Em formação

Analisando os resultados do PCR em tempo real


Desejo avaliar o nível de expressão gênica por PCR em tempo real. Tenho cinco controles que são "clinicamente" iguais. Calculei a "alteração dobrada" do gene alvo em relação a cada controle.

E se o resultado da "mudança de dobra" para meu gene alvo for diferente para cada controle? Quero dizer, é regulado para cima de acordo com três deles e regulado para baixo de acordo com os dois restantes.

A intervenção é tendenciosa? Ou devo considerar a média?


Forneça mais informações: alteração de dobra em relação a quê?

Se você fizesse o que eu acho que você fez (gene de controle único que você calculou a mudança de dobra do seu gene de interesse), eu diria que essa é a abordagem errada. O que você precisa é de um conjunto de genes que tenham níveis de expressão semelhantes em todas as suas amostras (controles e casos) para poder comparar seu gene de interesse com alguma linha de base comum. A seleção de tais genes deve ser o primeiro passo no projeto, e pode ser uma boa ideia usar uma das abordagens estabelecidas - eu recomendo o método GeNorm de Jo Vandensompele (link para o artigo). É assim: a partir de um painel de genes de controle em potencial, você seleciona dois ou três que são expressos de forma mais estável em suas condições experimentais e, em seguida, usa esses dois ou três genes de controle junto com seu gene de interesse em um qRT-PCR. Você então normaliza o sinal do seu gene para uma média dos genes de controle.

Foi demonstrado repetidamente que usar um único gene de controle, mesmo o chamado 'gene de manutenção', é enganoso, porque esses genes mudam seus níveis de expressão em algumas condições. Além disso, o uso de vários genes de controle protege você contra problemas potenciais devido à eficiência de amplificação desigual em diferentes amostras / grupos. No entanto, se você tiver vários genes de interesse, todos eles devem ter eficiência de amplificação comparável.


Provavelmente, você também precisa verificar se suas amostras não foram contaminadas com inibidores da reação de PCR, o que é muito comum se você primeiro extrair o mRNA, digerir o DNA restante e, em seguida, executar um PCR com uma diluição inferior a 10 vezes. Você precisa de uma diluição de pelo menos 200 vezes para se livrar de todos os artefatos.

Depois de diluir suas amostras, coloque repetições de diluições sucessivas de seu alvo e mRNA de linha de base (200xdiluição, 1000x diluição, 5000x diluição). Normalmente, você verá um bom espaçamento regular entre as curvas em seu gráfico rtPCR. Do contrário, algo deu errado com a reação.

De modo mais geral, o rtPCR é uma experiência bastante complicada e, se você quiser que seja 100% confiável, terá um certo número de controles para executar. Você pode encontrar uma orientação boa e abrangente aqui.


Análise sem suposições de dados quantitativos da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR)

A quantificação de mRNAs usando reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) monitorando a formação do produto com o corante fluorescente SYBR Green I está sendo amplamente usada em neurociências, biologia do desenvolvimento e diagnósticos médicos. A maioria dos procedimentos de análise de dados de PCR pressupõe que a eficiência de PCR para o amplicon de interesse é constante ou mesmo, no caso da comparação Ct método, igual a 2. O último método já leva a um erro de 4 vezes quando as eficiências de PCR variam em apenas um intervalo de 0,04. As eficiências de PCR de amplicons são geralmente calculadas a partir de curvas padrão baseadas em entradas de RNA conhecidas ou em séries de diluição de uma amostra de cDNA de referência. Neste artigo, mostramos que a primeira abordagem pode levar a eficiências de PCR que variam em um intervalo de 0,2, enquanto a segunda abordagem pode estar errada em 0,26. Portanto, propomos a regressão linear nos dados de Log (fluorescência) por número de ciclo como um método livre de suposições para calcular as concentrações iniciais de mRNAs e as eficiências de PCR para cada amostra. Um programa de computador para realizar este cálculo está disponível mediante solicitação (e-mail: [email & # 160protected] assunto: LinRegPCR).


1. Introdução

O estudo da expressão gênica em uma célula ou tecido em um determinado momento dá uma idéia da capacidade da célula para a síntese de proteínas. Ensaios de expressão gênica, por exemplo, perfil genético, são uma ferramenta importante e são amplamente utilizados em estudos de nanotoxicidade. Existem vários métodos disponíveis para determinar a expressão gênica, tais como análise de Northern blot, ensaio de proteção de ribonuclease (RPA), análise serial de expressão gênica (SAGE), reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR), cadeia de polimerase quantitativa em tempo real reação (qRT-PCR), matrizes de PCR e microarrays. Entre essas técnicas, a análise de Northern blot permanece um método padrão para detecção e quantificação dos níveis de mRNA, apesar do advento de técnicas mais robustas. O Northern blotting envolve o uso de eletroforese para separar as amostras de RNA por tamanho e, em seguida, detectar o mRNA com uma sonda de hibridização complementar a parte da sequência alvo. RPA é uma técnica extremamente sensível para a quantificação de RNAs específicos em solução. Pode ser realizado em RNA celular total ou mRNA selecionado por poli (A) como alvo. O método SAGE, bem como matrizes de PCR e microarrays, é usado para estudar a expressão gênica parcial ou global em células ou tecidos em várias condições experimentais. Neste capítulo, descreveremos os métodos para determinar a expressão gênica usando RT-PCR e PCR em tempo real. RT-PCR como uma ferramenta relativamente simples, barata, extremamente sensível e específica para determinar o nível de expressão de genes alvo. PCR em tempo real é um método quantitativo para determinar o número de cópias de modelos de PCR, como DNA ou cDNA, e consiste em dois tipos: baseado em sonda e baseado em intercalador. A PCR em tempo real baseada em sonda, também conhecida como TaqMan PCR, requer um par de primers de PCR e uma sonda oligonucleotídica fluorogênica adicional com um corante fluorescente repórter e um corante supressor anexados. O método baseado em intercalador (SYBR Green) requer um corante de DNA de fita dupla na PCR que se liga ao DNA de fita dupla recém-sintetizado e gera fluorescência. Ambos os métodos requerem um termociclador especial equipado com uma câmera sensível que monitora a fluorescência em cada amostra em intervalos frequentes durante a PCR. As principais técnicas subjacentes à RT-PCR e à PCR em tempo real são o isolamento total do RNA, a transcrição reversa (RT) e a PCR. A transcrição reversa envolve a síntese de DNA a partir de RNA usando uma DNA polimerase dependente de RNA. O PCR pode amplificar uma única ou algumas cópias de um pedaço de DNA em várias ordens de magnitude, gerando milhares a milhões de cópias de uma sequência de DNA particular. Aqui, apresentaremos procedimentos detalhados para RT-PCR e PCR em tempo real.


