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11.5: Animais transgênicos - Biologia


Um animal transgênico é aquele que carrega um gene estranho que foi deliberadamente inserido em seu genoma. Além do próprio gene, o DNA geralmente inclui outras sequências para permitir que ele seja incorporado ao DNA do hospedeiro e seja expresso corretamente pelas células do hospedeiro. Têm sido produzidos ovelhas e cabras transgênicas que expressam proteínas estranhas em seu leite. As galinhas transgênicas agora são capazes de sintetizar proteínas humanas na "clara" de seus ovos. Esses animais acabarão se revelando fontes valiosas de proteínas para a terapia humana.

Observação

Em julho de 2000, pesquisadores da equipe que produziu Dolly relataram sucesso na produção de cordeiros transgênicos nos quais o transgene foi inserido em um local específico do genoma e funcionou bem.

Transgênico camundongos forneceram as ferramentas para explorar muitas questões biológicas.

Exemplo

Camundongos normais não podem ser infectados com o vírus da poliomielite. Eles não têm a molécula da superfície celular que, em humanos, serve como receptor para o vírus. Portanto, ratos normais não podem servir como um modelo barato e facilmente manipulado para estudar a doença. No entanto, camundongos transgênicos que expressam o gene humano para o receptor do vírus da poliomielite

  • pode ser infectado pelo vírus da poliomielite e até mesmo
  • desenvolver paralisia e outras alterações patológicas características da doença em humanos.

Dois métodos de produção de camundongos transgênicos são amplamente utilizados:

  • transformando células-tronco embrionárias (ES células) crescendo em cultura de tecidos com o DNA desejado
  • injetar o gene desejado no pró-núcleo de um ovo de rato fertilizado

Fig.11.4.1 Métodos para produzir camundongos transgênicos

Método das células-tronco embrionárias - Método 1

Células-tronco embrionárias (ES células) são colhidas do massa celular interna (ICM) de blastocistos de camundongo. Eles podem ser cultivados em cultura e reter todo o seu potencial para produzir todas as células do animal maduro, incluindo seus gametas.

1. Faça o seu DNA

Usando métodos de DNA recombinante, construa moléculas de DNA contendo

  • o gene que você deseja (por exemplo, o gene da insulina)
  • vetor DNA para permitir que as moléculas sejam inseridas nas moléculas de DNA do hospedeiro
  • sequências promotoras e potenciadoras para permitir que o gene seja expresso pelas células hospedeiras

2. Transforme as células ES em cultura

Exponha as células cultivadas ao DNA para que algumas o incorporem.

3. Selecione para células transformadas com sucesso

4. Injetar essas células na massa celular interna (ICM) de blastocistos de camundongo.

5. Transferência de embriões

  • Prepare um pseudo-gestante camundongo (cruzando uma camundonga fêmea com um macho vasectomizado). O estímulo do acasalamento provoca as mudanças hormonais necessárias para tornar o útero receptivo.
  • Transfira os embriões para o útero.
  • Espero que eles implantar com sucesso e se desenvolver em filhotes saudáveis ​​(não mais do que um terço).

6. Teste sua prole

  • Remova um pequeno pedaço de tecido da cauda e examine seu DNA para o gene desejado. Não mais do que 10–20% o terão e serão heterozigotos para o gene.

7. Estabelecer uma cepa transgênica

  • Acasalar dois camundongos heterozigotos e selecionar sua prole para 1 em cada 4 que será homozigoto para o transgene.
  • O acasalamento desses irá encontrar a cepa transgênica.

O Método do Pronúcleo - Método 2

1. Prepare seu DNA como no Método 1

2. Transforme os ovos fertilizados

  • Colha os óvulos recém-fertilizados antes que a cabeça do espermatozoide se torne um pró-núcleo.
  • Injete o pró-núcleo masculino com seu DNA.
  • Quando os pró-núcleos se fundem para formar o núcleo diplóide do zigoto, permita que o zigoto se divida por mitose para formar um embrião de 2 células.

3. Implante os embriões em uma mãe adotiva pseudo-grávida e proceda como no Método 1.

Exemplo

Esta imagem (cortesia de R. L. Brinster e R. E. Hammer) mostra um camundongo transgênico (à direita) com uma ninhada normal (à esquerda). O camundongo gigante se desenvolveu a partir de um óvulo fertilizado transformado com uma molécula de DNA recombinante contendo:

  • o gene para hormônio de crescimento humano
  • um forte gene de camundongo promotor

Os níveis de hormônio do crescimento no soro de alguns dos camundongos transgênicos eram várias centenas de vezes maiores do que nos camundongos de controle.

Inserção de gene aleatório vs. direcionado

Os primeiros vetores usados ​​para a inserção do gene podiam, e colocaram, o gene (de uma a 200 cópias dele) em qualquer lugar do genoma. No entanto, se você conhece parte da sequência de DNA que flanqueia um determinado gene, é possível projetar vetores que substituem esse gene. O gene de substituição pode ser aquele que

  • restaura a função em um animal mutante ou
  • elimina a função de um locus particular.

Em ambos os casos, a inserção de genes direcionados requer

  • o gene desejado
  • neor, um gene que codifica uma enzima que inativa o antibiótico neomicina e seus parentes, como a droga G418, que é letal para células de mamíferos
  • tk, um gene que codifica timidina quinase, uma enzima que fosforila o análogo de nucleosídeo ganciclovir. DNA polimerase falha em discriminar contra o nucleotídeo resultante e insere este nucleotídeo não funcional em DNA recém-replicado. Assim, o ganciclovir mata as células que contêm o tk gene

Passo 1

Trate a cultura de células ES com a preparação do DNA do vetor.

Resultados:

  • A maioria das células deixar de captar o vetor; essas células serão mortas se expostas ao G418.
  • Em um poucas células: o vetor é inserido aleatoriamente no genoma. Na inserção aleatória, todo o vetor, incluindo o tk gene, é inserido no DNA do hospedeiro. Essas células são resistentes ao G418, mas são mortas pelo ganciclovir.
  • No ainda menos células: recombinação homóloga ocorre. Trechos de sequência de DNA no vetor encontram as sequências homólogas no genoma do hospedeiro, e a região entre essas sequências homólogas substitui a região equivalente no DNA do hospedeiro.

