Em formação

A Primeira Polimerase


Sabendo que a proteína polimerase é necessária para a transcrição de genes, qual polimerase é usada na transcrição da própria proteína polimerase?


Em eucariotos, sua RNA polimerase II. Nas bactérias, é a RNA polimerase normal. Embora seja verdade que agora as polimerases são necessárias para a transcrição de mais polimerases, esse mecanismo pode não ter estado sempre presente. Na hipótese do mundo do RNA, o RNA codifica as proteínas e não o DNA, portanto, com o surgimento do DNA, as RNA polimerases também podem ter se formado. Para produzir proteínas de RNA, os organismos usam complexos chamados ribossomos, que são ribozimas (enzimas de RNA), que passaram por muitas fases de evolução dos ribossomos originais, então não houve um problema com a produção de proteínas a partir de RNA e ao longo do curso de evolução, as polimerases foram então desenvolvidas, mas só foram necessárias com o surgimento do DNA.


História da reação em cadeia da polimerase

o história da reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido descrito como um clássico "Eureka!" momento, [1] ou como um exemplo de trabalho em equipe cooperativo entre pesquisadores díspares. [2] A seguir está uma lista de eventos antes, durante e depois de seu desenvolvimento:


Replicação, manutenção e organização de nucleóides do mtDNA

Mara Doimo,. Sjoerd Wanrooij, em The Human Mitochondrial Genome, 2020

1.2.3 Alongamento da replicação do mtDNA

Após o priming da síntese do mtDNA, o alongamento do primer de replicação é catalisado pelo POL γ codificado por núcleo, que foi a primeira polimerase isolada da mitocôndria de células HeLa humanas [71]. O POL γ precisa da ajuda do mtDNA helicase Twinkle e do mtSSB para replicar o mtDNA em células humanas. Juntos, POL γ, Twinkle e mtSSB constituem o replissoma mínimo do mtDNA (Fig. 1.3) e são essenciais para a reconstituição da replicação mitocondrial in vitro [72].

Figura 1.3. Proteínas do garfo de replicação do DNA mitocondrial do núcleo (mtDNA).

A helicase TWINKLE (azul) move-se na direção de 5 ′ a 3 ′ enquanto desenrola dsDNA. A proteína mtSSB (verde escuro) estabiliza a conformação de fita simples de DNA e estimula a síntese de DNA por POLγ (vermelho (A) e cinzento (B)). POLRMT (luz verde) sintetiza o primer de RNA (linha Amarela) necessários para a síntese de DNA da fita retardada.

1.2.3.1 A polimerase de DNA mitocondrial POL γ

POL γ foi descrito pela primeira vez como uma polimerase de DNA dependente de RNA [73]. A holoenzima consiste em uma subunidade catalítica de 140 kDa POL γA e duas subunidades acessórias de 55 kDa POL γB [74-76]. A subunidade catalítica possui DNA polimerase e atividades 3′ – 5 ′ exonuclease, além da atividade 5′-desoxirribose fosfato liase [77,78]. Em geral, a atividade exonuclease intrínseca de POL γ funciona como um mecanismo de revisão durante a replicação, o que garante a fidelidade da polimerase por meio de alta seletividade de nucleotídeos e extensão lenta de incompatibilidades [79]. O POL γ pode alternar entre as atividades de polimerase e exonuclease sem se dissociar do molde de DNA porque pode transferir o DNA nascente do local da polimerase para o local da exonuclease e vice-versa por meio de um mecanismo de transferência de fita intramolecular [80]. Com uma taxa de erro de menos de 1 × 10 −6 por nucleotídeo, POL γ é uma das polimerases mais precisas [79].

A subunidade acessória POL γB também é conhecida como o fator de processabilidade porque aumenta a processabilidade de POL γA aumentando sua afinidade de ligação ao DNA. Além disso, o POL γB estimula as atividades de exonuclease e polimerase, e também pode melhorar a ligação e incorporação de nucleotídeos, aumentando assim a taxa de polimerização da holoenzima [81,82]. Em solução, dímeros de POL γB formam um heterotrímero com a subunidade catalítica POL γA através da forte ligação do POL γB dímero ao POL γA monômero [75]. Cada unidade POL γB na holoenzima tem uma função específica: o monômero proximal a POL γA na holoenzima aumenta a interação com o DNA, enquanto o monômero distal POL γB é responsável por aumentar a taxa de reação [83]. A modelagem da ligação de POL γ ao DNA sugere que POL γA se liga a aproximadamente 10 pb do DNA molde e que a interação com POL γB aumenta a pegada de POL γA no DNA para 25 pb. Embora POL γB tenha atividade de ligação de dsDNA [84], ele não interage com o DNA molde do primer [85]. Embora não seja essencial para a estimulação de POL γA, a atividade de ligação de dsDNA de POL γB é necessária para a função do replissoma de mtDNA em um modelo de dsDNA através da coordenação de POL γ e Twinkle na forquilha de replicação [86].