O QUE É PCR?

Em sua essência, a tecnologia de PCR em tempo real utiliza PCR convencional. A PCR é um procedimento pelo qual o DNA pode ser copiado e amplificado (40). Como mostrado na Fig. 2, PCR explora DNA polimerases para amplificar pedaços específicos de DNA usando oligonucleotídeos de sequência específicos curtos adicionados à reação para atuar como iniciadores. A primeira e mais comumente usada dessas enzimas é Taq DNA polimerase (de Thermus aquaticus), enquanto que Pfu DNA polimerase (de Pyrococcus furiosus) é amplamente utilizado devido à sua maior fidelidade ao copiar DNA. Embora essas enzimas sejam sutilmente diferentes, ambas têm dois recursos básicos que as tornam úteis para PCR: 1) eles podem gerar novas fitas de DNA usando um modelo de DNA e primers, e 2) são resistentes ao calor. O último atributo é necessário porque após cada rodada de cópia do DNA, o DNA de fita dupla resultante (dsDNA) deve ser “fundido” em fitas simples por altas temperaturas dentro do tubo de reação (∼95 ° C). A reação é então resfriada para permitir que os primers de oligonucleotídeo se aninhem com o DNA modelo de fita única e direcionem a enzima DNA polimerase para iniciar o alongamento adicionando nucleotídeos complementares únicos para criar uma nova fita completa de DNA. Assim, dsDNA é criado. Este novo dsDNA deve então ser derretido antes que o próximo ciclo de cópia possa ocorrer. Portanto, se a reação funcionar com perfeita eficiência, haverá o dobro de dsDNA específico após cada ciclo de PCR. Na realidade, as reações não mantêm uma eficiência perfeita porque os reagentes dentro do PCR são consumidos após muitos ciclos, e a reação atingirá um platô (Fig. 3). Além disso, o auto-recozimento do produto acumulado também pode contribuir para o “efeito platô” (49). Na verdade, é exatamente esse atributo dos PCRs que torna a tecnologia de PCR em tempo real tão necessária. Como a reação é capaz de amplificar eficientemente o DNA apenas até uma certa quantidade antes do efeito de platô, não há como calcular com segurança a quantidade de DNA inicial quantificando a quantidade de produto na conclusão da PCR. Ou seja, não importa o quanto de uma sequência de DNA alvo específica esteja presente antes da PCR, pode haver quantidades semelhantes de DNA amplificado após a PCR, e qualquer correlação distinta entre as quantidades iniciais e finais é perdida. A PCR em tempo real aborda esse problema, aproveitando o fato de que as amplificações de DNA ocorrem de forma eficiente no início do processo de reação e, portanto, mede a formação do produto durante esta "fase exponencial" (Fig. 3). Esta medição se correlaciona com a quantidade de DNA inicial específico, permitindo assim a quantificação.

Figura 2.Reações enzimáticas que tornam possível a PCR em tempo real. UMA: PCR é representado. Altas temperaturas são usadas para “derreter” o DNA de fita dupla (ds) em suas fitas superior e inferior. Esta mistura é resfriada na presença de iniciadores específicos de sequência (denotados como direto e reverso) que anelam aos seus alvos, e uma temperatura ideal é então aplicada para permitir o alongamento do DNA complementar (setas) pela ação da DNA polimerase para completar um ciclo. Isso é repetido várias vezes e, se nenhum reagente for limitante, 2 n cópias do fragmento de DNA desejado podem ser obtidas. B: porque a DNA polimerase não utiliza RNA como molde, a conversão de RNA em DNA pode ser alcançada usando a enzima transcriptase reversa. ssDNA, DNA de fita simples.


Fig. 3.Resultados típicos de PCR em tempo real. UMA: gráfico de amplificação ilustrando o aumento no sinal repórter fluorescente (y-eixo, observe a escala logarítmica) com cada ciclo de PCR (x-eixo). o y-unidades de eixo (ΔRn) realmente refletem o sinal repórter normalizado para um corante de referência passivo no tampão de reação. As curvas vistas com um controle no-template (NTC), que carece de DNA adicionado, mostram que os primers por si só não geram sinal e que os reagentes usados ​​neste ensaio não apresentaram contaminação de DNA. B: curva de dissociação para esta análise mostrando um único pico agudo, sugerindo que apenas um produto de PCR específico foi gerado com este conjunto de iniciadores.


Analisando os resultados da PCR em tempo real - Biologia

A tecnologia de PCR em tempo real (RT-PCR) é altamente flexível e muitos instrumentos alternativos e sistemas de sonda fluorescente foram desenvolvidos recentemente. A redução do tempo prático, o aumento da confiabilidade e a precisão quantitativa aprimorada dos métodos RT-PCR contribuíram para a adoção do RT-PCR em uma ampla gama de novas aplicações.

Este manual essencial apresenta um guia abrangente para as tecnologias e aplicações mais atualizadas, além de fornecer uma visão geral da teoria dessa técnica cada vez mais importante. Especialistas renomados na área descrevem e discutem as mais recentes plataformas de PCR, produtos químicos fluorescentes, software de validação, análise de dados e controles internos e externos. Este volume oportuno e confiável também discute uma ampla gama de aplicações RT-PCR, incluindo: diagnóstico clínico, biodefesa, estudos de expressão de RNA, validação de dados de matriz, detecção de mutação, autenticidade e legislação alimentar, NASBA, halotipagem molecular e muito mais.

Um livro essencial para todos os laboratórios que usam PCR.

". uma visão geral abrangente da tecnologia RT-PCR, que é tão atualizada quanto um livro pode ser." de J. Microbiological Methods.

"fornece um foco duplo com o objetivo, nos primeiros capítulos, de fornecer a teoria e os aspectos práticos desta tecnologia diversa e superficialmente simples, contrabalançando isso nos capítulos posteriores com aplicações do mundo real, cobrindo doenças infecciosas, biodefesa, haplotipagem molecular e padrões alimentares. " da Microbiology Today.

"uma obra de referência que deve ser encontrada tanto nas bibliotecas universitárias quanto nas prateleiras de especialistas em aplicações experientes." da Microbiology Today.

"um guia abrangente para a tecnologia de PCR em tempo real e suas aplicações" do Food Science and Technology Abstracts (2009) Volume 41 Número 6.