Passo 2

Cultivar a mistura de células em meio contendo G418 e ganciclovir.

  • As células (a maioria) que não conseguiram captar o vetor são mortas por G418.
  • As células nas quais o vetor foi inserido aleatoriamente são mortas pelo ganciclovir (porque contêm o tk gene).
  • Isso deixa uma população de células transformadas por recombinação homóloga (enriquecida vários milhares de vezes).

etapa 3

Injete-os na massa celular interna dos blastocistos de camundongo.

Ratos Knockout: O que eles nos ensinam?

Se o gene de substituição (UMA* no diagrama) não é funcional (um alelo "nulo"), o acasalamento dos camundongos transgênicos heterozigotos produzirá uma cepa de "ratos nocaute"homozigoto para o gene não funcional (ambas as cópias do gene naquele locus foram" nocauteadas "). Camundongos knockout são ferramentas valiosas para descobrir a (s) função (ões) de genes para os quais cepas mutantes não estavam disponíveis anteriormente. Duas generalizações surgiram do exame de ratos knockout:

  • Os camundongos knockout geralmente não são afetados por sua deficiência. Muitos genes acabam não sendo indispensáveis. O genoma do mouse parece ter redundância suficiente para compensar a falta de um único par de alelos.
  • A maioria dos genes são pleiotrópico. Eles são expressos em diferentes tecidos de maneiras diferentes e em diferentes momentos do desenvolvimento.

Ratos Knockout Específicos de Tecido

Embora os genes de "manutenção" sejam expressos em todos os tipos de células em todos os estágios de desenvolvimento, outros genes são normalmente expressos apenas em certos tipos de células quando ativados pelos sinais apropriados (por exemplo, a chegada de um hormônio).

Para estudar esses genes, pode-se esperar que os métodos descritos acima funcionem. No entanto, descobriu-se que genes que são expressos apenas em certos tecidos adultos podem ser vitais durante o desenvolvimento embrionário. Nesses casos, os animais não sobrevivem o suficiente para que seu gene knockout seja estudado. Felizmente, agora existem técnicas com as quais camundongos transgênicos podem ser feitos, onde um determinado gene é eliminado em apenas um tipo de célula.

The Cre /loxP Sistema

Um dos bacteriófagos que infecta E. coli, chamado P1, produz uma enzima - designada Cre - que corta seu DNA em comprimentos adequados para embalagem em partículas virais frescas. Cre corta o DNA viral sempre que encontra um par de sequências designadas loxP. Todo o DNA entre os dois loxP os locais são removidos e o DNA remanescente ligado novamente (de forma que a enzima é uma recombinase). Usando o "Método 1" acima, os camundongos podem ser transformados em transgênicos para

  • o gene que codifica Cre ligado a um promotor que será ativado apenas quando for ligado pelos mesmos fatores de transcrição que ativam os outros genes necessários para a (s) função (ões) única (s) daquele tipo de célula;
  • um gene "alvo", aquele cuja função será estudada, flanqueado por loxP sequências.

No animal adulto,

  • aquelas células que
    • receber sinais (por exemplo, a chegada de um hormônio ou citocina)
    • para ligar a produção dos fatores de transcrição necessários
    • para ativar os promotores dos genes cujos produtos são necessários para aquele tipo particular de célula
    também ativará a transcrição do gene Cre. Sua proteína irá então remover o gene "alvo" em estudo.
  • Todas as outras células não terão os fatores de transcrição necessários para se ligarem ao promotor Cre (e / ou quaisquer intensificadores), de forma que o gene alvo permanece intacto.

O resultado: um camundongo com um determinado gene eliminado apenas em algumas células.

Ratos Knock-in

The Cre /loxP sistema também pode ser usado para

  • remover sequências de DNA que bloqueiam a transcrição do gene. O gene "alvo" pode então ser transformado sobre em certas células ou em determinados momentos, como o experimentador deseja.
  • substitua um dos genes do próprio rato por um novo gene que o investigador deseja estudar.

Esses camundongos transgênicos são chamados de camundongos "knock-in".

Ovelhas e cabras transgênicas

Até recentemente, os transgenes introduzidos em ovelhas inseridos aleatoriamente no genoma e geralmente funcionavam mal. No entanto, em julho de 2000, o sucesso na inserção de um transgene em um locus de gene específico foi relatado. O gene era o gene humano para alfa1-antitripsina, e dois dos animais expressaram grandes quantidades da proteína humana no leite.

É assim que foi feito.

Fibroblastos de ovelha (células de tecido conjuntivo) crescendo em cultura de tecidos foram tratados com um vetor que continha estes segmentos de DNA:

  1. 2 regiões homólogas à ovelha COL1A1 gene. Este gene codifica o colágeno Tipo 1. (Sua ausência em humanos causa a doença hereditária osteogênese imperfeita.)

    Esse locus foi escolhido porque os fibroblastos secretam grandes quantidades de colágeno e, portanto, seria de se esperar que o gene fosse facilmente acessível na cromatina.

  2. Um gene de resistência à neomicina para auxiliar no isolamento das células que incorporaram com sucesso o vetor.
  3. O gene humano que codifica a alfa1-antitripsina.

    Algumas pessoas herdam dois genes que não funcionam ou que funcionam mal para essa proteína. Seu baixo nível ou ausência resultante produz a doença Deficiência de alfa1-antitripsina (A1AD ou Alpha1) Os principais sintomas são danos aos pulmões (e às vezes ao fígado).

  4. Sites de promotores do beta-lactoglobulina gene. Estes promovem a expressão gênica impulsionada por hormônios em células produtoras de leite.
  5. Sítios de ligação para ribossomos para tradução eficiente dos mRNAs da beta-lactoglobulina.

As células transformadas com sucesso foram então

  • Fundido com ovos de ovelha enucleados e implantado no útero de uma ovelha (ovelha)
  • Vários embriões sobreviveram até o nascimento, e dois cordeiros viveram mais de um ano.
  • Quando tratados com hormônios, esses dois cordeiros secretaram leite contendo grandes quantidades de alfa1-antitripsina (650 µg / ml; 50 vezes mais do que os resultados anteriores usando a inserção aleatória do transgene).