1.2.3.2 O DNA mitocondrial helicase Twinkle

Twinkle (proteína T7 gp4-like com localização nucleóide intramitocondrial) é a helicase replicativa mitocondrial codificada por núcleo. Ele compartilha similaridade estrutural com o fago T7 primase / helicase e colocaliza com o mtDNA em complexos de nucleoproteína [87]. Twinkle é necessário para desenrolar o molde de DNA de fita dupla antes do POL γ que só pode usar ssDNA como molde [72]. É uma helicase de DNA dependente de NTP que desenrola o DNA em uma orientação 5′-3 ′ e precisa de uma estrutura semelhante a um garfo com um local de carregamento de DNA 5′ de fita simples e uma cauda 3′ curta para iniciar o desenrolamento [88] . A atividade helicase de Twinkle é estimulada consideravelmente por mtSSB [88], mas ele só pode desenrolar trechos mais longos de dsDNA na presença de POL γ [72]. Relatórios anteriores sugeriram que Twinkle é hexamérico [87,89], enquanto a análise mais recente por microscopia eletrônica revelou evidências de ambas as formas hexamérica e heptamérica [90,91].

1.2.3.3 A proteína mitocondrial de ligação ao DNA de fita simples

O mtSSB humano é uma proteína de 15 kDa que compartilha similaridade de sequência com Escherichia coli SSB [92], e forma um tetrâmero que se liga a 59 nt de ssDNA [93]. O DNA de fita simples envolve uma vez o tetrâmero mtSSB [94,95]. MtSSB estimula a atividade da POL γ polimerase, bem como a atividade da helicase Twinkle [88,96,97]. Foi sugerido que o efeito estimulador na atividade da POL γ polimerase ocorre sem qualquer interação direta entre as proteínas, através da capacidade do mtSSB de organizar o molde de ssDNA e remover quaisquer estruturas secundárias de DNA [98]. Estudos sobre Drosófila mtSSB mostrou que mtSSB aumenta Drosófila A síntese de POL γ principalmente aumentando o reconhecimento e a ligação do primer e, como resultado, aumenta a taxa de iniciação da síntese de DNA [99,100]. Além de estimular a atividade da polimerase POL γ, Drosófila mtSSB pode até estimular a atividade de exonuclease de POL γ [101].

1.2.3.4 O replissoma de DNA mitocondrial

Em ensaios bioquímicos, POL γ sozinho é incapaz de usar dsDNA como um modelo, mas a adição de Twinkle melhora drasticamente a polimerização por POL γ em um modelo de minicírculo preparado e permite a síntese de extensos trechos de DNA em um modo de replicação de círculo rolante [ 72]. A interação Twinkle-POL γ também permite que Twinkle desenrole trechos mais longos de dsDNA, embora as proteínas não pareçam formar um complexo estável [72]. A adição de mtSSB melhora ainda mais a síntese de DNA, permitindo a formação de produtos de DNA com comprimento de genoma [72]. Em conclusão, a polimerase de mtDNA POL γ juntamente com Twinkle e mtSSB constituem a maquinaria central necessária para replicar o mtDNA em células humanas. A importância dessas proteínas para a manutenção do mtDNA in vivo é enfatizada pelo fato de que defeitos nesses componentes centrais do replissomo do mtDNA levam à instabilidade do mtDNA e à doença mitocondrial [87,102-106].


Processo de Transcrição

A transcrição começa com a ligação da enzima RNAP a uma parte específica do DNA, também conhecida como região promotora. Essa ligação requer a presença de algumas outras proteínas - o fator sigma em procariotos e vários fatores de transcrição em eucariotos. Um conjunto de proteínas chamadas fatores gerais de transcrição são necessários para toda a atividade transcricional eucariótica e incluem o Fator de Iniciação da Transcrição II A, II B, II D, II E, II F e II H. Estes são suplementados por moléculas de sinalização específicas que modulam a expressão gênica por meio trechos de DNA não codificante localizados a montante. Freqüentemente, a iniciação é abortada várias vezes antes que um trecho de dez nucleotídeos seja polimerizado. Depois disso, a polimerase vai além do promotor e perde a maioria dos fatores de iniciação.

