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7.19A: Regulação de RNA e RNA antisense - Biologia


Os RNAs antisense são moléculas de RNA de fita simples que podem se ligar e inibir a tradução específica do mRNA para a proteína.

objetivos de aprendizado

  • Explicar a regulação do RNA via RNA antisense

Pontos chave

  • RNAs antisense são específicos para mRNAs com base no princípio de pares de bases complementares.
  • Os RNAs antisense ligam-se aos mRNAs e inibem a capacidade desses mRNAs de serem traduzidos em proteínas funcionais.
  • RNAs antisense de ocorrência natural foram identificados em E. coli, que carregam um plasmídeo R1 e controlam o sistema hok / sok que envolve a produção de produtos tóxicos e antitóxicos.

Termos chave

  • morfogênese: A diferenciação dos tecidos e o crescimento dos organismos.

A regulação gênica, a capacidade de controlar se um gene é expresso ou não, é crítica no controle de processos celulares e metabólicos e contribui para a diversidade e variação nos organismos. Além disso, é o determinante chave na diferenciação e morfogênese celular. Existem tipos específicos de moléculas de RNA que podem ser utilizadas para controlar a regulação gênica, incluindo RNAs mensageiros (mRNAs), pequenos RNAs, como microRNAs e, por último, RNAs antisense. A seguir está uma breve visão geral dos RNAs antisense e seu papel na regulação do RNA. RNAs antisense foram recentemente investigados como uma nova classe de drogas antivirais.

Os RNAs antisense são moléculas de RNA de fita simples que exibem uma relação complementar a mRNAs específicos. Os RNAs anti-sentido são utilizados para a regulação gênica e têm como alvo específico as moléculas de mRNA que são utilizadas para a síntese de proteínas. O RNA antisense pode emparelhar fisicamente e se ligar ao mRNA complementar, inibindo assim a capacidade do mRNA de ser processado na máquina de tradução. O emparelhamento de RNA antisense é uma técnica que pode ser utilizada em laboratório para a regulação gênica - no entanto, não é sem limitações. RNAs antisense de ocorrência natural foram isolados em vários micróbios, incluindo o E. coli Plasmídeo RI, que usa um sistema hok / sok. Um sistema hok / sok é um mecanismo empregado por E. coli que é usado como um mecanismo de eliminação pós-regional. O gene hok é um gene tóxico e o gene sok é uma antitoxina. Portanto, E. coli a utilização desse sistema pode regular a expressão de hok (toxina) e inibir sua tradução pela produção de RNA sok (antitoxina). O resultado é a repressão da tradução do mRNA de hok.


Tecnologia de RNA anti-sentido (com diagrama)

Nos casos em que um gene foi identificado e atribuído a um fenótipo específico, muitas vezes são necessárias abordagens adicionais para investigar exatamente a função do gene.

Esses obstáculos na identificação e manipulação de genes podem ser superados pela tecnologia de RNA antisense.

Muitos loci genômicos contêm unidades de transcrição em ambas as fitas, portanto, duas transcrições com orientação oposta podem se sobrepor. Enquanto uma fita codifica para uma proteína, a transcrição da outra fita não é codificadora. Esses transcritos antisense naturais (NATs) podem regular negativamente o transcrito sentido conjugado.

Os NATs são altamente prevalentes em uma ampla gama de espécies - por exemplo, cerca de 15% dos genes que codificam proteínas humanas têm um NAT associado. Os NATs podem ser divididos em cis-NATs, que são transcritos a partir de fitas opostas de DNA no mesmo locus genômico. trans-NATs são transcritos de locais separados. Os pares cis-NAT exibem complementaridade de sequência perfeita, enquanto os pares trans-NAT exibem complementaridade imperfeita e podem ter como alvo muitos alvos de sentido para formar uma rede de regulação complexa.

Uma abordagem engenhosa e promissora explora a especificidade das reações de hibridização entre duas cadeias de ácido nucleico complementares. Normalmente, apenas uma das duas fitas de DNA em uma determinada porção da dupla hélice é transcrita em RNA e é sempre a mesma fita para um determinado gene.

Se um gene clonado for modificado de forma que a fita de DNA oposta seja transcrita, ele produzirá moléculas de RNA antisense que têm uma sequência complementar aos transcritos normais de RNA. O RNA antisense, quando sintetizado em grandes quantidades, muitas vezes hibridiza com o RNA & # 8220sense & # 8221 feito pelos genes normais e, portanto, inibe a síntese da proteína correspondente (Fig. 141).

Um método relacionado é sintetizar moléculas curtas de ácido nucleico antisense por meios químicos ou enzimáticos e, em seguida, injetá-las (ou de outra forma distribuí-las) nas células, novamente bloqueando (embora apenas temporariamente) a produção da proteína correspondente.

O primeiro esforço que demonstrou definitivamente o bloqueio na tradução devido ao uso de RNA antisense em extratos livres de células (EFCs) foi realizado por Singer et al. (1963) Eles mostraram que a síntese de polifenilalanina em CFE com ácido poliuridílico como molde foi completamente inibida quando ácido poliadenílico foi adicionado à mistura de tradução. Este artigo descreve resumidamente os aspectos básicos e aplicados da tecnologia de RNA antisense, particularmente em sistemas de plantas.

