Em formação

Eletroforese em gel e espuma


Nunca vi esse tipo de coisa acontecer. O que pode desencadear isso ??


As bolhas de gás são formadas pela eletrólise da água, gerando bolhas de gás hidrogênio no eletrodo negativo e gás oxigênio no eletrodo positivo.

Quanto à espuma em si ... acho que há algum tipo de detergente no tampão. Alguns buffers de eletroforese contêm detergente.


Extração de DNA e kits de eletroforese

Uma linha completa de kits e currículos científicos baseados em investigação do DNA, projetados para ajudar os professores a apresentar aos alunos o emocionante mundo da biologia molecular. Esses kits educacionais de análise de DNA utilizam técnicas práticas para explorar a estrutura e função do DNA, a estrutura celular, a digestão de restrição e a eletroforese em gel de agarose.


Eletroforese em gel e espuma - Biologia

Princípios da eletroforese em gel de DNA

Eletroforese em gel separa DNA fragmentos por tamanho em um meio de suporte sólido (um gel de agarose). DNA as amostras são pipetadas para os poços de amostra, vistos como fendas escuras na parte superior da imagem. Aplicação de um corrente elétrica na extremidade superior (anodal, negativa) faz com que o DNA [lembre-se de que é um ácido] para migrar (eletroforese) em direção à extremidade inferior (catódica, positiva). A taxa de migração é proporcional ao tamanho: fragmentos menores se movem mais rapidamente e acabam no fundo do gel.

DNA é visualizado incluindo no gel um corante intercalante, brometo de etídio. DNA os fragmentos absorvem o corante à medida que migram através do gel. Iluminação com luz ultravioleta faz com que o corante intercalado fique fluorescente com uma cor rosa pálido.

Observe que os fragmentos maiores fluorescem mais intensamente. Embora cada um dos fragmentos de uma única classe de molécula esteja presente em equimolar proporções, os fragmentos menores incluem menos massa de DNA, absorvem menos corante e, portanto, fluorescem menos intensamente. Isso é mais evidente na pista da extrema direita, que mostra um conjunto em "escada" de fragmentos de DNA de tamanho conhecido que pode ser usado para estimar os tamanhos dos outros fragmentos desconhecidos.


A eletroforese em gel é uma técnica comum usada para separação e análise de DNA, RNA e proteínas com base em seu tamanho e carga. Existem dois tipos principais de eletroforese em gel, nomeadamente eletroforese em gel de agarose e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os géis de agarose são usados ​​principalmente para separação de ácido nucleico quando uma resolução mais alta é necessária, géis de poliacrilamida são usados. A página SDS é um tipo de eletroforese em gel comumente usado para separar misturas complexas de proteínas. É considerada uma técnica de separação de proteínas de alta resolução. Esta é a diferença entre a eletroforese em gel e a página SDS.

Referências:
1. Nowakowski, Andrew B., William J. Wobig e David H. Petering. & # 8220 SDS-PAGE nativo: Separação eletroforética de proteínas de alta resolução com retenção de propriedades nativas, incluindo íons metálicos ligados. www.ncbi.nlm.nih.gov. N.p., maio de 2014. Web. 7 de abril de 2017
2. Stellwagen, Nancy C. & # 8220Eletroforese de DNA em géis de agarose, géis de poliacrilamida e em solução livre. & # 8221 Eletroforese. Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA, junho de 2009. Web. 07 de abril de 2017

Cortesia de imagem:
1. & # 8220Gelelektrophoreseapparatur & # 8221 (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. & # 8220DNA Eletroforese em gel de agarose & # 8221 pela School of Natural Resources de Ann Arbor & # 8211 DNA lab (CC BY 2.0) via Commons Wikimedia


Eletroforese em gel e espuma - Biologia

BCH5425 Biologia Molecular e Biotecnologia
Primavera de 1998
Dr. Michael Blaber
[email protected]

A eletroforese em gel é usada para caracterizar uma das propriedades mais básicas - massa molecular - de polinucleotídeos e polipeptídeos

  • A eletroforese em gel também pode ser usada para determinar
    • a pureza dessas amostras
    • heterogeneidade / extensão da degradação
    • composição de subunidades.