Em 18 de junho de 2003, a empresa que fazia esse trabalho o abandonou devido ao grande custo de construção de uma instalação para purificar a proteína do leite de ovelha. A purificação é importante porque, mesmo quando 99,9% puro, os pacientes humanos podem desenvolver anticorpos contra as pequenas quantidades de proteínas de ovelha que permanecem.

No entanto, outra empresa, a GTC Biotherapeutics, perseverou e, em junho de 2006, obteve a aprovação preliminar para comercializar uma proteína humana, a antitrombina, na Europa. Sua proteína - a primeira produzida em um animal transgênico a receber aprovação regulatória para terapia humana - foi secretada no leite de cabras transgênicas.

Galinhas Transgênicas

As galinhas crescem mais rápido do que ovelhas e cabras e um grande número pode ser criado em quartos próximos. Eles também sintetizam vários gramas de proteína na "clara" de seus ovos. Dois métodos tiveram sucesso na produção de galinhas carregando e expressando genes estranhos.

  • Infectando embriões com um vetor viral portador
    • o gene humano para uma proteína terapêutica
    • sequências de promotor que irão responder aos sinais para a produção de proteínas (por exemplo, lisozima) na clara do ovo
  • Transformação de espermatozoides de galo com um gene humano e os promotores apropriados e verificação de qualquer prole transgênica.

Os resultados preliminares de ambos os métodos indicam que pode ser possível para as galinhas produzirem até 0,1 g de proteína humana em cada ovo que põem.

Isso não deveria custar apenas menos do que produzir proteínas terapêuticas em recipientes de cultura, mas as galinhas provavelmente adicionarão os açúcares corretos às proteínas glicosiladas - algo que a E. coli não pode fazer.

Porcos Transgênicos

Porcos transgênicos também foram produzidos pela fertilização de óvulos normais com células de esperma que incorporaram DNA estranho. Este procedimento, denominado transferência de genes mediada por esperma (SMGT), pode algum dia ser capaz de produzir porcos transgênicos que podem servir como fonte de órgãos transplantados para humanos.

Primatas Transgênicos

Na edição de 28 de maio de 2009 de Natureza, Cientistas japoneses relataram sucesso na criação de saguis transgênicos. Os saguis são primatas e, portanto, nossos parentes mais próximos (até agora) para serem geneticamente modificados. Em alguns casos, o transgene (para proteína fluorescente verde) foi incorporado à linha germinativa e passado para a prole do animal. A esperança é que esses animais transgênicos forneçam o melhor modelo para o estudo de doenças humanas e possíveis terapias.


3 exemplos importantes de animais transgênicos | Genética

Os pontos a seguir destacam os três exemplos importantes de animais transgênicos. Os exemplos são: 1. Clonagem de Dolly 2. Camundongos transgênicos 3. Sistema de repórter.

Exemplo # 1. Clonagem Dolly:

Em fevereiro de 1996, Ian Wilmut e colegas de trabalho do Roslin Institute e PPL Therapeutics, ambos em Edimburgo, Escócia, relataram na revista Nature que clonaram com sucesso uma ovelha de uma célula retirada do úbere de uma ovelha de seis anos.

O cordeiro clonado foi nomeado Dolly. No passado, os embi70s de animais geneticamente idênticos eram criados apenas com células de anfíbios, e aqueles criados a partir de núcleos adultos nunca haviam atingido a idade adulta. A clonagem em que os núcleos provinham de células fetais ou células de linhagens celulares já havia sido bem-sucedida antes em mamíferos. A palavra clone significa criar uma cópia geneticamente idêntica.

Para clonar um animal, é necessário começar com um ovo, a única célula conhecida por iniciar e apoiar o desenvolvimento. Para clonar um indivíduo, é necessário obter um óvulo sem núcleo e, então, transplantar nele um núcleo de origem conhecida.

Técnicas de transplante nuclear foram desenvolvidas com sapos e rãs na década de 1950. Os cientistas escoceses conseguiram obter óvulos de ovelha, enucleando-os (removendo seus núcleos) e, em seguida, transferindo-os em núcleos doadores, fundindo as células doadoras e os óvulos enucleados com um pulso elétrico.

O pulso elétrico também iniciou o desenvolvimento do ovo. Embora apenas uma das vinte e nove gestações iniciadas tenha sido bem-sucedida, a ovelha que nasceu parecia normal em todos os aspectos, já que havia gerado descendentes.

Outros tentaram esse tipo de experimento com muitos tipos de animais, incluindo ratos. Eles não tiveram sucesso por vários motivos. A explicação mais provável para o sucesso recente, segundo os cientistas, é que as células doadoras foram mantidas em uma fase de não crescimento por vários dias, o que pode ter sincronizado com o oócito.

Assim, o núcleo e o oócito estavam no mesmo estágio do ciclo celular e, portanto, eram compatíveis. Outras reorganizações que tiveram que ocorrer nos cromossomos doadores não são realmente conhecidas com certeza, mas uma coisa é certa: o núcleo de uma célula adulta na ovelha tem todo o material genético necessário para suportar o crescimento e desenvolvimento normais do ovo. O trabalho foi repetido desde então com cabras, gado e ratos.

Existem várias ramificações para o sucesso deste trabalho:

1. A clonagem de mamíferos pode se tornar um procedimento de rotina. Isso nos permitiria estudar o desenvolvimento dos mamíferos e replicar indivíduos geneticamente idênticos, particularmente animais transgênicos que teriam um genoma particular de valor.

2. Também podemos usar essas técnicas para estudar o envelhecimento, desde um núcleo & # 8220old & # 8221 no início do desenvolvimento de um novo organismo.

3. Além disso, é interessante a interação de um genoma específico com um citoplasma específico, uma vez que o citoplasma contém não apenas o material necessário para o desenvolvimento inicial, mas também organelas celulares, incluindo mitocôndrias que possuem seu próprio material genético.

Exemplo # 2. Camundongos transgênicos:

As células animais, como os protoplastos das células vegetais, podem captar cromossomos estranhos ou DNA diretamente do ambiente com uma eficiência muito baixa (na presença de fosfato de cálcio). A injeção direta de DNA melhora muito a eficiência.

