 min cada 50%, 70%, 90%, 2 × 10 min 100%). As amostras foram então colocadas em óxido de propileno por 1 he infiltradas durante a noite em uma mistura 1: 1 de óxido de propileno e TAAB Epon (TAAB Laboratories Equipment Ltd, https://taab.co.uk). No dia seguinte, as amostras foram incluídas em TAAB Epon e polimerizadas a 60 ° C por 48 h. Seções ultrafinas (cerca de 60 nm) foram cortadas em um micrótomo Reichert Ultracut-S, coletadas em grades de cobre, coradas com citrato de chumbo e examinadas em um microscópio eletrônico de transmissão JEOL 1200EX ou TecnaiG 2 Spirit BioTWIN, e 30 imagens de cada condição foram gravadas com uma câmera AMT 2 k CCD.

As razões de heterocromatina foram quantificadas com FIJI (versão 1.0). Um limite de 15% foi definido para todas as imagens que foram então binarizadas para revelar regiões de heterocromatina para quantificação. As regiões de heterocromatina foram calculadas para cada um dos 30 núcleos (excluindo o nucléolo) e calculadas como uma porcentagem.


Componentes de células eucarióticas

Na natureza, a relação entre forma e função é aparente em todos os níveis, incluindo o nível da célula, e isso ficará claro à medida que explorarmos as células eucarióticas. O princípio “a forma segue a função” é encontrado em muitos contextos. Por exemplo, pássaros e peixes têm corpos aerodinâmicos que lhes permitem mover-se rapidamente pelo meio em que vivem, seja o ar ou a água. Isso significa que, em geral, pode-se deduzir a função de uma estrutura olhando para sua forma, porque as duas se casam.

UMA célula eucariótica é uma célula que tem um núcleo ligado à membrana e outros compartimentos ou sacos ligados à membrana, chamados organelas, que possuem funções especializadas (Figura 2 e 3). A palavra eucariótico significa "kernel verdadeiro" ou "núcleo verdadeiro", apontando para a presença do núcleo ligado à membrana nessas células. A palavra “organela” significa “pequeno órgão” e, como já foi mencionado, as organelas têm funções celulares especializadas, assim como os órgãos do corpo têm funções especializadas.

Figura 2 Uma célula animal típica

Figura 3 Uma célula vegetal típica.


Eucariotos - Organismos modelo eucarióticos

Os cientistas se preocupam muito com a cura de doenças humanas e com a compreensão do desenvolvimento humano. Por razões óbvias, usar humanos como objetos experimentais não é exatamente considerado ético ou seguro.

Você pode se perguntar como estudamos humanos sem usar humanos. A resposta é usar organismos-modelo.

UMA organismo modelo é qualquer espécie usada para pesquisas científicas para responder a uma pergunta específica. Embora haja uma longa lista de organismos modelos em potencial que podem ser usados, há uma lista menor de organismos que foram usados ​​extensivamente ao longo dos anos como modelos comuns, tornando-os padrões em pesquisa.

Organismos modelo não precisam ser eucariotos, mas como todos os eucariotos provavelmente evoluíram a partir da mesma ancestralidade comum, estudar outros eucariotos pode nos dar muitos insights sobre o que está acontecendo dentro de nós.

Escolher o organismo modelo certo para um estudo de pesquisa é como escolher o carro certo. Um SUV cabe em muitos equipamentos de hóquei e tem tração nas quatro rodas para a neve, mas é um bebedor de gasolina. Uma Ferrari pode ser uma escolha ruim para o mau tempo e custa mucho dinero, mas é um passeio agradável ao sol. Uma minivan é prática para os pequenos, mas não é exatamente o carro mais legal que existe. A menos que seja dirigido por pais como este.

Custo, número de descendentes e tempo de reprodução são apenas algumas das coisas a serem consideradas ao escolher o organismo modelo de sua escolha. O dinheiro não cresce em árvores e o tempo é essencial. Quanto mais organismos você tiver e quanto mais rápido você puder obtê-los, maiores serão os experimentos. Ser capaz de manipular geneticamente um organismo significa ser capaz de fazer mutações facilmente e estudar seus efeitos.

No entanto, não importa quais sejam os profissionais, o organismo modelo certo precisa se adequar à pergunta que você está fazendo. Por exemplo, você não pode usar um fungo para estudar o desenvolvimento dos olhos porque um fungo não tem olhos.

Abaixo, você encontrará uma pesquisa de alguns dos organismos-modelo comuns usados ​​para obter uma visão melhor dos eucariotos.