    DNA:
    Os materiais de eletroforese em gel mais comuns para moléculas de DNA são

    A taxa de migração eletroforética do DNA através dos géis de agarose depende de quatro parâmetros principais:

    1. O tamanho molecular do DNA. As moléculas de DNA duplex linear viajam através dos géis de agarose a uma taxa que é inversamente proporcional ao log de seu peso molecular.

    Exemplo: compare a massa molecular com a taxa de migração esperada:

    1 / log (massa molecular)
    ou seja, parente Sr.

    2. A concentração de agarose. Existe uma relação linear inversa entre o logaritmo da mobilidade eletroforética e a concentração do gel.

    log inv (1 / Gel%)
    (ou seja, Sr. parente)

    3. A conformação do DNA.

    • DNA circular fechado (forma I) - tipicamente superenrolado
    • circular cortado (forma-II)
    • DNA linear (forma III)

    Essas diferentes formas do mesmo DNA migram em taxas diferentes através de um gel de agarose.

    • Quase sempre a forma linear (forma-III) migra na taxa mais lenta das três formas
    • O DNA superenrolado (forma I) geralmente migra mais rápido

    Faixa de separação de DNA linear

    Finalmente, o DNA sendo uma molécula ácida, migra em direção ao eletrodo carregado positivamente (cátodo).


    Exercícios de eletroforese em gel

    Neste laboratório, você usará géis de agarose para separar moléculas de DNA produzidas em reações de PCR. Esses produtos de PCR devem ser bem resolvidos em géis de agarose a 1,25% preparados em tampão TAE, que proporcionam boa separação de moléculas menores que 2 kb. Coloque a bandeja de fundição no aparelho de gel. Se você estiver usando aparelhos BioRad, posicione as cunhas pretas em cada extremidade da bandeja de fundição.

    1. Determine a quantidade de agarose necessária para um gel de 1,25% (1,25 g / 100 mL) adequado à plataforma de moldagem. A maioria dos aparelhos de gel no laboratório são os sistemas BioRad Mini-Sub GT com uma bandeja de fundição de 7 cm x 7 cm que acomoda um gel de 30 mL. Verifique seus cálculos com seus colegas de equipe antes de prosseguir.
    2. Encha um cilindro graduado com o volume apropriado de tampão TAE. Despeje a solução em um pequeno frasco.
    3. Pesar a quantidade apropriada de agarose. Polvilhe a agarose na superfície do TAE no frasco. Nota: a agarose não se dissolve até ser aquecida.
    4. Dissolva a agarose aquecendo a solução por intervalos de 15-20 segundos em um forno de micro-ondas. Após cada intervalo, remova o frasco e gire suavemente um pouco para dispersar o conteúdo. Observe se as partículas de agarose ainda estão aparentes ou se a agarose foi dissolvida. Os melhores géis são feitos de agarose que NÃO foi cozida demais. NOTA DE SEGURANÇA: A solução de agarose estará muito QUENTE quando você a remove do microondas! Tenha cuidado ao manusear o frasco. Tenha especial cuidado para não entrar em contato com o vapor que sairá pela abertura do frasco. Dobre várias toalhas de papel e enrole-as em volta do gargalo do frasco ao manuseá-lo. Se acontecer de você derramar um pouco de agarose quente na pele, lave imediatamente com água fria e alerte o seu AP.
    5. Deixe a solução de agarose esfriar até que você possa tocar confortavelmente no frasco com as mãos. Soluções de agarose acima de 60 ̊C irão deformar a bandeja de fundição! Despeje o gel. Coloque o pente de amostra no lugar. Não mova a plataforma de fundição até que o gel endureça. Você saberá que o gel está firme quando se tornar opaco. Deixe o gel curar por cerca de 20 minutos depois de endurecer.
    Preparação de amostra

    Prepare suas amostras para eletroforese enquanto o gel está curando, adicionando tampão de carga concentrado. O tampão de carga contém dois corantes, azul de bromofenol e xileno cianol. Durante a eletroforese, os corantes irão migrar com pesos moleculares "aparentes" de

    0,5 kb, respectivamente. O tampão de carregamento também contém glicerol, o que torna a amostra densa o suficiente para afundar no fundo do poço de amostra.