Por exemplo, camundongos transgênicos são agora rotineiramente preparados pela injeção de DNA em oócitos ou em embriões de uma ou duas células obtidos de camundongos fêmeas após tratamento hormonal apropriado.

Após a injeção de cerca de 2 picolitros (2 x 10-12 litros) de DNA clonado, as células são reimplantadas no útero de hospedeiras fêmeas receptivas. Em cerca de 15% dessas injeções, o DNA estranho se incorpora ao embrião.

Animais transgênicos são usados ​​para estudar a expressão e controle de genes eucarióticos estranhos. Em 1988, um camundongo transgênico com tendência ao câncer foi o primeiro animal geneticamente modificado a ser patenteado. Assim, o mouse fornece um excelente modelo para estudar o câncer. (Surgiu uma controvérsia sobre se os organismos superiores modificados deveriam ser patenteáveis ​​atualmente).

Os camundongos já foram transfectados com sucesso com um gene do hormônio do crescimento do rato, e ovelhas transgênicas foram produzidas que expressam o gene para um fator de coagulação humano. Surgiu a última disputa sobre o DNA recombinante, a partir da clonagem de ovelhas em 1997.

A transfecção também pode ser mediada por retrovírus (vírus de RNA contendo o gene da transcriptase reversa). Por exemplo, um vetor retroviral foi ritrodused e reparado o glóbulo branco humano sem a enzima adenosina desaminase.

Um retrovírus responsável por uma forma de leucemia em roedores, o vírus da leucemia murina Moloney foi projetado de forma que todos os genes do vírus fossem removidos e substituídos por um marcador antibiótico (resistência à neomicina) e o gene humano da adenosina desaminase.

O vírus se liga à superfície da célula e é levado para dentro da célula, seu RNA é convertido em DNA por transcrição reversa e o DNA é incorporado em uma das células, os cromossomos. Não é possível para o vírus altamente modificado atacar e danificar as células.

Exemplo # 3. Sistema de Repórter:

Dois sistemas repórter são usados ​​para indicar que uma experiência de transfecção foi bem-sucedida. As plantas podem ser transfectadas com os plasmídeos Ti de Agrobacterium tumefaciens. Quando uma planta é infectada com A. tumefaciens contendo o plasmídeo Ti, um tumor de galha em coroa é induzido, transferindo a região do T-DNA.

Essas células transfectadas com o T-DNA são induzidas a crescer, bem como a produzir opinas, das quais as bactérias se alimentam. Muitas pesquisas recentes se concentraram na engenharia de plasmídeos Ti para conter outros genes que também são transferidos para as plantas hospedeiras durante a infecção, criando plantas transgênicas. Uma série de experimentos foi especialmente encantadora.

As plantas de tabaco foram transinfetadas por plasmídeos Ti contendo o gene da luciferase de vaga-lumes. O produto desse gene catalisa a oxidação dependente de ATP da luciferina, que emite luz. Quando uma planta transfectada é regada com luciferina, ela brilha como um vaga-lume. O valor desses experimentos não é a produção de plantas brilhantes, mas sim o uso do brilho para & # 8220 relatar & # 8221 a ação de genes específicos.

Em outras experiências, os promotores e intensificadores de certos genes foram ligados ao gene da luciferase. Como resultado, a luciferase só seria produzida quando esses promotores fossem ativados, portanto, as áreas brilhantes da planta mostram onde o gene transfectado está ativo.

Um dos sistemas desenvolvidos mais recentemente relatados usa um gene de água-viva que produz proteína fluorescente verde. O valor desse sistema é que ele & # 8220 informa & # 8221 quando a luz ultravioleta incide sobre ele, em vez de exigir uma adição, como no sistema de luciferase (ver Tamarin, 2002).


Animais Transgênicos

Ratos transgênicos e outros animais. Um dos primeiros relatos de animais transgênicos publicado em dezembro de 1982 envolveu a transferência do gene do hormônio do crescimento (GH) (de rato) fundido ao promotor do gene da metalotioneína 1 (MT) de camundongo. Desde então, muitos animais transgênicos, incluindo aqueles em gado, ovelhas, cabras, porcos, coelhos, galinhas e peixes foram produzidos e serão utilizados no futuro para uma variedade de fins, incluindo

(i) sua eficiência na utilização de ração

(ii) capacidade de dar carne mais magra,

(iii) sua capacidade de crescer para um tamanho comercializável mais cedo e

(iv) sua resistência a certas doenças.

Mais do que isso recentemente, esforços estão sendo feitos para usar animais transgênicos como biorreatores vivos. Animais transgênicos produzidos para este propósito secretarão valiosas proteínas recombinantes e fármacos em seu leite, sangue e urina, que podem ser usados ​​para a extração dessas drogas. Esta nova possibilidade de fabricação de drogas por meio de animais transgênicos é muitas vezes descrita como 'agricultura molecular' ou 'farmacêutica molecular'.

Abreviações do gene & # 8211 ALV = vírus da leucose aviária alAT = Al anti tripsina BPV = vírus do papiloma bovino Eu = cadeia pesada de imunoglobulina FIX = fator IX: GH = hormônio de crescimento GRF = fator de liberação de crescimento, β Gal = β galactosidase hygo = higromicina BLG = β & # 8211 lactoglobulina MT = metalotioneína MLV = vírus da leucemia murina moloney c-myc = um proto-oncogene celular REV = reticuloendoteliose PRL = prolactina SV = SV = SV 40 TK = timidina quinase AFP = proteína anticongelante tPA = ativador de plasminogênio tipo tecido humano .

Embora inicialmente muitos experimentos que levaram à produção de animais transgênicos não tenham dado resultados comercialmente atraentes, o sucesso foi obtido em alguns casos recentes. Alguns desses casos serão discutidos aqui.

Cabras transgênicas.

