Em formação

A Invertase catalisa a hidrólise de outros açúcares além da sacarose?


Recentemente, fiz um laboratório onde testamos a especificidade do substrato da Invertase em diferentes tipos de açúcares, como álcoois de açúcar e dissacarídeos, medidos pela absorbância do vermelho usando um colorímetro. Nossos resultados indicaram que a lactose e a maltose foram hidrolisadas de maneira mais eficaz do que os álcoois de açúcar sorbitol, inositol e manitol. Acho que isso pode ser porque a lactose e a maltose são semelhantes em estrutura à sacarose, que normalmente hidrolisa, no entanto, esperava que houvesse uma resposta mais concreta.


O metabolismo de vacúolos e carboidratos

Este capítulo discute o metabolismo do vacúolo e dos carboidratos. O vacúolo é capaz de acumular uma ampla gama de moléculas inorgânicas e orgânicas e sequestrá-las contra um gradiente de concentração, mas há evidências conflitantes sobre a extensão em que tais processos estão envolvidos no metabolismo vacuolar de carboidratos primários. A sacarose é o metabólito principal em termos de metabolismo de carboidratos solúveis nas plantas. A sua síntese nas folhas, a dinâmica da sua exportação e o seu subsequente metabolismo nos tecidos sumidouros controlam a taxa e distribuição de uma vasta gama de vias de reacção catabólica e biossintética. A própria sacarose é um metabólito vacuolar e é o precursor biossintético de uma variedade de outros açúcares solúveis, alguns dos quais podem ser encontrados nos vacúolos. Vacúolos preparados mecanicamente e enzimicamente têm sido usados ​​para estudar o metabolismo de carboidratos. O tempo de incubação nas enzimas hidrolíticas e o fato de que essas preparações podem ter atividades contra alguns ou todos os carboidratos, que são encontrados naturalmente no tecido em teste, tornam o isolamento mecânico a opção preferida. As preparações de vacúolos isolados podem ser usadas para preparar membranas de tonoplasto purificadas e, portanto, vesículas de membrana que são capazes de taxas mensuráveis ​​de transporte de metabólitos. É importante, por um lado, ver o vacúolo como um componente do metabolismo geral do carbono nas plantas e, por outro lado, reconhecer seu caráter singular e multifuncional. Estes, por sua vez, afetam fortemente o importante papel desempenhado na partição de carbono.


Ocorrência e natureza da atividade da invertase em moscas pretas adultas (Simuliidae)

Em vitro a atividade da invertase foi mostrada em duas espécies de mosca negra, Prosimulium fuscum e Simulium venustum. A atividade da invertase foi confinada principalmente, senão inteiramente, ao intestino médio, fêmeas alimentadas com sacarose das duas espécies com níveis semelhantes de atividade enzimática. Nenhuma atividade de invertase foi encontrada nas glândulas salivares ou na colheita. O pH ideal para a atividade da invertase em S. venustum era 6 · 2. Nenhum aumento na atividade da invertase ocorreu quando alimentado com água S. venustum os machos foram alimentados com sacarose, e o pequeno aumento nas fêmeas foi estatisticamente insignificante. No entanto, após se alimentarem de sangue humano, as fêmeas mostraram um aumento acentuado na atividade da invertase, que então permaneceu em um nível quase constante por pelo menos 48 horas. Em adultos alimentados com sacarose de ambas as espécies, homogenatos de intestino médio ou de corpos inteiros de machos e fêmeas mostraram síntese de oligossacarídeos quando altas concentrações de substrato e homogenatos foram usadas.


Procedimento para ensaios de invertase

1. Obtenha tubos de ensaio de 8 x 13 mm e rotule-os de 1 a 8 com um marcador permanente Sharpie®.

2. No tubo 1, coloque 0,6 mL de água desionizada. Este tubo será usado para apagar o espectrofotômetro.

3. No tubo 2, coloque 0,5mL de glicose 6,0mM e 0,1mL de água desionizada. A glicose é um açúcar redutor. Como o ensaio mede a quantidade de açúcares redutores produzidos em cada reação, este será o seu controle positivo. Se, depois de executar suas reações, não houver mudança de cor neste tubo, você saberá que há um problema com o reagente DNS ou com a temperatura do banho-maria de 95 ° C.

4. No tubo 3, coloque 0,1 mL de água desionizada. Eventualmente, ele também terá sacarose e servirá como seu controle negativo, uma vez que não se espera que o reagente DNS reaja com a sacarose. Se você observar uma mudança de cor neste tubo depois de realizar suas reações, saberá que algo no ensaio em si não está funcionando.

5. No tubo 4, coloque 0,1mL de enzima invertase purificada. O tubo com a invertase purificada (1mg / mL em tampão de fosfato de potássio pH6) em um balde de gelo na bancada do instrutor. Certifique-se de misturar a solução de enzima antes de retirá-la. Após a conclusão do ensaio, você será capaz de comparar a mudança de cor nos tubos 3 e 4 para saber quanta sacarose foi convertida em glicose e frutose pela enzima invertase purificada.

6. Os tubos 5–8 serão usados ​​para testar a invertase que foi produzida pelas células de levedura do tipo selvagem e mutantes. As células foram cultivadas para você e podem ser encontradas em sua bancada em quatro tubos de 13 mm. Cada cepa de levedura foi cultivada em YEP + 2% de glicose e YEP + 0,05% de glicose. As células crescem quase 10 vezes melhor em glicose normal do que em glicose mínima, como você poderá ver pela turbidez dos tubos. A fim de testar aproximadamente o mesmo número de células, pipete 0,5mL de células selvagens crescidas com glicose a 2% para o tubo 5 e 5mL de células selvagens crescidas com glicose 0,05% para o tubo 6. Em seguida, pipete 0,5mL de glicose 2% - células mutantes crescidas no tubo 7 e 5mL de células mutantes crescidas com glicose a 0,05% no tubo 8.

7. Colete as células girando os tubos 5–8 em uma centrífuga clínica (de bancada) por 4 min (os tubos não precisam ser cobertos para não quebrar). Você deve girar o botão do cronômetro totalmente para a direita antes de trazê-lo de volta para 4 min. para fazer com que a centrífuga inicie e funcione a toda velocidade. Lembre-se que a centrífuga deve ser balanceada e que os volumes nos quatro tubos não são idênticos. Use seu cronômetro, pois os cronômetros da centrífuga nem sempre são precisos.

8. Após a centrifugação, as células de levedura serão peletizadas no fundo dos tubos. Não use pipeta para remover o sobrenadante. Inverta cada tubo sobre a pia, em uma rápida volta de seu pulso para que o tubo fique completamente de cabeça para baixo. O pellet NÃO vai cair! Sem virar o tubo de volta na posição vertical, toque a borda invertida do tubo em uma toalha de papel para remover mais algumas gotas de mídia. Quando o pellet for drenado, vire o tubo na posição vertical. Adicione 2,5mL de água desionizada a cada tubo para lavar as células. Agite cada tubo no vórtex para ressuspender as células na água, gire os tubos novamente por 5 minutos na centrífuga e descarte o sobrenadante.

9. Lave as células uma segunda vez com mais 2,5 mL de água. Vortex e girar na centrífuga uma terceira vez por 5min. O sobrenadante acima de todos os quatro peletes de células pode ser descartado. Deve ficar incolor (não amarelo) após esta segunda lavagem. Se ainda estiver amarelo, lave os quatro pellets de células mais uma vez. Quando as células estiverem adequadamente lavadas e drenadas, adicione 0,1mL de água desionizada e ressuspenda as células.

10. Agora você está pronto para começar seus ensaios. Leve seu rack de 8 tubos, uma pipeta de 1mL, seu cronômetro, sua solução de sacarose 3mM e seu notebook para um dos banhos de água a 55 ° C. Coloque seus tubos no banho-maria. Então, a cada 30seg, adicione 0,5mL da solução de sacarose 3,0mM ao próximo tubo e retorne-o ao banho-maria. Siga o tempo listado na tabela abaixo.

Tubo# Conteúdo Adicionar 0,5ml
de 3 mM de sacarose
Adicionar 3ml
de reagente DNS
1 agua Não adicione 14:00 min.
2 glicose Não adicione 14:30 min.
3 sacarose 00:00 min 15:00 min
4 sacarose + invertase 00: 30min. 15: 30min.
5 WT yst / 2,0% de glicose 01:00 min 16:00 min
6 WT yst / 0,05% de glicose 01:30 min 16:30 min
7 MUT yst / 2,9% de glicose 02:00 min 17:00 min
8 MUT yst / 0,05% de glicose 02:30 min 17:30 min


11. Após cada adição, você deve agitar o tubo brevemente para misturar o conteúdo e, em seguida, mover o tubo para outro local em seu rack no banho a 55 ° C para evitar a adição acidental de sacarose duas vezes ao mesmo tubo. Depois que suas adições de sacarose forem concluídas, afaste-se do banho-maria para dar aos outros grupos espaço para trabalhar.

12. Em seu caderno de laboratório, você deve configurar uma tabela como a acima que indica o conteúdo de cada tubo, mas você deve deixar espaço para registrar as leituras de absorbância que obterá no final dos ensaios e registrar suas observações sobre as cores do tubo. Você também pode usar esse tempo para pensar sobre as outras partes do laboratório de hoje e começar a preparar essas coisas.

13. Cada reação deve ocorrer por 15 minutos exatamente. Quando o tempo estiver quase acabando, leve uma pipeta de 5mL, seu cronômetro, seu notebook e o reagente DNS de sua bancada para o banho-maria. Pare cada reação adicionando 3mL de reagente DNS a cada tubo em intervalos de 30seg, de modo que cada tubo tenha reagido por 15min. Tenha cuidado para não adicionar reagente DNS aos tubos de outra pessoa.

14. O reagente DNS deve reagir em condições alcalinas e a mudança de cor torna-se evidente somente depois que as amostras foram aquecidas por 10 minutos a 90–95 ° C. Coloque todos os tubos de reação em um dos banhos de água quente contidos nas coifas químicas do laboratório. Defina o cronômetro para uma contagem regressiva de 10 minutos, para que você saiba quando o tempo acabou.