"Este volume deve ser de maior interesse para todos os investigadores interessados ​​e envolvidos no uso de RT-PCR. Os protocolos de RT-PCR cobertos neste livro serão de interesse da maioria, senão de todos, investigadores envolvidos em pesquisas que usam esta importante técnica. um livro bem equilibrado cobrindo os muitos usos potenciais de PCR em tempo real. valioso para todos os interessados ​​em RT-PCR. " das análises da Doodys (2009).

"fornecer ao usuário novato e experiente orientação sobre a tecnologia, sua instrumentação e suas aplicações" do SciTech Book News junho de 2009, p. 64

". escrito por autores internacionais especialistas em aplicações e princípios técnicos específicos. um compêndio útil de aplicações básicas e avançadas para cientistas de laboratório. É um livro introdutório ideal e servirá como um manual prático em laboratórios onde a tecnologia é empregada." do Australian J. Med. Sci. 2009. 30 (2): 59-60.

(EAN: 9781904455394 9781913652067 Assuntos: [microbiologia molecular] [pcr] [biologia molecular])


Existem dois métodos principais de quantificação de DNA em PCR em tempo real. Eles estão descritos na figura abaixo. Um usa intercalação de DNA ou corantes de direcionamento de sulco menor que mostram fluorescência aumentada após a ligação. A cada ciclo de amplificação, conforme a quantidade do DNA molde aumenta, o número de fluoróforos ligados e, portanto, a intensidade do sinal fluorescente, aumenta. Os corantes intercalantes fluorescentes populares incluem SYBR ® Green I e SYBR ® Gold. Sua principal vantagem é o custo, mas eles não são específicos e se ligam a todos os dsDNA e não apenas ao alvo.

O segundo método usa sondas de DNA específicas para sequências marcadas com fluoróforo. Uma variedade de produtos químicos são usados ​​para detecção. O tipo mais popular usa a atividade de exonuclease 5'-3 'de Taq polimerase para mastigar um oligonucleotídeo, que tem um fluoróforo e um inibidor nas extremidades 5 'e 3', respectivamente. A atividade de exonuclease da polimerase ajuda a separar o fluoróforo do inibidor, o que resulta em aumento da fluorescência. Mas então, como você determina a quantidade de ácido nucléico a partir das intensidades de fluorescência?


Analisando os resultados da PCR em tempo real - Biologia

Precisão e calibração de oligonucleotídeos comerciais e microarranjos de cDNA personalizados
Yuen T, Wurmbach E, Pfeffer RL, Ebersole BJ, Sealfon SC.
Departamento de Neurologia, Escola de Medicina Mount Sinai, Nova York, NY 10029, EUA.
Nucleic Acids Res. 2002 30 (10): e48.

Wurmbach E, Yuen T, Sealfon SC.
Métodos. 2003 31 (4): 306-316.

Departamento de Neurologia, Escola de Medicina Mount Sinai, Box 1137, 1 Gustave L. Levy Place, Nova York, NY 10029, EUA.

Descrevemos protocolos e resultados detalhados com uma plataforma integrada para estudar a expressão relativa do transcrito, incluindo projeto e fabricação de microarray, algoritmos de análise e calibração e PCR quantitativo em tempo real de alto rendimento. Essa abordagem otimiza a sensibilidade e a precisão enquanto controla o custo dos experimentos. Um array de cDNA de alta qualidade foi fabricado usando um número restrito de transcritos cuidadosamente selecionados com cada clone impresso em triplicado. Essa matriz focada facilitou tanto a medição repetida quanto os experimentos replicados. Após a normalização e a análise de expressão diferencial, descobrimos que os experimentos com esta matriz identificaram transcritos expressos diferencialmente com um alto grau de precisão e com alta sensibilidade a baixos níveis de expressão diferencial. O uso de um algoritmo de calibração melhorou a precisão da matriz na quantificação do nível relativo da expressão do transcrito. Todos os transcritos diferencialmente expressos identificados pela matriz foram testados independentemente usando ensaios de PCR em tempo real quantitativos de alto rendimento. Esta abordagem identificou de forma confiável transcritos com diferenças tão baixas quanto 1,3 vezes na expressão de transcritos entre amostras de RNA de grupos de tratamento e controle e foi aplicável a fontes de tecido altamente heterogêneas, como hipotálamo e córtex cerebral.

Perfil de RT-PCR em tempo real de mais de 1400 fatores de transcrição de Arabidopsis:
sensibilidade sem precedentes revela novos genes específicos de raízes e rebentos.

Czechowski T, Bari RP, Stitt M, Scheible WR, Udvardi MK.
Plant J. Abril de 2004 38 (2): 366-79.
Instituto Max-Planck de Fisiologia Molecular de Plantas, Am Muhlenberg 1, 14476 Golm, Alemanha


Organização da rede de genes acoplados ao receptor do hormônio liberador de gonadotrofina.

Wurmbach E, Yuen T, Ebersole BJ, Sealfon SC.
Departamento de Neurologia, Escola de Medicina Mount Sinai, Nova York, NY 10029, EUA
J Biol Chem. 2001 276 (50): 47195-47201

Michael W. Pfaffl, B. Gerstmayer, A. Bosio, Wilhelm Windisch
Journal of Nutritional Biochemistry 14 (2003) 691 & # 8211702

Instituto de Fisiologia, Departamento de Ciências Animais, Centro de Ciências da Vida e dos Alimentos, TUM, 85354 Freising, Alemanha
Memorec Biotech GmbH, Medical Molecular Research Cologne, 50829, Koeln, Alemanha
Divisão de Nutrição Animal e Fisiologia de Produção, Departamento de Ciências Animais, Centro de Ciências da Vida e dos Alimentos, TUM, 85354, Freising, Alemanha

No estudo aqui apresentado, foi analisado o efeito da deficiência de zinco nos níveis de expressão de mRNA no fígado e jejuno de ratos adultos. O consumo de ração foi restrito a 8 g / dia. A dieta semi-sintética foi fortificada com fitato puro e continha 2 g de Zn / g (deficiência de Zn, n 6) ou 58 g de Zn / g (controle, n 7). Após 29 dias de alimentação com depleção de Zn, todo o jejuno e o fígado foram recuperados e o RNA total foi extraído. O padrão de expressão específico do tecido foi rastreado e quantificado por análise de microarranjos e verificado individualmente por meio de RT-PCR em tempo real. Uma quantificação relativa foi realizada com o software Relative Expression Tool & copy recentemente desenvolvido em vários genes candidatos que mostraram uma expressão diferencial. Este estudo fornece a primeira visão comparativa da regulação da expressão gênica e análise de expressão totalmente quantitativa de 35 genes candidatos em um modelo de rato adulto com deficiência de Zn sem crescimento. Os resultados da expressão indicam a existência de padrão de expressão individual no fígado e jejuno e sua regulação específica do tecido sob deficiência de Zn. Além disso, no jejuno, foi possível demonstrar que vários genes relacionados com as células B são suprimidos na deficiência de Zn. No fígado, os genes da metalotioneína subtipo 1 e 2 (MT-1 e MT-2) podem ser dramaticamente reprimidos e, portanto, representam marcadores putativos para a deficiência de Zn. Os resultados de expressão implicam que alguns genes são expressos constitutivamente, enquanto outros são altamente regulados em tecidos responsáveis ​​pela homeostase do Zn.