Recentemente, cabras transgênicas foram produzidas com sucesso por grupos liderados por John McPherson e Karl Ebert, ambos dos EUA. Essas cabras transgênicas expressaram uma proteína heteróloga (uma variante do ativador do plasminogênio do tipo tecido humano = LAtPA) em seu leite. Esta proteína é usada para dissolver coágulos sanguíneos, ou seja, para o tratamento de trombose coronária. Um cDNA que representa LAtPA foi ligado ao promotor de ácido de soro de leite murino (WAP) ou a um promotor de caseína β em um vetor de expressão e usado para injetar embriões precoces obtidos cirurgicamente a partir de ovidutos de cabras leiteiras superovuladas. Esses embriões injetados foram imediatamente transferidos para os ovidutos de fêmeas receptoras (mães de aluguel) ou cultivados por 72 horas (bloqueado no estágio de 8-16 células), antes da transferência para o útero ou fêmeas receptoras de 29 filhos de 36 receptoras, um macho e uma fêmea continha o transgene. A fêmea transgênica deu à luz cinco filhos, um dos quais era transgênico mostrando expressão de LAtPA em um nível baixo de poucos miligramas por litro de leite. Em outro caso de cabra transgênica, poucos gramas de LAtPA por litro de leite podem ser obtidos. Nesta concentração, a cabra leiteira pode se tornar um biorreator economicamente viável para produtos farmacêuticos humanos.

Vacas transgênicas.

Na maioria das tentativas anteriores (no Canadá) para a produção de vacas transgênicas, embriões ou oócitos fertilizados produzidos in vivo foram utilizados. Oócitos fertilizados ou pró-embriões foram retirados cirurgicamente de vacas superovuladas e inseminadas artificialmente. Os zigotos microinjetados foram então transferidos por cirurgia diretamente para o oviduto das vacas receptoras ou para hospedeiros temporários como ovelhas ou coelhos. Em vista de duas operações cirúrgicas, este método é trabalhoso e mais caro.

Em ‘the Netherland’, recentemente (1991), uma técnica foi desenvolvida para a produção de embriões in vitro. Nesse novo procedimento, oócitos obtidos de ovários de vacas de abate foram maturados e fertilizados in vitro. Seus pró-núcleos foram microinjetados com um construto contendo um promotor bovino alfa & # 8211 Sl casei (bovino = boi) que conduz um cDNA que codifica a proteína humana de ligação ao ferro antibacteriana, "lactoferrina". Os embriões foram cultivados até o estágio de mórula / blástula e, em seguida, transferidos não cirurgicamente para fêmeas receptoras. Dois dos 19 bezerros nascidos de 103 zigotos transferidos eram transgênicos (um macho e outro fêmea). Este procedimento pode facilitar o uso de vacas como biorreatores no nível comercial.

Peixes Transgênicos.

Alilempis para produzir peixes transgênicos começou em 1985 e alguns resultados encorajadores foram obtidos. Os genes que foram introduzidos por microinjeção em peixes incluem o seguinte:

(i) gene humano ou de rato para hormônio de crescimento,

(ii) gene de frango para proteína cristalina delta,

(iii) gene de E. coli para β-galactosidase,

(iv) gene de E. coli para resistência à neomicina,

(v) gene da solha de inverno para proteína anticongelante (peixe chato de solha),

(vi) gene da truta arco-íris para o hormônio do crescimento.

A técnica de microinjeção tem sido usada com sucesso para gerar transgênicos em muitas espécies, como carpa comum, bagre, peixe dourado, loach, medaka, salmão, tilápia, truta arco-íris e peixe-zebra. Em outros animais (por exemplo, camundongos, vacas, porcos, ovelhas e coelhos), geralmente a microinjeção direta de DNA clonado em pronúcleos masculinos de ovos fertilizados tem se mostrado muito bem-sucedida, mas na maioria das espécies de peixes estudadas até agora, os pronúcleos não podem ser facilmente visualizados (exceto em medaka), de modo que o DNA precisa ser injetado no citoplasma.

Os óvulos e espermatozoides de indivíduos maduros são coletados e colocados em um recipiente seco separado. A fertilização é iniciada pela adição de água e esperma aos óvulos, mexendo suavemente para facilitar o processo de fertilização. As cascas dos ovos são endurecidas em água. Cerca de 10 ° a 10 ° moléculas de DNA linearizado em um volume de 20 ml ou menos são microinjetadas em cada ovo (estágio de 1-4 células) nas primeiras horas após a fertilização. Após a microinjeção, os ovos são incubados em bandejas de incubação apropriadas e os embriões mortos são removidos diariamente.

Uma vez que em peixes, a fertilização é externa, a cultura in vitro de embriões e sua subsequente transferência para mães adotivas (necessária em sistemas de mamíferos) não é necessária. Além disso, a injeção no citoplasma não é tão prejudicial quanto no núcleo, de modo que a taxa de sobrevivência em peixes é muito maior (35% a 80%).

O gene do hormônio de crescimento humano transferido para peixes transgênicos permitiu o crescimento duas vezes maior do que seus correspondentes peixes não transgênicos (peixinho dourado, truta arco-íris, salmão). Da mesma forma, o gene da proteína anticongelante (AFP) foi transferido em vários casos e sua expressão foi estudada em salmões transgênicos. Foi demonstrado que o nível de expressão do gene AFP ainda é muito baixo para fornecer proteção contra congelamento. Há também um relatório (em 1991) da produção de peixe-zebra transgênico de um Laboratório Indiano (Madurai Kamraj University). Nesta tentativa, um plasmídeo contendo o gene do hormônio de crescimento do rato foi microinjetado em ovos fertilizados de peixe-zebra, e sua presença confirmada em peixes adultos.

Porcos Transgênicos.

A eficiência da produção de suínos transgênicos ainda é muito baixa se comparada à produção de camundongos transgênicos. Em camundongos, 2,5% a 6% dos ovos microinjetados se desenvolveram em camundongos transgênicos, mas em porcos essa frequência foi tão baixa quanto 0,6%, mesmo quando até 7.000 ovos foram injetados. Apesar desta baixa frequência, porcos transgênicos carregando o gene do hormônio do crescimento (GH) de bovino (de origem "boi") de humano, e o gene da globina de ovelha foram produzidos (por V.G. Purse) no Agriculture Research Service, Beltsville, EUA. Os porcos portadores do gene hGH apresentaram diferentes níveis de expressão e apenas 66% desses animais apresentaram níveis detectáveis ​​de hGH e bGH em seu plasma. Os animais cresceram um pouco mais rápido, mas não se tornaram grandes da mesma forma. Porcos com o gene da globina de ovelha não mostraram qualquer expressão do transgene por razões desconhecidas. Nestes porcos transgênicos, no entanto, foi observado um aumento modesto de 10-15% no peso diário e 16-18% na eficiência alimentar, que é menor do que em camundongos, mas são comparáveis ​​aos obtidos devido à injeção diária com porco hormônio do crescimento. Observou-se também que houve redução acentuada da gordura subcutânea em alguns desses porcos transgênicos, sugerindo a possibilidade de produção de carne mais magra e com menor teor de gordura. Esses resultados podem ter um impacto significativo na indústria suína anual de US $ 9,5 bilhões.

