Em formação

As células tumorais primárias podem crescer em cultura 2D?


É possível expandir células tumorais primárias em cultura 2D? São células aderentes? Você tem alguma experiência especialmente com a cultura de câncer de pulmão de células não pequenas em 2D? Obrigada.


Resposta curta: Sim, isso é possível, é a forma como a maioria das linhas de células (cancerosas) foi gerada.

Resposta longa: a cultura de células de tecidos tumorais é feita em laboratórios, especialmente, se você não quiser contar com as culturas frequentemente muito antigas usadas em laboratórios. Muitos deles começaram na década de 1970 e são estranhos em muitos aspectos, por ex. contêm muitos cromossomos várias vezes. Eu isolei rotineiramente novas linhagens celulares de tecidos de melanoma (principalmente metástases de órgãos diferentes), mas o procedimento geral é o mesmo para outros tumores.

Para isolar as células de um tumor, primeiro você lava a amostra do tumor para se livrar do sangue. Em seguida, você corta os tumores em pequenos pedaços usando um bisturi, antes de adicionar uma mistura de enzimas como Colagenase, Dispase e Hialuronidase para dissolver o tecido ainda mais a fim de obter uma solução de célula única. Após a incubação com as enzimas, a suspensão é passada por um filtro de células para remover todos os agregados celulares maiores restantes e resíduos de tecidos e centrifugar as células. Eles são ressuspensos em um meio apropriado para o tipo de célula e semeados em uma placa / frasco apropriado. Para nossas amostras, isso era normalmente uma placa de 35 mm (ou uma placa de 6 poços, que tem a mesma área por poço) ou um frasco T25. A maioria das células de tais isolamentos crescem aderentes, mas às vezes você pode observar células, que não aderem às superfícies.

O procedimento em si não é muito complicado, mas precisa de otimização. Dependendo do seu tecido, o coquetel de enzimas pode ser variado, bem como a duração da incubação e o tempo de incubação nesta etapa. Então, diferentes superfícies de placa / frasco podem desempenhar um papel importante, também a composição do meio.

Quando começamos a fazer este trabalho no laboratório, cerca de 1 em cada 10 tentativas foram bem-sucedidas, após a otimização subimos para 6-7 de 10. O que é importante levar em consideração é que as células mudam durante a incubação e se adaptam a ela. Isso significa que você precisa se questionar sobre o quão bons modelos eles podem ser e precisam ser. Se precisar de nosso protocolo detalhado, me avise, posso publicá-lo em algum lugar.


Comparação de modelos de cultura 2D e 3D como plataformas de teste de drogas no câncer de mama

O número de pacientes que sofrem de câncer em todo o mundo está aumentando, e uma das questões mais desafiadoras em oncologia continua a ser o problema de desenvolver drogas ativas de maneira econômica e oportuna. Na verdade, a probabilidade de aprovação da descoberta pré-clínica ao ensaio clínico de fase I é mais baixa para medicamentos oncológicos (7%) em comparação com medicamentos para outras indicações (1). Considerando o alto custo e a natureza demorada do desenvolvimento clínico de medicamentos oncológicos, melhores plataformas pré-clínicas para a triagem de medicamentos são urgentemente necessárias.

Tradicionalmente, a atividade de drogas anticâncer tem sido avaliada em linhas celulares de câncer cultivadas bidimensionalmente (2D). No entanto, agora está sendo reconhecido que as células cultivadas em 2D são incapazes de simular o microambiente dos tumores originais, que crescem tridimensionalmente (3D) (2–7). Especula-se que isso seja relevante para o fato de que muitos medicamentos que provaram ser clinicamente fúteis foram avaliados pré-clinicamente como "ativos" usando modelos baseados em linhagem de células cultivadas em 2D. Os sistemas de cultura 3D têm recebido atenção como um meio de evitar certas desvantagens dos modelos de cultura 2D, recapitulando o microambiente tumoral, pelo menos em parte (2–7).

No presente estudo, para investigar a utilidade dos modelos de cultura 3D no teste da atividade de drogas quimioterápicas, comparamos a cultura 2D e 3D de linhas de células de câncer de mama e células primárias obtidas de um paciente com câncer de mama e cultivadas como um paciente xenoenxerto derivado (PDX).

Materiais e métodos

Linhagens celulares de câncer de mama e PDX

Dois receptores de estrogênio (ER) -positivo / HER2 -não amplificado (tipo luminal T-47D e MCF-7), dois ER-negativo / HER2-amplificado (HER2-tipo BT-474 e HCC-1954) (8) , e duas linhas celulares de câncer de mama ER-negativas / HER2-não amplificadas (triplo-negativo tipo BT-549 e MDA-MB-231) (8) da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA ) As células foram mantidas em RPMI-1640® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS Gemini-Bio-Products, Inc., Woodland, CA, EUA), 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina e glutamina 2 mM. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 e estavam em fase de crescimento logarítmico no início dos experimentos. As células foram passadas por ≤3 meses antes de células frescas serem obtidas a partir de estoques de passagem inicial congelados recebidos do fornecedor.

A amostra de tecido de câncer de mama foi coletada de um tumor primário ressecado cirurgicamente de uma paciente que foi submetida a uma cirurgia no Hospital Universitário de Kobe. O paciente deu consentimento informado para o uso das amostras tumorais em pesquisa, conforme aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola de Medicina da Universidade de Kobe. A geração do PDX foi conforme descrito anteriormente (9). Em resumo, os tecidos do câncer de mama foram cortados em fragmentos (

1 mm 3 de tamanho) usando uma lâmina de barbear, e 4 × 10 6 células foram transplantadas ortotopicamente em regiões de almofada de gordura mamária inguinal de camundongos NOD-SCID fêmeas (Clea, Tóquio, Japão). Quando o tamanho dos tumores atingiu

Com 1–2 cm de diâmetro, os camundongos foram sacrificados e o tumor do xenoenxerto foi excisado. Neste estudo, um pedaço de tecido PDX fresco originado de um tumor de câncer de mama do tipo luminal foi desagregado por método mecânico automatizado (Medimachine ® Azone, Osaka, Japão). As células primárias foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco / mistura de nutrientes F12 ® (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 2% de FBS, 100 U / ml de penicilina e 100 U / ml de estreptomicina e cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO 2. Todos os experimentos com animais foram realizados sob a aprovação do Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Kobe.

