Em formação

Daphnis Nerii não se move


Já faz um bom tempo desde o meu Daphnis Nerii já passou da fase de alimentação, agora é só uma espécie de recluso e fica encolhido em um canto e dorme o dia todo. Está um pouco amarronzado agora. Embora quando eu o verifico, levantando o recipiente e movendo-o, ele começa a pular estranhamente. Como um salto inicial, toda vez que é provocado. Talvez seja a última fase de seu período de instar. Está se preparando para pupar? Ou não está bem?


A Wikipédia nos diz o seguinte sobre a larva da mariposa-falcão oleandro (Daphnis Nerii):

Pouco antes de entrar na fase de pupa, a larva da mariposa-gavião torna-se mais marrom. A pupa desta espécie mede cerca de 5,5 a 7,5 centímetros de comprimento, é marrom claro com manchas pretas e uma linha preta no meio

O estágio em que sua criatura está provavelmente se parece com a Fig. 1. Provavelmente está bom.


Fig. 1. Lagarta logo antes da aplicação da pupa. fonte: wikipedia


Conteúdo

As antenas geralmente não são muito franjadas, mesmo nos machos. [2] Eles não têm órgãos do tímpano, mas os membros do grupo Choerocampini têm órgãos auditivos em suas cabeças. [2] Eles têm um frênulo e um retináculo para unir as asas posteriores e anteriores. [2] O tórax, abdômen e asas são densamente cobertos por escamas. Alguns esfingídeos têm uma tromba rudimentar, mas a maioria tem uma muito longa, [2] que é usada para se alimentar do néctar das flores. A maioria é crepuscular ou noturna, mas algumas espécies voam durante o dia. [8] Homens e mulheres têm vida relativamente longa (10 a 30 dias). [8] Antes do vôo, a maioria das espécies estremece seus músculos de vôo para aquecê-los e, durante o vôo, a temperatura corporal pode ultrapassar 40 ° C (104 ° F). [8]

Em algumas espécies, as diferenças na forma entre os sexos são bastante marcantes. Por exemplo, nas espécies africanas Agrius convolvuli (o convólvulo ou mariposa da ipomeia), as antenas são mais grossas e as marcas das asas mais manchadas no homem do que na mulher. Apenas os machos têm um gancho frenular indiviso e um retináculo. Além disso, os hawkmoths machos têm um pente parcial de cabelos junto com suas antenas. [9] As mulheres chamam os homens com feromônios. O macho pode encharcar a fêmea com um feromônio [8] antes do acasalamento.

Edição de comportamento

Algumas espécies voam apenas por curtos períodos ao anoitecer ou ao amanhecer, enquanto outras espécies só aparecem mais tarde à noite e outras por volta da meia-noite, mas tais espécies podem ocasionalmente ser vistas alimentando-se de flores durante o dia. Algumas espécies comuns na África, como o gavião-abelha oriental (Cephonodes hylas virescens), Macroglossum hirundo, e Macroglossum trochilus, são diurnos. [9]

Sabe-se que várias espécies são migratórias, todas na família Sphingini e Macroglossinae, especialmente nos gêneros. Agrius, Cephonodes, Macroglossum, Hippotion e Theretra. [10]

Edição de voo

Em estudos com Manduca sexta, as mariposas têm habilidades sensoriais de voo dinâmico devido às suas antenas. As antenas são vibradas em um plano de modo que quando o corpo da mariposa gira durante as manobras aéreas controladas, as antenas estão sujeitas às forças inerciais de Coriolis que são linearmente proporcionais à velocidade angular do corpo. [11] As forças de Coriolis causam deflexões das antenas, que são detectadas pelo órgão de Johnston na base de cada antena, com fortes respostas de frequência na frequência de batimento das antenas (cerca de 25 Hz) e no dobro da frequência de batimento. A magnitude relativa das duas respostas de frequência permite à mariposa distinguir a rotação em torno dos diferentes eixos principais, permitindo um controle rápido do curso durante as manobras aéreas. [12]

A maioria das espécies são multivoltinas, capazes de produzir várias gerações por ano se as condições climáticas permitirem. [8] As fêmeas depositam ovos translúcidos, esverdeados, achatados e lisos, geralmente isolados nas plantas hospedeiras. O tempo de desenvolvimento do ovo varia muito, de três a 21 dias.

As lagartas esfíngidas são de tamanho médio a grande, com corpos robustos. Eles têm cinco pares de prolegs. [8] Normalmente, seus corpos não têm cabelos ou tubérculos, mas a maioria das espécies tem um "chifre" na extremidade posterior, [2] que pode ser reduzido a um botão, ou ausente, no último ínstar. [8] Muitos são verdes e marrons crípticos e têm padrões de contra-sombreamento para ocultá-los. Outros são mais evidentemente coloridos, normalmente com manchas brancas em um fundo preto ou amarelo ao longo do corpo. Um padrão de barras diagonais nas laterais é uma característica comum. Ao repousar, a larva costuma manter as pernas afastadas da superfície e enfiar a cabeça por baixo (posição de oração), o que, à semelhança da Grande Esfinge de Gizé, dá origem ao nome de "mariposa esfinge". [8] Acredita-se que algumas larvas tropicais imitem cobras. [2] [13] As larvas regurgitam rapidamente seu conteúdo pegajoso, muitas vezes tóxico, do intestino anterior em atacantes como formigas e parasitóides. [8] A taxa de desenvolvimento depende da temperatura e, para acelerar o desenvolvimento, algumas espécies do norte e de grandes altitudes tomam banho de sol. [8] As larvas se enterram no solo para formar uma pupa, onde permanecem por duas a três semanas antes de emergirem como adultos.

Em alguns Sphingidae, a pupa tem uma tromba livre, em vez de se fundir à caixa da pupa, como é mais comum nos macrolepidópteros. [2] Eles têm um cremaster na ponta do abdômen. [8] Normalmente, eles se transformam em pupa da planta hospedeira, em uma câmara subterrânea, entre rochas ou em um casulo solto. [8] Na maioria das espécies, a pupa é o estágio de hibernação.

Edição de larvas

As larvas dos esfingídeos tendem a ser alimentadores específicos, em vez de generalistas. [8] Comparados aos saturniídeos de tamanhos semelhantes, os esfingídeos comem folhas jovens e macias de plantas hospedeiras com pequenas moléculas tóxicas e mastigam e amassam o alimento em pedaços muito pequenos. [14] Algumas espécies podem tolerar concentrações bastante altas de toxinas específicas. Vermes do tabaco (Manduca sexta) desintoxica e excreta rapidamente a nicotina, assim como várias outras mariposas esfinge relacionadas nas subfamílias Sphinginae e Macroglossinae, mas os membros da família Smerinthinae que foram testados são suscetíveis. [15] As espécies que são capazes de tolerar a toxina não a sequestram em seus tecidos 98% foi excretada. No entanto, outras espécies, como Hyles euphorbiae e Daphnis nerii, sequestram toxinas de seus hospedeiros, mas não as passam para o estágio adulto. [8]

Edição de Adultos

A maioria dos adultos se alimenta de néctar, embora algumas espécies tropicais se alimentem de secreções oculares, e os falcões roubam mel das abelhas. [8] Os esfingídeos noturnos tendem a preferir flores claras com longos tubos de corola e um odor adocicado, uma síndrome de polinização conhecida como "esfingofilia". [3] Algumas espécies são bastante gerais nas visitas, enquanto outras são muito específicas, com a planta sendo polinizada apenas com sucesso por uma espécie particular de mariposa. [3] As orquídeas freqüentemente têm tais relações específicas com mariposas-falcão e tubos de corola muito longos. A orquídea cometa (Angraecum sesquipedale), uma rara flor malgaxe com seu néctar armazenado na parte inferior de um tubo de 30 cm de comprimento (12 pol.), foi descrita em 1822 por Louis-Marie Aubert du Petit-Thouars e, mais tarde, Charles Darwin previu que deve haver algum mariposa especializada para se alimentar dela:

[A. sesquipetale tem] nectários de 11 polegadas e meia [29 cm], com apenas a polegada e meia inferior [3,8 cm] preenchida com néctar muito doce [. ] é, no entanto, surpreendente que qualquer inseto seja capaz de alcançar o néctar: ​​nossas esfinges inglesas têm probósceas tão longas quanto seus corpos, mas em Madagascar, deve haver mariposas com probósceas capazes de se estenderem a um comprimento entre 10 e 12 polegadas! [30 cm] [16]

Alfred Russel Wallace publicou uma espécie de "cartaz de procurado" (propriamente, um desenho em um livro) [17] de como esse lepidóptero poderia se parecer e, concordando com seu colega, acrescentou:

[A probóscide de uma mariposa falcão] da África tropical ([Xanthopan] morganii) tem sete polegadas e meia [19 cm]. Uma espécie com tromba duas ou três polegadas mais comprida [7,6 cm] poderia atingir o néctar nas flores maiores de Angraecum sesquipedale, cujos nectários variam em comprimento de dez a quatorze polegadas [36 cm]. Pode-se prever com segurança que essa mariposa exista em Madagascar, e os naturalistas que visitarem aquela ilha deveriam procurá-la com tanta confiança quanto os astrônomos procuraram o planeta Netuno, - e eles serão igualmente bem-sucedidos. [18]

O esfingídeo previsto foi descoberto 21 anos depois e descrito como uma subespécie de uma espécie africana estudada por Wallace: Xanthopan morganii praedicta, [19] para o qual, o nome subespecífico praedicta ("o previsto") foi dado. Os indivíduos malgaxes tinham peito e abdômen rosados, em vez de brancos, e uma linha apical preta nas asas anteriores, mais ampla do que nos espécimes do continente. Modelos de relógio molecular usando calibrações baseadas em taxa ou fósseis implicam que a subespécie de Madagascar X. morgani praedicta e as subespécies africanas Morgani divergiu 7,4 ± 2,8 Mya (milhões de anos atrás), que se sobrepõe à divergência de A. sesquipedale de sua irmã, A. sororium, ou seja, 7,5 ± 5,2 Mya. [20] Uma vez que ambas as orquídeas têm esporas extremamente longas, as esporas longas provavelmente existiram antes disso e foram exploradas por mariposas de língua comprida semelhantes a Xanthopan morganii praedicta. A longa separação geológica de subespécies Morgani e praedicta corresponde às suas diferenças morfológicas na cor da mama e do abdômen.


Conheça os hawkmoths

Em minha última postagem, descrevi uma de minhas tarefas curatoriais aqui no Museu: o realojamento de nossas extensas coleções de gaviões, formadas por cerca de 289.000 espécimes.

O realojamento da extensa coleção de falcões do Museu & rsquos vai manter-me ocupado pelos próximos meses (ouvi alguém dizer anos?)

Neste post gostaria que conhecessem as verdadeiras estrelas deste projeto, os próprios hawkmoths. Hawkmoths pertencem à família Lepidoptera chamada Sphingidae, uma família relativamente pequena se comparada com outras famílias da ordem Lepidoptera até agora. 208 gêneros e 1.492 espécies descrito. Hawkmoths são insetos pertencentes à família Sphingidae na ordem Lepidoptera. 208 gêneros e 1492 espécies de falcões foram descritos até agora. Linha superior (L-R): Deilephila elpenor (Hawkmoth elefante), Agrius convolvuli(Convolvulus hawkmoth), Elibia dolichus. Linha do meio (L-R): Cechenena sp., Triopus Hayesiana, Agrius convolvuli(Convolvulus hawkmoth). Linha inferior (L-R): Mimas tiliae (Gavião-limão), Hyles sp., Hyles lineata (Hawkmoth listrado), Akbesia Davidi.