Isso é seguido pelo desenrolamento do DNA de fita dupla, também conhecido como & # 8216melting & # 8217, para formar uma espécie de bolha onde ocorre a transcrição ativa. Esta & # 8216bolha & # 8217 parece mover-se ao longo da fita de DNA à medida que o polímero de RNA se alonga. Uma vez que a transcrição esteja completa, o processo é encerrado e a fita de RNA é processada. RNAP procariótica e RNA polimerases eucarióticas I e II requerem proteínas de terminação de transcrição adicionais. RNAP III termina a transcrição quando há um trecho de bases de timina na fita não molde de DNA.


7.1: Visão geral da reação em cadeia da polimerase

  • Contribuição de Clare M. O & rsquoConnor
  • Professor Associado Emérito (Biologia) no Boston College

A reação em cadeia da polimerase (PCR) revolucionou a biologia molecular. Com a PCR, os pesquisadores tinham uma ferramenta para amplificar sequências de DNA de interesse a partir de quantidades extremamente pequenas
de um modelo de DNA. De fato, bilhões de cópias podem ser sintetizadas a partir de uma única molécula de DNA em uma reação típica de PCR. O desenvolvimento da PCR surgiu da pesquisa sobre DNA polimerases e da descoberta de DNA polimerases termoestáveis ​​capazes de resistir a tratamentos térmicos prolongados que desnaturam a maioria das proteínas (Sakai et al., 1988). Hoje, a PCR é uma técnica padrão amplamente usada para analisar moléculas de DNA e construir novas moléculas recombinantes.

As polimerases de DNA termoestáveis ​​são fundamentais para a PCR. A primeira descrição do PCR usado
uma DNA polimerase de E. coli, que desnaturou e teve que ser substituído após cada rodada de
Síntese de DNA (Sakai et al., 1985). O procedimento foi muito melhorado com a substituição do E.
coli
polimerase com uma DNA polimerase de Thermus aquaticus, uma bactéria que prospera
em fontes termais no Parque Nacional de Yellowstone. o T. aquaticus DNA polimerase, ou Taqpolimerase, funciona melhor em temperaturas de 70-75 e # 778C e pode suportar incubação prolongada (mas não indefinida) a temperaturas acima de 90 e # 778C sem desnaturação. Dentro de alguns anos, oTaq polimerase foi clonada e superexpressa em E. coli, expandindo bastante sua disponibilidade. Hoje, a seleção de polimerases disponíveis para PCR aumentou dramaticamente, à medida que novas polimerases de DNA foram identificadas em outros organismos termofílicos e modificações genéticas foram introduzidas em Taq polimerase para melhorar suas propriedades.

A PCR envolve várias rodadas de síntese de DNA de ambas as extremidades do segmento de DNA que está sendo amplificado. Lembre-se do que acontece durante a síntese de DNA: um primer de oligonucleotídeo de fita simples se liga a uma sequência complementar no DNA. Esta região de fita dupla fornece
uma âncora para DNA polimerase, que estende o primer, SEMPREviajando na direção 5 & rsquo para 3 & rsquo. Os investigadores controlam os locais de início para a replicação do DNA, fornecendo oligonucleotídeos para servir como iniciadores para a reação (mostrado abaixo para Seu gene favorito Yfg). Para projetar primers de PCR, os investigadores precisam de informações precisas sobre a sequência dos locais de ligação do primer no DNA alvo. (Observação: as informações da sequência não são necessárias para a sequência inteira que será amplificada. A PCR é freqüentemente usada para identificar as sequências que ocorrem entre dois locais de ligação de iniciadores conhecidos.) Dois iniciadores são necessários para a PCR. Um primer se liga a cada fita da hélice do DNA.

A PCR começa com um período de desnaturação de vários minutos, durante o qual a mistura de reação é incubada a uma temperatura alta o suficiente para quebrar as ligações de hidrogênio que mantêm as duas fitas da hélice de DNA juntas. A desnaturação efetiva é crítica, porque a DNA polimerase requer DNA de fita simples como molde. O segmento de desnaturação inicial é mais longo do que as etapas de desnaturação subsequentes, porque os modelos biológicos para PCR, como o DNA genômico, são frequentemente moléculas longas e complexas mantidas juntas por muitas ligações de hidrogênio. Em ciclos de PCR subsequentes, os produtos (mais curtos) dos ciclos anteriores tornam-se os modelos predominantes.