Drogas

Paclitaxel (PTX), doxorrubicina (ADR) e 5-fluorouracil (5FU) foram adquiridos na Wako (Osaka, Japão). As soluções estoque foram preparadas em dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenadas a 20 ° C. Os medicamentos foram diluídos em meio fresco antes de cada experimento, com concentrações finais de DMSO & lt0,1%.

Teste de sensibilidade a drogas

As células (100 μl / poço, n = 6) foram semeadas (dia 0) em placas 2D [Falcon 96-well Tissue Culture Plate ® (353072) Corning Inc., NY, EUA] ou placas 3D [NanoCluture 96-well Plate ® (NCP-LH-96) SCIVAX, Kanagawa, Japão]. Os números de células semeadas por poço foram os seguintes (determinados em um experimento preparatório): BT-474, 5.000 (2D) e 15.000 células / poço (3D) T-47D, MCF-7 e BT-549, 2.500 (2D) e 10.000 células / poço (3D) HCC-1954, 1.000 (2D) e 5.000 células / poço (3D) MDA-MB-231, 500 (2D) e 2.500 células / poço (3D). Os medicamentos foram adicionados no dia 3. A concentração de cada medicamento foi ajustada para atingir 0,1, 1 e 10 × as áreas sob a curva (AUC) obtidas em estudos clínicos farmacocinéticos (Tabela I) (10). O número de células viáveis ​​foi avaliado usando um ensaio luminescente CellTiter-Glo ® (Promega, Madison, WI, EUA) no dia 6. Uma série de imagens de campo claro foram registradas nos dias 0-6 usando um microscópio invertido BZ-X710 ® ( Keyence, Osaka, Japão).

Tabela I

Concentrações de drogas aplicadas.

Tabela I

Concentrações de drogas aplicadas.

Dados de inserção de pacote
Nome da droga Dose (mg / m2) Concentração máxima de droga (μg / ml) AUC (μg · h / ml) MW Dose clínica para câncer de mama (mg / m 2) AUC estimada (μM · h) Concentração para exposição celular (1 × de AUC, μM)
PTX 180 4.47±1.29 16.46±3.76 853.91 175 13.66 0.19
ADR 50 8.70±2.73 62.40±40.7 579.98 60 43.35 0.60
5FU - - 20–24 130.08 - 2.86 0.04

[i] Os parâmetros farmacocinéticos de PTX e ADR são baseados nos dados da bula japonesa. Para 5FU, foi empregada a área ótima sob a curva (AUC) citada em um estudo anterior. As concentrações finais para exposição celular são calculadas de acordo com a AUC, peso molecular (MW), dose clínica indicada para câncer de mama (para PTX e ADR) e tempo de exposição (72 h). PTX, paclitaxel ADR, doxorrubicina 5FU, 5-fluorouracil.

Extração de proteína e Western blotting

As células tratadas com PTX (1 × a AUC, Tabela I) foram lavadas uma vez com PBS gelado e raspadas imediatamente após a adição de tampão de lise [20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10% glicerol, 1 % NP40] contendo inibidores de protease e fosfatase (NaF 100 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonil 1 mM, Na3 VO4 1 mM, aprotinina 2 mg / ml, leupeptina 5 mg / ml). Os lisados ​​celulares foram centrifugados a 14.000 × g por 10 min a 4 ° C para sedimentar o material insolúvel e os extratos de proteína sobrenadante foram coletados. As alíquotas dos extratos protéicos foram separadas por eletroforese em géis pré-moldados de poliacrilamida 7,5%, seguido pela transferência para membranas de difluoreto de polivinilideno. As membranas foram sondadas com um anticorpo para detectar poli (ADP-ribose) polimerase clivada (PARP) (Asp214) (D64E10) (1: 1,000 # 5625 Cell Signaling Technology Beverly, MA, EUA), e separadamente com um anticorpo β-actina ( 1: 3.000 A1978 Sigma-Aldrich). Cada anticorpo primário foi detectado usando reagentes de detecção Amersham ECL Plus Western Blotting (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).

Ensaio de hipóxia

As células em meio de manutenção foram plaqueadas (dia 0) em placas de 96 poços 2D (Corning Inc.) ou 3D (SCIVAX), como descrito acima. A sonda de hipóxia LOX-1 ® (SCIVAX) foi adicionada no dia 3. LOX-1 é um complexo de irídio emissor de luz fosforescente, sua fosforescência, que é extinta por oxigênio, e aumenta em resposta a baixos níveis de oxigênio, pode ser monitorada usando um microscópio de fluorescência (11). Um microscópio BZ-X710 foi usado para registrar as imagens de fluorescência no dia 4.