Também é relatado que uma elevação a longo prazo do hormônio do crescimento era geralmente prejudicial à saúde. Os porcos tiveram incidência de úlceras gástricas, artrite e várias outras doenças. Portanto, as técnicas terão que ser desenvolvidas para manipular melhor a expressão do transgene por uma variedade de métodos (por exemplo, mudando o background genético ou modificando o regimento de manejo).

Ovelhas transgênicas.

A taxa de transgênese em ovelhas é muito baixa (0,1 a 0,2%). Isso pode ser melhorado se apenas embriões transgênicos viáveis ​​(após a verificação necessária) forem transferidos para ovelhas substitutas (ovelhas). Os embriões no estágio de 8-16 células podem ser divididos em duas partes, uma para a cultura contínua e a outra para a detecção de genes integrados usando a reação em cadeia da polimerase (PCR). Embora a microinjeção seja o método mais comum para entrega de DNA, o direcionamento de genes pode ser cada vez mais usado no futuro. Nesta abordagem, as células-tronco embrionárias (ES) em cultura são transferidas com um vetor que direciona o gene a um local específico por recombinação homóloga (como discutido acima). A técnica, embora usada com sucesso em camundongos, ainda não foi aplicada em ovelhas, onde as células ES terão que ser isoladas primeiro.

Os primeiros relatórios de ovelhas transgênicas foram publicados por J.P. Simons (1988) de Edimburgo. Duas ovelhas transgênicas foram produzidas, cada uma carregando cerca de 10 cópias do gene do fator IX anti-hemofílico humano (cDNA) fundido com o gene BLG de 10,5 kb (BLG = β-lactoglobulina). O gene BLG foi utilizado, pois é necessário para a expressão específica do gene nas glândulas mamárias. Consequentemente, o gene tinha uma expressão específica para o tecido e as ovelhas secretavam fator IX humano (ou alfa-1 antitripsina) em seu leite; esse fator IX humano é ativo, embora a expressão de transgênicos seja baixa. As ovelhas transgênicas nasceram no início do verão de 1986 e foram acasaladas com sucesso no mesmo ano em dezembro. Em 1987, cada ovelha deu à luz um único cordeiro. Cada cordeiro herdou o transgene BLG-F IX e segregou o fator IX no leite. Este programa de produção de animais transgênicos por J.P. Simons em Edimburgo foi financiado pela Pharmaceutical Proteins Ltd. (Cambridge, Reino Unido) devido ao seu apelo comercial.

Em outro relatório (publicado em 1991), também de Edimburgo, foram produzidas cinco ovelhas transgênicas (Alan Colman e colegas). Em todos esses casos, o transgene envolveu a fusão do promotor do gene ovino β-lactoglobulina fundido ao aq humano, antitripsina (h a 1 Gene AT). Quatro desses animais eram fêmeas e um macho. Em uma mulher, a proteína hATh a 1 AT reached a level of 35 grams per litre of milk. The protein purified from milk had a biological activity indistinguishable from human plasma derived antitrypsin. The deficiency for h a 1 AT leads to a lethal disease emphysema, (BC-22), which is a common hereditary disorder among caucasian males of European descent. Therefore any strategy giving high yield of this protein economically will be most welcome. In view of this, transgenic sheep with h a 1 AT gene will prove very useful as a bioreactor.

Recombinant DNA technique can also be used to increase the ability of sheep for wool growth. For this purpose, genes essential for synthesis of some important amino acids found in keratin proteins of wool, have been cloned and introduced in embryos to produce transgenic sheep. For instance, genes (cysE and cysM) for two enzymes (serine acetyl transferase = SAT and O-acetylserine sulphydryase = OAS), involved in cystein biosynthesis, were isolated from bacteria and cloned in a vector. These genes were introduced in sheep cells, ultimately leading to the production of transgenic sheep, where these genes are expressed. Growth hormone (GH) genes have also been introduced and can be used to promote body weight. Other genes involved in wool production have also been cloned and well be used for transgenesis, thus increasing the potential of wool production through genetic engineering.


Animais Transgênicos

The growth in the field of molecular biology and biotechnology is due to the intensive research using transgenic animals. However, there are many ethical issues regarding the use of transgenic animals, because, the genome of transgenic animals is deliberately modified. The first transgenic animals called chimeric mice were created by combining two cells taken from two different embryos of different strains. This gave rise to a single embryo, which was implanted into a surrogate mother to give birth to a chimeric mouse.

Specially designed transgenic animals are used to study gene regulation and effects of genes on the normal functions of the human body and its development. To study the role of insulin in humans, genes from a rabbit or a mouse are introduced into another mouse, which then gives birth to transgenic animals having the altered gene for insulin. Then, the biological effects of the newly introduced gene are studied to obtain information about the role of insulin in the human body.

Transgenic animals are also used for understanding how genes contribute to the development of a disease and thereby help in treatments for diseases such as cancer, cystic fibrosis, rheumatoid arthritis and Alzheimer’s disease. Transgenic animals are used to produce expensive biological products such as alpha one antitrypsin used for the treatment of emphysema, at a cheaper rate. Even attempts for treatment of genetic disorders such as phenylketonuria or PKU and cystic fibrosis were made.

The first transgenic cow, Rosie, produced human protein enriched milk containing 2.4 grams of human protein in every litre. This milk contained the human gene alpha-lactalbumin which made it a more nutritionally balanced product than natural cow milk. The transgenic animals are also being used to test the safety of vaccines before using on humans and to test and study the toxicity of chemicals. The creation of transgenic animals has even reduced the overall use of laboratory animals.