15. Remova cuidadosamente os tubos do banho de água quente. Existem suportes para tubos de ensaio perto da banheira para ajudá-lo com os tubos quentes. CUIDADO: Tome cuidado para não queimar os dedos na água quente ou com o vapor e verifique se está removendo os próprios tubos da banheira.

16. Deixe seus tubos assentarem na bancada por 5 minutos até que estejam frios ao toque. Transfira o conteúdo (apenas despeje) em um novo conjunto de tubos. Em seguida, gire os tubos 5–8 por 2min em uma centrífuga clínica. As células nestes tubos devem sedimentar completamente e a solução não deve parecer turva após esta centrifugação. NÃO descarte o sobrenadante após esta rotação.

17. Limpe a parte externa de cada tubo de ensaio com um Kimwipe ™. Usando o tubo nº 1 para limpar o espectrofotômetro, leia a absorbância de cada reação a 540 nm e registre todos os dados em seu caderno de laboratório. Os níveis de atividade da invertase produzida pelas células de levedura foram maiores ou menores do que a atividade da invertase purificada?

Limpeza de Laboratório
Despeje as soluções DNS no recipiente de resíduos do exaustor. Você pode usar luvas para evitar manchas amarelas nas mãos.
Descarte os tubos de ensaio vazios do ensaio de invertase no recipiente de reciclagem de vidro na frente do laboratório.
Todos os materiais contaminados com bactérias devem ser descartados nos sacos de autoclave laranja colados nas bancadas.


Glicômica do sistema imunológico

Pierre Redelinghuys, Paul R. Crocker, em Handbook of Glycomics, 2010

Ativação de linfócitos T: as fases de expansão e contração da resposta imune adaptativa

Em células T virgens maduras, a isoforma menor de 115 kDa de CD43 carrega o núcleo dissialilado 1 O - tetrassacarídeos Neu5Acα (2,3) Galβ (1,3) (Neu5Acα (2,6)) GalNAc-Ser / Thr servindo como um marcador de células T pan. Estes podem ser detectados pelo aumento da ligação do SNA da lectina da planta e podem formar ligantes para o siglec CD22 específico para linfócitos B [46] (Figura 11.5a). Enquanto as células T naïve não expressam o núcleo 2 O-glicanos, em células T ativadas há ramificação em estruturas de hexassacarídeos de núcleo 2 maiores: Neu5Acα (2,3) Galβ (1,3) (Neu5Acα2,3Galβ (1,4) GlcNAcβ (1,6)) GalNAc-Ser / Thr dando origem à isoforma de CD43 de 130 kDa associada à ativação [36]. Essa conversão se deve ao aumento da expressão de C2GnT e à diminuição da atividade de ST6GalI (Figura 11.5b). Estas enzimas competem pelo mesmo substrato aceitador Galβ (1,3) GalNAc-Ser / Thr para formar os pontos de ramificação alternativos nestas estruturas. As células T, portanto, adquirem hexassacarídeos mais complexos na fase inicial após a ativação [47]. Além disso, ambas as isoformas de CD43 ligam a sialoadesina siglec específica do ácido siálico α2,3 e a sialoadesina extensivamente carregada negativamente O-glicanos de CD43 podem contribuir para seu papel na regulação negativa da adesão e ativação de células T. Mudanças na complexidade de O-glicanos em CD43 também influenciam muito suas interações com ligantes em células B.

Figura 11.5. Alterações na expressão de glicosiltransferases e no repertório de glicano acompanham a ativação de linfócitos T após a apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígeno (APCs). Linfócitos T em repouso (a), linfócitos T e seus subconjuntos logo após a ativação (b) e linfócitos T posteriormente após a ativação (c). C2GnT e as α2,6 sialiltransferases são amplamente responsáveis ​​por essas mudanças e existem diferenças entre as células T CD8 + e CD4 +, bem como entre os vários subconjuntos de células Th. Posteriormente, a ativação da expressão de ST6Gal-I diminui enquanto a expressão de GnTV aumenta, criando ligantes de galectina no receptor de células T (TCR).

A expressão de ST6GalNAcIV é rapidamente induzida após a ativação de linfócitos T CD8 + murinos [48], o que pode proteger essas células da apoptose induzida por galectina-1 no início da resposta imune (Figura 11.5b) [33]. Por outro lado, a expressão de ST6GalI é reduzida conforme detectado por uma ligação diminuída de SNA. As células murinas CD4 + diferem de suas contrapartes CD8 + por apresentarem aumento de 9-O acetilação de ácidos siálicos ligados a α2,6. Além disso, sua polarização em fenótipos Th1 e Th2 está associada à expressão regulada diferencialmente de ST6GalI, levando a fenótipos SNA baixo e SNA alto, respectivamente. Treg as células geralmente mostram um maior nível de sialilação [28,30], onde pode ser um meio de regular a tolerância e a capacidade de resposta das células imunes. Além disso, essas células superexpressam galectinas-1 e -10 que preferencialmente se ligam e induzem a morte de células SNA de baixo Th1, distorcendo a resposta imune a um perfil de citocinas Th2, um aspecto chave de sua atividade imunossupressora (Figura 11.5b) [30].

Mais tarde na ativação, há uma dessialilação global do núcleo 1 O-glicanos (Neu5Acα (2,3) Galβ (1,3) GalNAc-Ser / Thr) para gerar núcleo asialo 1 O-glicanos (Galβ (1,3) GalNAc-Ser / Thr) que são reconhecidos pela lectina vegetal PNA em CD8, CD43 e CD45 [49]. Essas alterações correspondem a uma expressão reduzida de ST6GalI e um aumento da expressão da galactosiltransferase α1,3GalT (Figura 11.5c). No caso de CD45, pode haver síntese de novo de CD45 abrigando núcleo asialo 1 O-glicanos em vez de dessialilação da glicoproteína existente. A dessialilação de CD45 pode ser dependente da isoforma. Por exemplo, em células T CD4 + ativadas, enquanto o núcleo 1 O-glicanos da isoforma CD45RB são sialilados, a sialilação reduzida de outras isoformas CD45 em células T ativadas pode promover o reconhecimento de antígenos, sinalização de TCR e produção de citocinas [31].

β (1,6)N-Acetilglucosaminiltransferase V (GlcNAcTV GnTV) é uma enzima chave no N-glicosilação de células T. Ao contrário da expressão diferencial de C2GnT observada durante a maturação de timócitos e ativação de linfócitos T, a expressão de GnTV e sua estrutura de oligossacarídeo resultante permanece constante em timócitos e células T periféricas virgens. No entanto, após a ativação de células T, a atividade de GnTV é regulada positivamente, iniciando a ramificação de GlcNAcβ (1,6) de N-glicanos no TCR para gerar estruturas de polilactosamina mais complexas que são reconhecidas pelas galectinas-1 e -3 [50] (Figura 11.5c). Aqui, a ligação da galectina cria uma estrutura de superfície celular que limita a mobilidade lateral do TCR, restringindo sua reticulação e agrupamento. Além disso, o tamanho maior do GnTV modificado N-glicanos também podem restringir a topografia e espaçamento dos aglomerados de TCR no plano da membrana. Isso aumenta o limite para a ativação das células T (força do sinal necessária para induzir a responsividade das células T ao antígeno) ao restringir o recrutamento de TCR aos locais de apresentação do antígeno [33]. Conforme discutido anteriormente por seu papel na indução de apoptose em timócitos, a formação dessas redes de galectina-glicoproteína desempenha um papel importante na sinalização celular e no turnover do receptor, determinando a escolha entre sobrevivência, proliferação e diferenciação celular e regulando as decisões entre tolerância e responsividade imunológica.

A atividade da sialidase endógena aumenta nas células imunes durante a ativação ou diferenciação. Existem quatro formas geneticamente distintas de sialidase de mamífero, cada uma com uma localização celular predominante (associada à membrana plasmática, lisossomal ou citosólica) e especificidade de substrato. Neu-1 é uma sialidase lisossomal que ocorre como um complexo multi-enzima que inclui β-galactosidase e PPCA, uma proteína que protege e ativa Neu-1. Após a ativação das células T, Neu-1 é regulado positivamente e, subsequentemente, desialila o núcleo 1 O-glicanos em glicoproteínas e em gangliosídeos, como GM1 e GM3, não apenas em lisossomas, mas também em localizações extralisossomais na periferia [51] (Figura 11.5c).

Após uma resposta imune bem-sucedida, os linfócitos T sofrem apoptose, eliminando 90% das células T antígeno-específicas previamente ativadas e gerando uma nova população de células de memória. Na ausência de estimulação de TCR recente, quando os sinais imunológicos estão diminuindo e quando os níveis de IL-2 são limitantes, as células T CD8 + periféricas sofrem apoptose dependente de caspase, um processo que é regulado pelo ressurgimento de asialo-core suscetível à galectina 1 O-glicanos (Galβ (1,3) GalNAc-Ser / Thr) que podem ser observados como um aumento na ligação a PNA. Esta mudança ocorre como resultado de uma redução na função ST3GalI por meio de um mecanismo regulador pós-transcricional e devido ao aumento Neu-1 atividade da sialidase após ativação [52,53]. Ao se ligar a estes asialo-core 1 O-glicanos, tanto as galectinas-1 quanto as -9 contribuem para a eliminação das células T específicas do antígeno ativadas na fase de resolução da resposta imune.

O alongamento das sequências de lactosamina (Galβ (1,4) GlcNAcβ (1,3)), o aumento da atividade de C2GnT e o aumento resultante no núcleo 2 O-glicanos nas glicoproteínas da superfície celular, como CD7, CD43 e CD45, juntamente com a sialilação α2,6 reduzida de CD45, aumenta a ligação à galectina-1, o que também leva à indução da morte celular [36]. A glicosilação diferencial dessas glicoproteínas de superfície celular pode regular seletivamente a sobrevivência de células efetoras Th1, Th2 e Th17. Enquanto as células Th1 e Th17 expressam um perfil de glicano necessário para a sinalização de galectina-1, morte celular e terminação da resposta inflamatória, a sialilação α2,6 diferencial de N- e O-glicanos em glicoproteínas de células Th2 protegem essas células da galectina-1 [30]. Assim, a galectina-1 regula negativamente as respostas imunes mediadas por Th1 e Th17 de maneira autócrina, levando à sua eliminação preferencial.