Identificação de genes responsivos à depleção intracelular de zinco no ser humano
Colon Adenocarcinoma Cell Line HT-29.

Kindermann B, Doring F, Pfaffl M, Daniel H.
J Nutr. 2004 Jan134 (1): 57-62.


Unidade de Nutrição Molecular e. Departamento Técnico de Zootecnia
Universidade de Munique, D-85350 Freising-Weihenstephan, Alemanha.

Validação de perfis de expressão gênica baseados em array por RT-PCR em tempo real (cinético).

Rajeevan MS, Vernon SD, Taysavang N, Unger ER. (2001)
J Mol Diagn. 3 de fevereiro de 2001 (1): 26-31.

Avaliamos a reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa em tempo real (cinética) (RT-PCR) para validar genes diferencialmente expressos identificados por arranjos de DNA. A expressão gênica de dois subclones de queratinócitos que diferem no estado físico do papilomavírus humano (epissomal ou integrado) foi usada como sistema modelo. Matrizes de filtro de alta densidade identificaram 444 de 588 genes como negativos ou expressos com menos de duas vezes de diferença, e os outros 144 genes como expressos exclusivamente ou com mais de duas vezes de diferença entre os dois subclones. A RT-PCR em tempo real usou detecção de corante SYBR Green I baseada em LightCycler e análise da curva de fusão para validar a mudança relativa na expressão gênica. O RT-PCR em tempo real confirmou a mudança na expressão de 17 de 24 (71%) genes identificados por matrizes de filtro de alta densidade. Genes com fortes sinais de hibridização e pelo menos duas vezes diferença eram prováveis ​​de serem validados por RT-PCR em tempo real. Esses dados sugerem que (i) a intensidade de hibridização e o nível de expressão diferencial determinam a probabilidade de validação de resultados de matriz de filtro de alta densidade e (ii) genes identificados por matrizes de DNA com uma diferença de duas a quatro vezes na expressão não podem ser eliminados como falsos nem ser aceito como verdadeiro sem validação. O RT-PCR em tempo real baseado na tecnologia LightCycler é adequado para validar os resultados da matriz de DNA porque é quantitativo, rápido e requer 1000 vezes menos RNA do que os ensaios convencionais.

Amplificação global de cDNA combinada com RT-PCR em tempo real:

quantificação precisa de vários genes do canal de potássio humano no nível de uma única célula.
Al-Taher A, Bashein A, Nolan T, Hollingsworth M, Brady G. (2000)
Fermento. Set 2000 3017 (3): 201-210.

Nós desenvolvemos um procedimento de RT-PCR quantitativo sensível adequado para a análise de pequenas amostras, incluindo células individuais, e o usamos para medir os níveis de mRNAs de canais de potássio em um painel de tecidos humanos e um pequeno número de células cultivadas em cultura. O método envolve uma amplificação global inicial de cDNA derivado de todo o mRNA poliadenilado adicionado seguido por RT-PCR quantitativo de genes individuais usando iniciadores específicos. A fim de facilitar o processamento rápido e preciso de amostras, adaptamos a abordagem para permitir o uso de PCR quantitativo em tempo real TaqMan. Demonstramos que a abordagem representa uma grande melhoria em relação às abordagens de PCR quantitativas convencionais e em tempo real existentes, uma vez que pode ser aplicada a amostras equivalentes a uma única célula, é capaz de medir com precisão os níveis de expressão equivalentes a menos de 1/100 cópia / célula (uma molécula de cDNA específica presente entre 10 (8) moléculas de cDNA totais). Além disso, uma vez que a etapa inicial envolve uma amplificação global de todos os genes expressos, um arquivo de cDNA permanente é gerado a partir de cada amostra, que pode ser regenerado indefinidamente para posterior análise de expressão.

Microarrays de DNA e além: completando a jornada do tecido à célula.
Mills JC, Roth KA, Cagan RL, Gordon JI. (2001)
Nat Cell Biol 2001 Aug3 (8): E175-178
Errata em: Nat Cell Biol, 3 de outubro de 2001 (10): 943

Para o biólogo celular, identificar mudanças na expressão gênica usando microarranjos de DNA é apenas o começo de uma longa jornada de tecido a célula. Discutimos como os usuários do chip podem primeiro filtrar o ruído (falsos positivos) de conjuntos de dados de microarray assustadores. A combinação da microdissecção de captura a laser com a reação em cadeia da polimerase em tempo real e a transcrição reversa é uma etapa de acompanhamento útil que permite a expressão de genes selecionados a serem quantificados usando novos métodos de hibridização in situ e imunohistoquímicos sensíveis com base na amplificação do sinal de tiramida.

Uso de PCR quantitativo em tempo real para validar os resultados da matriz de cDNA
e tecnologias de PCR de exibição diferencial.

Rajeevan MS, Ranamukhaarachchi DG, Vernon SD, Unger ER. (2001)
Métodos. 25 de dezembro de 2001 (4): 443-51.