Regulação de RNA anti-sentido natural da expressão gênica:

O RNA antisense de ocorrência natural estava envolvido na regulação do gene e isso foi demonstrado durante o estudo de replicação do plasmídeo E. coli ColE1. A replicação do plasmídeo ColE1 de E. coli envolve a formação de um primer de RNA que é processado por RNase-H enquanto ligado ao molde de DNA. O RNA anti-sentido se liga ao primer, inibindo o processamento do primer de RNA e a replicação do plasmídeo, portanto, o número de cópias do plasmídeo pode ser regulado (Tomizawa et al. 1981). Da mesma forma, a replicação do plasmídeo Staphylococcus aureus (pT 181) e o número de cópias parecem ser controlados por RNA anti-sentido (Kumar e Novick, 1985). A tradução do mRNA da transposase Tn10 de E. coli é inibida pelo mRNA antisense.

Um mecanismo adicional de controle translacional, denominado controle antisense, ocorre nas células bacterianas. Este tipo de regulação é mediado por RNA antisense, que contém sequências complementares à região de um mRNA contendo um códon de iniciação. A hibridização do RNA complementar antisense bloqueia o reconhecimento do códon de iniciação e a ligação da subunidade ribossômica 30S à sequência de Shine-Dalgarno (os locais de ligação do ribossomo de diferentes mRNAs bacterianos exibem dentro de 10 bases a montante do AUG uma sequência que corresponde a parte ou a todos do hexâmero. Este trecho de polipurina é conhecido como a sequência Shine-Dalgarno), evitando assim o início da tradução.

A expressão da transposase codificada pela sequência de inserção bacteriana IS 10 é regulada pelo mecanismo de controle de tradução antisense. A transposase catalisa a transposição desse elemento de DNA móvel. Se demasiada transposase fosse expressa, tantas mutações resultariam da transposição IS 10. que a célula hospedeira não sobreviveria.

Normalmente, isso não ocorre por causa do controle antisense. IS 10 contém dois promotores: um chamado PNO dirige a transcrição da fita que codifica para a transposase, a outra chamada PFORA encontra-se dentro do gene da transposase e direciona a transcrição da fita não codificadora, produzindo um RNA antisense complementar à extremidade 5 & # 8242 do mRNA da transposase (Fig. 14-2). Porque PFORA é um promotor muito mais forte do que PNO, o mRNA antisense é produzido em maior abundância do que o mRNA da transposase. A hibridização do RNA anti-sentido com a maior parte do mRNA da transposase muito mais raro evita a tradução, garantindo assim que a taxa de síntese da transposase e, por sua vez, a frequência de transposição, são compatíveis com a sobrevivência das células hospedeiras.

A análise detalhada do controle antisense em bactérias revelou que as estruturas secundárias dos RNAs complementares influenciam muito a taxa de hibridização e, portanto, a eficiência do controle antisense. Os RNAs transcritos de PFORA e PNO IS 10 foi otimizado por seleção natural para hibridizar a taxas extremamente altas em temperatura fisiológica e concentrações de sal, de modo que a expressão da transposase é inibida de maneira muito eficaz.

Além de procariotos, em eucariotos o RNA antisense está envolvido no splicing de hnRNA, pois envolve pequenas ribonucleoproteínas nucleares que possuem um componente de RNA complementar ao local de splice (Ragers e Wall, 1980). Também foi relatado que pequenos RNAs nucleolares anti-sentido codificados por íntrons desempenham um papel na metilação de rRNA (Nicoloso et al. 1996).

Os RNAs antisense de ocorrência natural também regulam a expressão gênica em plantas. Estes incluem transcritos de RNA antisense para mRNA K-amilase de cevada (Rogers, 1988), mRNA antisense complementar ao gene niv que codifica a enzima da via dos flavonóides, chalcona sintase (CHS) (Coen e Carpenter, 1988). Rogers identificou dois transcritos antisense na cevada, ambos eram imperfeitamente complementares ao gene da K-amilase, enquanto no caso do gene niv, os transcritos antisense surgiram devido a uma duplicação invertida de sequências líderes não traduzidas.

Portanto, um mecanismo provisório foi proposto para a geração de transcritos antisense. O ARN anti-sentido surge quando a transcrição de um gene prossegue na cadeia oposta ao molde na ausência de um forte local de terminação da transcrição na curta região intergénica. Os transcritos anti-sentido também foram identificados em Brassica para o gene da quinase do receptor do locus S que controla a auto-incompatibilidade em Brassica (Cock et al. 1997).

A regulação do RNA antisense envolve certos mecanismos básicos, com base nos quais foram classificados em três classes (Takamaya e Inouye, 1990):

Os RNAs antisense Classe I e # 8211 são diretamente complementares à região de codificação ou à sequência SD, resultando na inibição direta da tradução ou desestabilização do mRNA.

Os RNAs de Classe II e # 8211 incluem aqueles que se ligam a regiões não codificantes do RNA alvo, resultando em efeitos indiretos produzidos por, por ex. formação de estrutura secundária alternativa que sequestra o local de ligação ao ribossomo.

Os RNAs antisense Classe III e # 8211 regulam a transcrição do mRNA alvo por um mecanismo semelhante à atenuação transcricional.