As espécies pertencentes a esta família geralmente têm asas falcadas (curvas e em forma de gancho) e seu corpo é caracteristicamente alongado. A maioria das espécies tem um vôo muito rápido e ágil, e paira rapidamente na frente das flores se alimentando de néctar com sua língua, que geralmente é muito longa.

A longa língua de muitas espécies de falcões é usada principalmente para se alimentar do néctar das flores ou ocasionalmente, como no caso deste argentino. Xylophanes schreiteri, em sobras de café da manhã doce! Esta foto foi gentilmente cedida por Tony Pittaway. Verifique os sites interessantes de Tony e rsquos, Sphingidae do Paleártico Ocidental e Sphingidae do Paleártico Oriental, para mais informações e fotos de hawkmoths.

As lagartas de Hawkmoth são grandes e têm um chifre curvo na extremidade posterior. Quando perturbados, geralmente se erguem com os segmentos anteriores arqueados, de maneira que lembra a esfinge egípcia. Essas duas características larvais explicam por que essas mariposas também são conhecidas com os nomes comuns de lagarta e mariposa-esfinge, enquanto o nome comum hawkmoth se refere ao vôo rápido e formato de asa falcada do adulto.

As lagartas esfíngidas têm um chifre de várias formas no último segmento abdominal. Do canto superior direito no sentido horário: Cephonodes hylas, Dolbina inexacta, Eumorpha analis e Daphnis nerii (Mirtilo oleandro). Todas as imagens são de Tony Pittaway.

A beleza e a elegância dos hawkmoths sempre foram atraentes para os cientistas e o público, conseqüentemente, essas mariposas se tornaram um dos grupos de insetos mais coletados.

A beleza e a elegância dos hawkmoths sempre atraiu os cientistas e o público.

Em geral, os hawkmoth estão bem representados em todas as coleções de insetos, grandes ou pequenos, e são freqüentemente criados a partir de lagartas, o que ajudou a fornecer uma grande quantidade de informações sobre sua biologia e história de vida. A maioria das espécies também são facilmente atraído por fontes de luz artificiais e isso ajuda a pesquisá-los durante a realização de inventários de biodiversidade de uma área, o que, por sua vez, nos forneceu insights consideráveis ​​sobre seus padrões e intervalos de distribuição.

Muitas espécies de falcões são atraídas por fontes de luz artificial.

As fotos a seguir, tiradas de espécimes das coleções do Museu, mostram a ampla variação que existe em tamanho, forma, características e padrões de asas entre as diferentes espécies desta família de mariposas.

O impressionante verde esmeralda Euchloron maegera. Esta espécie é comumente distribuída em toda a África Subsaariana.

Oryba kadeni é outro hawkmoth maravilhosamente verde. É caracterizado por olhos muito grandes e antenas relativamente curtas. Esta espécie é encontrada de Belize ao sul do Brasil.

Alguns esfingídeos gostam de se vestir de rosa, como este adorável hawkmoth de elefante (Deilephila elpenor) Esta espécie é relativamente comum e amplamente distribuída. Ocorre em toda a Europa (com exceção do norte da Escandinávia, norte da Escócia e partes da Península Ibérica), para o leste através da Rússia temperada até a costa do Pacífico, Coréia e Japão. Também é encontrado na China até as províncias de Sichuan e Guangdong. É uma espécie comum no Reino Unido.

Leucophlebia lineata é outro bonito hawkmoth ostentando uma série de listras rosa, amarelo e branco nas asas anteriores. Esta espécie é encontrada desde o Paquistão, passando pela Índia e Sri Lanka, até o leste e sul da China, até o sudeste da Ásia.

Neococytius cluentius é um dos maiores hawkmoths com envergadura que pode chegar a 17cm, e uma língua longa de até 22cm. Ela ocorre do México à Argentina e também foi registrada como uma doença perdida no norte de Illinois e no sul de Michigan.

O recorde da língua mais longa pertence a Xanthopan morganii subsp. praedicta, um falcão relativamente grande encontrado em Madagascar, famoso por sua longa tromba usada para sondar flores para se alimentar de néctar. Graças à sua longa tromba, que pode atingir 25cm, esta mariposa está bem adaptada para se alimentar das flores das orquídeas estrela, nas quais o néctar é guardado no fundo de um esporão muito comprido. Ao fazer isso, o hawkmoth assegura a polinização da orquídea.

Por outro lado, o adulto dos hawkmoths da subfamília Smerinthini, como este Laothoe populi (o hawkmoth do choupo), têm aparelho bucal extremamente reduzido e são incapazes de se alimentar. Esta mariposa está bem distribuída pela Europa, até o sul da Turquia e para o leste pela Rússia, e até o leste até Irkutsk. É provavelmente o hawkmoth mais comum no Reino Unido, onde os adultos voam entre maio e julho.

Sphingonaepiopsis gorgoniades com sua envergadura de 2-3 cm é o menor hawkmoth. Ocorre em alguns países do Sudeste Europeu, Turquia, Ucrânia, Sul da Rússia, Cazaquistão, Quirguistão e Afeganistão. Também foi gravado em partes do Oriente Médio.

O hawkmoth Euryglottis aper me lembra um pouco um daqueles bonecos de pelúcia. É uma espécie muito peluda, pois voa a altitudes de até 2.800m na ​​Venezuela, Colômbia, Equador, Peru e Bolívia.

A coleção do Museu contém espécimes representativos de 207 gêneros e cerca de 1.300 espécies de hawkmoths uma cobertura global de 85%. Dos 289.000 espécimes de Sphingidae mantidos nas coleções do Museu, 113.000 estão fixados a seco e outros 176.000 não foram montados e ainda estão em seus envelopes originais. A coleção do Museu & # 160 é certamente a maior e mais completa coleção de esfingídeos do mundo.

No próximo post estarei apresentando mais fotos e informações sobre outras espécies de gaviões e também darei um pouco da história sobre a coleção original de gaviões do Museu de História Natural. Eu espero que você esteja de volta então.

Obrigado pela leitura e aproveito para desejar a todos os leitores um Feliz Natal e um Próspero Ano Novo.

Um simpático convolvulus hawkmoth que conheci em uma recente viagem à Bulgária. Ele não é fofo?


Alimentando larva de Daphnis nerii.

Olá! Eu sou muito novo em criar borboletas. Tive grande sucesso anteriormente com espécies endêmicas da Noruega, mas quero tentar algo novo. Comprei recentemente pupas dapnis nerii e quero criá-las quando chegar a hora. Eu vi uma postagem neste fórum (e em outros fóruns) sobre a alimentação de plantas para a larva, mas apenas espécies específicas da família do oleandro. Todas as plantas que vi listadas são muito difíceis de manter na Noruega por causa do clima aqui, então eu quero usar plantas um pouco mais resistentes do que as que eu vi listadas. Gostaria de saber se posso usar qualquer planta da família de espirradeira ou se devo me limitar às plantas que tenho visto nos fóruns.

(Eu estudo biologia na universidade de Oslo, então não tenha medo de se especializar )

Ligustrum (ligustro), pervinca e madressilva são todos supostos alimentos. Nunca tive sucesso com madressilva, então provavelmente é melhor ficar longe disso. Ligustrum é muito fácil de obter e também perene, o mesmo que acontece com a caramujo. Eu testei os dois, mas com a caramujo você precisa ter certeza de que não contém pesticidas.

Obrigado! Eu não tinha ideia de que a larva do loendro se alimentaria de plantas da família Privet.
Obrigado!

A dieta artificial, no seu caso, é a única escolha.

Os Sphingidae são as melhores mariposas do mundo!

Você poderia me dizer onde comprar?

Sem problemas. @Serge como é isso? Eu imagino que ligustrum e caramujo sejam fáceis de conseguir. Eu posso conseguir e moro na Escócia.


Besouro da batata do Colorado

O besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa ​​decemlineata), também conhecido como besouro do Colorado, o lanceiro de dez listras, o besouro da batata de dez linhas ou o percevejo da batata, é uma das principais pragas da cultura da batata. Tem aproximadamente 10 milímetros (0,39 pol.) De comprimento, com um corpo amarelo / laranja brilhante e cinco listras marrons marcantes ao longo do comprimento de cada um de seus élitros.

As fêmeas do besouro da batata do Colorado são muito prolíficas, podendo colocar até 700 ovos. Os ovos são amarelos a laranja e têm cerca de 1 mm de comprimento.Eles geralmente são depositados em lotes de cerca de 30 na parte inferior das folhas do hospedeiro. O desenvolvimento de todas as fases da vida depende da temperatura. Após 5 & # x201315 dias, os ovos eclodem em larvas marrom-avermelhadas com costas corcundas e duas fileiras de manchas marrom-escuras de cada lado. Eles se alimentam das folhas. Um besouro consome aproximadamente 40 cm ^ 2 de folhas de batata em um estágio larval e até 9 cm ^ 2 adicionais de folhagem por dia quando adulto.


Evidência funcional de mecanismos fisiológicos para contornar a neurotoxicidade dos cardenolídeos em uma espécie adaptada e uma não adaptada da mariposa-falcão

Como os cardenolídeos inibem especificamente a Na + K + -ATPase, os insetos que se alimentam de plantas contendo cardenolídeo precisam evitar esse efeito tóxico. Alguns insetos, como a borboleta monarca, dependem da insensibilidade ao local-alvo, mas outros lepidópteros adaptados a cardenolídeos, como a mariposa-falcão-espirradeira, Daphnis nerii, possuem Na + K + -ATPases altamente sensíveis. No entanto, as larvas desta espécie e as relacionadas Manduca sexta são insensíveis aos cardenólidos injetados. Por meio de ensaios de ligação radioativa com cordões nervosos de ambas as espécies, demonstramos que o perineuro ao redor do tecido nervoso funciona como uma barreira de difusão para um cardenolídeo polar (ouabaína). Em contraste, para cardenolidos apolares como a digoxina, um transportador de efluxo ativo limita o acesso ao cordão nervoso. Essa barreira pode ser abolida por inibidores metabólicos e por verapamil, um inibidor específico das glicoproteínas P (PGPs). Isso sustenta que um transportador do tipo PGP está envolvido na barreira cardenolida ativa do perineuro. A RT-PCR tecidual específica demonstrou a expressão de três genes semelhantes a PGP em cordões nervosos da lagarta, e a imunohistoquímica corroborou ainda mais a expressão de PGP no perineuro. Nossos resultados, portanto, sugerem que o perineuro de lepidóptero serve como uma barreira de difusão para cardenolidos polares e fornece uma barreira ativa para cardenolidos apolares. Isso pode explicar o alto na Vivo resistência a cardenólidos observada em algumas larvas de lepidópteros, apesar de suas Na + K + -ATPases altamente sensíveis.

1. Introdução

Ao longo da evolução, as plantas desenvolveram uma vasta diversidade de compostos secundários de plantas, muitos dos quais atuam como armas químicas contra os herbívoros. Em troca, os herbívoros desenvolveram estratégias para superar as defesas das plantas. Os mecanismos de resistência em insetos são numerosos e incluem a desintoxicação de toxinas por enzimas, excreção, exclusão (barreiras intestinais) e insensibilidade do local-alvo [1,2].