Métodos de reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) que monitoram o acúmulo de produto foram adaptados para a validação de genes expressos diferencialmente. Descrevemos um ensaio de PCR quantitativo em tempo real que usa detecção baseada em corante SYBR Green I e análise de curva de fusão de produto para validar genes diferencialmente expressos identificados por tecnologias de perfil de expressão gênica. Uma vez que o corante SYBR Green I é um corante intercalante inespecífico, a reação é tornada específica usando PCR "hot-start" e empiricamente determinadas temperaturas de anelamento e aquisição de sinal para cada iniciador específico de gene. Os níveis de expressão relativa foram quantificados pela construção de uma curva padrão usando diluições de cDNA de um gene altamente expresso. Usando esta abordagem, a PCR em tempo real validou 17 de 21 (71%) genes identificados por matrizes de DNA e todos, exceto 1 de 13 (91%) genes identificados por PCR de exibição diferencial (DD-PCR). A validação de genes diferencialmente expressos detectados por análise de array foi relacionada à intensidade de hibridização. Os resultados da RT-PCR em tempo real sugerem que os genes identificados por matrizes de DNA com uma diferença de duas a quatro vezes na expressão não podem ser aceitos como verdadeiros ou falsos sem validação. A validação de genes diferencialmente expressos detectados por DD-PCR não foi afetada pelas intensidades das bandas. Independentemente da tecnologia de perfil de expressão gênica (microarrays, DD-PCR, análise serial da expressão gênica e hibridização por subtração), uma vez que a sequência do gene de interesse é conhecida, a abordagem de RT-PCR em tempo real é bem adequada para validação de expressão diferencial uma vez que é quantitativo e rápido e requer 1000 vezes menos RNA do que os ensaios convencionais.

O modelo de alteração do limite de dobra: uma abordagem prática para selecionar
genes diferencialmente expressos a partir de dados de microarray.

Mutch DM, Berger A, Mansourian R, Rytz A, Roberts MA.
BMC Bioinformatics 2002 Jun 213 (1): 17
Regulação Metabólica e Genômica, Nestlé Research Center, Vers-chez-les-Blanc,
CH-1000 Lausanne 26, Suíça

FUNDO: A comunidade biomédica está desenvolvendo novos métodos de análise de dados para processar com mais eficiência os conjuntos de dados massivos produzidos por experimentos de microarray. Abordagens matemáticas sistemáticas e globais que podem ser prontamente aplicadas a um grande número de projetos experimentais tornam-se fundamentais para lidar corretamente com os conjuntos de dados de outra forma esmagadores.

RESULTADOS: O modelo de seleção de genes aqui apresentado é baseado na observação de que:
(1) variância da expressão do gene é uma função da expressão absoluta
(2) pode-se modelar essa relação a fim de definir um limite de alteração de dobra inferior apropriado de significância e
(3) esta relação define uma função que pode ser usada para selecionar genes expressos diferencialmente.
O modelo primeiro avalia a alteração dobrada (FC) em toda a gama de níveis de expressão absoluta para qualquer número de condições experimentais. Os genes são sistematicamente categorizados, e aqueles genes dentro dos X% superiores dos maiores FCs para cada categoria são avaliados com e sem o uso de réplicas. Uma função é instalada no topo X% de cada caixa, definindo assim uma alteração de limite de dobra. Todos os genes selecionados pelo modelo 5% FC estão acima da variabilidade da medição usando um nível de confiança dentro do desvio padrão (DP dentro) de 99,9%. A análise de PCR em tempo real (RT-PCR) demonstrou 85,7% de concordância com os dados de microarray selecionados pela função de limite.

CONCLUSÃO: O modelo FC pode selecionar com segurança genes expressos diferencialmente, conforme corroborado por dados de variância e RT-PCR. A simplicidade do processo geral permite selecionar os limites do modelo que melhor descrevem os dados experimentais, extraindo informações sobre os padrões de expressão gênica em toda a gama de níveis de expressão. Os genes selecionados por este processo podem ser comparados de forma consistente entre os experimentos e permitem que o usuário extraia informações globalmente com um alto grau de confiança.

A aplicação da PCR em tempo real (cinética) para amplificar produtos de cDNA transcritos reversamente do mRNA (RT) e da tecnologia de microarray estão a caminho de se tornarem ferramentas de rotina em biologia molecular. Ambos são adequados para estudar a expressão gênica, mas cada metodologia tem suas vantagens e desvantagens específicas. A tecnologia de microarray é ideal para rastrear muitos genes em uma etapa (& gt10.000 transcritos de genes) e a RT-PCR cinética é muito sensível, altamente quantitativa e requer até 1000 vezes menos RNA. Ambos permitem uma quantificação relativa e precisa de moléculas de mRNA com uma repetibilidade suficientemente alta e baixa variabilidade.
Mas a quantificação precisa de ácidos nucléicos requer uma metodologia reproduzível e um modelo matemático adequado para a análise de dados. Os tópicos específicos da quantificação relativa em microarray e tecnologia cinética de PCR de um transcrito de gene alvo em comparação com um transcrito de gene de referência ou gene de manutenção são descritos. Portanto, um novo modelo matemático e software são apresentados. A taxa de expressão relativa (R) é calculada a partir das eficiências cinéticas de PCR (E) e do desvio do ponto de cruzamento (CP) (DCP) de uma amostra desconhecida versus um controle. Este modelo não precisa de curva de calibração. Os níveis de controle foram incluídos no modelo para padronizar cada corrida de reação no que diz respeito à integridade do RNA, carregamento da amostra e variações inter-PCR. Alta precisão e reprodutibilidade (variação & lt2,5%) foram alcançadas no LightCycler & reg RT-PCR usando o modelo matemático estabelecido (Pfaffl, NAR 2001). R de um gene alvo é expresso em uma amostra versus um controle em comparação com um gene de referência. Etarget = eficiência de PCR em tempo real do transcrito do gene alvo Eref = eficiência de PCR em tempo real do transcrito do gene de referência? CPtarget = desvio CP do controle - amostra do transcrito do gene alvo? CPref = desvio CP do controle - amostra do transcrito do gene de referência.
Uma ferramenta de software de expressão relativa baseada em Excel e reg (REST e cópia) está agora disponível, que calcula E e R de várias (& lt16) amostras e quatro genes alvo (Pfaffl et al., NAR 2002). A proporção de expressão relativa é testada quanto à significância em comparação com o controle com base em um Teste de Randomização de Realocação Fixa de Pares Inteligentes e cópia.
Usando essa abordagem, para rastrear os níveis de expressão específicos do tecido por microarray e confirmar os resultados por RT-PCR cinético e REST & copy é uma combinação ótima e poderosa. As vantagens de ambos os sistemas de quantificação foram adicionadas - alto rendimento do microarray e sensibilidade do RT-PCR em tempo real.