Exames histológicos e imunohistoquímicos

As células foram colhidas raspando em formalina a 7,5%. No dia seguinte, o sedimento contendo o botão da célula foi retirado e processado em cera de parafina. O botão de células embebidas em parafina (bloco de células) foi seccionado com uma espessura de 4 μm e estes foram avaliados imunohistoquimicamente usando os seguintes anticorpos primários: Ki-67 (1: 5 # IR626 Dako, Glostrup, Dinamarca), caspase-3 (1 : 200 # NCL-CPP32 Leica-Novocastra, Newcastle upon Tyne, Reino Unido) e caspase-8 (1: 150 # NCL-CASP-8 Leica-Novocastra). Para a recuperação do antígeno, um tampão citrato (pH 6,0) foi usado por 10 min a 100 ° C e 30 min de resfriamento à temperatura ambiente. Um sistema MACH 2 Double Stain (Biocare Medical, Concord, CA, EUA) foi usado para detectar reações antígeno-anticorpo, seguido de coloração marrom por coloração DAB. Controles positivos apropriados foram empregados para todas as condições.

Resultados

Formação de esferóides em cultura 3D

Aproximadamente um dia após a semeadura em placas de cultura 3D, 3 das 6 linhas de células de câncer de mama, T47-D, BT-474 e BT-549, começaram a formar esferóides multicelulares densos (MCSs). O tamanho desses MCSs estabilizou

3 dias após a semeadura, e o tamanho máximo dos esferóides era

200–300 μm para cada uma dessas linhas de células. Para MCF-7, HCC-1954 e MDA-MB-231, as células se acumularam nas placas de cultura 3D um pouco mais do que nas placas de cultura 2D e, embora os esferóides formados, eram mais soltos do que aqueles produzidos pelas outras 3 células linhas (Fig. 1).

Figura 1

Efeito de drogas quimioterápicas no crescimento celular de linhas celulares de câncer de mama cultivadas em 2D e 3D. Seis linhas de células de câncer de mama foram semeadas no dia 0 e cultivadas em condições 2D ou 3D até o dia 6 (coluna da esquerda). Imagens de campo claro de cada linha celular foram capturadas no dia 6 (coluna da direita). Cada linha celular foi tratada com ou sem PTX, ADR ou 5FU do dia 3 ao dia 6. O número de células viáveis ​​presentes no dia 6 é mostrado em relação ao das células de controle sem droga. As linhas tracejadas representam a cultura 2D e as linhas sólidas representam a cultura 3D. Cada ponto de dados representa o valor médio e o desvio padrão de 6 poços replicados. As barras de escala indicam 100 μm.

Sensibilidade a drogas em cultura 2D e 3D

A taxa de crescimento relativa das 6 linhas de células de câncer de mama na presença ou ausência dos 3 agentes quimioterápicos (PTX, ADR e 5FU) em cultura de células 2D ou 3D é mostrada na Fig. 1. A faixa de concentrações de drogas utilizadas foi definido com base em dados de farmacocinética clínica (0,1, 1 e 10 × a AUC Tabela I) para explorar a relevância clínica dos resultados. Para 5FU, não houve diferença clara na sensibilidade entre a cultura 2D e 3D em qualquer uma das linhas de células testadas. As 3 linhas celulares que desenvolveram 3D-MCSs densos (T-47D, BT-474 e BT-549) tenderam a mostrar resistência relativa a PTX e ADR na cultura 3D em comparação com esta resistência em 2D. Em contraste, os outros 3 que desenvolveram esferóides 3D soltos (MCF-7, HCC-1954 e MDA-MB-231) tenderam a ter sensibilidade semelhante a PTX e ADR na cultura 2D e 3D. Estas descobertas confirmam que a formação de MCSs densos em cultura 3D desempenha um papel na determinação da sensibilidade das linhas celulares a PTX e ADR.

Apoptose induzida por PTX

Para explorar o mecanismo de sensibilidade diferencial a PTX nas culturas 2D e 3D, 3 linhas celulares foram submetidas a estudos adicionais BT-549 e BT-474 como representantes de linhas celulares formando densos 3D-MCSs, e MCF-7 como um exemplo do fenótipo 3D solto. A Fig. 2A mostra que para células BT-549 e BT-474, a exposição a PTX (1 × a AUC) resultou no encolhimento celular, indicativo de apoptose quando cultivadas em cultura 2D, ainda que 3D-MCSs densos permaneceram nas culturas 3D . O mesmo tratamento PTX de células MCF-7 produziu redução significativa das células em ambas as culturas 2D e 3D (Fig. 2A). Consistente com esses achados, o tratamento de células BT-549 ou BT-474 com PTX resultou em aumentos muito menores na PARP clivada na cultura 3D do que na cultura 2D, enquanto que em MCF-7 (com MCSs soltos) o mesmo PTX o tratamento resultou em um grau semelhante de aumento na PARP clivada (Fig. 2B). Estes resultados confirmaram que a resistência relativa a PTX nas linhas celulares com MCSs densos em cultura 3D do que em cultura 2D foi em parte devido à apoptose reduzida.

Figura 2

Efeito da PTX na apoptose em linhas celulares de câncer de mama cultivadas em 2D e 3D. (A) Imagens de campo claro de cada linha celular cultivada com ou sem PTX (1 × AUC) por três dias. As barras de escala indicam 100 μm. (B) Os lisados ​​de células de câncer de mama propagadas em culturas 2D e 3D foram imunotransferidos para detectar PARP clivada, o que indica apoptose celular. Os blots foram removidos e sondados novamente para β-actina como um controle de carregamento.

Hipóxia em MCSs densos

Especula-se que a formação de MCSs densos leva à hipóxia no interior dos esferóides mimetizando tumores in vivo, e a hipóxia é conhecida por ser um dos fatores associados à resistência aos quimioterápicos (12). Portanto, avaliamos o status do oxigênio em culturas 2D e 3D, utilizando a sonda de hipóxia LOX-1, que gera sinais que são visíveis por meio de microscopia de fluorescência. Como mostrado na Fig. 3, áreas hipóxicas foram observadas dentro do denso 3D-MCSs das linhas celulares BT-549 e BT-474, mas não nos esferóides soltos formados por células MCF-7 ou células cultivadas em 2D. Esses achados sugerem que o estado de hipóxia em densos 3D-MCSs pode ser uma das causas de sua resistência aos medicamentos.