Após a desnaturação inicial, a PCR envolve uma série de 30-35 ciclos com três segmentos, realizados em diferentes temperaturas. As reações de PCR são incubadas em termocicladores que ajustam rapidamente a temperatura de um bloco de reação de metal. Um ciclo típico inclui:

  • uma etapa de desnaturação - comumente 94 & # 778C
  • uma etapa de recozimento de primer - comumente 55 & # 778C
  • uma etapa de extensão - geralmente 72 e # 778C

As reações de PCR incluem vários ciclos de desnaturação, anelamento e extensão.

a sequência do primer. As DNA polimerases tornam-se mais ativas na temperatura de extensão, que está mais próxima de sua temperatura ideal. Os investigadores adaptam as temperaturas e o tempo das etapas acima para acomodar diferentes primers, modelos e DNA polimerases.

Os produtos de PCR do tamanho pretendido acumulam-se exponencialmente

PCR é de fato uma reação em cadeia, uma vez que a sequência de DNA de interesse praticamente dobra
com cada ciclo. Em dez ciclos, uma sequência será amplificada

1000 vezes (2 10 = 1024). Em vinte ciclos, uma sequência será amplificada

milhões de vezes. Em trinta ciclos, uma sequência pode ser teoricamente amplificada

bilhões de vezes. As reações de PCR no laboratório normalmente envolvem 30-35 ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. Para entender o PCR, é importante focar nos primeiros ciclos. Os produtos de PCR do tamanho pretendido aparecem primeiro no segundo ciclo. A amplificação exponencial do produto de PCR pretendido começa no terceiro ciclo.

Durante o primeiro ciclo, as DNA polimerases termoestáveis ​​sintetizam DNA, estendendo as extremidades 3 & rsquo dos primers. As DNA polimerases são enzimas processuais que continuarão a sintetizar o DNA até que literalmente caiam do DNA. Consequentemente, as moléculas de DNA complementar sintetizadas no primeiro ciclo têm uma grande variedade de comprimentos. Cada um dos produtos, entretanto, tem posição inicial definida, já que começa com a sequência do primer. Essas sequências "ancoradas" se tornarão modelos para a síntese de DNA no próximo ciclo, quando os produtos de PCR do comprimento pretendido aparecerem pela primeira vez. O modelo inicial para PCR continuará a ser copiado em cada ciclo subsequente de PCR, resultando em dois novos produtos & ldquoanchored & rdquo com cada ciclo. Como os comprimentos dos produtos & ldquoanchored & rdquo são bastante variáveis, no entanto, eles não serão detectáveis ​​nos produtos finais da reação de PCR.

As fitas de DNA do comprimento pretendido aparecem pela primeira vez durante o segundo ciclo. A replicação dos fragmentos & ldquoanchored & rdquo gera produtos de PCR do comprimento pretendido. O número desses fragmentos de comprimento definido dobrará a cada novo ciclo e rapidamente se tornará o produto predominante na reação.

A maioria dos protocolos de PCR envolve 30-35 ciclos de amplificação. Nos últimos ciclos, os produtos de PCR desejados não estão mais se acumulando exponencialmente por várias razões. Como em qualquer reação enzimática, os substratos de PCR esgotaram-se e as rodadas repetidas de incubação a 94 e # 778C começaram a desnaturar Taq polimerase.

O recozimento do primer é crítico para a especificidade na PCR

Um bom design de primer é fundamental para o sucesso da PCR. O PCR funciona melhor quando os primers são altamente específicos para a sequência alvo no DNA molde. O mispriming ocorre quando os primers se ligam a sequências que são apenas parcialmente complementares, fazendo com que a DNA polimerase copie as sequências de DNA erradas. Felizmente, os investigadores geralmente são capazes de ajustar os parâmetros experimentais para maximizar a probabilidade de que os primers hibridizem com os alvos corretos.

Os iniciadores de PCR são tipicamente oligonucleotídeos sintéticos entre 18 e 25 bases de comprimento. Ao projetar um primer, os pesquisadores consideram seu Tm, a temperatura na qual metade dos híbridos formados entre o primer e o molde irão derreter. Em geral, a estabilidade térmica de um híbrido aumenta com o comprimento do primer e seu conteúdo de GC. (Lembre-se de que um par de bases GC é estabilizado por três ligações H, em comparação com duas para um par AT.) A fórmula a seguir fornece uma estimativa aproximada de Tm de híbridos de oligonucleotídeos. Nesta fórmula, n refere-se ao número de nucleotídeos, e a concentração de cátions monovalentes é expressa em unidades molares (M).