    Adicione 4 μL de tampão de carga 6X diretamente a cada uma das reações de PCR de 20 μL do último laboratório. Resumidamente, centrifugue cada tubo para misturar o corante e as amostras, se necessário. Você usará metade de cada amostra em seus géis. Armazene a amostra restante na geladeira.

    Carregue e execute o gel de agarose
    1. Quando o gel solidificar, remova cuidadosamente o pente e as cunhas pretas.
    2. Oriente o gel no tanque de eletroforese de forma que os poços (orifícios feitos pelo pente) fiquem voltados para o eletrodo preto (negativo). As moléculas de DNA se moverão do poço em direção ao eletrodo vermelho (positivo). Encha o tanque com tampão TAE suficiente para submergir o gel (aprox. 275-300 mL).
    3. Carregue uma amostra em cada poço, que pode acomodar
    Mancha e analise o gel de agarose

    NOTA DE SEGURANÇA: Use luvas descartáveis ​​ao tingir géis. As luvas são importantes ao trabalhar com corantes intercalantes, que são mutagênicos potenciais.


    Spurthi & # 039s AP Biology Notebook


    Resumo
    Eletroforese em gel é um método que separa moléculas com base na taxa de movimento através do gel durante a aplicação de um campo elétrico. A direção em que as moléculas se movem (para frente ou para trás) é baseada na carga das moléculas porque elas se moverão em direção ao seu oposto polar. A rapidez com que essas moléculas se movem também é afetada pelos aspectos físicos da molécula, como tamanho e forma, a densidade do gel e a força do campo elétrico. Como a densidade do gel e a força do campo de eletricidade são iguais para todas as moléculas em uma determinada câmara de eletroforese, as partículas menores terão a taxa de movimento mais rápida.

    Como não fomos capazes de usar DNA para este laboratório, tivemos que substituí-los por corantes de carregamento. Esses corantes de carga contêm sacarose, azul de bromofenol e tampão TE. Fizemos a gelatina para ter pequenas ranhuras recuadas na extremidade. Nesses amassados, nós os preencheríamos com corante de carregamento de cor diferente. O corante de carga afundou porque continha a sacarose. O azul de bromofenol foi a forma como o corante foi capaz de se mover sendo positivo ou negativo. Com base no local para onde o corante foi movido, podemos dizer o quão grande eram as moléculas nele e se era positivo ou negativo.

    Parte 1
    Primeiro, moldamos um gel usando banho-maria, micro-ondas, pente de gel de 6 poços, torneira de máscara, bandeja e gel de agarose. Usando a fita adesiva, cobrimos as duas extremidades da bandeja de moldagem de gel para bloquear a queda do gel de agarose. Em seguida, deixamos o gel derreter no banho-maria que não o aqueceu por tempo suficiente. Portanto, esquentamos o frasco de gel com a tampa aberta em intervalos de 1 minuto até que esteja completamente derretido. Usando luvas de proteção retiramos o frasco, medimos 15 mL do líquido em um tubo de ensaio e usamos os 15 mL na bandeja de gesso. No entanto, pouco antes de colocar o gel na bandeja, colocamos o pente de gel de 6 poços próximo ao final da bandeja. Depois de permitir que o gel endureça na bandeja, remova a torneira de máscara de um lado. Antes de deslizar cuidadosamente o gel sem quebrar na câmara, despeje o tampão de um copo em um dos lados da câmara. Depois de colocar o gel na câmara, adicione o tampão até que o nível esteja aproximadamente 2-3 mm acima do topo do gel. Feche a câmara e deixe-a nessa posição por 24-48 horas.
    Parte 2
    2 dias depois, transfira o gel da câmara de volta para a placa para que ele se encaixe perfeitamente. Em seguida, coloque a placa com o gel de volta na câmara e despeje o tampão na câmara de forma que fique cerca de 2-3 milímetros acima do gel. Usando uma micropipeta, pegue uma cor de tinta e obtenha 10 ul dela. Repita esta etapa mais 4 vezes com cores diferentes de corantes e usando micropipetas diferentes para cada cor. Em seguida, conecte 5 baterias alcalinas em uma pilha e conecte o cabo vermelho e o cabo preto das baterias em suas respectivas partes da câmara. Assim que a bateria estiver conectada à câmara, observe o aparecimento de bolhas e se os diferentes corantes coloridos estão se movendo e, em caso afirmativo, em que direção da câmara. Após a observação, desconecte a bateria quando a amostra de corante de movimento mais rápido estiver perto do fim do gel.