Figura 3

Status de hipóxia em 3D-MCSs. Cada linha celular foi deixada crescer em uma cultura 2D ou 3D por três dias e, em seguida, a sonda de hipóxia LOX-1 foi aplicada por 24 horas e as células foram fotografadas por microscopia de fluorescência para revelar os níveis de oxigênio. As barras de escala indicam 100 μm.

Ki-67 e expressão de caspase

Foi relatado que a hipóxia causa dormência de células cancerosas na fase G0 (13), portanto, avaliamos a seguir a coloração com o anticorpo Ki-67, que é relatado como positivo em células, exceto para aquelas na fase G0. Conforme mostrado na Fig. 4, o índice Ki-67 foi maior na cultura 2D do que na cultura 3D para todas as 3 linhas de células testadas. A diferença foi particularmente marcada para as células BT-549, que formaram densos 3D-MCSs (84,0% de células Ki-67-positivas em 2D vs. 46,5% em 3D).

Figura 4

Expressão de Ki-67 e caspases em linhas celulares de câncer de mama cultivadas em 2D e 3D. Imagens de campo claro representativas são mostradas para a coloração imunohistoquímica (marrom) para Ki-67, caspase-3 e caspase-8 em linhas de células de câncer de mama cultivadas em 2D e 3D. As barras de escala indicam 100 μm.

Em seguida, devido a um estudo sugerindo que a regulação negativa de caspase-3 e -8 em condições de hipóxia pode mediar a resistência a PTX em células de câncer de mama (14), avaliamos imunohistoquimicamente a expressão dessas proteínas em culturas 2D e 3D. Como mostrado na Fig. 4, os níveis de expressão de caspase-3 e -8 foram quase idênticos entre as culturas 2D e 3D para todas as 3 linhas celulares testadas, com exceção das células BT-474, nas quais a expressão da caspase-3 era muito mais alto na cultura 2D do que este nível na cultura 3D. Além disso, a caspase-3 foi detectada principalmente nos núcleos de células BT-474 cultivadas em 2D, indicativo de caspase-3 ativa. Esses achados nos sugeriram que a hipóxia em 3D-MCSs pode levar à dormência celular e / ou regulação negativa da caspase-3, e resultar em resistência à PTX.

O potencial da cultura primária 3D para simular o crescimento do tumor in vivo

Para explorar a relevância de uma cultura 3D para o crescimento do tumor in vivo, comparamos um tumor excisado e suas culturas primárias 2D e 3D em termos de expressão de Ki-67, caspase-3 e caspase-8. Utilizamos um tumor PDX para esse fim. Conforme mostrado na Fig. 5, a proporção de células positivas para Ki-67 nas células cultivadas primárias 2D e 3D originadas de PDX, tumor PDX fresco e tumor original do paciente foram 77,4, 57,4, 41,6 e 34,1%, respectivamente . Além disso, consistente com as células BT-474 (Fig. 4), a expressão da caspase-3 foi muito maior no tumor PDX e sua cultura primária 2D do que na cultura primária 3D, enquanto nenhuma diferença foi observada na expressão da caspase-8 entre a cultura 2D e 3D. Esses achados confirmam que uma cultura primária 3D em vez de uma cultura primária 2D pode indicar melhor a dormência do tumor in vivo e características anti-apoptóticas.

Figura 5

Expressão de Ki-67 e caspases em um PDX e suas células em cultura primária 2D e 3D. Imagens de campo claro representativas são mostradas para a coloração imunohistoquímica (marrom) para Ki-67, caspase-3 e caspase-8 em células 2D e 3D de cultura primária originadas de PDX, tumor PDX fresco e tumor original do paciente (Ki- 67 apenas). As barras de escala indicam 100 μm.

Discussão

No presente estudo, demonstramos que certas linhagens de células de câncer de mama formaram densos 3D-MCSs, e a formação de MCSs foi associada à diminuição da sensibilidade aos quimioterápicos (Fig. 1). Nossos dados também revelaram que a resistência aos medicamentos pode ser causada por hipóxia em MCSs, que foi associada a um aumento da população de células na fase G0 e / ou regulação negativa de moléculas pró-apoptóticas, como a caspase-3 (Figs. 2–4). Além disso, a dormência do tumor observada no tumor PDX in vivo foi melhor representada por sua cultura primária 3D do que sua cultura primária 2D (Fig. 5).

Linhas celulares de câncer cultivadas em 2D cultivadas em superfícies de plástico são consideradas incapazes de simular com precisão as condições do tumor in vivo (2–7). Pode, portanto, ser previsto que o desenvolvimento de drogas anticâncer com base na triagem usando linhas celulares cultivadas em 2D não é eficiente. O fato de que vários medicamentos anticâncer são eliminados durante o desenvolvimento clínico indica que a atividade anticâncer tende a ser superestimada em uma plataforma de triagem baseada em cultura 2D. Em contraste, os sistemas de cultura 3D demonstraram simular melhor o microambiente tumoral in vivo do que uma cultura 2D (3-7), vários estudos anteriores mostraram que as células cultivadas em 2D tendem a superestimar a eficácia de drogas quimioterápicas em comparação com 3D- células em cultura (15-17). Consistente com esses estudos, nosso presente estudo mostrou que as linhas celulares que produzem densos 3D-MCSs são mais resistentes a PTX e ADR em uma cultura 3D do que em 2D (Fig. 2A). Ao medir a apoptose induzida por PTX, essa tendência foi ainda mais aparente (Fig. 2B), sugerindo que a formação de 3D-MCSs pode proteger as células da morte celular. Esses achados sugerem que uma cultura 3D evita potencialmente a superestimativa da eficácia antitumoral observada em uma cultura 2D. É digno de nota que os fenômenos foram observados com as concentrações de fármaco clinicamente alcançáveis ​​calculadas com base na AUC em pacientes com câncer, que eram menores do que as concentrações máximas de fármaco (Cmax, Tabela I). Embora as concentrações do fármaco em torno de Cmax tenham sido convencionalmente empregadas para testes em experimentos in vitro, essas concentrações podem ser inadequadas, uma vez que Cmax não persiste por horas in vivo (18). Portanto, acreditamos que as drogas que matam as células em crescimento 3D em concentrações menores que Cmax devem ser avaliadas para serem ativas.