Aplicações de PCR

Saúde Humana e o Projeto Genoma Humano

A PCR é uma ferramenta essencial que pode ser usada para melhorar a saúde e a vida humana. Na ciência médica, o PCR é usado para a detecção de organismos infecciosos e a detecção de mutações em vários genes. No caso da detecção de doenças como a AIDS, a PCR pode ser utilizada para estudar diretamente o DNA do vírus e é mais específica do que a detecção padronizada feita por ELISA. Além disso, a PCR tem alto potencial na aplicação de detecção de doenças como a doença de Lyme, onde pode identificar diretamente a presença de DNA bacteriano no tratamento conjunto. PCR também é usado para a detecção de Helicobacterium pylori e doenças virais sexualmente transmissíveis. O projeto do genoma humano se refere ao estudo de todos os genes humanos. O PCR desempenha um papel importante neste projeto, pois ajuda a identificar genes específicos juntamente com mutações e taxas de mutações nesses genes.

Impressão digital genética

Essa técnica é usada na ciência forense para comparar o DNA de uma pessoa com uma determinada amostra, como uma amostra de sangue encontrada na cena do crime. A amostra pode conter uma quantidade muito pequena de DNA. A aplicação da PCR vem nesta parte para amplificar a pequena quantidade de DNA de amostras como sangue, sêmen, saliva, cabelo, etc. Os fragmentos de DNA amplificados são posteriormente analisados ​​por eletroforese em gel.

Detecção de doença hereditária

É difícil entender as doenças hereditárias devido à sua conexão direta com o genoma. Este processo complexo e difícil pode ser facilmente analisado usando PCR. A PCR pode amplificar o DNA e, usando um marcador específico, pode-se detectar o gene responsável pela doença. Além disso, a taxa de mutação naquele gene específico também pode ser analisada por meio de PCR.

A clonagem de genes tem diferentes aplicações em escala industrial e laboratorial e a PCR pode ser usada para clonagem de genes específicos. Quando um determinado gene de interesse precisa ser clonado, a PCR é usada para amplificar o gene. Ele é então inserido em um vetor e o vetor é então transportado o gene dentro de uma célula. Portanto, a PCR é necessária para completar os estudos de clonagem de genes.

Análise de DNA antigo

O PCR pode ser usado na análise de DNA antigo. Por exemplo, o DNA isolado de múmias egípcias pode ser amplificado em PCR para estudos posteriores e identificação da pessoa. O gene pode ser usado para comparar com o gene de tempo recente e a análise evolutiva também pode ser realizada.


Estrutura da DNA polimerase ζ: capturando o driver da fuga

Durante a síntese de translesão, a DNA polimerase eucariótica ζ realiza a extensão de uma ampla gama de lesões de DNA. A elucidação da estrutura crio-EM da polimerase ζ revela como a enzima catalisa a síntese da fita de DNA além da lesão.

A síntese de translesão (TLS) é uma via mais propensa a erros usada pelas células para contornar o dano ao DNA que bloqueia a replicação normal do DNA 1,2,3,4,5,6. Durante a TLS, a DNA polimerase replicativa paralisada é substituída por uma ou mais TLS polimerases especializadas, que realizam a replicação através da lesão de DNA. Em muitos casos, o TLS requer duas polimerases especializadas: um 'insersor', para incorporar um nucleotídeo através da lesão de DNA, e um 'extensor', para catalisar a síntese adicional de fita de DNA. A polimerase "extensível" primária em eucariotos é a DNA polimerase (Pol) ζ 7. Embora essa enzima tenha sido purificada pela primeira vez há quase vinte e cinco anos 8, os estudos estruturais não tiveram sucesso, em parte devido à incapacidade de obter quantidades suficientes da proteína para a cristalografia de raios-X. Agora, Malik et al. 9 relatam uma estrutura crio-EM de Pol ζ de Saccharomyces cerevisiae e descrever as características estruturais que permitem catalisar a etapa de extensão do TLS.