    Esta foi tirada minutos após a ativação do campo elétrico. Como você pode ver, a maioria das tinturas tem taxas lentas de movimento.

    Esta foto foi tirada antes de desconectar os fios e interromper o fluxo de eletricidade. Os resultados, verificados por esta foto, estão registrados a seguir.

    O comprimento e a direção da execução são determinados pela carga da molécula. Com base nos resultados, podemos concluir que o corante violeta cristal é o mais negativo. É também a única molécula com carga negativa em nosso laboratório. O Verde Metílico foi o mais positivo, seguido pela Mistura Corante, Xileno Cianol e, finalmente, pelo Azul de Bromofenol.

    O corante violeta cristal não estava na mistura de corante porque não havia banda de corante encontrada na pista 6.

    Certos corantes migram em direção ao eletrodo positivo e outros em direção ao eletrodo negativo porque, em um campo elétrico, as moléculas tenderão a uma carga oposta à que carregam. Portanto, as moléculas positivas tenderão para o negativo, vice-versa.

    O aumento da concentração de agarose em um gel diminuirá o tamanho dos poros do gel, uma vez que o gel solidificou. O tamanho de poro menor pode ser usado para separar uma mistura de moléculas menores.

    Quando a separação dos corantes acontecia em um gel de agarose com maior percentual do que os usados ​​para separar muitas misturas de DNA. Podemos supor que as moléculas de corante são geralmente menores do que os fragmentos de DNA.

    Se fôssemos chamados para fora de nosso laboratório de eletroforese e não pudéssemos monitorar nosso laboratório ao longo do tempo, as amostras de corante continuariam a se mover para o lado negativo ou positivo dos pólos. Se o deixássemos de fora por tempo suficiente, o gel se moveria para fora do gel.

    O procedimento de eletroforese de agarose para DNA é diferente do nosso procedimento porque o DNA não é visível a olho nu, portanto, é necessário um corante de rastreamento nas amostras de DNA para dizer quando terminar o laboratório de eletroforese. Outra diferença é que o DNA carrega uma carga negativa, de modo que as amostras são colocadas em uma extremidade do gel, e não na outra.

    Eletroforese vs. Cromatografia

    Configuração de eletroforese


    Outro uso para a eletroforese pode ser engenharia genética, identificação de proteínas, testes de paternidade e triagem de doenças genéticas. Qualquer coisa relativa ao DNA pode ser usada em eletroforese.

    Devem ser estabelecidos bancos de dados para informações de DNA? Devem ser estabelecidos bancos de dados para informações de DNA, desde que seja para ajudar os outros e não seja abusado. Uma vantagem disso seria usá-lo para estudar doenças genéticas ou identificação em processos judiciais, mas uma desvantagem seria a pesquisa para tentar alterar a aparência do DNA. As pessoas que devem ter controle das informações devem ser aquelas cujo DNA está sendo armazenado e as informações devem ser controladas por pessoas confiáveis. Por exemplo, uma boa pessoa para o trabalho é alguém que não usará o banco de DNA para seus benefícios. Também deve ser fortemente vigiado porque é uma informação pessoal. O DNA retirado de um suspeito para identificação deve ser usado estritamente para identificação e apenas identificação. Apenas bebês com histórico familiar de doença genética devem ter suas impressões digitais de DNA coletadas no nascimento, para fins de segurança e prevenção precoce.

    Conclusão
    Depois de realizar este experimento usando corantes de carga, concluímos que o corante violeta cristal foi o mais negativo. Concluímos também que o verde de metila foi o mais positivo. Este experimento nos ajudou a obter uma melhor compreensão da eletroforese em gel.


    Resolução de problemas e limpeza

    Pergunta: "Como você descarta placas de Petri usadas?"