Regulação de ARN anti-sentido artificial da expressão gênica:

O RNA anti-sentido também tem sido usado para modular artificialmente a expressão gênica em plantas e animais. Um exemplo do uso do sistema binário para introduzir genes funcionais em plantas vem de experimentos usando RNA antisense para controlar a expressão de genes em plantas. A poligalacturonase (PG) é uma enzima que solubiliza as paredes das células vegetais por digestão da pectina. A redução da expressão da poligalacturonase pode levar a frutas que se machucam com menos facilidade.

Um segmento da extremidade 5 & # 8242 do gene PG foi inserido na orientação reversa, junto com o promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), em um vetor binário. Este vetor foi transferido para Agrobacterium e posteriormente para tomateiros. Frutos maduros de plantas transformadas que expressam a construção antisense tiveram níveis significativamente reduzidos de atividade da enzima PG.

Infelizmente, essas frutas eram tão macias quanto tomates selvagens, presumivelmente porque a atividade do PG é apenas um dos vários fatores que contribuem para o amaciamento das frutas. Outro fator é o etileno, e a inibição bem-sucedida do amadurecimento do tomate agora foi alcançada pela expressão de um RNA antisense para uma enzima na via metabólica do etileno.

O produtor pode despachar esses tomates sem machucá-los e usar etileno para amadurecê-los. Para determinar os requisitos ideais para uma regulação eficiente de RNA antisense, comprimentos variados, bem como regiões do gene sense 2-galactosidase foram direcionados (Pestka et al. 1998)

Esses experimentos levaram a certas conclusões gerais:

1. O RNA antisense deve ser complementar à extremidade 5 & # 8242 para o mRNA sentido e um local de ligação ao ribossomo funcional na extremidade 5 & # 8242 (Coleman et al. 1984).

2. Existe uma correlação significativa entre a concentração de RNA antisense e o mRNA sense. Para produzir inibição máxima, as razões molares entre o RNA antisense e o mRNA sense variam de 50: 1 a 600: 1. Foi de 150: 1 no caso de inibição da síntese de 2-galactosidase. Embora existam exemplos onde a inibição significativa é produzida com razão molar de 1: 1 entre o RNA sense e o RNA antisense, há competição entre o ribossomo e o RNA antisense para a ligação ao local de ligação ao ribossomo do mRNA sense. Conseqüentemente, os fatores que contribuem para o aumento da concentração de RNA antisense ajudam a produzir uma inibição mais forte (Melton, 1985).

3. Os fatores que aumentam a taxa de síntese do RNA anti-sentido, bem como aumentam a meia-vida, contribuem para a eficácia do RNA anti-sentido. Assim, o promotor para o gene antisense deve ser forte ou o gene antisense deve estar presente no plasmídeo de alto número de cópias para alta concentração do RNA antisense. O comprimento do RNA antisense e sua configuração influenciam a estabilidade e, portanto, a eficácia do RNA (Matsuyama e Mizuslima, 1985).

Modo de ação do RNA antisense:

O estudo da regulação antisense natural, bem como da inibição antisense artificial, não aponta para a existência de qualquer mecanismo único de ativação do gene. Vários modos de ação foram sugeridos pelas evidências acumuladas. O primeiro estágio em que um gene alvo pode ser inibido é a transcrição, mas ainda nenhuma evidência foi trazida à luz que apóie a inibição da transcrição, uma vez que a taxa de transcrição de ambos os genes sense e antisense não é afetada pela expressão do gene antisense (Sheehy et al. 1988).

O segundo estágio em que o transcrito antisense pode interferir é o estágio de processamento do RNA, conforme demonstrado por Tieman et al. (1992) que quando os dois íntrons no gene da pectina metil esterase foram colocados na orientação antisense, eles não foram separados. A formação de um duplex entre os transcritos antisense e sense é um fator que contribui para a inibição, foi levantada a hipótese de que um duplex de RNA-RNA é instável e suscetível a nucleases, mas nenhuma evidência direta para a formação de duplex foi encontrada, talvez devido à degradação do duplex (Bourque e Flok, 1992).

Portanto, a formação de tal duplex impediria o processamento ou transporte do mRNA sense através da membrana nuclear ou levaria à degradação do duplex anti-sense por nucleases, tornando o transcrito sense indisponível para tradução (Bonque e Folk, 1992).

A inibição também pode ocorrer na fase de tradução. O transcrito antisense competiria com os ribossomos para se ligar à extremidade 5 & # 8242 do RNA de sentido, inibindo assim a tradução. Isso foi observado por Pestka et al. (1984), que se o RNA antisense não for complementar à extremidade 5 & # 8242 do mRNA, a extensão da inibição é significativamente reduzida por meio de um nível de inibição mais baixo, mas significativo, o que mostra que ocorre a formação de duplex RNA antisense-mRNA, mas o ribossomo que se liga à extremidade 5 & # 8242 é capaz de remover o RNA antisense. Assim, uma vez que o ribossomo se liga ao mRNA, a formação de duplex mRNA-RNA antisense é grandemente reduzida, assim como a inibição (Pestka et al. 1984).

Fatores que influenciam a regulação do RNA antisense da expressão gênica:

Ao fazer construções antisense para regular especificamente a expressão de um gene particular, certos fatores devem ser levados em consideração. A presença de transcrito antisense muito em excesso do mRNA alvo é um pré-requisito para a inibição eficaz, portanto, a escolha do promotor é importante. O promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) é constitutivo e o mais amplamente utilizado.