Função de RNA polimerase

A RNA polimerase é a enzima mais importante no processo de transcrição. Lembre-se de que a transcrição é o processo de copiar o DNA de fita dupla em uma única fita de RNA. Eles podem parecer um pouco diferentes, mas ambos são escritos na linguagem de nucleotídeos. Para que a RNA polimerase comece seu trabalho, ela deve primeiro encontrar um apropriado região promotora. Esta região pode ser segmentada por fatores de transcrição em eucariotos. Essas proteínas se ligam ao local, criando um arranjo adequado para a RNA polimerase se ligar e iniciar a transcrição. Nas bactérias, existe apenas um único promotor, o fator de iniciação sigma. Este processo pode ser visto com a molécula de polimerização de RNA generalizada mostrada abaixo transcrevendo o DNA. Os fatores de transcrição não são mostrados.

À medida que a RNA polimerase se liga ao DNA, ela muda conformação, ou forma. Isso inicia a reação em cadeia enzimática que desenvolve uma nova cadeia de nucleotídeos em uma molécula de RNA baseada no modelo apresentado. Após a RNA polimerase ter criado esta nova molécula, o RNA deve ser processado e liberado do núcleo. Agora chamado RNA mensageiro, ou mRNA, ele encontrará um ribossomo que possui os mecanismos apropriados para o processo de tradução.

Muito parecido com a tradução do inglês para o espanhol, o ribossomo deve “ler” a sequência do RNA e converter a mensagem para a linguagem de aminoácidos. Essas pequenas moléculas formam longas cadeias, que se dobram em formas intrincadas para se tornarem proteínas bioquimicamente ativas. Essas proteínas, por sua vez, criam e mantêm partes do DNA, bem como o replicam. Partes do DNA armazenam a informação genética para a própria proteína RNA polimerase, que é primeiro decodificada por uma molécula de RNA polimerase. Essa situação é realmente a base do ovo e da galinha, se você pensar bem.


Estágio de conclusão do replicação: DNA Polimerase I

Uma vez que a DNA Polimerase III emparelha a maioria dos D-nucleotídeos complementares no desenvolvimento da fita principal e posterior, os primers de RNA ainda estão presentes. Outra enzima DNA polimerase, DNA polimerase I lê ambas as fitas principais e posteriores de 5 'a 3' das fitas parentais substituindo os nucleotídeos R por D-nucleotídeos. Embora a fita principal seja sintetizada continuamente, ainda há um primer de RNA na origem da bolha de replicação. Também é substituído pela DNA Polimerase I.

Estágio de conclusão do replicação: Ligase

Depois que a DNA Polimerase I substitui os primers de RNA, não há ligação fosfodiéster entre os fragmentos de Okazaki. Outra enzima, ligase, desce a fita retardada criando uma ligação fosfodiéster conectando os fragmentos de Okazaki.

Ligase une fragmentos de Okazaki.

Estágio de conclusão do replicação: telomerase

Em procariotos, uma vez que a ligase termina de conectar os fragmentos de Okazaki, o DNA foi replicado com sucesso. Isso se deve ao formato circular de seu DNA. No entanto, o DNA eucariótico é linear. Na vertente retardada, isso representa um problema. No final dos cromossomos, conhecido como o telômeros, não há nenhum lugar para a DNA Polimerase III se conectar devido à ausência de um primer de RNA. Se esses D-nucleotídeos nos telômeros não fossem sintetizados, as fitas de DNA eventualmente se tornariam mais curtas a cada replicação. Pensa-se que o envelhecimento é um produto do mau funcionamento da telomerase.

A telomerase estende as extremidades (telômeros) da fita retardada.

A telomerase é uma enzima que se liga à extremidade não sintetizada da fita retardada e catalisa a síntese de DNA a partir de seu próprio modelo de RNA, semelhante à engenharia reversa. Em uma extremidade da telomerase, alguns R-nucleotídeos combinam-se com a extremidade da fita não replicada. A telomerase então adiciona D-nucleotídeos ao final da fita retardada.

As extremidades opostas da telomerase são idênticas. O lado oposto da telomerase (se você ler da esquerda para a direita) termina com os mesmos R-nucleotídeos (AUU). A telomerase usa esse fenômeno para se desprender uma vez que o fio de retardamento foi estendido e, em seguida, reconectar de volta ao final do fio de retardamento estendido. A telomerase reconectada replica outra cópia exata da fita retardada. Este processo acontece várias vezes e a telomerase é eventualmente removida.