Resumo

The growth in the field of molecular biology and biotechnology is due to the intensive research using transgenic animals. However, there are many ethical issues regarding the use of transgenic animals, because, the genome of transgenic animals is deliberately modified. The first transgenic animals called chimeric mice were created by combining two cells taken from two different embryos of different strains. This gave rise to a single embryo, which was implanted into a surrogate mother to give birth to a chimeric mouse.

Specially designed transgenic animals are used to study gene regulation and effects of genes on the normal functions of the human body and its development. To study the role of insulin in humans, genes from a rabbit or a mouse are introduced into another mouse, which then gives birth to transgenic animals having the altered gene for insulin. Then, the biological effects of the newly introduced gene are studied to obtain information about the role of insulin in the human body.

Transgenic animals are also used for understanding how genes contribute to the development of a disease and thereby help in treatments for diseases such as cancer, cystic fibrosis, rheumatoid arthritis and Alzheimer’s disease. Transgenic animals are used to produce expensive biological products such as alpha one antitrypsin used for the treatment of emphysema, at a cheaper rate. Even attempts for treatment of genetic disorders such as phenylketonuria or PKU and cystic fibrosis were made.

The first transgenic cow, Rosie, produced human protein enriched milk containing 2.4 grams of human protein in every litre. This milk contained the human gene alpha-lactalbumin which made it a more nutritionally balanced product than natural cow milk. The transgenic animals are also being used to test the safety of vaccines before using on humans and to test and study the toxicity of chemicals. The creation of transgenic animals has even reduced the overall use of laboratory animals.


Knockout Mice: What do they teach us?

If the replacement gene (A* in the diagram) is nonfunctional (a "null" allele), mating of the heterozygous transgenic mice will produce a strain of "knockout mice" homozygous for the nonfunctional gene (both copies of the gene at that locus have been "knocked out").

  • Knockout mice are often surprisingly unaffected by their deficiency. Many genes turn out not to be indispensable. The mouse genome appears to have sufficient redundancy to compensate for a single missing pair of alleles.
  • Most genes are pleiotropic. They are expressed in different tissues in different ways and at different times in development.

The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics

Gembu Abe , . Koichi Kawakami , in Methods in Cell Biology , 2011

D Discussion

Transgenesis using the Tol2 transposon system is highly efficient. 50–70% of fish injected with the Tol2 system at the one-cell stage and grown up to the adulthood are germline-transmitting founder fish that can transmit the transgene to their offspring. Além disso, Tol2-mediated transgenesis has the following merits. First, transgenic fish carrying a single copy transgene integration can easily be created, whereas transgenic fish constructed by the plasmid DNA injection method often carry transgene concatemers at a single locus whose expression is silenced ( Stuart et al., 1988 ). Second, end-to-end integration of the transgene is guaranteed. Third, the transposon insertion does not cause gross rearrangement of the integration locus. Since the integration site is clean, it can be analyzed by PCR-based methods such as inverse PCR ( Kawakami et al., 2000, 2004 ), and adaptor-ligation PCR ( Kotani et al., 2006 Urasaki et al., 2006 ).


Class 12 Biology Chapter 12: Transgenic Animals

Animals whose genomes have been modified are known as Transgenic Animals. A foreign gene is inserted into the original genome of the animal to change its DNA. This method is used to improve the genetic traits of the targeted animal. The first ever transgenic animal was chimeric Mice, they were created by combining two cells taken from two different embryos of different strains. 

In the starting phases, genetic improvement was done by selective breeding methods. In which, the animals having required genetic qualities were mated for producing Individuals with Improved genetic characteristics. This method was quite successful, but was later replaced by recombinant DNA technology due to higher time consumption and higher expenses.

Define Transgenic Animals

The process of production of transgenic animals is known as Transgenesis. In which a foreign gene with desired qualities is introduced into the genetics of the targeted animal. The foreign gene introduced is known as the Transgene, and the Animal whose genome is changed is known as Transgenic. The genes are then passed further on to the next generations. 

Specifically designed transgenic animals are used to study the effects of genes on normal functioning of the human body & its development. They are also used to understand how genes contribute to the development of a disease and then help in treatments of various diseases. Transgenic animals are also used to produce expensive biological products at cheaper rates.Transgenic animals are genetically modified, that is why they are also known as Genetically Modified Animals (Organisms). 

ਏigure: The process of production of Transgenic animals

Methods For Producing Transgenic Animals

The Transgenic Animals are created by the various methods explained below : 


Physical Transfection

In the Physical Transfection method, the Gene of desired characteristics is directly injected into the pronucleus of the Fertilised Ovum. This was the first method to become effective in Mammals and was applicable to a large variety of species. Some other methods of Physical Transfection are particle bombardment, ultrasound & electroporation.


Chemical Transfection

One of the Chemical processes of gene Transfection is Transformação. In this method, DNA of the targeted animal is taken up in presence of Calcium Phosphate. In this method, the DNA & calcium phosphate co-precipitates, which eases in DNA uptake. The mammalian cells have the ability to take up foreign DNA from the culture medium. 


Retrovirus-Mediated Gene Transfer 

In order to enhance the chances of expression, the genes are conveyed by means of a vector. As retroviruses are capable of infecting the host cell, they are used as vectors so that they can transfect the desired genes into the targeted animal&aposs genome.


Viral Vectors 

In this method, various viruses are used to transfect rDNA into the Animal cell. The viruses have the ability to infect the Host Cell, express well as well as replicate systematically. 


Bactofection 

Bactofection is the method by which genes of interest are transferred into the genome of the targeted animal with the help of bacteria.

Some Transgenic Animals

Some examples of Transgenic Animals are as follows,
Transgenic Mice

The process wherein by injecting DNA into oocytes ou 1-2, the transgenic mice are developed is called Embryos taken from Female Mice. After injecting the DNA, the Embryo is implanted into the útero do Receptive Females.

Figure: Transgenic mice.