O subconjunto menor de células T que se destinam a se tornar células de memória promove sua sobrevivência reduzindo a expressão do núcleo 2 O-glicanos, evitando assim as interações com o núcleo 2 indutor de apoptose Oproteínas de ligação a glicano específicas como galectinas [33]. Uma vez que se tornam células T de memória, a atividade de C2GnT aumenta e, consequentemente, há aumento da expressão do núcleo da superfície celular 2 O-glicanos. Além disso, a diferenciação de células T CD8 + efetoras ativadas em células de memória viáveis ​​ocorre com uma ressialilação significativa do núcleo 1 O-glicanos [52].


O açúcar suprime a morte celular causada pela interrupção da fumarilacetoacetato hidrolase em Arabidopsis

Fumarilacetoacetato hidrolase (FAH) hidrolisa fumarilacetoacetato em fumarato e acetoacetato, a etapa final na via de degradação da tirosina (Tyr) que é essencial para os animais. Anteriormente, descobrimos pela primeira vez que a via de degradação de Tyr desempenha um papel importante nas plantas. Mutação do SSCD1 gene que codifica FAH em Arabidopsis leva à morte celular espontânea em condições de dias curtos. Neste estudo, apresentamos que o fenótipo letal do baixo-morte celular sensível ao dia 1 (sscd1) as mudas foram suprimidas por açúcares, incluindo sacarose, glicose, frutose e maltose de uma maneira dependente da dose. A análise de PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) mostrou a expressão dos genes da via de degradação de Tyr dioxigenase homogentisado e isomerase de maleilacetoacetatoe genes de processamento de sacarose célula-parede invertase 1 e invertase G alcalina / neutra, foi regulado no sscd1 mutante, no entanto, essa regulação positiva poderia ser reprimida pelo açúcar. Além disso, uma alta concentração de açúcar atenuou a morte celular de Arabidopsis mudas de tipo selvagem causadas por tratamento com succinilacetona exógena, um metabólito anormal resultante da perda de FAH na via de degradação de Tyr. Esses resultados indicaram que (1) o açúcar pode suprimir a morte celular em sscd1, o que pode ser porque o fornecimento de açúcar aumenta a resistência de Arabidopsis mudas aos efeitos tóxicos da succinilacetona e reduz o acúmulo de intermediários de degradação de Tyr, resultando na supressão da morte celular e (2) genes de processamento de sacarose célula-parede invertase 1 e invertase G alcalina / neutra pode estar envolvido na morte celular em sscd1. Nosso trabalho fornece insights sobre a relação entre açúcar e sscd1- morte celular mediada e contribui para a elucidação da regulação da morte celular resultante da perda de FAH nas plantas.

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Biologia 114 Teste 1

lipídios - compostos orgânicos ricos em energia, como gorduras, óleos e ceras, que são feitos de carbono, hidrogênio e oxigênio. Fornecer energia
e são a principal fonte de gordura no corpo.

proteínas- compostas por carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio.
Todos são compostos dos mesmos vinte aminoácidos.
Constituem mais de 50% da massa seca das células do corpo.

blocos de construção de lipídios
ácido graxo

Exemplo de um dissacarídeo
Sacarose

Ligações iônicas e outras interações polares
algumas cadeias laterais de aminoácidos têm carga positiva ou negativa. Cadeias laterais carregadas positivamente podem se ligar a cadeias laterais carregadas negativamente por meio de ligações iônicas. Da mesma forma, as cadeias laterais polares sem carga em uma proteína podem se ligar a aminoácidos iônicos.

Efeito hidrofóbico
Algumas cadeias laterais de aminoácidos são apolares. Esses aminoácidos tendem a excluir a água. À medida que uma proteína se dobra, os aminoácidos hidrofóbicos são provavelmente encontrados no centro da proteína, minimizando o contato com a água.

forças de van der Waals
Os átomos dentro das moléculas têm atrações fracas entre si se estiverem a uma distância ideal entre eles. Essa distância ótima é chamada de raio de van der Waals, e a atração fraca é a força de van der Waals. Se dois átomos estiverem muito próximos, suas nuvens de elétrons se repelirão. Se eles estiverem distantes, a força de van der Waals diminuirá.


Enzimas na fabricação de pão

Várias reações catalisadas por enzimas ocorrem durante a preparação do pão. Primeiro, o amido deve ser dividido em açúcar. O açúcar então deve ser dividido em açúcares simples para permitir que o fermento reaja com esses açúcares durante o processo chamado fermentação (aumento).

O amido é composto de muitas unidades de glicose unidas, mas a levedura não consegue digerir o amido, a menos que seja dividido em unidades de glicose.

A digestão enzimática do amido pode ocorrer de duas maneiras principais, danificando o amido mecanicamente ou gelatinizando-o.

O amido danificado soa como se tivesse sido estragado para assar, mas isso não é verdade. Significa simplesmente que alguns grânulos de amido foram esmagados, quebrados ou lascados durante o processo de moagem. Na verdade, alguns danos ao amido são altamente desejáveis ​​na farinha de pão e 6% dos danos (da quantidade total de amido presente) são considerados quase corretos.

Diversas enzimas são necessárias na massa para converter o amido em açúcares simples, dos quais o fermento pode se alimentar. Este é um processo complexo e envolve as enzimas alfa e beta amilase. Se essas enzimas estiverem presentes, elas podem digerir o amido e fornecer os açúcares para a fermentação do fermento.

O amido existe em duas formas diferentes - uma forma de cadeia não ramificada chamada amilose e uma forma ramificada chamada amilopectina. As enzimas que digerem o amido são chamadas de amilases.

Existem duas enzimas importantes que digerem esses tipos de alfa-amilase e beta-amilase do amido.

Alfa-amilase

A massa deve conter alguma alfa-amilase para digerir a parte amilopectina do amido, mas se a massa contiver muito dessa enzima, ela pode liquidificar completamente o amido.

A alfa-amilase ataca o amido praticamente em qualquer lugar ao longo de suas cadeias, produzindo cadeias menores de vários comprimentos. Essas cadeias podem conter uma unidade (glicose), duas unidades (maltose) ou unidades maiores, chamadas dextrinas, que contêm muitas unidades de glicose. Em uma massa, a beta-amilase pode digerir essas dextrinas em maltose.

Beta-amilase

Os grãos e a farinha de cereais sempre têm um suprimento adequado de beta-amilase, que pode digerir a amilose completamente em açúcares. A beta-amilase ataca as cadeias de amilose e as quebra em moléculas de maltose. A maltose é um dissacarídeo que contém duas moléculas de glicose.

A beta-amilase também começa a digerir a amilopectina de uma extremidade da molécula, mas não pode quebrar os ramos, então a digestão é interrompida sempre que se trata de um ramo. Portanto, a digestão do amido pela beta-amilase resulta em uma mistura de maltose e dextrinas maiores. A levedura produz a enzima maltase para quebrar a moltose em moléculas de glicose que pode fermentar.

Depois que o amido é decomposto nesses açúcares simples, outras enzimas na levedura agem sobre os açúcares simples para produzir álcool e dióxido de carbono na etapa de fabricação do pão chamada fermentação. A sacarose (açúcar) não pode ser fermentada diretamente pela enzima de levedura, zimase. Uma das outras enzimas da levedura, a invertase, deve primeiro digerir a sacarose em glicose e frutose. A enzima do fermento, zimase, fermenta esses açúcares.


Discussão

No Brasil, o bagaço da cana-de-açúcar é um importante resíduo agroindustrial. É composto de celulose (25–45%), hemicelulose (28–32%), lignina (15–25%) e uma pequena porcentagem de outros compostos [70, 71]. Apesar dessa composição recalcitrante, mecanismos eficientes de hidrólise permitem a liberação de açúcares fermentáveis ​​do bagaço da cana-de-açúcar e seu uso posterior para a produção de etanol celulósico [18, 72,73,74]. Estudos transcriptômicos e / ou proteômicos em fungos filamentosos têm sido empregados para entender e melhorar coquetéis enzimáticos para desconstruir a biomassa vegetal. Esses estudos revelaram um vasto repertório de celulases e hemicelulases [4, 18, 19, 75,76,77]. N. crassa, A. niger, T. reesei e A. nidulans são excelentes produtores de enzimas para aplicações industriais, e vários estudos enfocaram esses fungos [78,79,80,81,82]. Compreender os mecanismos moleculares pelos quais os fungos degradam a biomassa vegetal pode melhorar a etapa de sacarificação SEB, que é importante para a produção de etanol 2G no Brasil [4, 18, 19, 83, 84].

Para obter mais informações sobre novas enzimas e identificar novos genes específicos para a hidrólise da biomassa da cana-de-açúcar, optamos por investigar A. fumigatus por ser amplamente distribuído no meio ambiente, pode degradar a biomassa vegetal e é um excelente produtor de enzimas [21]. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo sobre a resposta transcricional e o secretoma de A. fumigatus cultivado em bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor.

Existem poucos estudos ômicos sobre a hidrólise de biomassa por A. fumigatus [22,23,24,25], e apenas um estudo analisou o transcriptoma de A. fumigatus quando cultivado em substratos de polissacarídeo. Miao et al. [25] conduziram um estudo transcricional sobre a indução de CAZymes por este fungo cultivado em celulose, xilana de espelta de aveia, palha de arroz e sacarose. Os autores mostraram que genes importantes são expressos diferencialmente em cada fonte de carbono.

Aqui, encontramos poucas discrepâncias no número de genes induzidos quando usamos SEB como fonte de carbono (Tabela 4). As principais famílias CAZyme (GH1, GH3, GH5, GH6, GH7, GH10, GH11, GH12, GH43, GH62, GH67, GH74, AA9, CE3, CE5 e CE16 [85]) também foram induzidas. No entanto, genes importantes, incluindo GH45, GH51, GH54, GH93, GH115 e CE1 foram regulados negativamente no SEB. Além disso, dois genes importantes foram induzidos exclusivamente em SEB: PL4 (Afu4g03780 e Afu8g00820), que desempenha um papel na degradação da pectina, e CBM35 (Afu8g02510), que é conhecido por se ligar principalmente a xilana e mananas [86]. A expressão gênica distinta foi provavelmente devido à composição do substrato e ao tempo de cultivo, que foi de 24 horas para nossa análise. Tempos de cultivo mais curtos podem apontar um novo padrão para a indução gênica. Em dados de qRT-PCR, observamos que 6 h é o início da expressão gênica, o que pode representar um mecanismo padrão no qual A. fumigatus age em contato com fontes complexas de biomassa e deve conter mais enzimas altamente induzidas. Esses resultados também explicam a porcentagem (35%) de CAZymes diferencialmente expressos identificados nos dados de RNA-Seq em 24 h.