Arabidopsis

Arabidopsis thaliana é a escolha ideal para um organismo modelo eucariótico comum para estudar plantas. Por ser uma planta e, portanto, em um reino diferente do seu, não é usada diretamente para estudar humanos. Ainda assim, muitos dos processos que as células vegetais realizam - como transcrição e tradução - são semelhantes às coisas que nossas células também fazem.

Arabidopsis é frequentemente usado em estudos de biologia molecular e genética para a compreensão de plantas com flores. Algumas de suas vantagens notáveis ​​são que ele se reproduz com relativa rapidez, pode ser geneticamente manipulado e seu genoma foi sequenciado. Ele tem a vantagem adicional de produzir lindas flores brancas, para que o laboratório sempre tenha uma boa aparência. Por ser uma planta com flor, também é uma angiosperma.


Arabidopsis thaliana

Fermento

As leveduras são um tipo de fungo unicelular. Existem toneladas de diferentes cepas de levedura, e muitas são usadas como organismos modelo. Um dos organismos modelo de levedura mais comuns é Saccharomyces cerevisiae (ou fermento de brotamento ou fermento de padeiro). Embora esse não seja normalmente o foco dos estudos em levedura, todos nós gostamos de fermento de uma forma ou de outra. Essas leveduras não apenas fazem um organismo modelo popular para pesquisas eucarióticas, mas também fazem cerveja, vinho e pão.

Qual fermento faz a melhor massa de pizza? Essa é uma pesquisa que gostaríamos de ver. E bocas.

Saccharomyces cerevisiae é um eucarioto simples que cresce rapidamente e é relativamente barato de manter. O que falta em partes do corpo humano e em doenças, é composto por um genoma sequenciado e processos celulares muito semelhantes. A levedura tem sido usada como um sistema modelo para estudar o envelhecimento humano. Agora, se pudéssemos parecer tão jovens quanto um fermento em flor.


Saccharomyces cerevisiae ou fermento de brotamento

Moscas

Pequenas moscas de fruta, principalmente Drosophila melanogaster, têm sido um inseto usado na pesquisa de modelos por um longo tempo. Você pode não ver por que alguém iria querer estudar uma praga tão irritante. Quantas vezes você espantou esses caras da sua torta de creme de banana?

Como inseto, as moscas da fruta são animais do filo Arthropoda. Esses minúsculos organismos são comumente usados ​​para estudar o desenvolvimento de partes do corpo. Embora seja verdade que não temos asas, compartilhamos algumas das mesmas vias de sinalização de proteínas no desenvolvimento das partes humanas.

Também é "fácil" transformar moscas. Portanto, eles têm sido usados ​​como uma ferramenta genética comum para entender as mutações e como são herdadas. Seu curto tempo de geração significa que podemos estudar os efeitos das mutações rapidamente.

Também podemos criar mutantes com olhos de cores diferentes e asas engraçadas, ou acabar com antenas onde deveria estar uma bunda de mosca. É fácil ver por que este pode ser um organismo modelo atraente, você sabe, quando não está comendo sua fruta.


Desenho de Drosophila melanogaster

Worms

Pode ser difícil ver por que os vermes também são um organismo modelo tão bom, mas o verme redondoCaenorhabditis elegans é uma escolha excelente para compreender a genética e o desenvolvimento. É classificado como um animal no filo Nematoda. O que faz o C. elegans um bom modelo tem muito a ver com o fato de ser um organismo transparente. Literalmente, não tem nada a esconder. Assistir ao desenvolvimento é muito fácil. Na verdade, o destino de cada célula do verme foi "mapeado", o que significa que você pode apontar para uma célula do embrião e saber exatamente onde ela vai parar e o que será.

Esses vermes são baratos de criar, fáceis de manipular geneticamente, podem ser congelados no tempo e resistir a condições absurdas. Caso em questão: C. elegans é um modelo popular para estudar o desenvolvimento muscular. (Observe os músculos trabalhando.) Ok, então não foi exatamente testado quanto ao número de supinos ou bíceps que pode fazer ... mas foi literalmente atirado no espaço para passar um tempo na Estação Espacial Internacional para que os cientistas podia ver o efeito da gravidade nos músculos.

Peixe-zebra

O peixe-zebra, ou Danio reiro, não é parte zebra, parte peixe. É tudo peixe. Também é um peixe que parece uma zebra.