    Resposta 1: "Autoclavar é o melhor. Se sua escola não pode pagar uma autoclave, uma boa panela de pressão elétrica (a la Sears) fará o truque. 14 # pressão. 15 minutos). Você pode mergulhá-los em lixívia a 10 por cento, mas isso não mata os esporos . E se você tivesse bacilos do antraz? São máquinas 'magras, más, formadoras de esporos'. Não quero ser tão tonto com isso, mas os organismos formadores de esporos podem ser tão perigosos quanto a E. coli toxigênica. "
    Stu Schnell, John C. Freeman High School, Los Angeles, Califórnia. 30/11/99

    Resposta 2: “Apenas uma sugestão para todos que se preocupam com pratos usados. Forme uma boa associação com o hospital local. O nosso é designado como 'amigo da educação'. Eles não apenas nos fornecem placas de ágar e sacos de risco biológico, mas eu os levo de volta ao hospital nos sacos de risco biológico e eles os descartam para mim junto com seus resíduos ”.
    Marla Vaughn, Oroville, Califórnia. 6/12/99

    Resposta 3: "Eu costumava levar meus pratos para o laboratório de microbiologia de uma faculdade próxima. Eles eram gentis o suficiente para autoclave-os. Algumas pessoas também derramam 10% de alvejante sobre eles e depois os descartam. No entanto, as leis estão mudando, e em Connecticut nós agora temos um acordo com uma empresa de lixo tóxico que nos fornece um contêiner forrado de plástico. Quando o contêiner se enche, nós ligamos para eles e eles vêm buscá-lo, pagando uma taxa (acho que arranjamos algo em torno de US $ 50 por coleta ). Uma escola pequena como nós leva muito tempo para encher o contêiner. Desde que você feche bem e contenha o cheiro, não é tão ruim. Encontrei essa roupa nas páginas amarelas. Tivemos que fazer algumas liga antes de encontrarmos uma empresa disposta a coletar o que eles chamam de lixo hospitalar. "
    Barbara Beitch, Hamden Hall Country Day School, Hamden, Connecticut. 01/12/99

    Resposta 4: "Se você não tiver uma autoclave ou panela de pressão, pode desinfetar as placas com uma solução de Clorox a 10 por cento. Cubra e deixe descansar por 10 minutos."
    Bruce Faitsch, Guilford High School, Guilford, Connecticut. 01/12/99

    Resposta 5: "O microondas não é uma alternativa segura à autoclavagem, na minha opinião. Não produz calor suficiente para matar esporos e muitas vezes aquece o assunto de maneira desigual. Use uma autoclave ou um dos desinfetantes comerciais projetados para matar esporos. Existem produtos profissionais no mercado que desinfetam totalmente, incluindo a eliminação de esporos. Wavacide é um desses produtos. O rótulo diz que é um esporicida quando usado na dosagem recomendada. Eu usei e ele funciona até onde sei. I limite seu uso ao ambiente, ou seja, bancadas, piso, etc., se ocorrer um derramamento acidental. Se você trabalha com bactérias, deve estar preparado para derramamentos, pois eles acontecerão em uma sala de aula, é garantido! Se você está falando de desinfetantes domésticos , Eu concordo - eles não matam esporos - na verdade, eles geralmente não matam totalmente as células vegetativas das bactérias. A autoclavagem é o método preferido de descarte seguro. Para professores não treinados em microbiologia, eles provavelmente deveriam usar um aparelho profissional l serviço. Agradeço qualquer informação que alguém possa fornecer sobre uma lei que trate deste assunto e, se for o caso, é uma lei estadual, federal ou apenas diretrizes, porque tem sido minha opinião profissional que treinou corretamente os professores com o equipamento adequado (autoclave) seria capaz de descartar com segurança os resíduos bacterianos. Na verdade, esperar semanas ou mesmo meses para um descarte profissional não é recomendado porque a espera pode aumentar o risco de contaminação. ”
    Bruce Faitsch, Guilford High School, Guilford, Connecticut. 10/04/00 e 11/04/00

    Pergunta: "Alguém pode me dar a 'linha do grupo' sobre a geração de uma curva padrão HindIII. Alguns dos meus alunos notaram que os tamanhos dos fragmentos EcoRI são muito mais precisos quando a curva padrão é gerada apenas por 'conectar os pontos' em vez de construir um linha de melhor ajuste. O primeiro ponto de dados na curva HindIII, o maior fragmento, geralmente está fora de linha com os outros pontos. Então, o que é? É uma "linha de melhor ajuste" ou "conecte os pontos"? Em alguns sites de universidades, li que conectar os pontos dá resultados mais precisos. "