Outros promotores comumente usados ​​incluem o promotor da nopalina sintase, o promotor do gene da proteína de ligação a clorofila a / b e o promotor do gene CHS. Promotores e terminadores idênticos podem ser empregados para ambos os construtos de sentido e anti-sentido, mas geralmente um excesso de transcritos anti-sentido é necessário, portanto, o gene anti-sentido é clonado junto com promotores constitutivos (Robert et al. 1989). Alguns pesquisadores utilizaram promotores específicos de tecido para a regulação antisense de uma função particular em um tecido específico.

Uma vez que a formação de duplex de transcritos de sentido e anti-sentido é a etapa crítica para a inibição, o grau de homologia e homologia em certas regiões específicas é importante. Embora alguma heterogeneidade seja tolerada, e. gene antisense de amido sintase de mandioca pode suprimir a amido sintase em batata (Salehuzzaman et al. 1993), maçã antisense ACC oxidase foi relatado para inibir a produção de etileno em tomate (Bolitho et al. 1997), mas baixa inibição é observada em casos onde grau de homologia é baixo.

Plantas de tabaco transgênicas carregando o gene antisense para ACC oxidase de tomate mostraram inibição variável em diferentes partes e estados fisiológicos, o que pode ser devido a vários graus de homologia ou flutuações em diferentes tecidos (Einset, 1996).

Oligonucleotídeos anti-sentido:

A inibição transitória de uma expressão de gene específica pode ser alcançada usando oligonucleotídeos antisense, que são moléculas de DNA curtas (14-18 bases) complementares à sequência líder 5 & # 8242 ou extremidade 3 & # 8242 do mRNA. Nos casos em que o oligonucleotídeo é complementar à sequência de codificação, o fragmento 5 & # 8242 pode ser traduzido para gerar um polipeptídeo truncado.

A ligação do oligonucleotídeo desoxi antisense e do mRNA alvo leva à formação de um duplex de DNA-RNA que é instável e é reconhecido pela RNase-H que degrada seletivamente a fita de RNA em um duplex de DNA-RNA, inibindo assim a tradução. No caso de bloqueio da atividade de RNase-H, o oligonucleotídeo direcionado aos sítios cap pode apenas inibir a tradução, pois inibe a ligação da subunidade 40S do ribossomo (Walder e Walder, 1988).

Existe outra classe de oligonucleotídeos que são chamados de bloqueadores de código ou oligonucleotídeos formadores de triplex (Riordam e Martin, 1991), estes se ligam ao sulco principal da sequência alvo do DNA, inibindo assim a transcrição. Eles podem inibir a ligação de fatores de transcrição ligando-se a montante da região de codificação ou podem inibir o movimento da RNA polimerase. A formação do triplex requer que o local alvo tenha sequências de homopurina ou homopirimidina e a terceira fita se liga por pareamento de bases de hoogstênio, embora a estratégia triplex seja bastante eficaz, especialmente no caso de transcrever genes ativamente, mas tem suas desvantagens como a exigência de uma homopurina / homopirimidina sequência alvo e ainda o problema de instabilidade triplex sob condições fisiológicas (Maher et al. 1989).

A eficácia dos oligonucleotídeos depende de vários fatores como a posição do local alvo contra o qual eles são direcionados, o comprimento do oligonucleotídeo e ainda a presença ou ausência de estrutura secundária no local de ligação. A estabilidade do oligonucleotídeo é muito essencial para uma inibição eficaz e, portanto, no caso de oligonucleotídeos não modificados, a baixa absorção e a degradação da nuclease foram os fatores limitantes.

Portanto, foram desenvolvidos vários tipos de modificações que tornam o oligonucleotídeo resistente a nucleases. As modificações são da estrutura de fosfato (por exemplo, metilfosfonatos, fosforotioatos e fosforosselonatos) (Stein e Cohen, 1988). ou as extremidades do oligômero podem ser modificadas (K-oligo descarboxinucleotídeo).

Os oligômeros podem ser acoplados com agentes intercalantes e agentes de metal reativos como EDTA-Fe, fenantrolina-Cu, etc. Polímeros sintéticos como PAMAM den-drímeros também foram investigados para funcionar como sistema de entrega para modulação de gene direcionado. Novos oligonucleotídeos de fosfonato de metila foram projetados com uma fração ligante interna não baseada em nucleotídeos devido à qual a base não pareada complementar do RNA se torna sensível à clivagem, portanto, a clivagem específica do local do RNA alvo é possível (Reynolds et al. 1996).

Aplicações da tecnologia de RNA antisense:

Estratégias antisense têm sido aplicadas a sistemas vegetais, bem como sistemas animais, não apenas para a produção de novos mutantes, mas também para estudar as etapas envolvidas em vias metabólicas específicas, identificando a função do gene, o desenvolvimento da planta, o melhoramento da colheita e outros novos usos.

O RNA antisense fornece uma abertura no estudo da regulação de genes virais, pois uma inibição antisense pode ser considerada uma mutação permeável que seria útil no estudo de genes, mutações nas quais são letais e sua inibição parcial também leva a uma mudança significativa na fenótipo.

Essa inibição parcial foi usada para criar um mutante do tabaco deficiente em NADH-hidroxipiruvato redutase para estudar o papel da foto-respiração na proteção contra o estresse (Oliver et al. 1993). Além de desvendar as funções vitais dos genes, a inibição do RNA anti-sentido tem sido usada para observar várias etapas nas vias metabólicas. Majeau et al. (1994) modificou a atividade da anidrase carbônica que não teve impacto significativo sobre o CO2 assimilação, mas antecipou o efeito do declínio da atividade da anidrase carbônica na condutância estomática e na suscetibilidade ao estresse hídrico.