Neste estudo, nos concentramos na resistência dos insetos aos cardenolídeos produzidos em plantas (também conhecidos como glicosídeos cardíacos), uma classe específica de toxinas vegetais [3,4]. Os cardenolídeos são inibidores específicos da Na + K + -ATPase, uma enzima animal onipresente e essencial para muitos processos fisiológicos [5,6].

Vários insetos herbívoros, incluindo a borboleta monarca (Danaus Plexippus) não apenas se alimentam de plantas contendo cardenolídeo, mas também sequestram as toxinas e, assim, obtêm proteção contra predadores [7]. A Na + K + -ATPase de D. plexippus é alterado por substituições de aminoácidos específicos, que reduzem significativamente sua suscetibilidade aos cardenolídeos (insensibilidade ao local-alvo [8,9]). Em estudos anteriores, no entanto, descobrimos que lepidópteros que são adaptados aos cardenolidos às vezes possuem Na + K + -ATPases sensíveis aos cardenolídeos [10,11]. Além disso, entre os lepidópteros adaptados ao cardenolídeo, a borboleta monarca na verdade parece ser um caso excepcional [9,12,13].

Em Lepidoptera, a Na + K + -ATPase é predominantemente expressa no tecido nervoso. A ocorrência concomitante de cardenólidos dietéticos na hemolinfa das lagartas, portanto, torna a interface entre o sangue do inseto e o tecido nervoso especialmente importante [11]. O cordão nervoso ventral dos insetos é, como em outros organismos, rodeado pelo perineuro, um tecido que mantém as condições iônicas necessárias para a excitabilidade dos neurônios, que podem ser diferentes da composição da hemolinfa (baixo K + e alto Na + necessários na o espaço extracelular do cordão nervoso versus uma proporção aproximada de 1: 1 na hemolinfa [14]). Além disso, acredita-se que esse tecido funcione como uma barreira hematoencefálica para compostos tóxicos de plantas presentes na hemolinfa dos herbívoros [15]. No entanto, até o momento, há apenas evidências funcionais limitadas para essa função protetora do perineuro.

Neste estudo, testamos se o perineuro pode funcionar como uma barreira aos cardenolídeos da dieta absorvidos pela hemolinfa e, assim, contribuir potencialmente para a resistência a essas toxinas. Usamos a mariposa-falcão oleandro (Daphnis neriifigura 1uma), um especialista em cardenolida que se alimenta principalmente de oleandro (Nerium oleander), uma planta rica nessas toxinas [16]. Para comparação, incluímos Manduca sexta, uma espécie aparentada que não está adaptada aos cardenolidos.

Figura 1. Ligação de 3 H-ouabaína ao cordão nervoso isolado de D. nerii lagartas: (uma) lagarta da mariposa-falcão oleandro (D. nerii) A principal planta hospedeira desta espécie é N. oleander, cuja marcada toxicidade é baseada em cardenolidos. (b) Rompimento da barreira perineurial com uréia em cordões nervosos isolados de D. nerii (cada ponto de dados representa a média (± s.d.) de três incubações independentes, ou seja, 18 lagartas foram usadas no total). (Versão online em cores.)

Daphnis nerii lagartas têm níveis relativamente baixos de cardenólidos de oleandro em seu corpo (aproximadamente 150–200 µg no máximo [16]). No entanto, devido à sua Na + K + -ATPase altamente sensível, mesmo quantidades mínimas de cardenolídeos na hemolinfa podem ser fatais [10]. Como o oleandro e outras plantas contendo cardenolídeo possuem cardenolídeos com uma ampla faixa de polaridade, especulamos que diferentes mecanismos podem ser importantes na resistência de insetos a diversos cardenolídeos. Por exemplo, o perineuro forma uma barreira de difusão para cardenólidos polares, como foi mostrado para M. sexta [17]. No entanto, cardenólidos não polares que são capazes de usar a via transcelular [18] podem exigir um mecanismo de barreira ativa (ou seja, transportadores de efluxo). Ambos os mecanismos são testados aqui por experimentos fisiológicos.

No cérebro de mamíferos, a glicoproteína-P (PGP) é um dos transportadores de efluxo mais importantes [19] com um espectro de substrato surpreendentemente amplo, incluindo a digoxina cardenolida [20]. Esta proteína ligada à membrana de 170 kDa, um membro da superfamília de transportadores ABC (cassete de ligação de ATP), expulsa compostos xenobióticos de células impulsionadas pela hidrólise de ATP. No M. sexta, Já foi sugerido que o PGP está envolvido na resistência à nicotina [15]. Em outros insetos, acredita-se que ele medeie a resistência a inseticidas ou xenobióticos [21,22]. Portanto, testamos se um transportador semelhante ao PGP pode estar envolvido na barreira hematoencefálica fisiológica do cordão nervoso da mariposa-gavião usando os conhecidos inibidores de PGP quinidina e verapamil. Ensaios imunohistoquímicos com anticorpos monoclonais foram posteriormente utilizados para visualizar a ocorrência de PGP e Na + K + -ATPase no cordão nervoso. Além disso, uma análise de M. sexta dados de etiquetas de sequência expressa (EST) seguidos por RT-PCR específico de tecido confirmaram a ocorrência de transportadores semelhantes a PGP no perineuro.

Em resumo, nossas investigações abordam a importância relativa dos mecanismos passivos e ativos na proteção do sistema nervoso da mariposa-falcão das toxinas vegetais potentes.

2. Material e métodos

(a) Produtos radioquímicos e inibidores

3 H-ouabaína (12 Ci mmol −1, dissolvido em 9: 1 etanol: tolueno, ou 30 Ci mmol −1, dissolvido em etanol) foi adquirido da GE Healthcare (Freiburg, Alemanha) e Perkin Elmer (Rodgau, Alemanha). A 3H-digoxina foi adquirida da Perkin Elmer (40 Ci mmol −1, dissolvido em etanol). Tanto a ouabaína quanto a digoxina provavelmente não ocorrem em plantas hospedeiras de larvas de D. nerii, mas foram usados ​​devido à sua disponibilidade comercial e polaridade fortemente diferente. 2,4-dinitrofenol (2,4-DNP Fluka, Taufkirchen, Alemanha), cianeto de carbonila 3-clorofenilhidrazona (CCCP Sigma, Taufkirchen, Alemanha), cloridrato de verapamil (Sigma) e quinidina (Sigma) foram usados ​​como soluções de estoque 0,05 M em etanol. Em nossos experimentos de ligação, usamos concentrações de 3H-cardenolide de 0,35 e 0,7 µM, respectivamente. Decidimos usar quantidades tão baixas porque Rubin et al. [17] observaram ligação não específica de 3 H-ouabaína a cordões nervosos nativos de Manduca em concentrações acima de 10 µM. Decidimos não referir nossos valores de desintegração por minuto (dpm) ao conteúdo de proteína ao longo dos experimentos porque a determinação da proteína provou ser dependente do tempo de armazenamento (a -20 ° C) pós-experimento. Referir-se aos cordões nervosos como unidades experimentais, por outro lado, provou ser altamente confiável porque o teor de proteína (determinado simultaneamente) de 18 D. nerii os cordões nervosos (oito gânglios cada, ver abaixo) tiveram uma média de 63,01 µg com um desvio padrão de 9,74. Os pequenos desvios-padrão de nossos grupos de tratamento ao longo dos experimentos fornecem evidências adicionais de que essa abordagem fornece dados confiáveis ​​que não são influenciados por diferenças de tamanho. Portanto, a radioatividade medida em nossos experimentos é expressa como dpm por cordão nervoso. Todos os dados usados ​​nos experimentos do inibidor são fornecidos no material eletrônico suplementar.

(b) Barreira de difusão

Para testar uma barreira de difusão para cardenólidos polares, seguimos o projeto experimental descrito por Rubin et al. [17], que interrompeu o perineuro de M. sexta por tratamento com ureia. Lagartas de D. nerii (Origem europeia) foram criados em grande pervinca (Vinca major), que é desprovido de cardenolidos, a 23 ° C (ciclo de 16 L: 8 D). Antes da dissecção, as lagartas de último ínstar foram resfriadas em gelo e decapitadas. Os cordões nervosos ventrais foram removidos, colocados em tampão de incubação frio (125 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 12,5 mM de imidazol, pH 7,3), limpos do tecido aderente e aparados em uma cadeia de oito gânglios mais conectivos intervenientes (gânglios abdominais mais gânglio metatorácico [23]). Para cada uma das três réplicas, foi usada uma série de seis lagartas. Um cordão nervoso de uma série foi usado como controle e mantido em tampão de incubação à temperatura ambiente durante o tratamento com uréia. Os cinco cordões nervosos adicionais foram imersos em ureia 3 M em tampão de incubação por 5, 10, 12, 15 ou 20 min, respectivamente. Os cordões foram então lavados duas vezes com tampão de incubação por pelo menos 5 min cada. A seguir ao tratamento com ureia, os cordões (incluindo o cordão de controlo) foram incubados individualmente em 100 µl de tampão de incubação com 0,7 µM de 3H-ouabaína durante 1 h a 37 ° C. Após a incubação, os cordões foram lavados em um volume em excesso de imidazol 10 mM (pH 7,3) por 30 min em gelo. Cada cabo foi então transferido para 200 µl de NaOH 0,2 M / SDS a 1 por cento e digerido durante a noite. A 150 µl deste extrato, 3 ml de coquetel de cintilação líquida (Ultima Gold, Perkin Elmer) foram adicionados e a radioatividade determinada em um contador de cintilação líquida (Wallac 1409, modo de contagem fácil). O restante de cada amostra foi armazenado a −20 ° C para posterior determinação de proteína com o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Scientific) usando BSA como padrão.

(c) Barreira ativa

(i) Manduca sexta

Ovos de M. sexta foram gentilmente fornecidos pelo Dr. Markus Huß (Universidade de Osnabrück). As lagartas foram criadas com dieta de mariposa cigana (MP Biomedicals) suplementada com estreptomicina, cloranfenicol, benzoato de metila e formalina (26 ° C 16 L: ciclo de 8 D). Apenas lagartas de último ínstar antes de atingir o estágio errante foram usadas.

(ii) Daphnis nerii

Lagartas de D. nerii (origem na Tailândia) foram criados a partir de ovos a 27 ° C em um ciclo de 13 L: 11 D. Lagartas nascidas foram inicialmente alimentadas com V. major posteriormente transferido (segundo instar) para N. oleander e elevado ao último instar.