    Resposta 1: "Quando eu fiz este mesmo laboratório como um aluno em um curso de graduação em biologia molecular, disseram-me que a função era parabólica e para usar uma curva de melhor ajuste em vez de uma linha de melhor ajuste. Pedi aos meus alunos de Biologia AP que façam com a curva e funciona muito bem. "
    Marcia Sloan, Cleburne High School, Cleburne, Texas. 01/10/01

    Resposta 2: "Fui ensinado a deixar cair o ponto superior (o fragmento grande) em uma curva HindIII ao usar um gel de 1 por cento porque essa concentração de gel funciona melhor para fragmentos de tamanho médio. Para separar fragmentos maiores, um gel menos concentrado seria usado para separar fragmentos menores, um gel mais concentrado seria usado - portanto, os vários protocolos para a preparação do gel, dependendo do tamanho dos fragmentos são de maior interesse. Isso nos dá bons resultados. A propósito - alguns anos atrás, quando calculadoras gráficas estavam sendo "pressionadas "como nova tecnologia, os alunos os usariam para obter uma curva de melhor ajuste e obtivessem bons resultados. No entanto, como eles não podem usar no Exame de Biologia AP, também os fiz usar o papel gráfico. Foi incrível ver quantos crianças muito inteligentes não podiam usar o papel quadriculado. Agora, não vou nem mesmo deixar que tirem suas calculadoras! "
    Ellen Mayo, Mills Godwin Speciality Center for Science, Mathematics, and Technology, Richmond, Virginia. 01/10/01


    Qual é a diferença entre Agarose e Poliacrilamida?

    Origem da Agarose e Poliacrilamida:

    Agarose: A agarose é um polímero de origem natural. É derivado de algas marinhas.

    Poliacrilamida: A poliacrilamida é de origem sintética e não é encontrada em nenhuma circunstância natural.

    Fórmula molecular de agarose e poliacrilamida:

    Agarose: A fórmula molecular da agarose é C24H38O19.

    Poliacrilamida: A fórmula molecular da poliacrilamida é (C 3H5NÃO)n.

    Estrutura Química da Agarose e Poliacrilamida:

    Agarose: A agarose é um polissacarídeo linear. É composto de unidades de dissacarídeo repetidas chamadas agrobiose mantidas juntas por ligações de hidrogênio.

    Poliacrilamida: A poliacrilamida é um polímero reticulado quimicamente. É feito de monômeros de acrilamida e um agente de reticulação N, N'-metilenobisacrilamida.

    Toxicidade de Agarose e Poliacrilamida:

    Agarose: Tanto a agarose quanto sua unidade monomérica agrobiose não são tóxicas por natureza.

    Poliacrilamida: A unidade monomérica da poliacrilamida, a acrilamida, é um carcinógeno presumido e neurotoxina conhecida, embora sua forma polimerizada seja atóxica por natureza.

    Características dos géis de agarose e poliacrilamida:

    IDADE e PÁGINA:

    Agarose: A preparação do gel de agarose para AGE é menos demorada, fácil e simples e não requer um iniciador ou catalisador de polimerização.

    Poliacrilamida: A preparação do gel de poliacrilamida para PAGE é demorada e tediosa e também requer um iniciador (persulfato de amônio) e catalisador de polimerização (N, N, N ’, N’-tetrametiletilendiamina & # 8211 TEMED).

    Natureza:

    Os géis de poliacrilamida são quimicamente mais estáveis ​​do que os géis de agarose.

    Tamanho do poro:

    Dada a mesma concentração, as matrizes de gel de poliacrilamida tendem a ter tamanhos de poros menores em comparação com uma matriz de gel de agarose.

    Alterando o tamanho dos poros:

    O tamanho dos poros dos géis de poliacrilamida pode ser alterado de maneira mais controlada do que os géis de agarose.

    Poder de resolução:

    Os géis de poliacrilamida têm alto poder de resolução, enquanto os géis de agarose têm baixo poder de resolução.

    Acomodação de ácido nucléico:

    Os géis de poliacrilamida podem acomodar maiores quantidades de ácido nucléico do que os géis de agarose para fins de resolução.

    Cortesia de imagens: Agarose and Structure of polyacrylamide via Wikicommons (domínio público)

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