Mutantes antisense de tabaco com diminuição drástica no conteúdo de Rubisco resultaram em baixa taxa fotossintética, no entanto, o desenvolvimento da folha foi normal e independente do conteúdo de Rubisco, embora o desenvolvimento da folha tenha sido atrasado (Jiang e Rodermel 1995). O alvo bioquímico de vários herbicidas é a acetolactato sintase, e isso foi confirmado pelo cultivo de plantas de batata transgênicas que expressam acetolactato sintase antisense que eram inviáveis ​​sem a suplementação de aminoácidos, portanto, um modelo in vivo para a ação do herbicida foi apresentado (Hofgen et al. 1995).

Da mesma forma, o efeito do etileno na morfogênese da parte aérea foi estudado por meio da produção de plantas de mostarda transgênica que expressam o gene da oxidase do ácido 1-aminociclopropano -1-carboxílico (ACC) antisense, e tais plantas mostraram aumento acentuado no potencial de regeneração e diminuição correspondente na produção de etileno ( Pua e Lee, 1995). Os genes da proteína da fibra de algodão também foram caracterizados usando a inibição de RNA antisense de um gene específico (Hohn, 1996). A inibição anti-sentido foi utilizada para determinar o papel da lipoxigenase (LOX) no protoplasto de lentilha pela introdução do gene LOX anti-sentido (Maccarone et al. 1995).

A tecnologia de RNA antisense formou a base para a elucidação da via biossintética dos flavonóides e, na verdade, o gene CHS foi o primeiro gene endógeno direcionado pelo RNA antisense em plantas. Plantas de petúnia CHS antisense produziram flores com pigmentação de corola clara, mas os níveis de estado estacionário de mRNA de outros genes específicos de flavonóides não foram afetados (Van der Krol et al. 1990).

S-adenosil-metionina (SAM) é um precursor comum para a biossíntese de etileno, bem como biossíntese de poliaminas (espermina e espermidina), e a inibição antisense da expressão do gene SAM descarboxilase em plantas transgênicas de batata forneceu uma abordagem molecular para estudar o efeito de manipulação dos níveis de poliamina no crescimento e desenvolvimento (Kumar et al. 1996).

As plantas de batata que expressam o gene antisense SAM descarboxilase mostraram fenótipos aberrantes devido ao esgotamento de poliaminas celulares e níveis elevados de etileno (Kumar et al. 1996). Além disso, os transgênicos de batata também foram produzidos com o gene antisense SAM descarboxilase conduzido por um promotor indutível por tetraciclina, e esses transgênicos fornecem uma oportunidade para investigações adicionais sobre a inter-relação entre as vias metabólicas da poliamina e do etileno.

Além de elucidar as etapas das vias metabólicas, a inibição do RNA antisense encontrou seu uso na identificação da função do gene como no caso de um gene de amadurecimento (pTOM5), que foi encontrado para ser uma parte da via dos carotenóides (Bird et al. 1991).

Outro gene relacionado ao amadurecimento do tomate (pTOM13) foi encontrado para estar envolvido na síntese de etileno e, portanto, pode ser uma parte do sistema ACC-oxidase envolvido na conversão de ACC em etileno (Thang et al. 1992) Arabidopsis expressando RNA anti-sentido contra repetição de anquirina (AKR) contendo o gene indicou o envolvimento do gene AKR na regulação da diferenciação do cloroplasto (Bouzayer et al. 1992). A repressão anti-sentido da subunidade de ligação de NADH codificada por núcleo do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial em plantas de batata levou ao crescimento vegetativo normal, mas reduziu a fertilidade masculina que pode ser devido à cadeia respiratória mitocondrial insuficiente (Heiser et al. 1997).

Plantas transgênicas de Flaveria bidentis com o gene anti-sentido Rubisco foram usadas para estudar a relação entre CO2 assimilação e conteúdo Rubisco em C4 plantas e observou-se que a inibição da Rubisco levou ao aumento do CO2 concentração e seu vazamento em bundlesheath (Caemmerer et al. 1997).

A importância do gene de transporte de peptídeo AtPTR2-B de Arabidopsis foi avaliada pela produção de transgênicos com o gene AtPTR2-B antisense, os transgênicos tinham fenótipo alterado, floração atrasada e sem sementeira, sugerindo um papel importante do gene no crescimento e desenvolvimento (Song et al. 1997).

Outros exemplos da tecnologia de RNA antisense sendo utilizada para elucidar as funções do gene incluem o gene da ascorbato peroxidase (APX) antisense que expressa o tabaco transgênico, levando ao aumento da suscetibilidade dos transgênicos à lesão de ozônio, sugerindo o papel principal do APX na tolerância ao estresse oxidativo (Orvar e Ellis , 1997). A inibição anti-sentido do gene da biotina carboxilase no tabaco levou a um severo retardo de crescimento, reforçando a importância da biotina para o crescimento das plantas (Shintami et al. 1997).