Cordões nervosos de ambas as espécies foram dissecados conforme descrito acima e mantidos até a incubação em gelo em Manduca solução salina: 5,0 mM K2HPO4, MgCl 10,0 mM2, CaCl 1,0 mM2, NaCl 10,0 mM, KOH 10,0 mM, L-prolina 7,4 mM, citrato tripotássico 7,7 mM, succinato dissódico 2,8 mM, glicose 2,0 mM, sacarose 175,0 mM, ácido málico 5,6 mM, HEPES 10,0 mM, pH 6,7 [24]. Novamente, os oito gânglios posteriores foram usados. Para testar a hipótese de que os cordões nervosos de M. sexta e D. nerii possuem uma barreira de energia que evita que os cardenolidos atinjam a Na + K + -ATPase, os inibidores metabólicos 2,4-DNP e CCCP foram aplicados. Para testar se um transportador do tipo PGP está envolvido nesta barreira, usamos verapamil e quinidina, que são inibidores competitivos de PGP bem conhecidos [25]. Todos os inibidores foram dissolvidos em etanol e aplicados a uma concentração final de 1 mM. Os controles foram incubados com uma quantidade equivalente de etanol. A concentração de 3H-digoxina no ensaio foi de 0,35 µM (concentração de etanol 3,36%). Cada cordão nervoso foi incubado em um volume de 100 µl Manduca solução salina a 37 ° C. Após 30 min, os tubos foram colocados em gelo, a solução radioativa foi removida, 1 ml de imidazol 10 mM frio (pH 7,3) adicionado e misturado por agitação em vórtice. Após substituir o tampão de lavagem uma vez, os tubos foram invertidos e mantidos em gelo por 30 min. A etapa de lavagem curta foi realizada para remover a solução radioativa aderente, enquanto a etapa de lavagem longa foi realizada para remover a 3H-digoxina não ligada [17]. Em um experimento adicional (dados não mostrados), descobrimos que quase toda a radioatividade aderente é removida do tecido após a etapa de lavagem de 30 min. Após a lavagem, as amostras foram lisadas e a radioatividade contada como descrito acima.

(d) Análise estatística

Se necessário, os dados foram quadrados ou transformados em log para atingir homogeneidade de variâncias (teste de Levene) e distribuições aproximadamente normais (Shapiro-Wilk). Os dados foram analisados ​​por ANOVA usando um desenho de blocos ao acaso com o experimento como fator de bloqueio. As comparações post hoc são baseadas no teste de diferença significativa honestamente de Tukey (HSD). Todos os testes estatísticos foram realizados com SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, IBM).

(e) Comparação da permeabilidade da digoxina versus ouabaína

Este experimento foi realizado para demonstrar a diferente permeabilidade do perineuro de D. nerii lagartas para ouabaína e digoxina. Como tampão de incubação, solução salina fisiológica sem fontes de energia (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na 4,3 mM2HPO4, 1,4 mM KH2PO4, pH 7,4 [26]), caso contrário, o ensaio seguiu os procedimentos descritos acima. Os cordões nervosos de controlo foram incubados em tampão com 0,7 µM de 3H-digoxina ou apenas 3H-ouabaína. Paralelamente, os cordões nervosos foram incubados com os compostos marcados mais CCCP (1 mM). O CCCP foi adicionado para desativar os processos de transporte ativo e obter uma estimativa da quantidade de cardenólidos que infiltram o cordão nervoso por difusão.

(f) Imunohistoquímica

(i) transportador semelhante a P-glicoproteína

Cordões nervosos de frio D. nerii lagartas (último ínstar) foram dissecadas e imersas em PBS. Os tecidos foram fixados por 1 h em temperatura ambiente em fixador Lana (ácido pícrico 15%, paraformaldeído 4% (PFA) em tampão fosfato de sódio 0,5 M, pH 7 [15]). Após a fixação, os tecidos foram lavados três vezes por 10 min cada em PBS e sucessivamente crioprotegidos em 5, 10 e 15 por cento de sacarose em PBS por 1 h cada. A seguir, os tecidos de crioproteção foram incluídos em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) (Sakura, Alphen aan den Rijn, Holanda) congelado em isopentano em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C até o corte. Seções de 16 µm foram cortadas em um criostato Leica CM 1950 e deixadas secar em temperatura ambiente. As lâminas foram armazenadas a −80 ° C até o uso. O anticorpo anti-PGP C-219 (Abcam, Cambridge, UK dissolvido em PBS) foi aplicado a uma concentração de 10 µg ml-1. Nas seções de controle, o anticorpo primário foi omitido. O anticorpo primário foi detectado com o NOVADetect DAB (3,3′-diaminobenzidina) -Substrate Kit (Dianova, Hamburgo, Alemanha). As seções coradas foram rapidamente lavadas com água desionizada, transferidas para 80 por cento de etanol (via etanol a 60%) e montadas em Euparal. Seções de gânglios foram inspecionadas em um Zeiss Axioskop 2 e fotografadas com uma câmera colorida Zeiss AxioCam.

(ii) Na + K + -ATPase

Para visualizar o local-alvo de cardenólidos nos gânglios da mariposa-falcão (M. sexta) seguimos os métodos descritos em [27] e [11]. Para a detecção específica de Na + / K + -ATPase em secções de parafina, usamos o anticorpo monoclonal α5 (desenvolvido por D. M. Fambrough, mantido e distribuído pelo Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, EUA).

(g) Análises filogenéticas moleculares

As sequências de codificação de três transportadores semelhantes a PGP de Trichoplusia ni [28] foram usados ​​para identificar homólogos M. sexta sequências em uma coleção de M. sexta ESTs (H. Vogel 2011, dados não publicados). As sequências de aminoácidos correspondentes são fornecidas no material eletrônico suplementar, figura S1. Os transportadores semelhantes a PGP disponíveis foram baixados do GenBank (data de adesão: maio de 2012), incluindo os três transportadores semelhantes a PGP de Drosophila melanogaster (MDR49, MDR50 e MDR65 [29,30]), bem como vários transportadores semelhantes a PGP de outros insetos e crustáceos. Uma lista de seqüência completa, incluindo os números de acesso, é fornecida no material eletrônico suplementar, tabela S1. As sequências de aminoácidos foram alinhadas com MAFFT usando a rotina G-INS-i [31] e o alinhamento foi processado com Gblocks v. 0.91b [32]. As configurações de Gblocks e o alinhamento final são fornecidos em material eletrônico suplementar, figura S2. As análises filogenéticas foram realizadas com M r B ayes v. 3.1 [33] usando o modelo WAG [34]. A amostragem de Monte Carlo da cadeia de Markov acoplada à metrópole foi realizada com uma cadeia fria e três aquecidas. Duas execuções independentes foram realizadas por 1 milhão de gerações. As árvores foram amostradas a cada 100ª geração e as probabilidades posteriores foram estimadas nas 7500 árvores finais (queimada = 2.500). PGPs de mamíferos, que são conhecidos por serem homólogos aos transportadores semelhantes a PGP de D. melanogaster [29,30] foram usados ​​para enraizar o filograma para fins de visualização.

(h) RT-PCR

O RNA total foi extraído de cordões nervosos (oito gânglios posteriores, tecidos de 2-3 indivíduos agrupados) e intestinos médios de M. sexta lagartas (último ínstar) com o kit RNeasy plus (Qiagen, Hilden, Alemanha). Em ambos os casos, foram realizadas três extrações independentes de RNA (réplicas biológicas). As quantidades de RNA foram avaliadas pela leitura da absorção a 260 nm e subsequentemente confirmadas por eletroforese em gel desnaturante.Quantidades equivalentes foram transcritas em cDNA com Superscript III (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha) usando uma combinação de dT-17 e primers hexâmeros aleatórios. A amplificação foi realizada usando um protocolo padrão (Invitrogen Taq Polymerase PCR: 95 ° C por 45 s, 52 ° C por 60 s e 72 ° C por 60 s 40 ciclos). Os iniciadores de oligonucleotídeos específicos do gene foram: 5′-TTGACGGCAGTGTGACGATAG-3 ′ e 5′-CCTTCAGGAGACGTTTGCATC-3 ′ para M. sexta Transportador semelhante a PGP I, 5′-TCAAGATGTAGAGCCCGTGGT-3 ′ e 5′-CCAGCGGTAGTGAAGGTTGAG-3 ′ para M. sexta Transportador semelhante a PGP II e 5′-TTCGGTGGCGCAGTTTATAGT-3 ′ e 5′-TCTTGTGCCCATCTTCTTTGC-3 ′ para M. sexta Transportador tipo PGP III. A especificidade do primer foi confirmada pelo sequenciamento dos produtos de PCR correspondentes (GATC, Konstanz, Alemanha).

3. Resultados

(a) Barreira de difusão

Em nosso experimento com D. nerii lagartas, encontramos um resultado correspondente ao descrito para M. sexta [17]: ligação de ouabaína ao isolado D. nerii cordão nervoso aumentou linearmente com o tempo ao longo dos primeiros 10 minutos de incubação em ureia 3 M (figura 1b) Após 10 min, a curva atingiu um platô indicando que um limite de permeabilização foi alcançado, ou permeabilização completa da barreira de difusão e saturação dos locais de ligação de ouabaína.

(b) Barreira ativa

Em contraste com a ouabaína polar, a digoxina mais lipofílica é conhecida por permear as membranas celulares [18]. Portanto, presumimos que os cardenolidos apolares necessitem de mecanismos de barreira ativa que os impeçam de entrar no cordão nervoso.

Aplicação dos inibidores metabólicos (ionóforos) 2,4-DNP e CCCP no cordão nervoso isolado de M. sexta aumentou significativamente a ligação ao tecido de 3 H-digoxina (figura 2uma) para 1,7 vezes e 2,3 vezes, respectivamente, do controle não tratado. Para D. nerii, testamos apenas o inibidor mais eficaz CCCP (figura 2c) Aqui, o aumento da ligação de 3 H-digoxina foi ainda mais forte do que em M. sexta (4,5 vezes em comparação com 2,3 vezes).

Figura 2. Influência dos inibidores na ligação de 3 H-digoxina em cordões nervosos isolados: (uma) efeito dos inibidores metabólicos 2,4-DNP e CCCP nas cordas nervosas de M. sexta (n = 5 média ± d.p.). (b) Efeito dos inibidores de PGP quinidina e verapamil nas cordas nervosas de M. sexta (n = 5 média ± dp). (c) Influência do inibidor metabólico CCCP e do inibidor PGP verapamil na ligação de 3 H-digoxina em cordões nervosos isolados de D. nerii (n = 6 média ± dp). Asteriscos acima das linhas horizontais indicam diferenças significativas (p & lt 0,05, ANOVA de bloco randomizado com experimento como fator de bloqueio, seguido por testes Tukey HSD). Cada ponto de dados representa a média de 5 cordões nervosos por tratamento (b e c) ou 6 cordões nervosos por tratamento (c) ± s.d.

Para avaliar o envolvimento de um transportador do tipo PGP na barreira ativa, os inibidores de PGP amplamente usados ​​verapamil e quinidina foram testados quanto ao seu efeito na ligação da digoxina ao cordão nervoso. Para M. sexta, o verapamil aumentou a ligação da 3H-digoxina ao cordão nervoso 2,7 vezes. A quinidina produziu uma tendência semelhante (figura 2b) que, no entanto, não foi significativo. Para D. nerii, apenas verapamil foi aplicado, o que novamente aumentou significativamente a ligação de 3H-digoxina. Curiosamente, como com CCCP, este efeito também foi mais forte do que em M. sexta (3,4 vezes em comparação com 2,7 vezes).

Para excluir a possibilidade de que o verapamil simplesmente permeabilize o perineuro, M. sexta os cordões nervosos foram incubados com digoxina e digoxina mais verapamil ou com ouabaína e ouabaína mais verapamil, respectivamente. Se o verapamil simplesmente rompesse a barreira de difusão passiva, também se esperava que a ouabaína polar ganhasse acesso e se ligasse ao tecido nervoso em maior extensão após o tratamento com verapamil. No entanto, este não foi o caso (veja o material eletrônico suplementar, figura S3).