Uma vez que a telomerase alonga a fita parental retardada, primase se liga sintetizando um primer de RNA, que permite ao DNA Polimerase III replicar os nucleotídeos D restantes na fita não replicada. Ligase funde o último segmento restante criando a ligação fosfodiéster final. Isso resulta em duas cópias exatas do DNA original com telômeros ligeiramente mais longos.

Reparando erros

A DNA Polymerase III é extremamente precisa. Outra DNA polimerase atua como um leitor de provas, DNA polimerase II. Uma vez que a replicação está completa, a DNA Polimerase II viaja por todo o link das fitas do DNA parental em busca de pares de bases incompatíveis. Assim que detecta uma incompatibilidade, a DNA Polimerase II remove o D-nucleotídeo da nova fita de DNA e o substitui pelo D-nucleotídeo complementar à fita parental.

No entanto, mesmo esta etapa de revisão não é totalmente precisa, a falta de par de bases incompatíveis ocorre aproximadamente um a cada bilhão de vezes. Esses erros levam a mutações no nível dos nucleotídeos. Essas mutações são a única maneira pela qual novos alelos são gerados e geralmente são neutras ou deletérias em relação à aptidão. Ocasionalmente, essas mutações criarão fenótipos benéficos, permitindo a esses organismos uma probabilidade maior de sobreviver e se reproduzir. Essas mutações tendem a se amplificar nas gerações futuras devido à seleção natural.


Reação em cadeia da polimerase

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Reação em cadeia da polimerase (PCR), uma técnica usada para fazer várias cópias de um segmento específico de DNA com rapidez e precisão. A reação em cadeia da polimerase permite que os investigadores obtenham grandes quantidades de DNA que são necessárias para vários experimentos e procedimentos em biologia molecular, análise forense, biologia evolutiva e diagnósticos médicos.

O PCR foi desenvolvido em 1983 por Kary B. Mullis, um bioquímico americano que ganhou o Prêmio Nobel de Química em 1993 por sua invenção. Antes do desenvolvimento da PCR, os métodos usados ​​para amplificar ou gerar cópias de fragmentos de DNA recombinante eram demorados e trabalhosos. Em contraste, uma máquina projetada para realizar reações de PCR pode completar muitas rodadas de replicação, produzindo bilhões de cópias de um fragmento de DNA, em apenas algumas horas.

A técnica de PCR é baseada nos processos naturais que uma célula usa para replicar uma nova fita de DNA. Apenas alguns ingredientes biológicos são necessários para a PCR. O componente integral é o DNA molde - ou seja, o DNA que contém a região a ser copiada, como um gene. Apenas uma molécula de DNA pode servir de modelo. A única informação necessária para que este fragmento seja replicado é a sequência de duas regiões curtas de nucleotídeos (as subunidades do DNA) em cada extremidade da região de interesse. Essas duas sequências modelo curtas devem ser conhecidas para que dois primers - pequenos trechos de nucleotídeos que correspondem às sequências modelo - possam ser sintetizados. Os primers se ligam, ou anelam, ao modelo em seus locais complementares e servem como ponto de partida para a cópia. A síntese de DNA em um primer é direcionada para o outro, resultando na replicação da sequência interveniente desejada. Também são necessários nucleotídeos livres usados ​​para construir as novas fitas de DNA e uma DNA polimerase, uma enzima que faz a construção adicionando sequencialmente nucleotídeos livres de acordo com as instruções do modelo.

A PCR é um processo de três etapas que é realizado em ciclos repetidos. A etapa inicial é a desnaturação, ou separação, das duas fitas da molécula de DNA. Isto é conseguido aquecendo o material de partida a temperaturas de cerca de 95 ° C (203 ° F). Cada fio é um modelo no qual um novo fio é construído. Na segunda etapa, a temperatura é reduzida para cerca de 55 ° C (131 ° F) para que os primers possam recozer com o molde. Na terceira etapa, a temperatura é elevada para cerca de 72 ° C (162 ° F), e a DNA polimerase começa a adicionar nucleotídeos nas extremidades dos primers recozidos. Ao final do ciclo, que dura cerca de cinco minutos, a temperatura sobe e o processo recomeça. O número de cópias dobra após cada ciclo. Normalmente, 25 a 30 ciclos produzem uma quantidade suficiente de DNA.

No procedimento de PCR original, um problema era que a DNA polimerase precisava ser reabastecida após cada ciclo porque não é estável nas altas temperaturas necessárias para a desnaturação. Este problema foi resolvido em 1987 com a descoberta de uma DNA polimerase estável ao calor chamada Taq, uma enzima isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus, que habita fontes termais. Taq a polimerase também levou à invenção da máquina de PCR.