As vantagens potenciais dos sistemas de cultura 3D em relação aos sistemas de cultura 2D são que apenas o primeiro pode apresentar gradientes de oxigênio que existem em tumores in vivo. A hipóxia é conhecida por causar resistência aos medicamentos por meio de vários mecanismos. Um mecanismo convencional é o da interrupção do ciclo celular induzida por hipóxia. Sullivan et al demonstraram que a hipóxia induziu um aumento da população G0 não ciclável associada à resistência ao etoposídeo em linhagens de células de câncer de mama (13). Consistente com este resultado, uma das linhas celulares formando MCSs densos em 3D, BT-549, tinha um índice de marcação Ki-67 muito mais baixo (representando uma população G0 maior) no 3D do que nas células cultivadas em 2D. No entanto, outra linha celular que formou 3D-MCSs densos, BT-474, tinha apenas um Ki-67 ligeiramente menor em 3D do que em 2D, com uma diferença de 12,1% (Fig. 4), que era realmente menor do que em MCF -7 células que formaram apenas MCSs soltos. Isso indicou que a resistência aos medicamentos associada a 3D-MCSs densos nem sempre pode ser atribuída a um aumento da população de células G0-dormentes. Portanto, avaliamos a expressão de caspase-3 e -8, uma vez que a regulação negativa dessas duas moléculas pró-apoptóticas, juntamente com a mudança na expressão de outras seis moléculas, foram identificados como potencialmente envolvidos na proteção induzida por hipóxia contra PTX induzida apoptose por estudo anterior (14). Parcialmente consistente com este estudo, BT-474 expressou níveis mais baixos de caspase-3 na cultura 3D do que na cultura 2D. Além disso, descobrimos que a dormência do tumor e a regulação negativa da caspase-3 observada no tumor do paciente original e / ou tumor PDX foi melhor mantida nas células cultivadas primárias 3D do que nas células cultivadas primárias 2D (Fig. 5). Esses achados sugerem que a cultura 3D pode fornecer uma plataforma de triagem de drogas melhor, uma que produz resultados mais clinicamente relevantes.

Várias limitações de nosso estudo merecem menção. Em primeiro lugar, este estudo foi derivado da natureza de um modelo in vitro. Atualmente, existem vários sistemas de cultura 3D além do que usamos, mas nenhum deles é considerado um método padrão, e não está claro qual sistema é o mais clinicamente relevante (3–7). Uma observação clara é que a cultura 3D de linhas celulares nunca representará com precisão e totalmente o microambiente tumoral in vivo, porque o último tem interações com tecidos do estroma ou perfusões sanguíneas. A co-cultura com células do estroma ou cultura primária em condições 3D pode resolver parcialmente esses problemas e estão sob investigação em nosso laboratório. Modelos animais como PDXs estão sendo avaliados como uma plataforma potencial de triagem de drogas para a próxima geração (19-22), no entanto, a dificuldade no desenvolvimento e expansão do modelo PDX e seu alto custo impedirão seu uso em alto rendimento triagem. Portanto, vale a pena continuar a aprimorar os sistemas de cultura 3D como plataformas de triagem de drogas. Em segundo lugar, embora nossos resultados apoiem que a hipóxia em cultura 3D pode desempenhar um papel na resistência aos medicamentos, não provamos os mecanismos moleculares subjacentes disso no presente estudo. Além disso, não exploramos muitos outros mecanismos potenciais de resistência a drogas induzida por hipóxia, como aumento do efluxo de drogas ou autofagia, ou inibição da senescência ou dano ao DNA (12,23). Esses mecanismos de resistência aos medicamentos induzidos por hipóxia são relatados como mediados principalmente pelo fator-1α indutível por hipóxia (HIF-1α) (12,24,25). Em nosso estudo, no entanto, não fomos capazes de detectar HIF-1α com imuno-histoquímica ou western blotting, mesmo em MCSs densos (dados não mostrados).

Em conclusão, as células de câncer de mama cultivadas em 3D mostram resistência relativa aos medicamentos em comparação com as células cultivadas em 2D quando formam densos 3D-MCSs, e a resistência está associada à hipóxia. 3D-MCSs pode ser utilizado como uma plataforma de teste de drogas baseada em células in vitro.

Reconhecimentos

Agradecemos a Sra. Megumi Izumi e as equipes do Centro de Coloração Avançada de Tecidos do Hospital da Universidade de Kobe (KATS) por seu excelente suporte técnico. Este estudo foi apoiado pelo Global Centers of Excellence Program (H.M.), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (T.M.) e por um Research Grant da Takeda Science Foundation (T.M).