(c) Comparação da permeabilidade da digoxina versus ouabaína

Quando os cordões nervosos de D. nerii foram incubados com cardenolide sozinho ou em combinação com CCCP, o último aumentou significativamente a ligação à digoxina, mas não a ligação à ouabaína (figura 3). Isso apóia nossa conclusão de que a digoxina pode infiltrar a medula nervosa por difusão quando os portadores de efluxo ativos estão desativados. A ouabaína polar, entretanto, é excluída por uma barreira de difusão e sua ligação não é aumentada quando o veneno metabólico CCCP é aplicado. Curiosamente, a barreira ativa ainda era funcional neste experimento (e excluindo a maior parte da digoxina quando não bloqueada por CCCP), embora aqui tenhamos usado PBS em vez de Manduca salina. Em contraste com o último, o primeiro carece de fontes de energia, indicando que os níveis de energia intrínseca são suficientes para manter a funcionalidade dos transportadores de efluxo durante o experimento.

Figura 3. Difusão de digoxina e ouabaína no cordão nervoso de D. nerii. Como os dois cardenólidos têm atividades específicas diferentes, os valores de dpm não são diretamente comparáveis. Os dados são, portanto, apresentados como pmol cardenolídeo / cordão nervoso (em vez de dpm por cordão nervoso) para permitir comparações quantitativas. Os cordões nervosos foram incubados em concentrações iguais de ouabaína e digoxina, respectivamente (0,7 µM). Cada ponto de dados é a média de três cordões nervosos por tratamento (ou seja, 12 lagartas foram usadas no total).

(d) Detecção imunohistoquímica de um transportador semelhante à glicoproteína P

O anticorpo C219 anti-PGP amplamente utilizado liga-se a um epítopo conservado da proteína [35]. Aplicamos este anticorpo a criosecções de gânglios de D. nerii lagartas e coloração específica encontrada (precipitado marrom) apenas na periferia do respectivo gânglio (figura 5uma).

(e) Identificação de transportadores semelhantes à glicoproteína-P expressos nos cordões nervosos

Três proteínas com pelo menos 75 por cento de identidade com qualquer um dos transportadores semelhantes a PGP de T. ni foram identificados nas ESTs de M. sexta. Aqui, arbitrariamente, nos referimos a essas proteínas correspondentes como transportadores I, II e III do tipo PGP. A análise filogenética (figura 4uma) mostra que os transportadores semelhantes a PGP de lepidópteros I formam um clado monofilético com D. melanogaster MDR50 e várias outras proteínas de inseto (probabilidade posterior 1.0). Transportadores semelhantes a PGP de lepidópteros III formam um clado monofilético com D. melanogaster MDR65 (probabilidade posterior de 0,97), que estão em uma posição de grupo irmão com um clado monofilético que, entre outras proteínas de inseto, inclui D. melanogaster MDR49 (probabilidade posterior 1,0). Os transportadores semelhantes a PGP de lepidópteros II estão em uma posição de grupo irmão de um clado monofilético, que compreende ambos D. melanogaster MDR49 e MDR65 (probabilidade posterior 0,98). As análises de RT-PCR mostram que todos os transportadores semelhantes a PGP de lepidópteros são expressos no cordão nervoso de M. sexta, enquanto no intestino uma expressão forte comparável parece estar restrita ao transportador semelhante a PGP I (figura 4b).

Figura 4. Caracterização molecular de M. sexta Transportadores tipo PGP: (uma) relações filogenéticas entre transportadores artrópodes semelhantes a PGP. Exceto por M. sexta, as sequências disponíveis foram recuperadas do GenBank e uma foi escolhida arbitrariamente se várias sequências por gênero existissem. De acordo com estudos anteriores, os transportadores semelhantes a PGP de D. melanogaster foram denominadas proteínas multirresistência a drogas (MDR) e as PGPs de mamíferos foram usadas para enraizar o filograma [29,30]. Os nós com probabilidades bayesianas posteriores superiores a 0,95 são indicados por círculos pretos preenchidos e a barra de escala é igual a 0,1 substituições esperadas por local. (b) Detecção de transportador semelhante a PGP que codifica mRNAs em tecido nervoso e intestino médio de M. sexta (triplicatas biológicas em condições de PCR idênticas).

(f) Detecção imunohistoquímica de Na + K + -ATPase

A aplicação do anticorpo monoclonal anti-Na + K + -ATPase α5 revelou um forte sinal nas cordas nervosas larvais de M. sexta gânglios (figura 5b) A ocorrência de Na + K + -ATPase é aparentemente restrita aos neurônios dentro do gânglio e nenhum sinal específico pode ser observado no perineuro.

Figura 5. Detecção imunohistoquímica de um transportador semelhante a PGP e Na + K + -ATPase em seções de gânglios larvais de lepidópteros: (uma) Seção congelada de um D. nerii gânglio tratado com o anticorpo anti-PGP C219. Marcação específica (precipitação marrom, seta preta) pode ser vista na periferia do gânglio. Acima, tratamento abaixo, controle (anticorpo primário omitido). (b) Seção de parafina de um gânglio de um M. sexta lagarta. Laranja (asterisco branco): marcador específico de Na + K + -ATPase pelo anticorpo α5. Azul (seta branca): núcleos corados com dicloridrato de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). (Versão online em cores.)

4. Discussão

Em nosso estudo, nos concentramos em D. nerii e M. sexta, duas espécies intimamente relacionadas que diferem em suas plantas hospedeiras e nos compostos secundários aos quais são normalmente expostos. Enquanto que M. sexta naturalmente não é exposto a cardenolidos dietéticos, D. nerii é um especialista em oleandro e encontra altas concentrações de cardenólidos de uma ampla faixa de polaridade em sua dieta natural, oleandro. Esta espécie não sequestra cardenólidos como fazem outros especialistas, como a borboleta monarca. A presença de apenas pequenas quantidades de cardenolidos no corpo [16] poderia ser alcançada por uma membrana intestinal impermeável relativa, como foi observado em insetos generalistas, como Schistocerca e Periplaneta [1]. Tal impermeabilidade não é surpreendente no caso dos cardenolídeos polares, que são incapazes de atravessar passivamente a membrana intestinal, embora nessas espécies os intestinos sejam mesmo impermeáveis ​​à digitoxina cardenolida marcadamente apolar. Como Na + K + -ATPase de D. nerii é altamente suscetível aos cardenolídeos [10], mecanismos adicionais são necessários para evitar que mesmo pequenas quantidades penetrem na hemolinfa.

Um estudo anterior sobre lagartas adaptadas a cardenolídeo revelou que a Na + K + -ATPase é amplamente restrita ao tecido nervoso das lagartas [11]. Assim, descobrimos que D. nerii lagartas podem tolerar altos níveis de ouabaína se injetada na cavidade do corpo da larva [10]. Portanto, postulamos um mecanismo que evita que os cardenolídeos atinjam a Na + K + -ATPase dentro do sistema nervoso e, portanto, focamos aqui na interface entre a hemolinfa contendo cardenolídeo e o cordão nervoso ventral.

Nossos dados revelaram que a ouabaína ganha acesso à Na + K + -ATPase apenas quando o cordão nervoso de D. nerii foi tratado com ureia. Como se acredita que a uréia perturba o perineuro dos lepidópteros [17], nossos resultados fornecem evidências de que o perineuro intacto nativo não é permeável à ouabaína e podemos assumir que isso se aplica também a outros cardenolidos relativamente polares. Portanto, o sítio-alvo dos cardenolídeos, a Na + K + -ATPase, é protegido dos cardenolídeos polares presentes na hemolinfa. Observamos aqui um aumento dependente do tempo semelhante da ligação de 3 H-ouabaína ao cordão nervoso tratado com uréia, conforme descrito por Rubin et al. [17] para M. sexta aos cordões nervosos de D. nerii, uma espécie que realmente tem que lidar com cardenólidos dietéticos.

A barreira de difusão é provavelmente constituída pelas células do perineuro que formam junções herméticas [14], impedindo a via paracelular para a difusão dos compostos. Esta barreira provavelmente não é seletiva para cardenolidos, mas representa uma barreira de difusão para qualquer composto polar. A composição iônica da hemolinfa não seria adequada para a função nervosa e, portanto, o perineuro é considerado responsável pela manutenção das concentrações de íons necessárias no espaço extracelular do cordão nervoso [14]. Portanto, a impermeabilidade à ouabaína do perineuro de D. nerii provavelmente não é uma especialização. No entanto, o LD50 de ouabaína injetada para Schistocerca e Periplaneta é tão baixo quanto 4,4 e 0,6 µg por indivíduo, respectivamente [36]. Isso pode significar que a perineúria de Schistocerca e Periplaneta não são tão apegados à ouabaína como a das mariposas-falcão. No entanto, a Na + K + -ATPase nestes insetos pode não estar restrita ao tecido nervoso, mas também pode ocorrer em outros tecidos, e. no intestino e nos túbulos de Malpighi [37-39].

No entanto, lidar com os cardenolidos dietéticos também implica que as formas não polares devem ser excluídas do cordão nervoso. Para testar a existência de uma barreira ativa para cardenólidos apolares no perineuro da mariposa-falcão, usamos a digoxina cardenolida relativamente apolar, que é conhecida por permear células passivamente. Com a aplicação dos ionóforos CCCP e 2,4-DNP, objetivamos bloquear a cadeia respiratória em nosso tecido teste, interrompendo assim o fornecimento de ATP. Consistente com a noção de uma barreira ativa que protege a Na + K + -ATPase, encontramos uma maior ligação da digoxina às cordas nervosas quando os inibidores metabólicos CCCP ou 2,4-DNP foram aplicados. Isso se encaixa na hipótese de um mecanismo de efluxo ativo: quando o suprimento de energia se esgota, a digoxina não pode mais ser removida ativamente das células e atinge seu local-alvo.

Os portadores da família PGP são fortes candidatos para mediar o efeito observado: no cérebro dos mamíferos, eles constituem a parte mais importante da barreira hematoencefálica por extrusão de compostos infiltrantes [19]. Além disso, Mayer et al. [40] demonstraram que o PGP é responsável por excluir a digoxina do cérebro de camundongos do tipo selvagem. PGPs são membros da família de genes mdr, dos quais pelo menos três genes estão presentes no Drosófila genoma ([41] e referências nele). No M. sexta (este estudo) e outras espécies de lepidópteros [28], três transportadores semelhantes a PGP foram identificados que são homólogos aos de D. melanogaster. Todos estes são expressos no Manduca cordão nervoso e, portanto, são candidatos potenciais para os portadores de efluxo aqui evidenciados.

Para testar se os transportadores semelhantes a PGP estão envolvidos na barreira de digoxina movida por energia, incubamos cordões nervosos de M. sexta e D. nerii com dois dos inibidores de PGP mais amplamente usados, quinidina e verapamil. Esses compostos são conhecidos por elevar o nível plasmático de digoxina em humanos quando coadministrados com este fármaco e este fenômeno é atribuído principalmente à inibição de PGP ([40], e referências nele). Ambos em D. nerii e em M. sexta, a aplicação de verapamil aumentou a quantidade de digoxina ligada ao tecido nervoso. Estas observações sugerem que a barreira de efluxo para digoxina é mediada por um transportador do tipo PGP. Ao comparar os dados das duas espécies de mariposa-falcão, é evidente que a ligação da digoxina sob condições de controle é cerca de duas vezes maior em M. sexta como em D. nerii. Neste ponto, no entanto, é difícil julgar se essa diferença é devido a diferenças quantitativas ou qualitativas na barreira perineural de ambas as espécies e também pode haver diferenças de tamanho entre as duas espécies.