Como o DNA de uma ampla variedade de fontes pode ser amplificado, a técnica foi aplicada a muitos campos. A PCR é usada para diagnosticar doenças genéticas e detectar baixos níveis de infecção viral. Na medicina legal, é usado para analisar vestígios minúsculos de sangue e outros tecidos, a fim de identificar o doador por sua “impressão digital” genética. A técnica também foi usada para amplificar fragmentos de DNA encontrados em tecidos preservados, como os de um mamute lanudo congelado de 40.000 anos ou de um humano de 7.500 anos encontrado em uma turfa.

Este artigo foi revisado e atualizado mais recentemente por Erik Gregersen, Editor Sênior.


Qual é a função da DNA polimerase?

A replicação do DNA requer o desenrolamento da estrutura complementar de duas fitas do DNA. Este processo é mediado pelo rompimento das ligações de hidrogênio que mantêm as bases unidas, resultando na formação de duas fitas simples.

A aparência em forma de Y resultante nessa região do DNA é chamada de forquilha de replicação. O início da replicação ocorre em locais específicos chamados de origem de replicação (ori). Após o estabelecimento da bifurcação de replicação, vem o replissome, vários fatores que permitem que a replicação ocorra.

As polimerases de DNA são um desses fatores cruciais. São enzimas com várias subunidades que participam do processo de replicação do DNA na célula. Eles catalisam a adição de nucleotídeos às fitas de DNA existentes. Existem muitas famílias de DNA polimerase que desempenham um papel na replicação do DNA, existem pelo menos 15 em humanos e são necessárias em diferentes pontos durante o processo.

Função da polimerase durante a replicação do DNA

As enzimas da DNA polimerase normalmente funcionam em pares, cada enzima replica uma das duas fitas que compõem a dupla hélice do DNA. Eles são chamados de filamento principal e filamento posterior e são nomeados de acordo com a velocidade relativa em que são replicados.

As fitas replicadas são sintetizadas usando as fitas principais e posteriores como modelos. Conseqüentemente, as duas novas moléculas de DNA de fita dupla produzidas consistem em uma fita da hélice original (a fita principal ou a final) e uma nova fita. Esse processo é chamado de replicação semiconservativa e é essencial, pois permite que a informação genética seja transmitida de geração em geração.

As atividades de ambas as DNA polimerases são coordenadas por duas estruturas chamadas de carregador de grampo deslizante e grampo deslizante. The sliding clamp loader contacts single-stranded binding proteins that coat the separated helix as well as the sliding clamp.

Two sliding clamps encircle the two strands of DNA, and together with accessory proteins called the clamp loader complex, provide a stable binding site for the two DNA polymerases. The unwound single-stranded DNA templates move toward the complex the behavior of the clamp loader on the leading and lagging strand differ because of a property called directionality.

This is determined by the orientation of the phosphate bond and characterized by the conventions 5’ to 3’ and 3’ to 5’. Each of the two strands of the helix necessarily possess opposite directionality this is essential for base pairing to occur. Their pairing is also referred to as antiparallel.

DNA polymerase synthesizes only in a 5′ to 3′ direction. Consequently, the strand with the complementary 3’ to 5’ directionality, the leading strand, is synthesized as one continuous piece. Conversely, the strand with 5’ to 3’ directionality is synthesized as a series of small fragments called Okazaki fragments.

The lagging strand orientation of 5’ to 3’ is incompatible with DNA polymerase to accommodate this requirement, the clamp loader must continually release and reattach at a new location. This requires the lagging strand to bubble out from the replisome.

Polymerases for DNA repair

Several polymerases exist in both prokaryotes and eukaryotes. They provide polymerase activity under two broad categories normal replication and repair. Under conditions of normal replication, DNA polymerase corrects errors by 3′ → 5′ exonuclease activity.

Outside of normal replicative events, DNA repair is an ongoing process that is necessary to maintain the integrity of the genome. Both endogenous and exogenous insults result in damaged DNA for example, single-strand and double-strand breaks, strand cross-linking, base loss, and base modification.

Multiple pathways exist to repair these DNA damage events in a selective manner. These include mismatch repair, nucleotide excision repair, base excision repair, double-strand break repair, and inter-strand cross-link repair. The biochemical difference that exists between these polymerases allows them to fulfill distinct roles under these specific conditions of repair.


Assista o vídeo: DNA Replication 3D Animation (Novembro 2021).