Referências

Hay M, Thomas DW, Rosenthal J, et al: taxas de sucesso de desenvolvimento clínico para drogas em investigação. Nat Biotechnol. 32: 40–51. 2014. Ver artigo: Google Scholar: PubMed / NCBI


Células primárias humanas: espreitando para a vida real

As células primárias humanas são isoladas diretamente dos tecidos e retêm as características morfológicas e funcionais de seu tecido de origem. Por exemplo, o tecido tumoral original de câncer colorretal preserva vários marcadores tumorais e microRNAs conhecidos. Em comparação, as linhas celulares apresentam diferenças em sua expressão (Pastor et al., 2010).

As células primárias, no entanto, não vivem para sempre. Eles passam por processos de senescência e têm potencial limitado de autorrenovação e diferenciação. À medida que envelhecem, eles mostram alterações morfológicas e funcionais, por isso você deve usá-los nas primeiras passagens. As características genéticas e a idade dos doadores também são importantes, pois suas células podem se comportar de forma diferente nas mesmas condições de cultivo. Isso pode ser uma coisa boa quando você está investigando como características celulares específicas diferem na população ou ao testar novos compostos. Por outro lado, seus testes exigem baixa variância? Em seguida, use células do mesmo doador. Uma vantagem das células primárias humanas é que você não precisa depender de modelos animais. Isso significa que você pode evitar diferenças entre as espécies - como na anatomia, vias moleculares e metabolismo - que podem afetar a toxicidade do medicamento e o modo de ação.


Metodologias Scaffold vs. Scaffold-free para a formação de esferóides

O tipo de técnica de cultura de células 3D escolhida depende do tipo de células, origem do tecido (ou seja, linha celular, célula primária), o objetivo do estudo e a necessidade de capacidades de alto rendimento. Há um grande número de ferramentas de cultura disponíveis comercialmente para a formação de esferóides 3D e podem ser separadas em técnicas baseadas em andaimes e livres de andaimes 8.

Técnicas baseadas em andaimes

A matriz extracelular (ECM) é um componente importante do microambiente celular em tecidos nativos onde as conexões de célula a matriz são essenciais para a sobrevivência, proliferação, diferenciação e migração de células. Os andaimes têm como objetivo imitar a ECM nativa e podem ser compostos por uma variedade de materiais biológicos e sintéticos com diferentes porosidades, permeabilidade, química de superfície e rigidez destinadas a mimetizar o microambiente de tecidos específicos para promover o crescimento e a migração celular 1,4. Exemplos de métodos de cultura 3D baseados em andaimes incluem placas micropadronizadas 9, esferas de microtransportadores 10 e sistemas microfluídicos mais sofisticados 4,10,11,12. Tanto a composição quanto a rigidez da matriz extracelular ao redor das células, bem como as propriedades biológicas, como compatibilidade celular ou adesividade, têm efeitos importantes na sinalização e no comportamento celular 13,14.

Estruturas biológicas como colágeno e Matrigel ™ (derivado das células de sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)) são comumente usadas para a formação de esferóides 4. Eles não apenas fornecem suporte físico para as células se anexarem e se reorganizarem em estruturas 3D, mas também podem contribuir com fatores de crescimento solúveis, hormônios e outros componentes não identificados, que podem afetar a expressão de genes e proteínas 13,14. Portanto, os pesquisadores precisam considerar essas interações de matriz ao selecionar um andaime 3D para uma aplicação específica, pois essas interações podem confundir os resultados.

Os andaimes poliméricos usam hidrogéis sintéticos ou outros materiais poliméricos biocompatíveis para gerar os suportes físicos para culturas 3D. Eles podem oferecer mais flexibilidade de design do que andaimes biológicos, modificados para ter as características ECM desejadas para o tipo de célula de interesse para estimular a agregação celular, mantendo a funcionalidade do tecido 4. Esses polímeros são biologicamente inertes, o que contorna os problemas que surgem do uso de andaimes biológicos, conforme mencionado acima. Poli (etilenoglicol) (PEG) é comumente usado para esta aplicação devido à sua não toxicidade e não imunogenicidade 4. Uma grande desvantagem dos andaimes sintéticos é que podem exigir um técnico qualificado e tempo extra para executar as tediosas etapas de fabricação 15.

Em um esforço para aumentar o rendimento, a microfabricação para formar arranjos de micropoços de hidrogel côncavos mostraram potencial para gerar esferóides multicelulares de tamanho uniforme 9. Um exemplo é uma placa micropadronizada de hidrogel à base de poli (etilenoglicol) (PEG), que permite a geração eficiente de, bem como a cultura de, corpos embrióides de tamanho uniforme usados ​​para estudos de diferenciação neural 9. No entanto, a caracterização e análise subsequentes de esferóides celulares em tais matrizes de hidrogel, bem como a produção em massa do dispositivo, apresentam desafios para pesquisadores e fabricantes.

As plataformas microfluídicas são um método mais sofisticado, o que adiciona um nível adicional de complexidade ao introduzir um aspecto de perfusão no ambiente de cultura 10,14. Comumente referidos como "órgão em um chip", esses sistemas multicanais replicam funções-chave de órgãos vivos, permitindo nutrição contínua e introdução de oxigênio, bem como remoção de resíduos, criando assim um ambiente biológico mais realista e dinâmico 8. Normalmente, os microcanais são revestidos ou preenchidos com hidrogel para capturar e fornecer um arcabouço para o crescimento celular 10,11. Esse sistema também facilita a geração de esferóides maiores e mais complexos e também permite que os esferóides sejam mantidos para estudos de longo prazo, uma vez que os parâmetros de seu microambiente podem ser rigidamente controlados 11.

Técnicas sem andaimes

Em contraste, os métodos de esferóide livre de andaime não usam biomateriais ou componentes de ECM para apoiar a fixação e migração de célula a célula. Essas técnicas promovem a adesão célula a célula (sobre célula a superfície) como o principal motivador para sua formação. Neste processo de automontagem forçada, as células secretam seus próprios componentes de ECM, que recapitula com mais precisão o na Vivo eventos que ocorrem durante a embriogênese, morfogênese e organogênese 10. Os biólogos de células tumorais comumente usam métodos sem estrutura para formar esferóides tumorais para estudar a expressão gênica ou a sensibilidade a drogas 14.