Einleitung: DNA Mikroarrays são gro & szligartige Werkzeuge um funktionelle Zusammenh & aumlnge auf der mRNA Ebene zwischen einer Vielzahl von Genen zu untersuchen. Aber aufgrund der sequenzabh & aumlngigen Hybridisierungseigenschaften und deren Variationen die den Hybridisierungsreaktionen zugrunde liegen, m & uumlssen die Array Ergebnisse als semi-quantitativ angesehen werden. Als optimale Erg & aumlnzung der signifikanten Array Ergebnisse bietet sich die sensível Verifikation der Expressionsdaten mittels voll quantitativer RT-PCR em tempo real an.
Ziel morre Projektes bestand darin mittels Northern-Blot, cDNA Array und em tempo real RT-PCR Techniken, einen Katalog e Genen zu ermitteln die im Menschen regional bzw. tempor & aumlr beschr & aumlnkte mRNA Expressionsmuster w & aumlhrend der ersten Stunden der Wundheilung aufweisen.

Hintergrund: Die mecanische Verletzung der Gef & auml & szligwand, wie z.B. durch die Angioplastie, f & uumlhrt zur Aktivierung von Endothelzellen und zum endothelialen Wundverschluss durch deren Migration und Proliferation. Eine sehr schnelle Zellantwort auf die mechanische Endothelzellverletzung stellt die Expression von Early Response Genen, die eng mit dem Zellwachstum korreliert sind, dar. So induziert die mechanische Verletzung die Expression von c-FOS mRNA (Briski & Gillen, 2001) und EGR-1 mRNA (Yan et al., 2000) und bereits nach einer Stunde ist das Maximum der mRNA Expression erreicht.
Ziel unserer Untersuchungen war es in vitro weitere Early Response Gene zu identifizieren, die durch die mechanische Verletzung in kürzester Zeit in Endothelzellen aktiviert werden und dadurch einen besseren Einblick in die molekularen Mechanismen des Wundheilungsprozesses zu gewinnen. Um dieses Ziel zu erreichen, kamen unterschiedliche molekularbiologische Methoden zum Einsatz, wie etwa Northern-Blot (Ergebnisse werden nicht beschrieben), cDNA Mikroarray Technologie und als voll quantitative Bestätigungsmethode die real-time RT-PCR.

Methodik: Um neue durch die mechanische Verletzung induzierte Gene zu entdecken und zu identifizieren wurde ein Zeitfenster von bis zu 6 Stunden gewählt. Aus unverletzten und verletzten konfluent gewachsenen humanen Endothelzellen aus Umbilikalvenen (HUVEC) wurde Gesamt-RNA extrahiert und mittels des Atlas Pure Total Labeling Sytem (Clontech, CA, USA) [P32]-markierte cDNA Sonden hergestellt. Diese Sonden wurden getrennt voneinander auf zwei Atlas Human 1.2 I Array Membranen (Clontech) hybridisiert: unverletzt versus verletzt cDNA Sonden aus HUVEC Zellen. Auf diesen Nylon-Membranen sind cDNA Fragmente von 1176 verschiedene Genen immobilisiert, darunter auch Housekeeping Gene zur Normierung der Expressionsergebnisse, wie GAPDH, b-Actin, Ubiquitin.
Die Bestätigung dieser semi-quantitativen Array Ergebnisse erfolgte mittels voll quantitativer real-time RT-PCR Analyse. Hierfür wurde mit einem LightCycler (Roche Diagnostics, Penzberg) gearbeitet, der schnelles Thermocycling (rapid cycling) mit der Online SYBR Green I Fluoreszenzdetektion der RT-PCR Produkte kombiniert. Als Quantifizierungsstrategie wurde eine neu entwickelte normalisierte relative Quantifizierung gewählt (Pfaffl, 2001), wobei die mRNA Expressionsdaten eines Zielgens mit denen eines Referenzgens (House Keeping Gen) verglichen wurden. Die relative Expressionsratio ( R ) wird anhand der PCR Effizienzen (E) und der Differenz der „Crossing Points“ (CP) der zu vergleichenden Ansätze berechnet. In unserem Falle waren das einerseits unverletzte versus verletzte Endothelzellen Gesamt-RNA bzw. cDNA.

Ergebnisse: Die Bestimmung der CP Zyklenzahlen (n=3) der real-time RT-PCR für GAPDH und ATF-3 zeigen die geringe intra-Assay Varianzen (<2,8% VQ) und somit hohe Reproduzierbarkeit der LightCycler RT-PCR. Für die Zielgene ergaben sich folgenden minimale und maximale real-time PCR Effizienzen: Ec-FOS = 1,89 und EICAM-1 = 2,06. Es konnte mit Hilfe der beschriebenen Methoden neben schon bekannten durch Verletzung induzierte Early Response Gene, wie c-FOS, und EGR-1, auch weitere Gene nachgewiesen werden, wie ICAM-1, ATF-3, TTP, ADAMTS-1, ETR-101 und PAI-1 (Arnaoutis et al., 2000). Die Genexpression wurden im verletzten Zustand, im Vergleich zur unverletzten Kontrolle, extrem aufreguliert: c-FOS 264–fach, TTP 102-fach, ATF-3 43,5-fach, ADAMTS-1 25,3-fach, ETR-101 11,2-fach, ICAM-1 5,7-fach und PAI-1 2,2-fach (Mittelwert aus drei Wiederholungen). GAPDH wurde im Gegensatz nur marginal reguliert (

40%). Die Expressionsdaten weisen jedoch darauf hin, dass nicht nur Transkriptionsfaktoren, sondern auch Adhäsionsmoleküle und Plasminogen Inhibitoren in der Frühphase der mechanischen Verletzung von Endothelzellen vermehrt expremiert werden.
Schlussfolgerungen: Mit dem Northern-Blot und dem Atlas DNA Array System konnte die differentielle Expression von einer Vielzahl von „neuer“ Early Response Genen aufgezeigt und mittels relativer Quantifizierung in der real-time RT-PCR exakt quantifiziert werden.
Mit der Mikroarray Technik und als optimal Ergänzung die real-time RT-PCR wurden somit schnelle als auch hoch quantitative analytische Möglichkeiten geschaffen, den Funktionszusammenhang auf mRNA Ebene zu entdecken, was besonders in nächster Zukunft vor dem Hintergrund des komplett publizierten humanen Genoms von besonderen Interesse sein wird.