Como as glicosiltransferases (GTs) contribuem para a remodelação das células fúngicas, a porcentagem de genes regulados positivamente foi baixa (

1%). Da mesma forma, Miao et al. [25] descreveram que os genes que codificam GTs são regulados negativamente na cepa Z5, o que apóia a ideia de que os GTs não participam diretamente da hidrólise da biomassa complexa.

Nesse sentido, a própria biomassa deve ser investigada para se entender a hidrólise da biomassa da cana-de-açúcar da melhor maneira possível. Um trabalho semelhante realizado por Borin et al., 2017 [18] descreveu uma resposta transcricional de A. niger e T. reesei cultivado em SEB por diferentes períodos. Eles encontraram 190 CAZymes regulados positivamente de 62 famílias diferentes em A. niger, e 105 genes de 51 famílias CAZyme em T. reesei, enquanto detectamos 135 CAZymes regulados positivamente no A. fumigatus transcriptoma aqui. O número de genes induzidos por cada microrganismo era diferente e dependia do tempo. Um número maior de DEGs em A. niger e T. reesei foi observada em 24 horas de cultura, e então comparamos nossos dados nesta duração, e novamente pequenas diferenças em CAZymes regulados positivamente foram observadas.

Após a hidrólise da biomassa, que quebra a celulose e a hemicelulose em mono- ou dissacarídeos, os açúcares liberados precisam ser transportados para as células por meio de um grande número de transportadores de açúcar, muitos dos quais ainda não foram caracterizados [20, 21, 87]. Um dos principais desafios relacionados à produção de biocombustíveis a partir da biomassa lignocelulósica é a incapacidade dos organismos de crescer, transportar e fermentar açúcares diferentes da glicose (por exemplo, xilose e celobiose). Obter uma melhor visão sobre os transportadores potenciais de xilose e / ou celobiose parece ser uma boa abordagem para superar este desafio [87]. Esses transportadores representam uma importante ferramenta industrial que pode ser aplicada em diferentes processos industriais [88,89,90]. Além disso, os genomas de fungos filamentosos também codificam um grande número de transportadores da superfamília de facilitadores principais (MFS). Por exemplo, o T. reesei e A. nidulans foi previsto que os genomas codificam 164 e 357 proteínas pertencentes ao MFS, respectivamente, embora o número exato de proteínas envolvidas no transporte de açúcar permaneça desconhecido [91,92,93].

Também estávamos interessados ​​em novos transportadores de açúcar, como o transportador de xilose. Até agora, nenhum transportador de açúcar para A. fumigatus relacionados à decomposição de biomassa foi descrito. Verificamos que os transportadores homólogos de 25 DEG tinham perfis de expressão particulares, regulados positivamente ou regulados negativamente, sugerindo que a hidrólise SEB liberou glicose, xilose ou celobiose suficientes para regular a expressão do gene do transportador de açúcar. Outro achado interessante foi que dois transportadores de açúcar (Afu6g14442 e Afu1g03530) foram altamente induzidos em SEB (25,5 vezes e 10 vezes, respectivamente) e na presença de xilose a 1%, o que revelou que esses transportadores de açúcar poderiam ser transportadores de xilose específicos em Aspergillus fumigatus. Superexpressão de transportadores de xilose em S. cerevisiae é uma maneira rápida de usar xilose e pode melhorar a produtividade do etanol [94].

Além do transcriptoma, avaliamos as proteínas secretadas por A. fumigatus por SDS-PAGE e LC-MS / MS. Da mesma forma, três estudos compararam o secretome de A. fumigatus em substratos complexos (Tabela 2) [22,23,24]. Liu et al., [24] identificaram 152 proteínas na palha de arroz e 125 proteínas diferentes no Avicel. Adav et al., [23] quantificaram 73 proteínas pertencentes a celulases, glicosídeos hidrolases e amilases. Detectamos algumas proteínas secretadas que também foram identificadas quando A. fumigatus foi cultivado em milho, trigo, soja, Avicel, palha de arroz, xilana e amido como fonte de carbono. No entanto, pela primeira vez, verificamos importantes CAZimas secretadas como inchaço (CBM1), duas endoglucanases putativas (LPMO) (AA9), acetil xilano esterase (CBM1), duas feruloil esterases (CE1), endo-1,4-beta- xilanase (GH11), endo-1,3 (4) -beta-glucanase (GH16), glicosil hidrolase (GH3), endoglucanase (GH5), arabinanase (GH43), endo-1,4-beta-manosidase (GH5 / CBM1 ) e arabinogalactano endo-1,4-beta-galactosidase (GH53). Desta forma, podemos concluir que detectamos quantidades de proteínas semelhantes às descritas anteriormente, que podem ser específicas para a biomassa SEB.

Esses dados mostraram que, embora os dados do transcriptoma não tenham revelado novos alvos enzimáticos potenciais para a desconstrução da desconstrução da biomassa da cana-de-açúcar, as análises do secretoma indicaram enzimas-chave que podem ser essenciais para essa hidrólise e que atuam sinergicamente para uma desconstrução eficiente. Observamos claramente a necessidade de enzimas acessórias secretadas como LPMO e inchaço, que nunca foram descritas em outros A. fumigatus análises de secretoma [95], o que nos permitiu concluir que os outros CAZymes secretados juntamente com AA9 identificados em A. fumigatus formam um potencial arsenal de enzimas hidrolíticas.

LPMOs foram recentemente implicados na degradação da biomassa lignocelulósica. Embora essas enzimas tenham sido classificadas pela primeira vez nas famílias GH61 e CBM33, atualmente são classificadas nas famílias AA9 e AA10. Essas enzimas clivam as ligações glicosídicas da biomassa lignocelulósica por meio de um mecanismo oxidativo que fornece novos fins para o reconhecimento das celulases e para a ação na celulose [95, 96]. Além disso, AA9s foram identificados em A. niger , M. thermophile, T. asperellum, e T. reesei crescimento de secretoma no bagaço da cana-de-açúcar, o que nos permite concluir que eles desempenham um papel importante na quebra da biomassa lignocelulósica [4, 95,96,97,98,99].

Muitos estudos se concentraram nas enzimas LPMO, e alguns trabalhos até mesmo as caracterizaram, mas nenhuma investigação sobre as enzimas LPMO de A. fumigatus estão disponíveis até agora [96]. Portanto, o papel da maioria dessas enzimas permanece obscuro, e a expressão de AA durante A. fumigatus o crescimento do bagaço sugere que eles desempenham um papel importante na degradação da biomassa.

Juntos, o transcriptoma e o secretoma mostraram várias enzimas que A. fumigatus usa para hidrolisar SEB e que provavelmente atua sinergicamente para despolimerizar celulose e hemicelulose. Na maioria Aspergillus espécies, genes distintos codificam a mesma classe de enzimas (isoenzimas) [77], conforme observado pelos dados sobre o A. fumigatus secretome e transcriptoma. Nossos resultados sugerem que a hidrólise completa dessa biomassa de lignocelulose em açúcares simples, como glicose, xilose e arabinose, requer as ações combinadas de várias enzimas que possuem diferentes especificidades de substrato e agem sinergicamente. O grande potencial desta espécie é evidente, e suas enzimas podem contribuir para a otimização de coquetéis enzimáticos para uso na produção de bioetanol 2G.


Efeito da composição da massa e das condições de fermentação no desempenho da levedura

Açúcares

A Figura 2 dá uma visão geral das diferentes fontes endógenas e adicionadas de açúcares fermentáveis ​​na massa e sua degradação por enzimas endógenas (cereais) e enzimas adicionadas ou de levedura.

Fontes de açúcares fermentáveis ​​na massa e sua degradação durante a fermentação

A massa de farinha de trigo contém diferentes fontes de açúcares fermentáveis. Existem alguns sacarídeos livres naturalmente presentes na farinha de trigo. Suas quantidades são, no entanto, relativamente baixas, variando de aproximadamente 0,05% (para glicose, frutose e maltose) a 0,2% a 0,3% (para sacarose e rafinose) (Potus e outros 1994 Sahlström e outros 2004 Delcour e Hoseney 2010 Codina e outros 2013). No farelo de trigo, entretanto, concentrações relativamente altas de sacarose (1,75% a 3,0%) estão presentes (MacArthur e D'Appolonia 1979 Brillouet e Mercier 1981 Verspreet e outros 2015). Portanto, a refeição inteira contém concentrações mais altas de sacarídeos livres do que a farinha. De fato, concentrações de sacarose de 0,9% e 1,1% foram relatadas para massa de farinha inteira (Verspreet e outros 2013 Struyf e outros 2017a).

Devido à quantidade relativamente baixa de sacarídeos livres na farinha de trigo, a maioria dos açúcares fermentáveis ​​na massa são gerados pela degradação do amido danificado por amilases (Randez-Gil e Sanz 1994 Hebeda e Zobel 1996 Bell e outros 2001 Cauvain and Young 2007 Codina e Leahu 2009). Amido danificado refere-se a grânulos de amido que são danificados durante a moagem, e sua quantidade varia de 5% a 8% (base farinha) em farinhas de trigo duro obtidas por moagem de rolo (Van Der Borght et al. 2005). Estudos recentes mostraram que, ao lado do amido danificado, o frutano também é uma fonte importante de açúcares fermentáveis ​​na massa (Struyf e outros 2017a). Os frutanos consistem em unidades β-frutofuranosil e contêm uma ou nenhuma unidade α-glucopiranosil (Lewis 1993). A quantidade de frutano nos grãos de trigo varia de 0,7% a 2,9% do peso seco do grão (Huynh e outros 2008). Um estudo de Haska e outros (2008) mostrou que os níveis de frutano na farinha (1,4% a 1,7%) eram claramente inferiores aos da fração correspondente do farelo de trigo (3,4% a 4,0%). Com base em nossas próprias observações e dados da literatura, os níveis de frutano na refeição inteira variam de 0,6% a 2,9% (Haskå e outros 2008 Huynh e outros 2008 Andersson e outros 2013).