A presença de um transportador semelhante a PGP é, além disso, demonstrada por nossos dados imunohistoquímicos que revelaram ligação específica do anticorpo anti-PGP C219 na periferia de D. nerii gânglios. A presença desta proteína no sistema nervoso de M. sexta já foi demonstrado [15], embora de maneira geral os dados sobre a ocorrência de transportadores do tipo PGP em insetos sejam limitados. Nosso conhecimento sobre o envolvimento de PGPs na exclusão de compostos vegetais em insetos herbívoros ainda é insuficiente, mas a excreção de nicotina nos túbulos de Malpighi Manduca lagartas [42] já foi sugerido para ser baseado em um homólogo de PGP [43]. Especialmente, a ampla gama de substratos sugere um papel-chave potencial para esses transportadores na resistência de insetos herbívoros a compostos tóxicos de plantas secundárias. Além disso, transportadores do tipo PGP podem não apenas fazer parte da barreira hematoencefálica, mas também ser responsáveis ​​por tornar os intestinos dos insetos impermeáveis ​​a algumas toxinas das plantas. Eles poderiam, em teoria, permitir que espécies generalistas lidassem com uma ampla gama de diversos compostos tóxicos secundários de plantas.

Os mecanismos de exclusão de cardenolídeo descritos aqui, no entanto, podem não ser o único modo de resistência aos cardenolidos. Sabe-se que os cardenolidos são modificados metabolicamente no corpo do inseto [16,44]. Se regiões da molécula são afetadas, que medeiam as interações bioquímicas, o metabolismo também resulta em desintoxicação. Além disso, pode-se esperar que a excreção pelos túbulos de Malpighi reduza os níveis de hemolinfa dos cardenolidos. A situação é ainda mais complicada pelo fato de que a digoxina não é apenas substrato para PGP, mas também para polipeptídeos transportadores de ânions orgânicos (Oatps) e potencialmente até mesmo transportadores adicionais [45].

Assim, nossa imagem de como os especialistas lidam com os cardenolídeos parece ser uma diversidade de estratégias, com várias frequentemente usadas juntas, mas potencialmente com combinações distintas entre diferentes herbívoros.


Materiais e métodos

As larvas de três espécies de mosca-serra usando plantas contendo glicosídeo cardíaco como hospedeiros (um especialista e dois generalistas) foram testadas quanto à insensibilidade do local-alvo de suas Na, K-ATPases. Monophadnus latus (especialista) foram coletados como larvas de Helleborus niger L. (Ranunculaceae), contendo bufadienolides (Glombitza et al., 1989), por André Mégroz em um jardim na cidade de St. Gallen, Suíça, em maio de 2014. Pachyprotasis rapae (L.) (Hymenoptera: Tenthredinidae) larvas (generalistas) foram coletadas de Digitalis purpurea L. (Plantaginaceae), contendo cardenólidos, por G. Petschenka perto de Waldkatzenbach, Baden-Württemberg, Alemanha, em agosto de 2012, e Pachyprotasis variegata (Fallén) larvas (generalistas) de Digitalis lutea L. ou Digitalis grandiflora Mill., Que também contém cardenólidos (Luckner & Wichtl, 2000), por G. Petschenka perto de Bad Urach, Baden-Württemberg, Alemanha, em junho de 2011. Ovos ou pupas de Daphnis nerii L. (Lepidoptera: Sphingidae) foram obtidos de criadores via Internet e originados de cruzamentos entre linhagens europeias e tailandesas ou de espécimes egípcios. Para D. nerii e Empyreuma pugione L. (Lepidoptera: Arctiidae), que foi originalmente coletado em Cuba, uma cultura de laboratório foi estabelecida e mantida em Nerium oleander L. (Apocynaceae, contendo cardenólidos) e para D. nerii além de Vinca major L. lagartas de Manduca sexta (L.) (Lepidoptera: Sphingidae) foram criados com dieta artificial (dieta de mariposa cigana MP Biomedicals, Heidelberg, Alemanha). Adultos de Leptinotarsa ​​decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae) foram obtidos do Instituto Max Planck para Biologia do Desenvolvimento, Tübingen, Alemanha, e mantidos como uma cultura em folhas frescas de batata (Solanum tuberosum L.) (Solanaceae). Locusta migratoria (L.) (Orthoptera: Acrididae) foram adquiridos em uma loja de animais e Periplaneta americana (L.) (Blattodea: Blattidae) foram obtidos de uma colônia mantida na Universidade de Hamburgo (Alemanha).

O RNA foi extraído do tecido dos insetos usando o kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha) seguindo os protocolos do fabricante: para E. pugione, tecido nervoso, músculos e túbulos de Malpighi foram dissecados de mariposas adultas e extraídos separadamente, por D. nerii tecido nervoso de uma lagarta foi usado, enquanto para P. rapae e P. variegata a cápsula da cabeça de uma larva foi extraída, e por M. latus uma larva jovem inteira foi usada. A amplificação por RT-PCR e o sequenciamento dos genes Na, K-ATPase seguiram os procedimentos descritos em Dobler et al. (2012) com um primer adicional como em Petschenka et al. (2013a). Isso produz um fragmento da Na, K-ATPase do aminoácido 89 a 817, alcançando do primeiro ao sexto domínio transmembranar e cobrindo todos os resíduos importantes da bolsa de ligação ao glicosídeo cardíaco. As sequências foram depositadas no Genbank sob o número de acesso. LN736262 - LN736266. Além disso, sequências de citocromo oxidase I (COI) foram geradas para os dois Paquiprotasis espécies e estão acessíveis sob o Genbank no. LN736267 e LN736268, visto que essas larvas não puderam ser identificadas a priori. As pesquisas BLAST retornaram correspondências perfeitas para as sequências COI de P. rapae e P. variegata depositado sob o número de acessos. KC972733 e KC974970, respectivamente. As sequências de Na, K-ATPase foram editadas usando Sequencher 5.1 (Genecodes, Ann Arbor, MI, EUA) e foram alinhadas e traduzidas em sequências de aminoácidos com MEGA 5.2.2 (Tamura et al., 2011).

Para testar a ocorrência de transportadores do tipo PGP no intestino médio de insetos, realizamos um levantamento imunohistoquímico envolvendo cinco espécies: D. nerii, M. sexta, L. decemlineata, P. americana, e L. migratoria. Os intestinos médios foram dissecados em tampão de dissecção resfriado [Tris 5 mM, sacarose 250 mM, pH 8 (pH 10 para L. migratoria)], fixado por 1 h em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), lavado em PBS, crioprotegido por imersão subsequente em 10, 20 e 30% de sacarose cada, incorporado em Tissue-Tek (Sakura, Torrance, CA, EUA), e congelado a −80 ° C. Seções de tecido de 14 μm foram cortadas em um criostato Leica CM 1950, transferidas para lâminas microscópicas Polysine ™ (Roth, Karlsruhe, Alemanha), deixadas secar em temperatura ambiente e armazenadas congeladas a −80 ° C. Após o descongelamento, as seções de tecido foram lavadas com PBS, incubadas com H 0,3%2O2 em metanol por 30 min, lavado em PBS e bloqueado com NOVADetect Block (Dianova, Hamburgo, Alemanha). Depois de enxaguar novamente em PBS, o anticorpo C219 da glicoproteína P (Abcam, Cambridge, Reino Unido), foi aplicado a 4 ° C durante a noite [1-1,45 μg ml -1 em 5% de soro de cabra normal (NGS), 1% de albumina de soro bovino (BSA), 0,3% Triton X-100 em PBS]. Os controles foram tratados com NGS / BSA em PBS, apenas. Após a lavagem com PBS, as seções foram tratadas com potenciador de camundongo / coelho (Dianova) por 10 min, lavadas com PBS, incubadas com um marcador de polímero de peroxidase de rábano (HRP) (Dianova) por 10 min e, subsequentemente, lavadas com PBS. A ligação de HRP às seções de tecido foi visualizada usando um kit de substrato 3,3′-diaminobenzidina (DAB) (Dianova). Após 20 min, as seções foram lavadas com H2O e desidratado em uma série crescente de etanol seguido por isopropanol / xilol (1: 1) e 2 × 100% xilol. Finalmente, as seções foram incorporadas com composto para montagem DPX (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha), visualizadas em um microscópio Axioskop 2 (Zeiss, Jena, Alemanha) e fotografadas com uma AxioCam Color Camera (Zeiss). Os controles foram tratados da mesma maneira que os tratamentos, mas o anticorpo C219 foi omitido.


MATERIAIS E MÉTODOS

Criação de traças

Todos os experimentos relatados aqui foram realizados em adultos de mariposas-falcão Oleander criadas em laboratório, D. nerii (Linnaeus 1758). As larvas dessas mariposas foram criadas nas folhas de dois tipos de plantas hospedeiras Nerium oleander e Tabernaemontana divaricata colocado dentro de caixas com tampo de malha para permitir fácil ventilação. As pupas foram embebidas em serragem e transferidas para gaiolas de tela de arame. Após a emergência, as mariposas adultas foram expostas a um ciclo natural de dia e noite. Para reprodução, mantivemos cerca de 4-8 mariposas em uma proporção sexual de 1: 1 dentro de uma câmara de Plexiglass de 1 m 3 com suas plantas hospedeiras. Após 2-3 dias, coletamos os ovos das plantas hospedeiras e os colocamos em condições de temperatura e umidade ambiente até a eclosão e durante os estágios larvais. Nessas condições, o ciclo de vida ovo a ovo da mariposa era de aproximadamente 45 dias.

Microscopia eletrônica de varredura

Para obter imagens de resolução fina das cerdas de Böhm, usamos microscopia eletrônica de varredura em antenas excisadas de mariposas-falcão recém-mortas (Fig. 1A, B). As amostras das antenas foram desidratadas através de uma série de álcool 10%, 20%, 30%, 50%, 75%, 90% e 100% e posteriormente colocadas em fitas de carbono sobre tocos de alumínio. Colocamos os stubs em um ultrasonicator por 1 min para remover o material particulado e um dessecador por 30 s para remover a umidade residual. A amostra foi então revestida por pulverização catódica com ouro por ∼30 se as amostras foram fotografadas usando microscopia eletrônica de varredura (EVO LS10).

Procedimento de tethering

Todos os experimentos comportamentais foram realizados em adultos amarrados com 1-2 dias de idade D. nerii mariposas. Para anestesiar as mariposas com frio, nós as colocamos a –20 ° C até que se tornassem inativas. As mariposas anestesiadas foram então amarradas ventralmente a um poste de alumínio (2 mm de diâmetro, 5–6 cm de comprimento) no esterno usando uma mistura de adesivo de cianoacrilato e bicarbonato de sódio (ver Sane e Jacobson, 2006). Esse procedimento garantiu que as mariposas permanecessem presas durante toda a duração dos experimentos.

Medição do comportamento de posicionamento da antena

Ablação de mecanossensores

Todos os procedimentos experimentais envolvendo a ablação das cerdas de Böhm foram realizados na antena direita, enquanto a antena esquerda foi deixada intacta e serviu como um controle interno. Em mariposas com cerdas ablacionadas e tratadas com sham, primeiro reduzimos a atividade das mariposas, colocando-as no gelo, e removendo as cerdas de Böhm usando uma agulha hipodérmica de calibre 30.