Os métodos livres de andaimes podem ser divididos em baseados em agitação e livres de agitação 11. Rotating flasks and bioreactors are a relatively simple way to form spheroids through continuous stirring of the culture medium, which keeps cells in suspension to form aggregates 1,10,15 . The main drawback is that a broad size range of spheroids is generated and the shear stress from continuous agitation is undesirable. Agitation-free methods include the use of hanging drop plates (gravity forced aggregation) 1,10,15 , low cell attachment plates 1,17 , and emerging techniques like magnetic levitation 18 , and magnetic 3D bioprinting 19 . The advantages of scaffold-free methods are that they can be applied to many different cell types and are relatively easy to execute.

Figure 2 outlines some of the most common methods, both scaffold-based and scaffold-free, for 3D spheroid formation discussed here.

Figure 2. Methods of Spheroid Formation
A. Hanging Drop Method – cells are seeded in small droplets of medium and are forced into cellular aggregates due to gravity.
B. Low cell attachment plates – surfaces are modified to promote cellular aggregation into spheroids rather than cell adhesion to cultureware surface.
C. Spinner flasks – stirred or rotating vessels prevent cell adhesion to flasks through continued agitation promoting spheroids formation in suspension.
D. Matrices – cells are seeded into natural or synthetic matrices and scaffolds allowing spheroids to form on these frameworks.
E. Microcarrier beads – cells adhere to and proliferate on the surface of natural or synthetic solid beads coated with matrices that allow cells to adhere and proliferate to form spheroids.
F. Micropatterned plates – plates are etched with matrices promoting spheroid formation in these areas.
G. Magnetic levitation – cells are magnetized using nanoparticles and incubated under magnetic forces, which causes the cells to be suspended within the culture to form spheroids.
H. Magnetic bioprinting – magnetized areas are printed onto the bottom of cultureware using magnetic forces. This method can be used to assemble cells in different 3D patterns, such as cylindrical or honeycomb.
I. Microfluidics – cell spheroids situated in microchannels in a perfusion system allowing for flow of nutrients and oxygen to the cells and waste to be removed simulating vasculature found in organ systems.


Afiliações

Division of Hematology, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Yuan-Hung Lo, Kasper Karlsson & Calvin J. Kuo

Division of Oncology, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

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Autor correspondente


How cancer cells fuel their growth

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Cancer cells are notorious for their ability to divide uncontrollably and generate hordes of new tumor cells. Most of the fuel consumed by these rapidly proliferating cells is glucose, a type of sugar.

Scientists had believed that most of the cell mass that makes up new cells, including cancer cells, comes from that glucose. However, MIT biologists have now found, to their surprise, that the largest source for new cell material is amino acids, which cells consume in much smaller quantities.

The findings offer a new way to look at cancer cell metabolism, a field of research that scientists hope will yield new drugs that cut off cancer cells’ ability to grow and divide.

“If you want to successfully target cancer metabolism, you need to understand something about how different pathways are being used to actually make mass,” says Matthew Vander Heiden, the Eisen and Chang Career Development Professor and an associate professor in the Department of Biology, and a member of MIT’s Koch Institute for Integrative Cancer Research.

Vander Heiden is the senior author of the study, which appears in the journal Developmental Célula on March 7. The paper’s lead author is MIT graduate student Aaron Hosios.

Since the 1920s, scientists have known that cancer cells generate energy differently than normal cells, a phenomenon dubbed the “Warburg effect” after its discoverer, German biochemist Otto Warburg. Human cells normally use glucose as an energy source, breaking it down through a series of complex chemical reactions that requires oxygen. Warburg discovered that tumor cells switch to a less efficient metabolic strategy known as fermentation, which does not require oxygen and produces much less energy.

More recently, scientists have theorized that cancer cells use this alternative pathway to create building blocks for new cells. However, one strike against this hypothesis is that much of the glucose is converted into lactate, a waste product that is not useful to cells. Furthermore, there has been very little research on exactly what goes into the composition of new cancer cells or any kind of rapidly dividing mammalian cells.

“Because mammals eat such a diversity of foods, it seemed like an unanswered question about which foods contribute to what parts of mass,” Vander Heiden says.

To determine where cells, including those in tumors, were getting the building blocks they needed, the researchers grew several different types of cancer cells and normal cells in culture dishes. They fed the cells different nutrients labeled with variant forms of carbon and nitrogen, allowing them to track where the original molecules ended up. They also weighed the cells before and after they divided, enabling them to calculate the percentage of cell mass contributed by each of the available nutrients.

Although cells consume glucose and the amino acid glutamine at very high rates, the researchers found that those two molecules contribute little to the mass of new cells — glucose accounts for 10 to 15 percent of the carbon found in the cells, while glutamine contributes about 10 percent of the carbon. Instead, the largest contributors to cell mass were amino acids, which make up proteins. As a group, amino acids (excluding glutamine) contribute the majority of the carbon atoms found in new cells and 20 to 40 percent of the total mass.

“These experiments reveal important details that reinforce our fundamental understanding of the metabolic underpinnings of molecular biosynthesis and cellular proliferation,” says Jared Rutter, a professor of biochemistry at the University of Utah who was not involved in the research. “The MIT team has performed a rigorous and quantitative assessment of the contributions of glucose, glutamine, and other molecules to the mass of proliferating mammalian cells in culture.”

Although initially surprising, the findings make sense, Vander Heiden says, because cells are made mostly of protein.