O amido danificado é degradado em açúcar fermentável maltose por amilases que atuam nas ligações α- (1,4) - e / ou α- (1,6) dos polímeros de amido (Van der Maarel e outros 2002).Dois tipos de amilases estão presentes na farinha de trigo: α-amilases e β-amilases. α-Amilases são endo-amilases que hidrolisam as ligações α- (1,4) dentro da cadeia de amido mais ou menos aleatoriamente, gerando oligossacarídeos e dextrinas α-limite. As β-amilases são enzimas de ação exo que clivam a maltose da extremidade não redutora da cadeia do amido (Van der Maarel e outros 2002). A capacidade de uma suspensão farinha-água de produzir maltose é conhecida como atividade amilolítica da farinha (Dodić e outros 2005). Em amostras de massa não levedada, a degradação enzimática do amido danificado leva a um aumento muito rápido dos níveis de maltose durante a mistura e nos primeiros minutos de incubação. Struyf e outros (2016) relataram um aumento na concentração de maltose de 0,1% na farinha para 1% após a mistura e 2% após 180 min de incubação. Isso também foi relatado por Lee e Geddes (1959), que observaram que, após a mistura, o teor de maltose de uma massa lisa era 10 a 15 vezes maior do que o teor de maltose da farinha original. Os níveis de maltose na massa dependem do conteúdo total de amido danificado e da atividade α-amilase da farinha (Struyf e outros 2016). As massas preparadas a partir de farinhas com atividades de α-amilase mais altas ou maiores teores de amido danificado, portanto, conterão níveis mais altos de maltose. Como a atividade da α-amilase é frequentemente limitada na farinha de trigo, a α-amilase ou α-amilase do malte fúngica é frequentemente adicionada à farinha de trigo para aumentar o nível de açúcares fermentáveis ​​na massa (Hebeda e Zobel 1996 Hruskova e outros 2003 Cauvain and Young 2007 )

Frutanos e sacarose são degradados em frutose e glicose pela invertase, que é secretada por S. cerevisiae células de levedura e retidas em sua parede celular (Nilsson e outros, 1987). A sacarose endógena da farinha é muito rapidamente degradada pela invertase de levedura. Vários estudos mostraram que toda a sacarose presente na farinha ou na farinha integral foi degradada durante a mistura da massa, sem nenhuma sacarose no início da fermentação (Potus e outros 1994 Codina e outros 2013 Verspreet e outros 2013). Além disso, os níveis de frutano diminuíram em 30 a 80% durante a mistura e fermentação (Verspreet e outros 2013 Knez e outros 2014 Gélinas e outros 2015). Observou-se que uma proporção maior da população inicial de frutanos foi degradada quando a farinha de trigo foi usada para fazer pão em vez de farinha integral (Knez e outros 2014 Gélinas e outros 2015).

Preferência de substrato de fermento na massa de pão

Glicose e frutose são as fontes de açúcar preferidas de S. cerevisiae (Carlson 1999). Embora a frutose seja usada concomitantemente com a glicose, o consumo desta é mais rápido quando os dois açúcares estão presentes (Berthels e outros, 2004). A glicose retarda a absorção de frutose. Na verdade, ambos os açúcares são importados para as células de levedura pelos mesmos transportadores, mas eles mostram uma afinidade maior pela glicose do que pela frutose (Verstrepen e outros, 2004). Ao lado da glicose e da frutose, as células de levedura são capazes de degradar e consumir uma ampla gama de outros carboidratos presentes na massa como, por exemplo, sacarose, frutano e maltose. A invertase de levedura, sacarose degradante e frutano, é codificada por uma família de SUC genes, dos quais SUC2 é o mais extensamente caracterizado (Trumbly 1992). o SUC os genes são regulados exclusivamente pela repressão da glicose (Carlson e Botstein 1982 Trumbly 1992). A invertase de levedura é ativa durante a mistura, também quando as células de levedura são cultivadas com glicose como a única fonte de açúcar (Potus e outros 1994 Codina e outros 2013 Jayaram e outros 2013 Verspreet e outros 2013 Struyf e outros 2017a). A alta atividade da invertase de fermento de padeiro durante a mistura e fermentação resulta em uma rápida degradação do frutano e da sacarose presentes na massa (Verspreet e outros 2013). A glicose e a frutose resultantes são rapidamente consumidas durante os estágios iniciais de fermentação. Portanto, a taxa de fermentação durante a primeira hora de fermentação da massa magra depende principalmente do teor de frutano e sacarose da farinha (Figura 3) (Struyf e outros 2017a). Somente quando a glicose, a frutose, a sacarose e o frutano estão quase esgotados, as células de levedura começarão a consumir maltose. Os genes que estão envolvidos no consumo de maltose foram caracterizados em detalhes para cepas de laboratório de S. cerevisiae (Attfield e Bell 2003). Para consumir maltose, as células de levedura precisam de 1 de 5 maltose não ligada MAL loci. Cada MAL locus consiste em 3 genes que codificam uma enzima transportadora de maltose (maltose permease) MALTE, uma enzima hidrolisante de maltose (maltase) MALS, e uma proteína reguladora (MALR) que é necessário para a indução dos outros 2 genes (Charron e outros 1989 Trumbly 1992 Higgins e outros 1999). Em contraste com a sacarose, a maltose precisa ser transportada para as células de levedura pela maltose permease, após o que é hidrolisada no interior das células pela maltase. A expressão da maltose permease e genes da maltase é regulada pela repressão da glicose e indução da maltose (Trumbly 1992). O mecanismo de repressão da glicose, portanto, cria uma fase de latência no CO2 produção quando as células de levedura precisam se adaptar do consumo de glicose / frutose ao consumo de maltose, que é o açúcar mais abundante na massa de farinha de trigo (Figura 3) (Higgins e outros, 1999). Uma queda clara na taxa de fermentação é observada quando a glicose, frutose, sacarose e frutano estão quase esgotados e as células de levedura precisam se adaptar ao consumo de maltose (Struyf e outros 2017a). O teor de maltose da massa influencia principalmente a produção de CO2 após a fase de latência. Consequentemente, ele determina o tempo de fermentação produtiva total, em vez da taxa de fermentação nos estágios iniciais de fermentação (Figura 3) (Struyf e outros 2017a).

Efeito das enzimas endógenas e adicionadas no teor de açúcar da massa e na taxa de fermentação

Os grãos de trigo maduros contêm β-amilases, mas sua atividade de α-amilase é relativamente pequena. Portanto, a farinha de trigo é frequentemente suplementada com as últimas enzimas para aumentar o nível de açúcares fermentáveis ​​(Hebeda e Zobel 1996 Cauvain e Young 2007). Na verdade, a quantidade de maltose liberada durante o repouso da massa depende da atividade da α-amilase presente na massa (Struyf e outros 2016). Adição de α-amilase (Aspergillus oryzae) à farinha, portanto, resulta em níveis significativamente mais altos de maltose na massa, conforme observado em vários estudos (Lee e Geddes 1959 Potus e outros 1994 Struyf e outros 2016). Os efeitos da suplementação com α-amilase e os níveis mais elevados de maltose resultantes sobre a taxa de fermentação da levedura ainda são debatidos. Enquanto alguns autores relataram que a adição de amilases aumenta a atividade fermentativa específica das células de levedura (Dodić e outros 2005), outros descreveram que a produção de gás não foi aumentada ou significativamente menor quando α-amilase foi adicionada, devido aos efeitos osmóticos (Wood e Brown 1985 Potus e outros 1994). Essas diferentes observações podem ser explicadas por diferenças nas dosagens. Quando altas dosagens de α-amilase são usadas, é possível que uma grande parte do amido danificado presente na farinha (& gt80%) seja degradado em maltose (Struyf e outros 2016). Quando altos níveis de amido danificado (como 8%) estão presentes na farinha, os níveis de maltose podem chegar a 6%. Esses altos níveis de maltose podem causar estresse osmótico à levedura, levando a uma menor viabilidade da levedura e menores taxas de fermentação. Quando, no entanto, as dosagens adequadas são usadas, a adição de α-amilase fúngica não afeta negativamente a taxa de fermentação e aumenta o tempo de fermentação produtiva (Struyf e outros 2017). Nesse caso, a taxa de fermentação inicial (primeira hora de fermentação) é determinada pelo consumo dos açúcares preferidos (glicose e frutose, derivados da sacarose e frutano) e não pelo consumo de maltose (Figura 3). Portanto, a suplementação de α-amilase afeta apenas os estágios posteriores da fermentação.

A adição de uma quantidade apropriada de α-amilase à massa aumenta o volume do pão (Kuracina e outros 1987 Kulp 1993 Sahlström e Bråthen 1997). O efeito positivo da adição de α-amilase no volume do pão pode, entretanto, não ser atribuído apenas à geração de açúcares adicionais. É descrito que a adição de preparações de α-amilase (fúngica ou malte) aumentou o volume do pão de massa e esponja, mesmo quando foi adicionado 6% de açúcar, indicando que os açúcares não foram limitantes neste caso. O aumento do volume do pão foi explicado pelos efeitos da α-amilase no amido gelatinizado, levando a um aumento do forno (Cauvain e Chamberlain 1988). Na verdade, a α-amilase reduz a viscosidade da massa durante a gelatinização do amido, prolongando assim o aumento do forno, o que resulta em um aumento no volume do pão (Goesaert et al., 2009). Para atacar o amido gelatinizado, a α-amilase adicionada deve ser termoestável o suficiente (até 65 ° C), o que é o caso para a maioria das amilases bacterianas e de cereais, mas menos para as amilases fúngicas (Cauvain e Young 2007).