Das lebensnotwendige Spurenelement Zink wirkt als Cofaktor von mehr als 300 Enzymen und ist ein Stabilisator biologischer Membranen. Zink ist außerdem Bestandteil von Transkriptionsfaktoren. Es greift somit in die Regulation der Genexpression ein1. Während in Modellorganismen wie z. B. Saccharomyces cerevisiae zahlreiche Zink-sensitive Gene identifiziert wurden2, sind beim Säuger bisher nur wenige Gene als Zink-abhängig beschrieben worden. Möglicherweise sind die genutzten Methoden wie z. B. differential display3 zu unempfindlich, um umfangreiche Daten zur Zink-abhängigen Expression einzelner Gene zu erhalten. Wir haben deshalb geprüft, ob die cDNA-Array-Technologie geeignet ist, Zink-abhängige Säugergene zu identifzieren. Als in-vitro Modellsystem dienten intestinale Epithelzellen (HT-29), die für 72 Std. in einem Medium mit normaler (0.25 ppm) bzw. erhöhter (10 ppm) Zinkkonzentration kultiviert wurden. Die gewählten Bedingungen führten zur drastischen Veränderung der Expression eines bereits bekannten Zink-sensitiven Gens (Metallothionein-1). Zum Screening dienten cDNA-Arrays (Clontech), die mit radioaktiv-markierten cDNAs aus den kultivierten Zellen (0.25 versus 10 ppm Zink) hybridisiert wurden. Die Arrays wurden mittels Phosphorimager ausgelesen und die Signale auf zwei Housekeeping-Gene (GAPDH, ß-Actin) bezogen. Die Auswertung zeigte, dass durch die erhöhte Zinkkonzentration

1% der repräsentativen Säugergene (1176) in ihrer Expression verändert (> 1.6-fach) sind. Mittels Northern Blot-Analyse und Real-time RT-PCR konnte für ausgewählte Gene die Modulation der Expression verifiziert werden. Die identifizierten Gene codieren u. uma. für ein Oberflächenantigen und Proteasomproteine. Das Genprodukt und die Funktion eines Gens (Hypothetical 40 kDa Protein) sind bisher nicht bekannt. Das etablierte Reporterzellsystem und die cDNA-Array-Technologie sind somit prinzipiell geeignet, Zink-abhängige Säugergene zu identifizieren.

The essential trace element zinc acts as a cofactor in more than 300 enzymes, it stabilizes biological membranes and it is part of the transcriptional control of gene expression (J. Nutr. 130: 1500-1508). Zinc deficiency in mammals causes severe metabolic disturbances and this may in part be caused by changed expression of genes involved in processes such as growth and development. Whereas numerous zinc-dependent genes have been found in model organisms such as Saccharomyces cerevisiae (PNAS 97: 7957-7962), just a few genes are known in mammals that show zinc-dependent expression (PNAS 93: 6863-6868). We have tested the cDNA-array-technology to identify zinc-dependent genes in a mammalian cell system in vitro. We used the intestinal epithelial carcinoma cell line HT29, cultured for 72 hours in media containing either a normal zinc (0.25 ppm) or a high zinc (10 ppm) concentration. The selected conditions caused drastic alterations in the expression of metallothionein-1, already known as a zinc-sensitive gene. For screening purposes we employed cDNA-arrays (Clontech), hybridized with radioactive labeled cDNAs, which we derived from the cultured cells (0.25 versus 10 ppm zinc). Gene expression on the arrays was analyzed using a phosphorimager and the corresponding signals were standardized to the housekeeping genes GAPDH and ß-Actin. When compared to cells grown under normal conditions, the higher zinc concentration changed expression (> 1.6 fold) of approx. 1% of the represented mammalian genes (1176) on the array. Changes in the expression level of selected mRNA´s were verified by light-cycler PCR. Among others, a surface antigen and proteins of the proteasom complex showed significantly altered expression levels. Some genes have not yet been identified by function such as a putative 40 kDa protein. In summary, our reporter cell system and the cDNA-array-technology appear to be suitable for the identification of genes that show altered expression dependent of the zinc concentration in the cell.

Zink ist ein essentielles Spurenelement und besitzt vielfältige biochemische Funktionen im Intermediär- und Hormonstoffwechsel sowie in der Immunabwehr. Wenngleich es als Bestandteil von genregulatorischen Transkriptionsfaktoren bekannt ist, sind bisher nur wenige zink-sensitive Gene des Säugers identifiziert worden1. Wir haben geprüft, inwieweit DNA-Array-Technolgie2 geeignet ist die differentielle Genexpression im experimentellen Zinkmangel zu erfassen. Nach Erzeugung eines isolierten klinisch-biochemisch beschreibbaren Zinkmangels bei Ratten wurde deshalb für Lebergewebe eine vergleichende Transkriptomanalyse durchgeführt. Dazu wurden zwei DNA-Arraysysteme (Clontech, MWG-Biotech) auf der Basis von cDNA- bzw. Oligonukleotid-Sonden eingesetzt. Die Oligonukleotid-Arrays lieferten im Vergleich generell die reproduzierbareren Ergebnisse. Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass die mRNA-Spiegel von

2500 untersuchten Gene im Zinkmangel verändert (³ 1.8-fach und £ 0.5-fach) waren. Mittels Northernblot-Analyse und Realtime-PCR wurden die Befunde der Arrays bei ausgewählten Transkripten verifiziert. Signifikante Änderungen in den Transkriptmengen ließen sich u.a. für Wachstumsfaktor-Rezeptoren, diverse Strukturproteine, Enzyme für Proteinmodifikationen, Enzyme des Xenobiotika-stoffwechsels und Proteine mit Beteiligung an Exocytose-Prozessen bestimmen. Die unterschiedlichen Funktionen der identifizierten Genprodukte bestätigen die Annahme, dass Zink auch beim Säuger eine Vielzahl von Genen in ihrer Expression beeinflußt. Die auffällige Symptomatik eines isolierten Zinkmangels mit ausgeprägter Wachtumsretardierung läßt sich also auch auf der Ebene des Transkriptoms an Schlüsselgenen abbilden. Die DNA-Array-Technologie könnte damit zum diagnostischen Werkzeug für die Beurteilung der Funktion und der Versorgungslage des Organismus mit essentiellen Mikronährstoffen werden.