O peixe-zebra também é um grande organismo modelo. É um cordado, como nós, e é comumente usado para estudar vertebrados. Podemos usar o peixe-zebra para estudar o desenvolvimento, pois ele se desenvolve rapidamente, produz muitos descendentes e tem um embrião transparente que torna a imagem desse processo fácil. Tem muitos genes comparáveis ​​ao desenvolvimento humano e às doenças. Também podemos mantê-lo em tanques de peixes com um baú de tesouro afundado, pedras de aquário azul elétrico e um navio pirata.


O peixe-zebra é um sistema de modelo comum de vertebrados

O rato doméstico comum também é um organismo modelo de cordados popular. Ratos, também conhecidos como Mus musculus, não tenha tantos descendentes por ninhada ou se reproduza tão rapidamente em comparação com outros modelos de vertebrados menores, como o peixe-zebra. No entanto, em comparação com os humanos, eles são uma escolha muito melhor para se reproduzir rapidamente, produzindo vários filhotes por gravidez e bem. não sendo humanos. Os ratos, sendo mamíferos como nós, compartilham muitos homologia genética com humanos, o que significa muitos genes com sequência semelhante e função de proteína correspondente.

O Mighty Mouse é frequentemente usado para pesquisas genéticas e de desenvolvimento, e muito comumente para a compreensão de doenças humanas como câncer, diabetes e obesidade.


Mus musculus, um rato doméstico comum, ótimo para pesquisa e que provavelmente também quer um biscoito.

Brain Snack

As leveduras são um eucarioto unicelular tão simples, mas conseguimos obter a partir delas muitas informações valiosas sobre os sistemas básicos de biologia. Infelizmente, com a escassez de dinheiro para pesquisa, eles não são mais tão populares como um sistema modelo, o que leva a paródias como essa dos pesquisadores que os amam.


Capítulo 9 Células eucarióticas e organismos multicelulares - Apresentação PPT do PowerPoint

Capítulo 9 Células eucarióticas e organismos multicelulares Figura CO: Giardia de forma oblonga Cortesia do Dr. Stan Erlandsen / CDC As origens dos eucariotos permanecem obscuras que vieram. & ndash Apresentação PPT do PowerPoint

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Conteúdo

As protocélulas primitivas foram os precursores dos organismos unicelulares de hoje. Embora a origem da vida ainda seja um grande mistério, na teoria atual, conhecida como hipótese do mundo do RNA, as primeiras moléculas de RNA teriam sido a base para catalisar reações químicas orgânicas e autorreplicação. [4]

A compartimentação foi necessária para que as reações químicas fossem mais prováveis, bem como para diferenciar as reações com o ambiente externo. Por exemplo, uma ribozima replicadora de RNA precoce pode ter replicado outras ribozimas replicadoras de sequências de RNA diferentes se não forem mantidas separadas. [5] Essas células hipotéticas com um genoma de RNA em vez do genoma de DNA normal são chamadas de 'ribocélulas' ou 'ribócitos'. [4]

Quando anfifílicos como os lipídios são colocados na água, as caudas hidrofóbicas (temerosas de água) se agregam para formar micelas e vesículas, com as extremidades hidrofílicas (que amam a água) voltadas para fora. [2] [5] As células primitivas provavelmente usaram vesículas de ácido graxo que se auto-organizam para separar as reações químicas do ambiente. [5] Por causa de sua simplicidade e capacidade de se automontar na água, é provável que essas membranas simples sejam anteriores a outras formas de moléculas biológicas primitivas. [2]

Os procariotos não possuem organelas ligadas à membrana, como mitocôndrias ou um núcleo. [6] Em vez disso, a maioria dos procariotos tem uma região irregular que contém DNA, conhecida como nucleóide. [7] A maioria dos procariotos tem um único cromossomo circular, que está em contraste com os eucariotos, que normalmente têm cromossomos lineares. [8] Nutricionalmente, os procariontes têm a capacidade de utilizar uma ampla variedade de materiais orgânicos e inorgânicos para uso no metabolismo, incluindo enxofre, celulose, amônia ou nitrito. [9] Os procariontes como um todo são onipresentes no ambiente e também existem em ambientes extremos. [ citação necessária ]