Embora a α-amilase seja frequentemente usada para aumentar a quantidade de açúcares fermentáveis ​​na massa, pouca informação pode ser encontrada sobre o efeito de outras enzimas que degradam o amido, como amiloglucosidase e α-glucosidase, na liberação de açúcares na massa e na capacidade de fermentação de fermento de padeiro. Isto é surpreendente, uma vez que o produto da hidrólise da amiloglucosidase e α-glucosidase (glicose), é o açúcar mais preferido do fermento de padeiro. Amiloglucosidase (glucoamilase) e α-glucosidase são ambas enzimas de ação exo que clivam resíduos de glicose da amilose e amilopectina (Van der Maarel e outros 2002). Eles mostram, no entanto, uma especificidade de substrato diferente: amiloglucosidases agem preferencialmente em polissacarídeos de cadeia longa, enquanto α-glucosidase funciona melhor em maltooligossacarídeos curtos (Van der Maarel e outros 2002). Pouco se sabe sobre a presença dessas enzimas que degradam o amido na farinha de trigo comum. A atividade da glucoamilase foi observada em fermentações de massa fermentada simuladas sem atividade microbiana (Röcken e Voysey 1995 Gänzle 2014) e em amostras de massa não levedada (Struyf e outros 2016). As glucoamilases podem ser utilizadas no pão para gerar glicose, pois proporciona mais doçura do que a maltose, produto da ação da β-amilase (Hebeda e Zobel 1996). Existe uma relação linear entre a dosagem de glucoamilase e o nível final de glicose no produto (Hebeda e Zobel 1996). Além disso, a adição de dosagens adequadas de glucoamilase ou uma combinação de glucoamilase e α-amilase, leva a CO semelhante2 níveis de produção como adição de 6% de sacarose, o que pode ser explicado pelos altos níveis de glicose gerados pela glucoamilase (Pomeranz e outros 1964 Bussiere e La Gueriviere 1974 Valjakka e outros 1994 Struyf e outros 2017c). Como a adição de glucoamilase resulta na liberação de glicose, o CO2 a taxa de produção do fermento de padeiro é positivamente afetada diretamente desde o início da fermentação, e não apenas nas fases posteriores, conforme observado com a adição de α-amilase. Isso significa que a adição de glucoamilase aumenta a taxa máxima de fermentação no início da fermentação, mas também aumenta o tempo de fermentação produtiva devido à liberação de altos níveis de glicose (Struyf e outros 2017c).

A adição de α-glucosidase à massa leva à degradação da maltose em glicose, mas não a um aumento no nível de açúcar fermentável total. Na verdade, a α-glucosidase tem uma alta especificidade para a maltose, mas uma baixa especificidade para dextrinas maiores geradas pela α-amilase. Como resultado, a liberação de maltose mediada por β-amilase de dextrinas ainda é a etapa limitante. Portanto, a suplementação de α-glucosidase apenas aumenta a taxa de fermentação inicial do fermento de padeiro devido à conversão de maltose em glicose (Struyf e outros 2017c).

Correlação entre os níveis de sacarose adicionada e a taxa de fermentação

A sacarose é comumente usada em níveis variados em diferentes sistemas de massa para melhorar o sabor e como fonte de nutrientes para células de fermento (Nagodawithana e Trivedi 1990). Quando as concentrações de sacarose na massa são muito altas, como por exemplo em massas doces que contêm níveis de sacarose de até 30% (Sasano e outros, 2012b), as células de fermento sofrem forte estresse osmótico. Isso danifica os componentes celulares e reduz sua capacidade de fermentação (Verstrepen e outros 2004). Na verdade, a exposição de células de levedura a condições hiperosmóticas leva à rápida desidratação celular e limita o crescimento celular e o CO2 capacidade de produção (Randez-Gil e outros 2003). Como consequência da pressão hiperosmótica, a taxa de fermentação e o volume final do produto assado são reduzidos (Myers e outros 1997 Hernandez-Lopez e outros 2003). Quando inoculadas em uma massa com alto teor de açúcar (18% de sacarose), as células de levedura precisam se adaptar às condições hiperosmóticas da massa, resultando em uma longa fase de latência antes de começarem a produzir CO2 a taxas aceitáveis. Um mutante que teve uma produção mais alta do osmólito glicerol por meio da superexpressão de GPD1, teve uma fase de latência mais curta em comparação com o tipo selvagem (Aslankoohi e outros 2015). Isso indica que altos níveis de açúcar na massa prolongam o tempo que as células de fermento precisam para atingir sua taxa de fermentação máxima. Aslankoohi e outros (2015) ilustraram que a quantidade total de CO2 produzida pelo fermento de padeiro na massa com 18% de açúcar é muito menor do que na massa com 6% de açúcar devido à longa fase defasada observada na massa com 18% de açúcar.

Para evitar lesões letais, as células de fermento de padeiro precisam adquirir osmotolerância pela indução da expressão da proteína do estresse, o acúmulo de protetores do estresse e mudanças em sua composição de membrana (Shima e Takagi 2009). As células de levedura podem acumular glicerol e trealose quando a pressão osmótica é detectada (Hirasawa e outros 2006 Shima e Takagi 2009). De fato, as cepas de levedura com alta tolerância à sacarose (HS) mostram uma alta expressão de proteínas necessárias para a produção de glicerol e trealose quando as concentrações de sacarose atingem 5 a 40%. S. cerevisiae é conhecido por acumular glicerol por meio de uma via de glicerol de alta osmolaridade (HOG) (Schüller e outros, 1994). A síntese de trealose é catalisada por um complexo de proteína trealose sintase dependente de UDP-glicose codificado por 4 genes (Jules e outros 2004). Ao lado do glicerol e da trealose, também o acúmulo de prolina confere tolerância ao estresse de alta sacarose (Sasano e outros, 2012b). S. cerevisiae sintetiza L-prolina a partir de L-glutamato, que é catalisada por 3 enzimas, ɣ-glutamil quinase (o PRO1 produto do gene), ɣ-glutamil fosfato redutase (o PRO2 produto do gene), e Δ 1 -pirrolina-5-carboxilato redutase (o PRO3 produto do gene). A maioria das estratégias para aumentar a osmotolerância de cepas de fermento de padeiro são baseadas em um acúmulo melhorado de glicerol intracelular, trealose ou prolina. Essas estratégias serão discutidas na próxima seção desta revisão.

Efeitos do tempo de mistura e da velocidade de mistura nos níveis de açúcar e na taxa de fermentação

Tanto o tempo de mistura quanto a velocidade de mistura podem afetar o CO2 taxa de produção de leveduras durante a fermentação da massa de pão. Na verdade, aumentá-los pode aumentar os níveis de maltose na massa e a extensão desse aumento depende da variedade da farinha e, mais especificamente, do conteúdo de amido danificado e da atividade de amilase da farinha (Potus e outros, 1994). Eles só podem afetar o CO2 taxa de produção quando os açúcares são limitantes e a maltose serve como nutriente para as células de levedura durante a fermentação.

O efeito do tempo de mistura também depende do tipo de fermento usado. Quando a levedura comprimida é usada, tempos curtos de mistura já são suficientes para atingir as taxas máximas de fermentação (Sahlström e outros 2004). Quando o fermento seco instantâneo é usado, no entanto, tempos curtos de mistura não permitem a reidratação completa das células de fermento. Portanto, o prolongamento do tempo de mistura aumentou a taxa de fermentação quando a levedura seca instantânea foi usada (Sahlström e outros 2004). Próximo ao tempo de mistura, também o método de mistura parecia crucial para reidratar o fermento seco instantâneo. Foi demonstrado que a mistura do mixógrafo foi muito mais eficiente na reidratação da levedura seca instantânea do que a mistura com espátula (Sahlström e outros 2004).

Efeitos do sal no desempenho da levedura durante a fermentação

O sal é geralmente usado na panificação em níveis de cerca de 1 a 2%, com base no peso da farinha. A salinidade inclui 2 componentes principais: um componente osmótico e um componente iônico ligado ao acúmulo de íons Na + en Cl - que se tornam tóxicos em altas concentrações (Xiong et al. 2002). A adição de sal resulta em uma ligeira diminuição na viabilidade das células de levedura e no desempenho fermentativo (Randez-Gil e outros 2013). Portanto, a produção de gás pelas células de levedura é reduzida quando a adição de sal aumenta (Hutton 2002 Lynch e outros 2009 Luchian e Canja 2010). Isso significa que a adição de sal à massa de pão também é uma forma de evitar o excesso de CO2 taxas de produção, levando a um processo de fermentação mais controlado (Hutton 2002). Além disso, é necessário incluir o sal na receita de panificação para seu efeito de fortalecimento na rede do glúten (Preston 1989 Delcour e Hoseney 2010).

Em massas doces, onde o sal é combinado com até 30% de sacarose ou xarope de glicose-frutose como adoçante, o sal é mais prejudicial do que em massas magras sem açúcar. A presença de açúcar e sal na massa doce reduz fortemente a atividade de água da massa. Portanto, as concentrações eficazes de Na + nesses produtos aumentam, levando a efeitos prejudiciais no desempenho de panificação que não são observados em massa magra (Hernandez-Lopez e outros 2003).

A exposição de células de levedura ao estresse salino implica tanto a exposição à toxicidade catiônica específica quanto ao estresse osmótico. Tal como acontece com altas concentrações de açúcar, as células de levedura acumulam solutos compatíveis, incluindo trealose, prolina e glicerol, como uma estratégia para se adaptar ao estresse osmótico induzido pelo sal (Takagi e outros 1997 Takagi 2008). Aslankoohi e outros (2015) mostraram que os mutantes com uma deleção de GPD1, que codifica uma enzima essencial na produção de glicerol, produziu menos CO2 do que o tipo selvagem em massa contendo sal. Na massa sem sal, que tem uma atividade de água muito maior do que a massa normal com sal, CO2 a produção foi semelhante para o mutante e o tipo selvagem. Portanto, foi sugerido que a produção de glicerol pela via HOG está ligada à eficiência com que as células de levedura se adaptam ao estresse osmótico na massa (Aslankoohi e outros 2015). Outra via, chamada via calcineurante-Crz1, é de importância crítica para a adaptação a altas concentrações de sal. A calcineurina é necessária para a tolerância das células de levedura a íons como Na + / Li +, Mn 2+ e OH - (Yoshimoto e outros 2002 Cyert 2003).