The effects of Zinc (Zn) deficieny have been established in both, humans and experimental animals, and are known to result in anorexia, impaired immunity, skin lesions, abnormal development und growth retardation. Although the specific genes involved in these clinical symptoms remains unclear. The essential trace element Zn is a constituent of hundreds of enzymes. It also is an important component of many transcription factors. This latter property suggests an involvement of Zn as a regulatory ion in gene expression. Indeed, recent studies have observed changes in transcript level of some genes induced by Zn deficiency. With the advent of DNA microarray technology, there is a tool which allows to study the expression of a large number of genes simultaneously and to identify previously unsuspected genes. In this study, we used two different array systems to compare the expression of more than 2500 different genes in the liver of Zn adequate and Zn deficient rats. 32Phosphor- or fluorescence-labeled cDNA from liver of control and Zn deficient animals were hybridized to microarrays. By comparing gene expression profile of both groups, the mRNA levels of 81 genes were altered in Zn deficient status. These include genes essential for protein modification, exocytosis, signaltransduction, extracellular transport, structural proteins, metabolic pathways and xenobiotic metabolism. The expression of 48 genes was reduced (< 0,5 fold), whereas the mRNA of 33 was elevated (> 1,8 fold). For 23 genes, the results were verified by northern blot analysis. 14 of these genes were detectable on northern blots, of which 9 were confirmed as regulated. The result indicates that Zn deficieny causes an aberrant regulation of genes important for growth. Further characterization of the identified genes will show whether they evoke the phenotype of Zn deficiency in-vivo.

Advanced quantitative real-time PCR in clinical diagnostics and cDNA microarray validation
1st European Conference in Functional Genomics and Diseases,
Prague, Czech Republic, May 14-17, 2003

Real-time PCR is the method of choice for quantitative studies of gene expression. The method has been an important tool in basic research for some years, and has now also started to replace more conventional methods in clinical diagnostics. Real-time PCR is characterized by a wide dynamic range of quantification, high sensitivity and high precision. One of the major problems in DNA quantification is to account for PCR inhibitions appropriately. We have developed an in situ calibration method based on either addition of known amount of target DNA or dilution of the test sample to determine sample specific PCR efficiencies. Relative gene expression in clinical samples and cDNA microarray validations are applications particular suitable for in situ calibration, resulting in high accuracy. In situ calibration is particular suitable for a few samples per gene investigations, for example: cDNA microarray validation and relative gene expression in clinical samples. Further, the efficiency and reproducibility of various reverse transcription assays has been carefully evaluated. Our results suggest that sample to sample variation in reverse transcription is significantly higher than in real-time PCR, except when quantifying very low copy numbers. The efficiency of reverse transcription differs significantly between genes and priming strategy. The reproducibility of reverse transcription and real-time PCR suggest that the least difference in mRNA that can be significantly measured is


Difference Between PCR and Real-time PCR

PCR or Polymerase chain reaction is a revolutionized discovery in modern molecular biology, which was first developed by the chemist Kary Mullis in 1983. It allows a single sequence in a complex DNA to be amplified for analysis. The basic idea of the PCR is that two primers, which are complementary to the opposite strands of a DNA sequence, are oriented toward each other the primers produce complementary strands, each containing the other primer. Hence, the result is a large quantity of a sequence corresponding to the DNA that lies between the two primers. DNA polymerase enzyme is used to extend the primers in PCR. DNA polymerase is a thermostable enzyme, and it has the ability to survive in high temperatures (94 to 95 °C) used for denaturation of template DNA.

The PCR involves three steps, namely, repeated rounds of denaturation, annealing of primers, and synthesis of DNA. A thermocycler machine is used to perform this reaction so that it can be programmed to change the temperatures quickly and accurately. Applications of the PCR are criminal investigations, DNA fingerprint, detection of pathogens, and analysis of DNA of early human species.

What is Conventional PCR?

There are three major stages of conventional PCR, namely DNA amplification stage, separation of PCR, and detection of products. Separation of DNA segments are typically done by agarose gel electrophoresis. The products are then stained with etheiduim bromide. Finally, detection is achieved by visualization of bands onto gels under UV light. Therefore, the final results of conventional PCR are not expressed as numbers. Normally the conventional PCR is only able to detect a single parameter.

What is Real-time PCR?

Real-time PCR can detect the amplification of products, as the products are synthesized. With the development of technology, PCR has become a very popular technique, especially for the detection and identification of bacteria in foods. The real-time PCR uses a florescent dye system and thermocycler equipped with fluorescent- detection capability.

What is the difference between Conventional PCR and Real-time PCR?

• Conventional PCR is more time consuming as it uses gel electrophoresis to analyze the amplified PCR products. In contrast, real-time PCR is less time consuming as it can detect amplifications during the early phases of the reaction.

• Real-time PCR collects data at the exponential growth phase of PCR while traditional PCR collects data at End-point of the reaction.

• The end point results of the conventional PCR may not be very precise, but the results of the real-time PCR are very precise.

• Real-time PCR is more sensitive than conventional PCR.

• Conventional PCR has very poor resolution while real-time PCR can detect very little changes due to the high resolution.

• End point detection of conventional PCR has short dynamic range while real-time PCR detection has wide dynamic range.

• Unlike conventional PCR, automated detection techniques are found in real-time PCR.

• Conventional PCR is highly sophisticated and labor intensive more than real-time PCR.

• Unlike real-time PCR, conventional PCR cannot discriminate between dead and live bacteria.

• Real-time PCR uses fluorescent dye system to detect the products while conventional PCR uses ethidium bromide and UV light to visualize bands in the agarose gel medium.


Resumo

Syphilis, a re-emerging public health problem worldwide caused by Treponema pallidum subsp pallidum (T. pallidum), usually induces systemic and chronic inflammation in hosts who do not receive timely therapy after exposing to high-risk factors such as leprous sexual contact. Before the treatment, rapid and accurate detection of syphilis is essential. However, the existing detection methods, which focus on the treponemal or non-treponemal antibody test, both have inherent limitations. For instance, both of them cannot distinguish the stage and severity of syphilis. Non-treponemal test such as RPR, which is generally deemed to be used for assessing treatment response, is influenced by biological false positives. Therefore, it is imperative to seek out a new and effective diagnostic test. With recent advancements in molecular biology and whole-genome sequencing, the molecular diagnosis has increased in popularity, especially the use of polymerase chain reaction (PCR). Here, we firstly present a mini-review on the research of PCR detection methods used for syphilis diagnosis over the past decade, and we then compare these methodologies to assess their potential and the challenges faced. This information can provide a fresh perspective to help researchers address the current challenges.


PCR Reagents & qPCR Reagents

Reagents optimized for reverse transcription, PCR, and real-time PCR to generate reproducible data.

Real-Time PCR Supermixes and Kits

Designed for superior qPCR performance with any detection chemistry on any instrument.

PCR Plastic Consumables

PCR tubes, plates, seals, and accessories precisely manufactured for various PCR applications.

PrimePCR PCR Primers, Assays, and Arrays

Experimentally validated PCR primer and probe assays for real-time PCR and Droplet Digital PCR.


Assista o vídeo: Interpretando o resultado de uma PCR em tempo real - parte 1 (Janeiro 2022).