Edição de bactérias

As bactérias são uma das formas de vida mais antigas do mundo e são encontradas virtualmente em toda a natureza. [9] Muitas bactérias comuns têm plasmídeos, que são moléculas de DNA curtas, circulares e autorreplicantes separadas do cromossomo bacteriano. [11] Os plasmídeos podem carregar genes responsáveis ​​por novas habilidades, sendo a resistência aos antibióticos de importância crítica atual. [12] As bactérias se reproduzem predominantemente assexuadamente por meio de um processo denominado fissão binária. No entanto, cerca de 80 espécies diferentes podem passar por um processo sexual conhecido como transformação genética natural. [13] A transformação é um processo bacteriano para a transferência de DNA de uma célula para outra e, aparentemente, é uma adaptação para reparar danos ao DNA na célula receptora. [14] Além disso, os plasmídeos podem ser trocados por meio do uso de um pilus em um processo conhecido como conjugação. [12]

As cianobactérias fotossintéticas são indiscutivelmente as bactérias mais bem-sucedidas e mudaram a atmosfera primitiva da Terra ao oxigená-la. [15] Estromatólitos, estruturas constituídas por camadas de carbonato de cálcio e sedimentos retidos deixados por cianobactérias e bactérias da comunidade associadas, deixaram para trás extensos registros fósseis. [15] [16] A existência de estromatólitos dá um excelente registro quanto ao desenvolvimento de cianobactérias, que são representadas em todo o Arqueano (4 bilhões a 2,5 bilhões de anos atrás), Proterozóico (2,5 bilhões a 540 milhões de anos atrás) e Fanerozóico (540 milhões de anos atrás até os dias atuais) eons. [16] Muitos dos estromatólitos fossilizados do mundo podem ser encontrados na Austrália Ocidental. [16] Lá, alguns dos estromatólitos mais antigos foram encontrados, alguns datando de cerca de 3.430 milhões de anos atrás. [16]

O envelhecimento clonal ocorre naturalmente nas bactérias e aparentemente se deve ao acúmulo de danos que podem ocorrer mesmo na ausência de estressores externos. [17]

Archaea Edit

As fontes hidrotermais liberam calor e sulfeto de hidrogênio, permitindo que os extremófilos sobrevivam usando o crescimento quimiolitotrófico. [19] Archaea são geralmente semelhantes em aparência às bactérias, daí sua classificação original como bactéria, mas têm diferenças moleculares significativas, principalmente em sua estrutura de membrana e RNA ribossômico. [20] [21] Ao sequenciar o RNA ribossômico, foi descoberto que os Archaea provavelmente se separaram das bactérias e foram os precursores dos eucariotos modernos e, na verdade, estão mais filogeneticamente relacionados aos eucariotos. [21] Como o nome sugere, Archaea vem de uma palavra grega archaios, significando original, antigo ou primitivo. [22]

Algumas arquéias habitam os ambientes mais inóspitos do ponto de vista biológico da Terra, e acredita-se que isso, de alguma forma, imite as condições precoces e adversas às quais a vida provavelmente foi exposta [ citação necessária ] Exemplos desses extremófilos arqueanos são os seguintes:

    , temperatura ótima de crescimento de 50 ° C-110 ° C, incluindo os gêneros Pyrobaculum, Pyrodictium, Pyrococcus, Thermus aquaticus e Melanopyrus.[23], temperatura ótima de crescimento de menos de 15 ° C, incluindo os gêneros Metanogênio e Halorubrum.[23], pH ótimo de crescimento maior que 8, incluindo o gênero Natronomonas. [23] [24], pH ótimo de crescimento inferior a 3, incluindo os gêneros Sulfolobus e Picrophilus. [23] [25], (também conhecidos como barófilos), preferem altas pressões de até 130 MPa, como ambientes oceânicos profundos, incluindo os gêneros Metanococo e Pyrococcus. [23], crescem de forma otimizada em altas concentrações de sal entre 0,2 M e 5,2 M de NaCl, incluindo os gêneros Haloarcula, Haloferax, Halococcus. [23][26]

Metanógenos são um subconjunto significativo de arquéias e incluem muitos extremófilos, mas também são onipresentes em ambientes de pântanos, bem como em ruminantes e intestino grosso de animais. [27] Este processo utiliza hidrogênio para reduzir o dióxido de carbono em metano, liberando energia na forma utilizável de trifosfato de adenosina. [27] Eles são os únicos organismos conhecidos capazes de produzir metano. [28] Em condições ambientais estressantes que causam danos ao DNA, algumas espécies de archaea se agregam e transferem o DNA entre as células. [29] A função dessa transferência parece ser substituir as informações da sequência de DNA danificada na célula receptora por informações da sequência não danificada da célula doadora. [30]