A tecnologia de RNA antisense também tem sido utilizada para o melhoramento de culturas, além de ser utilizada para o ganho de conhecimentos básicos de desenvolvimento de plantas. A tecnologia tem sido usada na modificação da composição do óleo de semente de óleo de semente de Brassica (Knutzon et al. 1992). O gene da enzima dessaturase foi inibido, levando à produção de sementes com alto teor de óleo de estearato, sem que houvesse diminuição no teor de lipídios das sementes.

A inibição do RNA anti-sentido da expressão do gene da quitinase resultou no aumento da suscetibilidade a doenças fúngicas em plantas Arabidopsis, elucidando algum papel das quitinases na proteção de plantas (Samac e Shah, 1994). Essa técnica também tem sido usada para conferir resistência a infecções virais de plantas. Batatas transgênicas que expressam RNA antisense para a proteína de revestimento do luteovírus do rolo de folha da batata (PLRV) foram resistentes à infecção (Kawchuk et al. 1991). Stanley et al. (Stanley et al. 1990) produziram mandioca transgênica resistente ao vírus latente da mandioca (CLV) pela introdução de uma repetição em tandem de DNA subgenômico B do CLV.

As plantas transgênicas Nicotiana benthaniana que expressam o gene C1 antisense (que codifica para a proteína Rep) do vírus do enrolamento da folha amarela do tomate (TYLCV) foram consideradas resistentes à infecção por TYLCV (Bendalmane e Gronenborn, 1997), portanto, transgênicos de tomate podem ser produzidos, os quais seriam resistentes ao TYLCV, uma das principais doenças do tomate.

A tecnologia de RNA antisense foi recentemente relatada para gerar Hsp70 mutante em A. thaliana e isso trouxe à tona o papel protetor de HSp70 na tolerância térmica e um efeito regulatório sobre os fatores de transcrição de choque térmico levando à autorregulação da resposta ao choque térmico (Lee e Schoftl 1996 )

A estratégia do gene antisense foi aplicada para inibir a expressão de um gene alérgeno durante a maturação da semente no arroz, e a inibição persistiu na progênie das plantas transformadas (Tada et al. 1996).

A tecnologia de RNA antisense tem certas lacunas básicas que precisam ser superadas antes que todo o seu potencial seja explorado. Em primeiro lugar, parece não haver um único mecanismo universal de ação antisense; cada sistema deve ser estudado independentemente quanto aos seus aspectos mecanicistas de inibição.

O grau de inibição é bastante variável, mesmo quando uma única cópia do gene antisense está presente; esse aspecto precisa ser mais estudado em correlação com o número de cópias e o efeito posicional na expressão do gene antisense. Além desses, os efeitos de longo prazo da expressão do gene antisense ou dosagem de oligonucleotídeos antisense, sua degradação e efeitos de ligação não específica precisam ser investigados.

Em conclusão, a tecnologia de RNA antisense é promissora tanto para os sistemas vegetais quanto para os animais, mas antes de seu uso extensivo, os fundamentos da tecnologia devem ser elucidados e a tecnologia adequadamente modulada para que possa ser explorada em todo o seu potencial .


Fundo

Agora está bem claro que as interações RNA-RNA são extremamente importantes na regulação da expressão gênica. Os transcritos antisense naturais (NATs) são simplesmente RNAs contendo sequências que são complementares a outros RNAs endógenos [1]. Eles podem ser transcritos em cis de fitas de DNA opostas no mesmo locus genômico (cis-NATs), ou em trans de loci separados (trans-NATs) [2]. Estudos em vários sistemas eucarióticos têm mostrado que os NATs podem regular a expressão gênica nos níveis de transcrição, maturação, transporte, estabilidade e tradução [1]. Eles estão envolvidos em impressão genômica, interferência de RNA, splicing alternativo, inativação de X e edição de RNA [3-7]. Embora a maioria dos relatórios tenha se concentrado em cis NATs atuantes [8-10], recentemente muitos trans-NATs foram descobertos em humanos, Arabidopsis thaliana e outras espécies, sugerindo que os transcritos antisense podem estar envolvidos em redes regulatórias complexas em eucariotos [11-14].

Muitas pesquisas se concentraram nessa classe de RNA cuja função parece nada mais que a regulação. O principal deles são os microRNAs (miRNAs), um subconjunto de trans-NATs que formam RNA de fita dupla e, subsequentemente, induzem o silenciamento do gene [15]. Centenas de miRNAs - endógenos, aproximadamente 22 nucleotídeos RNAs - foram identificados no genoma humano e reprimem as atividades pós-transcricionais de genes alvo por meio de uma sequência complementar imperfeita, muitas vezes, mas não exclusivamente na região 3 'não traduzida do mRNA (3'-UTR) [16]. Outro grupo de pequenos RNAs, pequenos RNAs de interferência (21-25 nucleotídeos de comprimento), são derivados de longos RNAs de fita dupla e medeiam a degradação de mRNAs com sequências totalmente complementares [17].

A maior parte do RNA em uma célula humana provavelmente não é um RNA regulador especializado. É provável que os RNAs codificadores possam regular uns aos outros por emparelhamento sentido-antisense? De forma mais geral, se não sabemos se um RNA é codificador de proteína ou não, com que frequência vemos um potencial par sentido-antisense com outro RNA? Aqui, abordamos esse problema procurando por pares sentido-antisense putativos, comparando todos os RefSeqs humanos com todos os outros. Dado que sabemos que alguns RNAs não codificantes, especialmente miRNAs, são susceptíveis de emparelhar com outros transcritos [15], restringimos nossa análise ao mRNA codificador de proteínas. Estudos recentes [11-13] identificaram milhares de trans-NATs em mRNAs humanos ou marcadores de sequência expressa, mas são todos longos trans-NATs. Esperamos saber se é possível que o mRNA que codifica a proteína possa regular outra proteína que codifica o mRNA por meio do par curto sentido-antisense.