Os insetos experimentais foram divididos em seis grupos. No primeiro grupo (controle), as cerdas foram deixadas intocadas, mas as mariposas foram submetidas a anestesia fria semelhante aos insetos experimentais. As mariposas de controle foram autorizadas a se recuperar após amarrar sem quaisquer procedimentos adicionais. No segundo grupo (sham), escovamos uma agulha sobre as cerdas sem quebrá-las, mas por outro lado manuseamos a mariposa de maneira semelhante aos casos experimentais. No terceiro grupo (cerdas escapais e pedicelares ablacionadas), realizamos a ablação tanto da escápula quanto das cerdas pedicelares de Böhm. No quarto grupo (cerdas escapais ablacionadas), apenas as cerdas escapais foram ablacionadas, enquanto as cerdas pedicelares foram mantidas intactas. No quinto grupo (cerdas pedicelares ablacionadas), as cerdas pedicelares foram ablacionadas, mas não as cerdas escapais. Finalmente, no sexto grupo (articulação pedicelo-flagelo restrita), usamos adesivo de cianoacrilato para colar a articulação pedicelo-flagelo. Este tratamento eliminou ou reduziu substancialmente a entrada para os órgãos de Johnston, que abrangem a articulação pedicelo-flagelar e são estimulados por distorções mecânicas desta articulação (Sane et al., 2007).

Ao final de cada experimento, as mariposas foram colocadas a –20 ° C. Nós os examinamos de perto após a morte usando microscopia de luz para garantir que as manipulações experimentais fossem limpas e restritas àquelas destinadas ao experimento.

Perturbação eletromagnética das antenas dos insetos

Para perturbar a posição da antena à distância durante o voo amarrado, anexamos um pequeno pedaço de ferro (& lt10% da massa da antena) à antena direita da mariposa amarrada e usamos um eletroímã (fonte de alimentação de 36 V, 2 A DC) colocado além do comprimento da antena para mover a antena de sua posição definida (Fig. 1C). Um protocolo personalizado do LabVIEW (National Instruments, Austin, TX, EUA) entregou trens de pulso (largura de pulso de 300 ms em intervalos de 700 ms em alguns experimentos anteriores, a largura de pulso era de 1 s com um intervalo de 1 s) para o eletroímã através da um conversor AD (National Instruments, USB 6229). Um LED vermelho conectado em paralelo com o eletroímã indicava quando o eletroímã estava ligado em nossas gravações de vídeo. Registramos entre 8 e 10 pulsos ou perturbações para cada mariposa. Para digitalização, selecionamos apenas as tentativas em que o início do estímulo resultou em um movimento claramente detectável (& gt5 graus 5–20 graus) da antena (Fig. 1F, inserção). Como nem sempre era possível posicionar com precisão o eletroímã em relação à antena da mariposa viva, o ângulo máximo perturbado da posição da antena variou de tentativa para tentativa. Para comparar a cinemática de recuperação, portanto, normalizamos cada traço do ângulo interantenal em relação ao seu valor de pico.

Aquisição, digitalização e análise de vídeo de alta velocidade

Após cada tratamento, permitimos que as mariposas presas se recuperassem por 2 he filmamos seu voo usando duas câmeras de alta velocidade Phantom v7.3 sincronizadas (Vision Research, Wayne, NJ, EUA) a 1000 frames s –1 (tempo de exposição de 100 μs ) Essa taxa de quadros garantiu cerca de 30–33 quadros por batimento de asa, fornecendo, assim, uma resolução temporal suficientemente detalhada do movimento da antena. Uma câmera foi posicionada acima da mariposa para fornecer uma perspectiva dorsal e outra câmera foi posicionada frontalmente. Dois pontos pretos marcados na antena a ± 0,5 cm de sua ponta facilitaram a digitalização. O vôo foi provocado por meio de estímulos táteis ou soprando ar suavemente no animal. Calibramos as câmeras fixas antes e depois de cada experimento. Um código Matlab personalizado (Mathworks, Natick, MA, EUA) para calibração e digitalização (Hedrick, 2008) foi usado para converter as coordenadas cartesianas das antenas em coordenadas esféricas para calcular os ângulos interantenais (Sane et al., 2007). O erro de digitalização foi estimado medindo a constância do comprimento da antena em função do tempo em uma amostra de vídeos digitalizados. As estimativas de erro ficaram entre 0,5% e 3,2%, dentro dos limites aceitáveis ​​de erro de medição.

(A) Micrografia eletrônica de varredura da base da antena mostrando as cerdas de Böhm escapal e pedicelar. (B) Close de um campo de cerdas pedicelares, mostrando algumas cerdas desviadas pela borda cuticular do escapo (setas brancas ver também material suplementar Filme 1), como ocorreria durante os movimentos das antenas. (C) Diagrama esquemático do experimento para estudar o posicionamento da antena perturbando a antena com um eletroímã. (D) Um traço bruto representativo mostrando a recuperação do ângulo interantenal ao seu valor original (traço azul) após perturbações sucessivas com o eletroímã. O traço vermelho representa o estado do eletroímã (ligado / desligado) conforme medido usando um LED vermelho. (E) Coordenadas de ângulo teta normalizadas representativas (azimutal) da antena esquerda não perturbada (em cima) e a antena direita perturbada (em baixo) mostrando ipsilateralidade de posicionamento antenal. Cada traço azul é uma média de sete tentativas da mesma mariposa, enquanto as linhas vermelhas representam os desvios padrão. Cada traço foi normalizado para seu próprio pico. As áreas sombreadas em cinza em D e E representam a duração quando o estímulo está ativado. (F) Os deslocamentos de estímulo cortados entre os conjuntos de dados mostram estereotipia na recuperação da posição da antena. Os traços azuis representam um gráfico médio para cada mariposa individual (N= 7) enquanto a média do grupo é mostrada em preto com a área sombreada cinza representando 1 s.d. A inserção mostra a perturbação entregue às antenas no início do estímulo.

(A) Micrografia eletrônica de varredura da base da antena mostrando as cerdas de Böhm escapal e pedicelar. (B) Close de um campo de cerdas pedicelares, mostrando algumas cerdas desviadas pela borda cuticular do escapo (setas brancas ver também material suplementar Filme 1), como ocorreria durante os movimentos das antenas. (C) Diagrama esquemático do experimento para estudar o posicionamento da antena perturbando a antena com um eletroímã. (D) Um traço bruto representativo mostrando a recuperação do ângulo interantenal ao seu valor original (traço azul) após perturbações sucessivas com o eletroímã. O traço vermelho representa o estado do eletroímã (ligado / desligado) conforme medido usando um LED vermelho. (E) Coordenadas de ângulo teta normalizadas representativas (azimutal) da antena esquerda não perturbada (em cima) e a antena direita perturbada (em baixo) mostrando ipsilateralidade de posicionamento antenal. Cada traço azul é uma média de sete tentativas da mesma mariposa, enquanto as linhas vermelhas representam os desvios padrão. Cada traço foi normalizado para seu próprio pico. As áreas sombreadas em cinza em D e E representam a duração quando o estímulo está ativado. (F) Os deslocamentos de estímulo cortados entre os conjuntos de dados mostram estereotipia na recuperação da posição da antena. Os traços azuis representam um gráfico médio para cada mariposa individual (N= 7) enquanto a média do grupo é mostrada em preto com a área sombreada cinza representando 1 s.d. A inserção mostra a perturbação entregue às antenas no início do estímulo.

As posições das antenas para cada tratamento foram plotadas como diagramas de rosa das distribuições de frequência dos ângulos interantenais (medidos de 200–300 quadros de vídeo digitalizados por mês) em tratamentos experimentais usando Oriana (Kovach Computing Services, Anglesey, Reino Unido) (Fig. 2 ) Os dados mostraram direcionalidade significativa do vetor médio (comprimento do vetor médio & gt0,9 em todos os casos), e ajuste a uma distribuição de Von Mises com não uniformidade significativa (P& lt0.01 usando o teste de Rayleigh e o teste de espaçamento de Rao para uniformidade circular) (Batschelet, 1981). Portanto, usamos o parâmetro paramétrico Watson – Williams F-teste (multisample, pairwise) para comparar as médias circulares do ângulo interantenal entre os conjuntos de dados (Zar, 1999).

Neuroanatomia das cerdas de Böhm

Para visualizar o circuito neural subjacente ao sistema mecanossensorial e motor da antena, anestesiamos as mariposas a frio, inserimos-as em um tubo de seringa serrado e imobilizamos sua cabeça e tórax com cera dentária fundida. A cápsula da cabeça dorsal exposta foi então descalcificada e dissecada para obter acesso aos músculos antenais intrínsecos e extrínsecos para preenchimentos com corante fluorescente. A organização dos músculos antenais em D. nerii é idêntico ao de M. sexta (Kloppenburg et al., 1997). Como os neurônios sensoriais são mais propensos a estimular os músculos do mesmo segmento, preenchemos os músculos intrínsecos do musculus scapo-pedicellaris posterior [Ms-pp (Niehaus e Gewecke, 1978)] em combinação com um preenchimento sensorial das cerdas pedicelares posteriores (pPB ), ou o músculo extrínseco tentorio-scapalis lateralis [Mt-sl (Niehaus e Gewecke, 1978) ou músculo depressor anterior (ADM) (Kloppenburg et al., 1997)] em combinação com as cerdas mediais da escápula (mSB). Para o propósito deste artigo, esses pares de cerdas musculares podem ser vistos como combinações representativas para preenchimentos de corante e eletrofisiologia. Neuroanatomia mais detalhada de outras combinações será publicada em outro lugar.

Diagramas de rosa (tamanho do compartimento de 10 graus) representando ângulos interantenais de mariposas-falcão voadoras amarradas. Todas as manipulações foram realizadas apenas na antena direita. (A) Mariposas de controle intactas com antenas não manipuladas (N= 9). (B) Mariposas tratadas com simulação não mostram significância (P& gt0,05) aumento no ângulo interantenal (N= 10). (C) Reduzindo a entrada para os órgãos de Johnston, restringindo a articulação pedicelar-flagelar não altera significativamente o posicionamento da antena (N= 9). (D) A ablação de todos os campos das cerdas de Böhm na antena direita causa posicionamento antenal impróprio, conforme representado por um (*P& lt0,01) aumento nos ângulos interantenais. A antena esquerda não manipulada assume a posição normal (N= 10). (E) A ablação apenas de campos de cerdas escapais resultou em um aumento significativo no ângulo inter-antenal (*P& lt0.05), semelhante a mariposas com todas as cerdas removidas (N= 10). (F) A ablação apenas de campos de cerdas pedicelares não teve efeito nos ângulos inter-antenais (N= 9). A linha preta representa o ângulo médio circular de cada conjunto de dados, com intervalos de confiança de 95% representados pelo arco preto. Cada círculo concêntrico representa o aumento da frequência em etapas de 1.