Embora a adição de sal leve à redução da produção de gás pelas células de levedura, a quantidade de CO2 o restante na massa é menor quando os níveis de sal são reduzidos. Como afirmado antes, o sal tem um efeito fortalecedor na rede de glúten e a remoção do sal da massa resulta em uma rede de glúten mais fraca que não pode reter o gás que é produzido durante a fermentação (Preston 1989 Toyosaki 2007 Lynch e outros 2009 Delcour e Hoseney 2010 Toyosaki e Sakane 2013).Em geral, pode-se concluir que a adição de sal resulta em uma ligeira diminuição na viabilidade das células de levedura e no desempenho fermentativo. Ainda assim, o sal precisa ser incluído na receita do pão devido ao seu efeito fortalecedor na rede do glúten.

Efeitos da adição de sal ao meio de cultura de levedura

Enquanto a adição de sal à massa resulta em menor CO2 nas taxas de produção, a adição de sal ao meio de cultura afeta positivamente a capacidade de fermentação das células de levedura. Foi relatado que a adição de NaCl ao meio de cultura aumenta a capacidade de fermentação de cepas de levedura em massa magra (Oda e Tonomura 1993 Bagum e outros 1998). Os efeitos da adição de NaCl ao meio de cultura foram menos pronunciados no fermento de massa doce (Oda e Tonomura 1993). Uma possível explicação para a maior capacidade de fermentação das leveduras após o pré-crescimento em meio contendo NaCl pode ser que as células de levedura estão acumulando osmoprotetores durante o crescimento na presença de NaCl.

Vitaminas, minerais e aminoácidos

Sabe-se que a suplementação dos meios de fermentação com certos nutrientes pode aumentar a viabilidade e a taxa de fermentação da levedura. Por exemplo, S. cerevisiae não pode fixar o nitrogênio atmosférico e requer o fornecimento de nitrogênio orgânico (aminoácidos) ou nitrogênio inorgânico (sais de amônio). Ao lado das fontes de nitrogênio, os minerais e, especialmente, os principais íons metálicos, são importantes determinantes do desempenho da levedura (Walker e Stewart 2016). Foi demonstrado que íons metálicos como Mg 2+, K +, Ca 2+ e Zn 2+ têm um impacto sobre as leveduras durante a fermentação da cerveja e destilação. Por exemplo, aumentar o Mg 2+ livre em meios de fermentação aumentou a produção de álcool, enquanto a manutenção de altas taxas de Mg 2+: Ca 2+ nas matérias-primas de fermentação é importante para o desempenho máximo da fermentação (Walker et al. 2006). Próximo, S. cerevisiae também requer fatores de crescimento em baixas concentrações para processos catalíticos específicos ou razões estruturais. Vitaminas, nucleotídeos, aminoácidos, ácidos graxos e esteróis são um exemplo de tais fatores de crescimento. “Alimentos de levedura” comercialmente disponíveis, com base em misturas de extrato de levedura, fosfato de amônio e minerais, podem ser empregados para suplementar a mídia e fornecer esses fatores de crescimento (Walker e Stewart 2016).

Embora o papel das vitaminas e especialmente dos minerais na fermentação e destilação das fermentações seja amplamente descrito na literatura científica, o papel das vitaminas e minerais durante as fermentações da massa é pouco descrito. Leveduras de padeiro usadas comercialmente são geralmente cultivadas em melaço. A maioria dos minerais e vitaminas necessários para o crescimento ideal do fermento estão presentes em níveis adequados. Ao observar os minerais presentes, P, S, K e Ca estão presentes em quantidades adequadas ou em excesso, enquanto as concentrações de Mg e Mn podem ser limitantes. Para vitaminas, apenas a biotina pode ser limitante e precisa ser adicionada ao meio de crescimento (Walker e Stewart 2016). A biotina é uma vitamina essencial para as células de levedura porque está envolvida em várias reações enzimáticas (Knowles 1989) e as células de levedura são incapazes de sintetizá-la (Lindegren 1945). As fontes de nitrogênio no melaço são limitantes e o crescimento ideal da levedura requer suplementação (Albers e outros 1996 Reed 2012 Walker e Stewart 2016).

Os efeitos da adição de minerais ou vitaminas no desempenho das células de fermento durante a fermentação da massa de pão são mal descritos. Isso pode ser explicado pelo fato de que especialmente a refeição completa já contém altos níveis de micronutrientes, como minerais e vitaminas B e E (Bertrais e outros, 2000). Além disso, as fermentações da massa de pão são muito curtas (1 a 2 horas), em comparação com as fermentações de infusão e destilação que duram vários dias. Portanto, pode ser possível que as vitaminas e minerais fornecidos pelo meio de crescimento (geralmente melaço) ou pela farinha / refeição inteira sejam suficientes para fermentações de massa de pão (curtas), enquanto este não é o caso durante a fermentação ou destilação (longa) fermentações.

A maioria das pesquisas sobre vitaminas na massa concentrou-se nos efeitos da fermentação do fermento nos níveis de vitamina na massa e no pão, em vez de nos efeitos dos níveis de vitamina no desempenho do fermento durante a fermentação. É, por exemplo, descrito que algumas vitaminas B são sintetizadas por células de fermento durante a fermentação da massa de pão (Batifoulier et al. 2005). Ao lado das vitaminas, vários minerais também estão presentes na massa da farinha de trigo. De Brier e outros (2015) estudaram a distribuição de minerais nos grãos de trigo. Potássio, P, Mg e Ca são os minerais mais abundantes na farinha de trigo, enquanto outros minerais (Si, F, Zn, Mn, Cu, Mo, Sec, Cd) também estão presentes, mas em níveis mais baixos. Os níveis de minerais, exceto para Ca, são mais elevados na farinha de trigo integral do que na farinha branca devido às suas maiores concentrações na fração do farelo de trigo (De Brier e outros 2015). Embora a refeição completa contenha uma quantidade relativamente alta de minerais, sua biodisponibilidade pode ser limitada devido à presença de fitato, que tem uma forte capacidade quelante (Poutanen e outros, 2009). As fitases são capazes de desfosforilar o fitato, pelo qual o fosfato inorgânico livre e os ésteres de fosfato de inositol são formados. Estes têm uma capacidade menor de influenciar a biodisponibilidade mineral (Poutanen e outros, 2009). Tanto as matérias-primas de grãos quanto as leveduras apresentam atividade fitase. O pH ótimo da fitase de trigo é 5,0, enquanto o da fitase de levedura é 3,5 (Türk et al., 1996). Foi demonstrado que uma diminuição moderada do pH da massa para 5,5 é suficiente para reduzir o conteúdo de fitato da farinha de trigo integral em cerca de 70% pela atividade da fitase endógena presente na farinha (Leenhardt e outros 2005). Jayaram e outros (2013) descreveram como a fermentação do fermento reduz o pH na massa pela formação de ácidos, o que explica porque a fermentação fornece condições de pH ideais para a degradação enzimática do fitato (Gillooly e outros, 1984, Blandino e outros, 2003). Embora esta maior biodisponibilidade de minerais tenha efeitos nutricionais positivos em humanos ao consumir pão (Schlemmer et al., 2009), não é descrito na literatura se a redução do teor de fitato e, portanto, o aumento da biodisponibilidade de minerais, também tem efeitos benéficos na taxa de fermentação do fermento.

Ao lado de vitaminas e minerais, também os aminoácidos estão presentes na massa. Geralmente, a fermentação da massa com apenas fermento como agente de fermentação reduz a concentração de aminoácidos livres, enquanto a fermentação da massa fermentada com bactérias de ácido láctico resulta em um aumento na concentração de aminoácidos durante a fermentação devido ao aumento da proteólise (Thiele e outros 2002). Sabe-se que o aumento da quantidade de aminoácidos livres na massa de trigo pode melhorar o sabor do pão devido ao papel dos aminoácidos no aroma do pão. Portanto, a maior quantidade de aminoácidos na massa fermentada pode contribuir para o sabor mais pronunciado do pão de massa fermentada em comparação com o sabor do pão normal produzido a partir de massa fermentada (Hansen e outros 1989 Thiele e outros 2002).

As células de levedura são conhecidas por converter certos aminoácidos em aminas bioativas. Por exemplo, Yilmaz e outros (2014) mostraram que um isômero de melatonina é formado na massa de pão durante a fermentação do fermento. Como a taxa de formação do isômero de melatonina e a degradação do triptofano eram compatíveis entre si, foi hipotetizado que o triptofano tem um papel na formação do isômero de melatonina (Yılmaz e outros 2014). O isômero de melatonina mostra atividade antioxidante e citoprotetora, portanto, a formação desse composto durante a fermentação pode contribuir para o valor nutricional do produto final (Yılmaz e outros 2014). Os aminoácidos também são precursores de compostos aromáticos específicos. Foi demonstrado em um estudo de Schieberle (1990) que a prolina e a ornitina presentes na levedura são precursoras da 2-acetil-l-pirrolina, um odor de torrado, na casca do pão. Além disso, foi relatado que os aminoácidos originários da farinha (por exemplo L-fenilalanina e L-leucina) são convertidos em odorantes potentes como 2-feniletanol e 3-metilbutanol através da via de Ehrlich durante a fermentação. De fato, os aminoácidos da farinha podem ser convertidos em compostos de aroma pelo metabolismo da levedura por meio dessa via (Gassenmeier e Schieberle 1995). Isso pode indicar que a adição de aminoácidos à massa de trigo pode aumentar a formação de compostos aromáticos específicos e, portanto, alterar o perfil de sabor do pão (Schieberle 1990, Gassenmeier e Schieberle 1995).

Pode-se concluir que os efeitos da adição de minerais e / ou vitaminas na taxa de fermentação da levedura durante a fermentação da massa são pouco descritos. O efeito da fermentação da massa mediada pelo fermento nos níveis / disponibilidade de vitaminas e minerais na massa e no pão tem ganhado mais atenção na literatura científica. As leveduras influenciam os níveis de vitaminas na massa ao sintetizá-las e influenciam a disponibilidade de minerais ao diminuir o pH da massa, criando assim condições ideais para a fitase do trigo. A conversão de aminoácidos em compostos de aroma mediada por levedura pode contribuir para o sabor do pão e a formação de compostos nutricionais como o isômero de melatonina, mas o conhecimento sobre sua contribuição para a taxa de fermentação da levedura durante a fermentação da massa é limitado.