Dolly Sheep

Dolly, the sheep was the very first mammal to be cloned with the help of an adult cell. In this process, the udder cells from a Finn Dorset white sheep of 6 years old were injected into an unfertilized ovo from a Scottish Blackface ewe, whose nucleus was removed. Com a ajuda de electrical pulses, the cell was made to fuse. After fusion of the cell nucleus with the egg, the resulting embrião era cultured for the next 6-7 days. The embryo was then implanted into another Scottish Blackface Ewe, which was responsible for the birth of Transgenic Sheep, Dolly .

Some Applications of Transgenic Animals 

It is because the benefits are provided to the man that the Transgenic Animals are being created. Some of them are given below: 


Biological Products

Various biological products such as Medicines & amp Nutritional Suplementos are obtained from transgenic animals. Research is still going on for manufacturing medicines in order to treat the diseases like hereditary emphysema and phenylketonuria. O primeiro Transgenic Cow, produced milk which contained 2.4 gram human protein per litre. This milk can also be given to babies as a substitute of natural cow milk.

Normal Physiology and Development

Foreign Genes are introduced into Transgenic Animals, due to which the growth factor alteres. Which is why these animals are helpful for the study of Gene Regulation and their effects on the Functioning of the Body.


Study About Diseases

These animals are specially structured for the analysis of the role of genes in the development of certain diseases. Additionally, in order to come up with a cure for these diseases, the transgenic animals are used as model organisms.

For instance, there are various Transgenic models for diseases such as Alzheimer&aposs e Câncer.


Vaccine Safety

Before the vaccines are injected into humans, the transgenic animals are used as model organisms. This is for testing the safety of the vaccines.

Perguntas frequentes

Que. Can the Transgenic Animals created in labs be released into the Ecosystem?

Ans. Não , because if they are released into the Ecosystem they can spread to the natural population and cause an imbalance in the Ecosystem.

Que. How does a transgenic cow differ from a Normal/Natural cow?

Ans. Transgenic cows are the genetically modified (GM) cows. An extra gene or genes gets inserted into their DNA. That Extra Gene may come from the different species or from the same species .

Que. Are knockout mice also a Example of transgenic Animals?

Ans. sim, they are also Genetically Modified Mouse in which an existing gene has been Inactivated by replacing it with an artificial piece of DNA.

Que. What was the unique Application of the milk obtained from the first transgenic cow ?

Ans. The First ever transgenic cow (Rosie) gave milk which had human alpha-lactalbumin. It was a more balanced product nutritionally for human babies than milk of a natural cow.

Ques. What are the Ethical Issues of Transgenic Animals ?

Ans. Genetic Engineering and selective breeding violate the animal rights as they involve manipulating animals .In this the animals are used for the Wellbeing of Humans.Rather than treating them being of value in themselves .

Que. What are the methods of creating transgenic animals?

Ans. The methods of creating transgenic animals are,

Physical transfection- In the Physical Transfection method, the Gene of desired characteristics is directly injected into the pronucleus of the Fertilised Ovum. This was the first method to become effective in Mammals and was applicable to a large variety of species. 

Chemical transfection- One of the Chemical processes of gene Transfection is Transformation. In this method, DNA of the targeted animal is taken up in presence of Calcium Phosphate. In this method, the DNA & calcium phosphate co-precipitates, which eases in DNA uptake. 

Retrovirus-mediated gene transfer- In order to enhance the chances of expression, the genes are conveyed by means of a vector. As retroviruses are capable of infecting the host cell, they are used as vectors so that they can transfect the desired genes into the targeted animal&aposs genome.

Viral vectors- In this method, various viruses are used to transfect rDNA into the Animal cell. The viruses have the ability to infect the Host Cell, express well as well as replicate systematically. 

Bactofection- Bactofection is the method by which genes of interest are transferred into the genome of the targeted animal with the help of bacteria.


Transgenes in genetically modified food are safe for human consumption

So, you’ve bought a new pair of jeans and you love them. You wear them every single day…you even sleep in them. They were made with transgenic cotton, so your skin, the largest organ in your body, is in constant contact with the transgenic fibers of the cotton. Should you be worried that you’ll absorb the bollworm toxin from the cotton through your skin and be poisoned by it? The answer is no, and here’s why:

  1. The cotton is dead plant tissue. Its cells are no longer expressing genes, including that toxic transgene.
  2. The transgene was toxic to bollworm larvae, not to mammals.

Okay, so the transgenic cotton you wear cannot harm you. But what about the transgenic food we eat, like tomatoes, soy, or corn? Most of the corn and soy grown in the US is transgenic. Why shouldn’t we worry about eating transgenic (versus non-transgenic) plants?

  1. As with cotton, the food plant DNA and the transgenes in it are in the plant cells, which are dead by the time they reach your table, much less enter your digestive system. They do not have the ability to express themselves, and the proteins those genes make are not harmful to mammals.
  2. Your body absorbs nutrients (vitamins, minerals) and sugars from food in the intestine. The plant matter itself, including the DNA, stays on the “outside” of your body, because the digestive system is basically just a long tube that runs through your body but never connects to the inside. It only has two openings, the mouth and anus, and both of those go to the outside of the body.

Transgenic Fly Virtual Lab

This interactive, modular lab explores the techniques used to make transgenic flies and demonstrates how these flies can be used to study gene expression.

Scientists use transgenic organisms, which contain DNA that scientists inserted in the organisms’ genomes, to research many biological processes. In this lab, students produce and conduct experiments with virtual versions of transgenic Drosófila fruit flies. Students first create transgenic flies that glow when a gene involved in circadian rhythms is activated. They then use these flies in three experiments to examine gene expression under different conditions and in different locations in the fruit fly’s body. Throughout this lab, students engage in key science practices, including evaluating a hypothesis, collecting data, and interpreting graphs.

The lab contains an interactive lab space, an informational notebook, and embedded quiz questions. It also includes supplementary resources, such as a glossary of scientific terms, images of equipment and tools, and a list of references.

The accompanying worksheet provides structure and guidance as students perform the tutorials, experiments, and quizzes in the lab.

Student Learning Targets
  • Describe how recombinant DNA technology is used to produce transgenic organisms.
  • Explain how transgenic organisms can be used to explore biological processes.

Explain how light production through a reporter gene is used as an external marker of internal molecular events.


Assista o vídeo: Animales Transgenicos (Dezembro 2021).