Diagramas de rosa (tamanho do compartimento de 10 graus) representando ângulos interantenais de mariposas-falcão voadoras amarradas. Todas as manipulações foram realizadas apenas na antena direita. (A) Mariposas de controle intactas com antenas não manipuladas (N= 9). (B) Mariposas tratadas com simulação não mostram significância (P& gt0,05) aumento no ângulo interantenal (N= 10). (C) Reduzindo a entrada para os órgãos de Johnston, restringindo a articulação pedicelar-flagelar não altera significativamente o posicionamento da antena (N= 9). (D) A ablação de todos os campos das cerdas de Böhm na antena direita causa posicionamento antenal impróprio, conforme representado por um (*P& lt0,01) aumento nos ângulos interantenais. A antena esquerda não manipulada assume a posição normal (N= 10). (E) A ablação de apenas campos de cerdas escapais resultou em um aumento significativo no ângulo inter-antenal (*P& lt0.05), semelhante a mariposas com todas as cerdas removidas (N= 10). (F) A ablação apenas de campos de cerdas pedicelares não teve efeito nos ângulos interantenais (N= 9). A linha preta representa o ângulo médio circular de cada conjunto de dados, com intervalos de confiança de 95% representados pelo arco preto. Cada círculo concêntrico representa o aumento da frequência em etapas de 1.

Usamos Texas Red dextrano aquoso (3000 MW, pico de emissão 615 nm Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) para preenchimentos de músculos antenais e fluoresceína-dextrano aquoso (3000 MW, pico de emissão 521 nm Molecular Probes) para preencher os neurônios sensoriais exposta pós-ablação das cerdas de Böhm. Os animais foram mantidos vivos por pelo menos 24 horas após o preenchimento do corante para permitir a permeação total do corante, após o que o cérebro foi fixado em paraformaldeído a 4% por 8–10 he dissecado. Os cérebros dissecados foram desidratados através de uma série de álcool (50-100% de etanol), depurados com xileno e totalmente montados em DPX. As lâminas foram fotografadas com um microscópio confocal de varredura a laser (Olympus FV1000) com ampliação de 10 × / 20 × (Fig. 3). Coletamos seções ópticas de 1 µm do cérebro usando varredura sequencial com um laser He-Ne 543 nm e um laser Kr-Ar 488 nm para detectar fluorescência vermelha e verde, respectivamente. As imagens assim obtidas foram processadas com ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA).

Em alguns casos, crio-seccionamos o cérebro para obter uma visão mais clara dos preenchimentos duplos sensório-motores (Fig. 3C, F). Depois de preencher e dissecar como descrito acima, incubamos o cérebro em uma solução de sacarose a 30% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 24-48 h a 4 ° C e embebidos e congelados em Jung Tissue Freezing Medium. O tecido incorporado neste bloco de seção foi fatiado em seções de 60 μm usando um criostato Leica CM 1850 a temperaturas abaixo de –20 ° C. As seções foram montadas em VectaShield H-1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) e fotografadas usando um microscópio confocal (40 × / 60 ×, imersão em óleo).

Eletromiografia dos músculos antenais

Para registrar a atividade dos músculos antenais em resposta à estimulação das cerdas de Böhm, primeiro imobilizamos as mariposas adultas colocando-as em um tubo de seringa serrado, conforme descrito acima. A preparação foi montada em uma mesa pneumática sob um microscópio de dissecção giratório (após 1 h de recuperação), e a antena esquerda (na qual realizamos todas as gravações) foi inserida em um capilar de vidro e colada no local aproximadamente no 5º anel do flagelo. Restringimos a articulação pedicelo-flagelar com cola de cianoacrilato para garantir que apenas o escapo estivesse livre para se mover. Os músculos antenais foram expostos usando um procedimento semelhante para preenchimentos de neurônios motores, e um eletrodo de aterramento foi inserido na área frontal da cutícula da cabeça.

Registramos as respostas dos músculos extrínsecos (Mt-sl) à estimulação das cerdas da escápula (mSB) e dos músculos intrínsecos (Ms-pp) à estimulação das cerdas pedicelares (pPB) usando um eletrodo de registro de tungstênio (5 μm de diâmetro, 2 MΩ impedância FHC, Bowdoin, ME, EUA) montada em um estágio de cabeça extracelular (Dagan 8024, Minneapolis, MN, EUA). Estimulamos mecanicamente as cerdas com uma escova montada no eixo de um motor de passo. O movimento da escova foi rastreado por meio de um sensor óptico. Usando este aparelho, entregamos estímulos de impulso curtos de 50 ms (40-60 tentativas / mês) às cerdas de Böhm usando pCLAMP10.0 através da um conversor AD (DigiData 1322A Axon Instruments, Union City, CA, EUA) enquanto mantém a antena imóvel. A resposta ao impulso do sistema forneceu medidas de latência de resposta. Também fornecemos estímulos em branco onde a escova se movia no ar sem entrar em contato com nenhuma superfície para identificar fontes potenciais de ruído elétrico devido ao movimento da escova. As respostas musculares foram amplificadas usando um amplificador intracelular duplo (Dagan IX2 700) e o ruído de frequência de linha foi eliminado usando um eliminador de ruído HumBug (Quest Scientific, North Vancouver, BC, Canadá). Após cada gravação, preenchemos os músculos nos locais de gravação com Texas Red dextran e os campos de cerdas estimulados com fluoresceína dextran. Depois de manter a mariposa viva por 24 horas, fixamos, dissecamos e fotografamos o cérebro usando microscopia confocal.


Sensibilidade do local-alvo em um herbívoro especializado em relação aos principais compostos tóxicos de sua planta hospedeira: a Na + K + -ATPase da mariposa-falcão oleandro (Daphnis Nerii) é altamente suscetível a cardenolidos

As lagartas da mariposa espirradeira, Daphnis nerii (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Sphingidae) alimentam-se principalmente de oleandro (Nerium oleander) Esta planta é rica em cardenólidos, que inibem especificamente a Na + K + -ATPase. Uma vez que alguns insetos que se alimentam de plantas de cardenolídeo possuem Na + K + -ATPases resistentes a cardenolídeo, testamos se D. nerii também possui essa estratégia para contornar a toxicidade do cardenolídeo. Para tanto, foi estabelecido um ensaio fisiológico, que permitiu a medição direta da sensibilidade dos cardenolídeos Na + K + -ATPase. Usando Schistocerca gregaria, como uma espécie de referência sensível aos cardenolídeos, mostramos que D. nerii A Na + K + -ATPase foi extremamente sensível ao cardenolídeo ouabaína. Surpreendentemente, sua sensibilidade é ainda maior do que a do generalista sensível a cardenolídeo, S. gregaria. A presença ou ausência de cardenólidos na dieta de D. nerii não influenciou a sensibilidade do cardenolídeo da enzima, indicando que a insensibilidade do local-alvo não é induzível nesta espécie. No entanto, apesar da sensibilidade de sua Na + K + -ATPase, lagartas de D. nerii recuperou-se rapidamente de uma injeção de uma quantidade excessiva de ouabaína em sua hemocele. Concluimos que D. nerii possui adaptações que permitem que ele se alimente com uma dieta rica em cardenolídeos diferente da previamente descrita em insetos especializados em cardenolídeos e discuta outros mecanismos de resistência em potencial.

Esta é uma prévia do conteúdo da assinatura, acesso através de sua instituição.


IndiaBioscience

Arnab Chakraborty

Já viu um inseto voar para dentro de uma sala, navegar no ar turbulento do ventilador e pousar na borda de sua xícara de café? Já viu alguém pairar sobre uma flor ao vento? A delicada e bela dança de suas asas é coreografada em tempo real pelo feedback de seus sistemas sensoriais, comandados pelas antenas.

Mariposa falcão (Foto: Anand Krishnan)

Os insetos usam suas antenas para uma variedade de funções: olfato, gravidade, temperatura, fluxo de ar, umidade e para manobras que requerem correção instantânea e controle de vôo. O controle de voo eficaz requer que o inseto sinta e posicione as antenas (em relação ao seu corpo) com precisão. Para entender melhor por que, imagine que você tenha que tocar um objeto próximo a você sem olhar para ele. Para fazer isso com sucesso, você precisa ter informações visuais anteriores da última posição do objeto e também saber onde seu braço está atualmente. Sentimos a (presente) posição de nossos braços por meio do conhecimento dos estados musculares do braço, e a posição final é ditada por um conhecimento constante da posição do braço durante o movimento. Se tudo correr bem, o braço faz contato com o alvo. Para obter uma imagem mais clara de como os insetos adquirem informações e, subsequentemente, controlam sua posição antenal, os cientistas do Insect Flight Lab, NCBS (Anand Krishnan e colaboradores, liderados por Sanjay P Sane) estudaram a mariposa gavião-oleandro (Daphnis nerii) Eles descobriram que o comportamento de posicionamento das antenas em mariposas-falcão é provocado por informações de diferentes sistemas sensoriais - mecanosensação e visão.

Em seu trabalho anterior, a equipe mostrou que uma mariposa falcão voadora adquire feedback mecanossensorial sobre a posição de suas antenas usando estruturas chamadas cerdas de Böhm. As cerdas de Böhm são pequenas placas de cabelo localizadas na base das antenas. Quando as antenas se movem, elas roçam nas cerdas, alterando também sua posição e orientação. Isso permite que eles detectem a posição atual e qualquer mudança de posição das antenas (propriocepção). Em seus experimentos, a equipe removeu essas cerdas e deliberadamente interrompeu a posição da antena. Posteriormente, as mariposas não conseguiram recuperar a posição antenal. Outras experiências mostraram as vias neurais envolvidas neste processo e mostraram que o tempo de resposta (estimulação das cerdas à ativação muscular) era muito baixo (a & lt10ms) - assemelhando-se ao reflexo monossináptico. Assim, está claro que as cerdas de Böhm são essenciais para o posicionamento das antenas em vôo. Os pesquisadores propõem que o posicionamento pode ser essencial para o olfato durante o vôo. Este trabalho se baseia em trabalhos anteriores de Sane (liderado por Thomas L Daniel), de que outro órgão na base da antena responde a movimentos pequenos e de alta frequência da antena, como vibrações devido ao som ou fluxo de ar.

E a visão então? Estudos em muitos insetos mostraram que eles modulam a posição da antena usando pistas visuais também - como uma antena de grilo que pode rastrear um objeto em movimento na frente dela. Em seu trabalho mais recente, Krishnan e Sane mostraram que os estímulos visuais influenciam a posição antenal nas mariposas-falcão também. Seus experimentos ajudam a afirmar que uma antena responde (de uma maneira seletiva de movimento e direção) a sinais visuais, permitindo que as mariposas-falcão modulem a posição da antena. O que é interessante é a diferença notável entre a escala de tempo deste feedback visual (visuo-motor) (em

35 - 60ms, cerca de algumas batidas de asa), quando comparado com a resposta semelhante a reflexo à entrada mecanossensorial nas cerdas de Böhm (em & lt10ms). Isso sugere que, embora as mariposas-falcão confiem principalmente no feedback mecanossensorial para fazer correções rápidas ou manobras no meio do vôo, o feedback visual também influencia sua posição antenal.

Com esses dois estudos adicionando ao nosso conhecimento anterior, os autores concluem que tanto a visão quanto a mecanosensação se combinam para modular o vôo. Suas pesquisas enriquecem nossa compreensão do vôo e seu controle na compreensão dos insetos, que no longo prazo pode se estender aos esforços de eco / conservação, agricultura ou mesmo robótica.

Esta peça recebeu amplo apoio de Taruni Roy - que é um aluno de PhD integrado no Insect Flight Lab, NCBS.


Assista o vídeo: רפרף ההרדוף - DAPHNIS NERII MOVIE - FIRST PROMO (Dezembro 2021).