Dada uma combinação perfeita entre duas transcrições de mRNA, fica-se tentado a supor que uma regulação de nível sentido-antisense deve estar acontecendo. No entanto, um nulo simples, em que a combinação perfeita é apenas um artefato estatístico espúrio, também é viável. Indeed, if one were to take a randomly generated short sequence, at some rate we would expect to find at least sometimes a perfect match somewhere in the transcriptome. How then might we know if the matches are meaningful? First, we ask whether such matches are more common than expected. To this end we employ both randomizations and alternative pairing rules. Second, we look for indications that the matches have unusual properties. Antisense regulation often involves pairing in the UTR or from transcripts originating in a UTR [13, 15]. We therefore ask whether there is a per base pair enrichment for paired matches, at least one of which is a UTR. Third, we ask whether transcripts with different numbers of potential partners have different levels of expression and whether there is a difference between pairs of tissue specific genes and those of housekeeping genes. Finally, we ask whether within the coding transcript single nucleotide polymorphism (SNP) levels are lower than in flanking domains. The results suggest an unexpected richness of short sequence sense-antisense regulation between transcripts originating from protein coding genes.


Integrated detection of natural antisense transcripts using strand-specific RNA sequencing data

Pairs of RNA molecules transcribed from partially or entirely complementary loci are called cis-natural antisense transcripts (cis-NATs), and they play key roles in the regulation of gene expression in many organisms. A promising experimental tool for profiling sense and antisense transcription is strand-specific RNA sequencing (ssRNA-seq). To identify cis-NATs using ssRNA-seq, we developed a new computational method based on a model comparison framework that incorporates the inherent variable efficiency of generating perfectly strand-specific libraries. Applying the method to new ssRNA-seq data from whole-root and cell-type-specific Arabidopsis libraries confirmed most of the known cis-NAT pairs and identified 918 additional cis-NAT pairs. Newly identified cis-NAT pairs are supported by polyadenylation data, alternative splicing patterns, and RT-PCR validation. We found 209 cis-NAT pairs that have opposite expression levels in neighboring cell types, implying cell-type-specific roles for cis-NATs. By integrating a genome-wide epigenetic profile of Arabidopsis, we identified a unique chromatin signature of cis-NATs, suggesting a connection between cis-NAT transcription and chromatin modification in plants. An analysis of small-RNA sequencing data showed that ∼4% of cis-NAT pairs produce putative cis-NAT-induced siRNAs. Taken together, our data and analyses illustrate the potential for multifaceted regulatory roles of plant cis-NATs.

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Statistical framework for the identification…

Statistical framework for the identification of cis -NAT gene pairs. ( UMA )…

Types of newly identified cis…

Types of newly identified cis -NAT pairs and their tissue distribution. ( UMA…

Experimental validation of novel predicted…

Experimental validation of novel predicted cis -NAT pairs. ( UMA ) Cumulative distribution…

Expression quantification of cis -NAT…

Expression quantification of cis -NAT genes. ( UMA ) Scatter plot of gene…

Cumulative frequency of minor gene…

Cumulative frequency of minor gene fraction (Ψ). Numbers next to the green and…

Example of cell-type–specific expression of…

Example of cell-type–specific expression of cis -NAT pairs. ( UMA ) Cumulative distribution…

Distribution of activating chromatin mark.…

Distribution of activating chromatin mark. The distribution of H3K4me3 around the transcription start…


Tsix transcription- versus RNA-based mechanisms in Xist repression and epigenetic choice

Recent inquiries have revealed a surprisingly large number (>2500) of naturally occurring antisense transcripts, but their function remains largely undiscovered. A better understanding of antisense mechanisms is clearly needed because of their potentially diverse roles in gene regulation and disease. A well-documented case occurs in X inactivation, the mechanism by which X-linked gene expression is equalized between XX females and XY males. The antisense gene Tsix determines X chromosome choice and represses the noncoding silencer, Xist. In principle, Tsix action may involve RNA, the act of transcription, or local chromatin. Here, we create novel Tsix alleles to distinguish transcription- versus RNA-based mechanisms. When Tsix transcription is terminated before Xist (TsixTRAP), Tsix cannot block Xist upregulation, suggesting the importance of overlapping antisense transcription. To separate the act of transcription from RNA, we knocked in Tsix cDNA in the reverse orientation (Tsix(cDNA)) to restore RNA levels in cis without concurrent transcription across Xist. However, Tsix(cDNA) cannot complement TsixTRAP. Surprisingly, both mutations disrupt choice, indicating that this epigenetic step requires transcription. We conclude that the processed antisense RNA does not act alone and that Tsix function specifically requires antiparallel transcription through Xist. A mechanism of transcription-based feedback regulation is proposed.