As células eucarióticas contêm organelas ligadas à membrana, como mitocôndrias, um núcleo e cloroplastos. As células procarióticas provavelmente mudaram para células eucarióticas entre 2,0 e 1,4 bilhões de anos atrás. [31] Este foi um passo importante na evolução. Em contraste com os procariontes, os eucariotos se reproduzem usando mitose e meiose. O sexo parece ser um atributo onipresente, antigo e inerente à vida eucariótica. [32] A meiose, um verdadeiro processo sexual, permite o reparo de recombinação eficiente de danos ao DNA [14] e uma maior variedade de diversidade genética combinando o DNA dos pais seguido de recombinação. [31] As funções metabólicas em eucariotos também são mais especializadas por meio da divisão de processos específicos em organelas. [ citação necessária ]

A teoria endossimbiótica sustenta que as mitocôndrias e os cloroplastos têm origens bacterianas. Ambas as organelas contêm seus próprios conjuntos de DNA e têm ribossomos semelhantes a bactérias. É provável que as mitocôndrias modernas já tenham sido uma espécie semelhante a Rickettsia, com a capacidade do parasita de entrar em uma célula. [33] No entanto, se a bactéria fosse capaz de respirar, teria sido benéfico para a célula maior permitir que o parasita vivesse em troca de energia e desintoxicação de oxigênio. [33] Os cloroplastos provavelmente se tornaram simbióticos por meio de um conjunto semelhante de eventos e são provavelmente descendentes de cianobactérias. [34] Embora nem todos os eucariotos tenham mitocôndrias ou cloroplastos, as mitocôndrias são encontradas na maioria dos eucariotos e os cloroplastos são encontrados em todas as plantas e algas. A fotossíntese e a respiração são essencialmente o reverso uma da outra, e o advento da respiração juntamente com a fotossíntese possibilitou um acesso muito maior à energia do que a fermentação sozinha. [ citação necessária ]

Protozoa Edit

Os protozoários são amplamente definidos por seu método de locomoção, incluindo flagelos, cílios e pseudópodes. [35] Embora tenha havido um debate considerável sobre a classificação dos protozoários causada por sua diversidade absoluta, em um sistema há atualmente sete filos reconhecidos sob o reino Protozoa: Euglenozoa, Amoebozoa, Choanozoa sensu Cavalier-Smith, Loukozoa, Percolozoa, Microsporidia e Sulcozoa. [36] [37] Protozoários, como plantas e animais, podem ser considerados heterótrofos ou autótrofos. [33] Autótrofos gostam Euglena são capazes de produzir sua energia usando a fotossíntese, enquanto os protozoários heterotróficos consomem alimentos canalizando-os através de uma garganta semelhante à boca ou engolfando-os com pseudópodes, uma forma de fagocitose. [33] Enquanto os protozoários se reproduzem principalmente assexuadamente, alguns protozoários são capazes de reprodução sexuada. [33] Protozoários com capacidade sexual incluem as espécies patogênicas Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii, Trypanosoma brucei, Giardia duodenalis e Leishmania espécies. [14]

Ciliophora, ou ciliados, são um grupo de protistas que utilizam cílios para locomoção. Exemplos incluem Paramecium, Stentors, e Vorticela. [38] Os ciliados são amplamente abundantes em quase todos os ambientes onde a água pode ser encontrada, e os cílios batem ritmicamente para impulsionar o organismo. [39] Muitos ciliados têm tricocistos, que são organelas em forma de lança que podem ser descarregadas para capturar a presa, ancorar-se ou para se defender. [40] [41] Os ciliados também são capazes de reprodução sexuada e utilizam dois núcleos exclusivos dos ciliados: um macronúcleo para controle metabólico normal e um micronúcleo separado que sofre meiose. [40] Exemplos de tais ciliados são Paramecium e Tetrahymena que provavelmente empregam recombinação meiótica para reparar danos ao DNA adquiridos em condições estressantes. [ citação necessária ]

Os Amebozoa utilizam pseudópodes e fluxo citoplasmático para se mover em seu ambiente. Entamoeba histolytica é a causa da disenteria amebiana. [42] Entamoeba histolytica parece ser capaz de meiose. [43]

Editar algas unicelulares

As algas unicelulares são autotróficas semelhantes às plantas e contêm clorofila. [44] Eles incluem grupos que possuem espécies multicelulares e unicelulares:

    , algas flageladas, principalmente unicelulares, que ocorrem frequentemente em água doce. [44] Em contraste com a maioria das outras algas, elas não têm paredes celulares e podem ser mixotróficas (tanto autotróficas quanto heterotróficas). [44] Um exemplo é Euglena Gracilis. (algas verdes), principalmente algas unicelulares encontradas na água doce. [44] As clorofitas são de particular importância porque acredita-se que sejam as mais relacionadas à evolução das plantas terrestres. [45], algas unicelulares que possuem paredes celulares siliciosas. [46] Eles são a forma mais abundante de algas no oceano, embora também possam ser encontrados em água doce. [46] Eles respondem por cerca de 40% da produção marinha primária do mundo e produzem cerca de 25% do oxigênio mundial. [47] As diatomáceas são muito diversas e compreendem cerca de 100.000 espécies. [47], algas flageladas unicelulares, algumas delas blindadas com celulose. [48] ​​Os dinoflagelados podem ser mixotróficos e são as algas responsáveis ​​pela maré vermelha. [45] Alguns dinoflagelados, como Pyrocystis fusiformis, são capazes de bioluminescência. [49]

Fungos unicelulares Editar

Os fungos unicelulares incluem as leveduras. Os fungos são encontrados na maioria dos habitats, embora a maioria seja encontrada em terra. [50] As leveduras se reproduzem por meio da mitose e muitas usam um processo chamado brotamento, em que a maior parte do citoplasma é mantida pela célula-mãe. [50] Saccharomyces cerevisiae fermenta carboidratos em dióxido de carbono e álcool e é usado na fabricação de cerveja e pão. [51] S. cerevisiae também é um organismo modelo importante, uma vez que é um organismo eucariótico que é fácil de crescer. Tem sido usado para pesquisar câncer e doenças neurodegenerativas, bem como para compreender o ciclo celular. [52] [53] Além disso, pesquisas usando S. cerevisiae tem desempenhado um papel central na compreensão do mecanismo de recombinação meiótica e a função adaptativa da meiose. Candida spp. são responsáveis ​​pela candidíase, causando infecções na boca e / ou garganta (conhecidas como candidíase) e vagina (comumente chamadas de infecção por fungos). [54]

A maioria dos organismos unicelulares são de tamanho microscópico e, portanto, são classificados como microrganismos. No entanto, alguns protistas e bactérias unicelulares são macroscópicos e visíveis a olho nu. [55] Os exemplos incluem:


Figura 14.10 Em células eucarióticas, a síntese de DNA e RNA ocorre em um compartimento separado da síntese de proteínas. Em células procarióticas, os dois processos ocorrem juntos. Que vantagens pode haver em separar os processos? Que vantagens pode haver em tê-los ocorrendo juntos?

Figura 14.10 Em células eucarióticas, a síntese de DNA e RNA ocorre em um compartimento separado da síntese de proteínas. Em células procarióticas, os dois processos ocorrem juntos. Que vantagens pode haver em separar os processos? Que vantagens pode haver em tê-los ocorrendo juntos?

As vantagens de processos separados de síntese, transcrição e tradução de DNA em eucariotos e o mesmo ocorrendo em procariotos.

Introdução:

Os procariotos são organismos unicelulares sem um núcleo bem definido e organelas celulares ligadas à membrana. Os eucariotos são organismos unicelulares ou multicelulares com um núcleo bem definido coberto por uma membrana nuclear, exibindo nucleoplasma e nucléolo junto com as organelas ligadas à membrana em seu citoplasma, como a mitocôndria, retículo endoplasmático, corpos de Golgi, cloroplasto. Procariotos e eucariotos também diferem na síntese de DNA, RNA e proteínas.

Explicação da solução

Em procariotos, a síntese de DNA e RNA ocorre no citoplasma da célula. A ausência de compartimentalização em procariotos faz com que a síntese de RNA e proteínas ocorra simultaneamente, auxiliando em sua síntese mais rápida e permitindo que a célula se reproduza em um ritmo mais rápido. Esta reprodução mais rápida pode trazer mudanças na célula e pode ajudar as células a evoluir.

Nos eucariotos, a síntese do DNA ocorre no núcleo da célula por um processo denominado replicação do DNA. A síntese de RNA ocorre no citoplasma da célula. As vantagens dessa separação são que proteínas e produtos de RNA mais complexos são formados separadamente por um conjunto de etapas específicas com o mínimo de dano a eles. Isso também evita a interação dessas moléculas entre si e auxilia na regulação da expressão gênica.

Assim, a separação da síntese de DNA e RNA da síntese de proteínas em eucariotos auxilia na formação de produtos complexos com danos mínimos e sua síntese em procariotos ocorrendo juntos faz com que eles se reproduzam rapidamente.

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