Farelo de trigo

A presença de farelo de trigo na massa influencia a taxa de fermentação do fermento. Como afirmado antes, a farinha de trigo geralmente contém baixos níveis de açúcares fermentáveis, enquanto a refeição completa contém níveis mais altos de sacarose e frutano. O conteúdo mais alto de sacarose e frutano da refeição inteira em comparação com a farinha pode ter efeitos significativos na taxa de fermentação da levedura quando os açúcares são limitantes (Verstrepen e outros 2004 Codina e outros 2013 Verspreet e outros 2013). Struyf e outros (2017a) mostraram que a taxa de fermentação do fermento de padeiro durante os estágios iniciais de fermentação foi significativamente maior na massa de farinha integral do que na massa de farinha de trigo, o que pode estar correlacionado com os maiores teores de sacarose e frutanos na refeição inteira. Além disso, o farelo de trigo também contém α-amilases relacionadas ao farelo (Hemdane e outros 2016). Essas α-amilases podem causar uma maior liberação de maltose durante a fermentação e, portanto, prolongar o tempo de fermentação produtiva.

Além disso, algumas vitaminas e minerais estão presentes em quantidades maiores no farelo de trigo do que na farinha. Por exemplo, a maioria das vitaminas B presentes nos grãos de trigo estão localizadas no farelo e no germe (Pederson e outros, 1989). Com exceção do Ca, a concentração da maioria dos minerais (Mg, Mn, P, K e Fe) na farinha é muito menor do que a concentração no farelo regular. Quando os minerais ou vitaminas são limitados na farinha de trigo, a adição de farelo de trigo pode influenciar positivamente a taxa de fermentação da levedura durante a fermentação. Deve-se, no entanto, notar que a biodisponibilidade de minerais no farelo de trigo pode ser limitada devido à presença de níveis significativos de fitato no farelo de trigo (Guo e outros 2015).

Experimentos não publicados no Laboratório de Química e Bioquímica de Alimentos (KU Leuven, Bélgica) mostraram que a taxa de fermentação das células de levedura na refeição inteira contendo 6% de açúcares era maior do que na farinha branca contendo 6% de açúcares. Como os açúcares não eram limitantes nesses sistemas de massa, outros componentes do farelo de trigo aumentaram a taxa de fermentação das células de levedura. Outros experimentos mostraram que o tratamento térmico do farelo de trigo (1 h, 130 ° C) resultou na perda de seus efeitos positivos na taxa de fermentação. Isso indica que os componentes do farelo de trigo que têm efeitos positivos na taxa de fermentação das células de levedura durante a fermentação são sensíveis ao calor e perdem seu impacto com o aquecimento. Esses componentes podem ser proteínas ou peptídeos, ou outros componentes sensíveis ao calor que perdem integridade quando aquecidos. Outros experimentos são necessários para elucidar completamente quais componentes estão afetando a taxa de fermentação.

Temperatura de fermentação e armazenamento

As massas de farinha de trigo são geralmente fermentadas a temperaturas entre 25 e 32 ° C (Cauvain e Young 2007). Um estudo de Torija e outros (2003) mostrou que a quantidade de células de levedura viáveis ​​diminuiu quando as temperaturas estavam muito altas (35 ° C) durante a fermentação do vinho. Para fermentações de massa de pão, os pesquisadores se concentraram principalmente no desempenho das células de fermento após o armazenamento refrigerado ou congelado da massa. As massas congeladas permitem a separação temporal da produção da massa e do cozimento e também permitem a produção e distribuição em grande escala da massa congelada, independentemente do processo de cozimento subsequente (Lin e outros 2015a). As massas refrigeradas podem ser armazenadas em temperaturas mais baixas (& gt0 ° C) por várias horas, oferecendo mais flexibilidade ao padeiro porque o cronograma de fermentação é menos apertado dessa forma (Domingues 1996).

No caso de massas congeladas não fermentadas, recomenda-se reduzir ao mínimo a fase de fermentação antes da congelação da massa. Foi descrito por vários autores que a tolerância das células de levedura ao congelamento é melhor em tais condições (Kline e Sugihara 1968 Zounis e outros 2002). No entanto, o congelamento pode destruir a estrutura celular das células de fermento, e a atividade de fermentação do fermento é drasticamente reduzida após o descongelamento da massa (Sasano e outros, 2012a). A quantidade total de CO produzido2, que é a área sob a curva de gaseificação, é reduzida em massas congeladas. Até que ponto o CO2 a produção é reduzida depende de vários fatores, incluindo o período de tempo antes do congelamento (prefermentação) e a duração do armazenamento congelado (Meric e outros, 1995). A morte celular é uma razão para esta perda de poder de gaseificação, mas também deve ser levado em consideração o dano criogênico não letal (Meric e outros, 1995).

Os efeitos deletérios na atividade do fermento pioram em massas doces congeladas, uma vez que o congelamento e o descongelamento reduzem ainda mais a atividade da água (Randez-Gil e outros 2003). Por esta razão, as cepas de fermento de padeiro que são tolerantes ao congelamento são altamente desejáveis. Foi demonstrado que as cepas tolerantes ao congelamento de S. cerevisiae tinham maiores habilidades de acumulação de trealose do que outros S. cerevisiae cepas (Hino e outros 1990). O acúmulo de osmólitos, como a prolina e a trealose, aumenta a osmo e a criotolerância. Por causa disso, a osmo- e a criotolerância estão frequentemente ligadas entre si (Sasano e outros 2012a Sasano e outros 2012b). Além do acúmulo de osmólitos, também se sabe que a resistência ao congelamento está correlacionada com a composição lipídica da membrana e o metabolismo respiratório (Gélinas e outros 1991). O etanol serve como fonte respirável de carbono e como crioprotetor sob condições de congelamento rápido (Lewis e outros, 1993).

Próximo aos problemas com a viabilidade do fermento após o congelamento, o dano por congelamento aumenta a quantidade total de compostos de sulfidrila de baixo peso molecular lixiviados das células de fermento para a massa. Agentes redutores como cisteína, glutationa reduzida (GSH) e peptídeos contendo cisteína podem se difundir de células de fermento mortas para a amostra de massa e, portanto, podem afetar a estrutura da massa (Verheyen e outros 2015). Existe uma correlação entre o conteúdo de GSH solúvel em água da levedura e o número de células lisadas (Verheyen e outros 2015). Partindo do pressuposto de que a massa congelada contém níveis mais elevados de células lisadas do que a massa normal devido a lesões por congelamento, mais glutationa estará presente nas massas congeladas. De fato, Ribotta e colaboradores (2003) descreveram que o congelamento e armazenamento congelado de levedura comprimida resultou em um aumento de células mortas. As quantidades de proteínas e substâncias redutoras lixiviadas das células de levedura aumentaram com o aumento do tempo de armazenamento congelado. Foi demonstrado que os componentes lixiviados da levedura congelada tiveram influência na formação da rede de glúten e afetaram negativamente os volumes do pão (Ribotta et al., 2003). Além disso, o lixiviado da levedura congelada por 6 semanas teve um efeito semelhante na reologia da massa medida por farinografia e análises extensigráficas como a adição de 50 ppm de glutationa (Wolt e D'appolonia 1984).

Massas resfriadas são aquelas que ficam armazenadas por longos períodos em baixas temperaturas, o que oferece mais flexibilidade aos padeiros. Para massas refrigeradas, o overproofing é um problema bem conhecido. As células de levedura tendem a continuar a metabolizar a maltose, gerada pela hidrólise danificada do amido, mesmo em baixas temperaturas. Isso resulta na produção de CO2 durante todo o período de armazenamento. O overproofing afeta negativamente as propriedades organolépticas e reológicas da massa, produzindo pães finais de baixa qualidade (Pyler 1973 Domingues 1996 Brinker e Schmidt 2008). Uma possível solução para evitar o overproofing é o uso de cepas de leveduras limitadas por substrato que não podem consumir maltose e apenas consomem substratos mais controláveis ​​e limitantes, como sacarose e frutano. Na verdade, os níveis de frutano e sacarose na farinha de trigo e na farinha integral são menos variáveis ​​do que os níveis de maltose. Além disso, o frutano e a sacarose não são gerados durante a fermentação, mas apenas degradados, o que torna seus níveis mais controláveis. De acordo com Van Eijk (1991), CO suficiente2 pode ser produzida por leveduras maltose-negativas, principalmente a partir da fração frutana da farinha durante um processo de fermentação de 1,5 h. Ao lado de Van Eijk (1991), Domingues (1996) também relatou sobre o uso de cepas de leveduras limitadas por substrato. As massas descritas com cepas maltose-negativas podem ser armazenadas em baixas temperaturas (& gt0 ° C) por um período prolongado sem o risco de CO excessivo2 produção (Domingues 1996). Um estudo publicado mais recentemente mostrou que cepas de leveduras limitadas por substrato podem ser usadas quando sacarose e frutano suficientes estão presentes na massa, o que é principalmente o caso na massa de farinha integral. No caso da massa de farinha de trigo com baixas quantidades de frutano, a adição de substratos como sacarose é necessária para um período de fermentação suficientemente longo (Struyf e outros 2017b).

Outra ferramenta para controlar a fermentação em massas refrigeradas com fermento é a imobilização de fermento. A imobilização da levedura com microesferas de alginato / gelatina permitiu a parada completa da fermentação durante o armazenamento refrigerado. O aumento da temperatura leva à solubilização do grânulo e à retomada da fermentação (Gugerli e outros 2004).


Reconhecimentos

A pesquisa dos autores é apoiada por uma bolsa do Fonds Wetenschappelijk Onderzoek (bolsa número G.0859.10 para PVD), o projeto colaborativo FP7 da Comissão Europeia TiMet (contrato número 245142 para MS), o Bundesministerium für Bildung und Forschung (planta KBBE-SAFQIM projeto 0315912, para JL) e a Sociedade Max Planck (para MS e JL). Dedicado ao Dr. Marshall (Hal) Davidson Hatch e ao Prof. Hans-Walter Heldt em seus 80 anos.

Nome do arquivo Descrição
tpj12509-sup-0001-FigS1.pdfapplication / PDF, 111,4 KB Figura S1. Efeito da expressão constitutiva de TPS e TPP na relação de Tre6P com a sacarose.
tpj12509-sup-0002-TableS1.pdfapplication / PDF, 27,3 KB Tabela S1. Meta-análise de Tre6P e níveis de sacarose e Tre6P: proporções de sacarose em plantas de tipo selvagem.
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