Antisense RNA regulation in prokaryotes: rapid RNA/RNA interaction facilitated by a general U-turn loop structure

Efficient gene control by antisense RNA requires rapid bi-molecular interaction with a cognate target RNA. A comparative analysis revealed that a YUNR motif (Y=pyrimidine, R=purine) is ubiquitous in RNA recognition loops in antisense RNA-regulated gene systems. The (Y)UNR sequence motif specifies two intraloop hydrogen bonds forming U-turn structures in many anticodon-loops and all T-loops of tRNAs, the hammerhead ribozyme and in other conserved RNA loops. This structure creates a sharp bend in the RNA phosphate-backbone and presents the following three to four bases in a solvent-exposed, stacked configuration providing a scaffold for rapid interaction with complementary RNA. Sok antisense RNA from plasmid R1 inhibits translation of the hok mRNA by preventing ribosome entry at the mok Shine & Dalgarno element. The 5' single-stranded region of Sok-RNA recognizes a loop in the hok mRNA. We show here, that the initial pairing between Sok antisense RNA and its target in hok mRNA occurs with an observed second-order rate-constant of 2 x 10(6) M(-1) s(-1). Mutations that eliminate the YUNR motif in the target loop of hok mRNA resulted in reduced antisense RNA pairing kinetics, whereas mutations maintaining the YUNR motif were silent. In addition, RNA phosphate-backbone accessibility probing by ethylnitrosourea was consistent with a U-turn structure formation promoted by the YUNR motif. Since the YUNR U-turn motif is present in the recognition units of many antisense/target pairs, the motif is likely to be a generally employed enhancer of RNA pairing rates. This suggestion is consistent with the re-interpretation of the mutational analyses of several antisense control systems including RNAI/RNAII of ColE1, CopA/CopT of R1 and RNA-IN/RNA-OUT of IS10.


Informação sobre o autor

Afiliações

Institute of Molecular and Translational Therapeutic Strategies, Hannover Medical School, Hannover, Germany

Cardior Pharmaceuticals GmbH, Hannover Medical School, Hannover, Germany

National Heart and Lung Institute, Imperial College London, London, UK

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Contribuições

Both authors researched the data for this article, discussed the content, wrote the manuscript and reviewed and/or edited the manuscript before submission.

Autor correspondente


Natural antisense RNA promotes 3' end processing and maturation of MALAT1 lncRNA

The RNase P-mediated endonucleolytic cleavage plays a crucial role in the 3' end processing and cellular accumulation of MALAT1, a nuclear-retained long noncoding RNA that promotes malignancy. The regulation of this cleavage event is largely undetermined. Here we characterize a broadly expressed natural antisense transcript at the MALAT1 locus, designated as TALAM1, that positively regulates MALAT1 levels by promoting the 3' end cleavage and maturation of MALAT1 RNA. TALAM1 RNA preferentially localizes at the site of transcription, and also interacts with MALAT1 RNA. Depletion of TALAM1 leads to defects in the 3' end cleavage reaction and compromises cellular accumulation of MALAT1. Conversely, overexpression of TALAM1 facilitates the cleavage reaction in trans Interestingly, TALAM1 is also positively regulated by MALAT1 at the level of both transcription and RNA stability. Together, our data demonstrate a novel feed-forward positive regulatory loop that is established to maintain the high cellular levels of MALAT1, and also unravel the existence of sense-antisense mediated regulatory mechanism for cellular lncRNAs that display RNase P-mediated 3' end processing.

© The Author(s) 2016. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.

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TALAM1 is a NAT at the MALAT1 locus. ( UMA ) Expression analysis…

MALAT1 positively regulates the transcription…

MALAT1 positively regulates the transcription and stability of TALAM1, and forms RNA duplex…

MALAT1 cellular accumulation and 3′…

MALAT1 cellular accumulation and 3′ end processing are compromised in TALAM1-depleted cells. (…

TALAM1 promotes the 3′ end…

TALAM1 promotes the 3′ end processing of MALAT1 RNA. ( UMA ) Cutoff…

Model for the feed-forward positive…

Model for the feed-forward positive regulatory loop at the MALAT1 locus to maintain…


Non-coding RNA regulation of endothelial and macrophage functions during atherosclerosis

The endothelial lining can be viewed as the first line of defense against risk factors of vascular disease. Endothelial dysfunction is regarded as an initial event for atherogenesis since defects in vascular integrity and homeostasis are responsible for lipid infiltration and recruitment of monocytes into the vessel wall. Monocytes-turned-macrophages, which possess astounding inflammatory plasticity, perpetuate chronic inflammation and growth of atherosclerotic plaques and, are therefore central for the pathogenesis of atherosclerosis. Because endothelial cells and macrophages are key players during atherogenesis, it is crucial to understand the regulation of their functions in order to develop strategies to intervene disease progression. Interestingly, non-coding RNAs (ncRNAs), broad class of RNA molecules that do not code for proteins, are capable of reprogramming multiple cell functions and, thus, can be used as target agents. MicroRNAs are small ncRNAs whose roles in the regulation of vascular functions and development of atherosclerosis through post-transcriptional manipulation of gene expression have been widely explored. Recently, other ncRNAs including long noncoding RNAs (lncRNAs) have also emerged as potential regulators of these functions. However, given their poor-genetic conservation between species, much work will be needed to elucidate the specific role of lncRNAs in vascular biology. This review aims to provide a comprehensive perspective of ncRNA, mostly focusing in lncRNAs, mechanism of action and relevance in regulating lipid metabolism-independent endothelial and macrophages functions in the pathogenesis of atherosclerosis.