“There’s some economy in utilizing the simpler, more direct route to build what you’re made out of,” he says. “If you want to build a house out of bricks, it’s easier if you have a pile of bricks around and use those bricks than to start with mud and make new bricks.”

Refocusing the question

It remains something of a mystery why proliferating human cells consume so much glucose. Consistent with previous studies, the researchers found that most of the glucose burned by these cells is excreted as lactate.

“This led us to conclude that the importance of high glucose consumption is not necessarily the manipulation of carbon that allows you to make cell mass, but more for the other products that it provides, such as energy,” Hosios says.

Vander Heiden’s lab is now pursuing a more comprehensive understanding of how the Warburg effect may help cells reproduce. “It refocuses the question,” he says. “It isn’t necessarily about how the Warburg effect helps cells put glucose into cell mass, but more about why does glucose-to-lactate conversion help cells use amino acids to build more cells.”

Other authors of the paper include Vivian Hecht, a former MIT graduate student Laura Danai, a Koch Institute postdoc Scott Manalis, the Andrew (1956) and Erna Viterbi Professor in the MIT departments of Biological Engineering and Mechanical Engineering and a member of the Koch Institute Jeffrey Rathmell, a professor at Vanderbilt University School of Medicine Marc Johnson, a Vanderbilt University postdoc and Matthew Steinhauser, an assistant professor of medicine at Harvard Medical School and Brigham and Women’s Hospital.

The research was funded by the National Institutes of Health, the Burroughs Wellcome Fund, and the Damon Runyon Cancer Research Foundation.


New Research Results Explain How Dormant Tumor Cells Become Active in Later Years

Scientists using a three-dimensional cell culture system have identified a mechanism by which dormant, metastatic tumor cells can begin growing again after long periods of inactivity. The new findings indicate that the switch from dormancy to proliferative, metastatic growth may be regulated, in part, through signaling from the surrounding microenvironment, which leads to changes in the skeletal architecture of dormant tumor cells. Targeting this mechanism may also provide strategies for inhibiting the switch from dormancy to proliferation. The results of this study by National Cancer Institute (NCI) scientists and their collaborators, appears in the August 1, 2008, issue of Cancer Research. NCI is part of the National Institutes of Health.

The recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and follow-up therapy. According to NCI’s Jeffrey E. Green, M.D., one of the lead researchers of this study, "Recent evidence suggests that, in many cases, tumor cells have already seeded metastatic sites even when the primary tumor is diagnosed at an early stage." Approximately 30 percent of breast cancer patients diagnosed with early-stage disease have been found to have breast cancer cells in their bone marrow. However, these cells seem to exist primarily as micrometastases that do not manifest themselves clinically in any way.

Although many of these disseminated tumor cells may not survive for extended periods of time, a subset of them may represent dormant but viable cells that could begin to proliferate years later. These dormant cells can be resistant to conventional therapies, such as chemotherapy, that target actively dividing cells such cells could account for disease recurrence after apparently successful treatment of primary tumors.

It has been proposed that tumor cells can switch from a dormant state to become active micrometastases, but the size of the resulting tumors may be limited by the availability of an adequate blood supply, which is needed to provide oxygen and nutrients for cell growth. Discerning the mechanisms that either maintain prolonged cellular dormancy or activate dormant tumor cells to a proliferative stage has been a goal of scientists for many years. The development of therapeutic approaches to eliminate these inactive micrometastatic tumor cells has been hampered by the absence of models in living systems that mimic cellular dormancy and the emergence of clinical metastatic disease.

The tumor microenvironment has been increasingly recognized as a critical regulator of cancer progression. The extracellular matrix (ECM), a key component of the microenvironment, is in immediate contact with tumor cells. The ECM significantly affects tumor biology and progression by providing factors for cell growth and survival and for stimulating the growth of new blood vessels to feed the tumor. Also, cell adhesion to the ECM triggers signaling pathways that can regulate various phases of cell growth. Thus, interactions between tumor cells and the ECM are critical modulators of the metastatic potential of tumor cells.

In this study, NCI investigator Dalit Barkan, Ph.D., and colleagues characterized a novel application of a three-dimensional culture system in which the growth of several different types of tumor cells in the ECM correlated with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at metastatic, secondary sites in a living system. A three-dimensional system can be used to culture a variety of different cells and tissues in the laboratory for prolonged periods of time. The results revealed that a stage of prolonged tumor cell inactivity, presumably preceding a later stage that is dependent on blood vessel formation for metastatic growth, exists due to a brake being applied to the cell division cycle, which is the regulated series of steps that a cell goes through when it replicates. The researchers were also able to demonstrate that the switch from inactive to proliferative, metastatic growth is strongly influenced by interactions with the ECM.

"We hope that, with additional studies, we can begin to discover new ways to therapeutically keep the dormant-to-active switch in the ‘off’ position, thus limiting the chance that micrometastases become active in later life," said Green.

For more information on Dr. Green’s research, please go to http://ccr.cancer.gov/staff/staff.asp?profileid=13662.

For more information about cancer, please visit the NCI website at http://www.cancer.gov, or call NCI’s Cancer Information Service at 1-800-4-CANCER (1-800-422-6237).

Sobre o National Institutes of Health (NIH): NIH, a agência de pesquisa médica do país, inclui 27 institutos e centros e é um componente do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA. O NIH é a principal agência federal que conduz e apóia pesquisas médicas básicas, clínicas e translacionais, e está investigando as causas, tratamentos e curas para doenças comuns e raras. Para obter mais informações sobre o NIH e seus programas, visite www.nih.gov.

NIH e hellipTurning Discovery Into Health ®

Referência

Barkan D, Kleinman H, Simmons JL, Asmussen H, Kamaraju AK, Hoenorhoff MJ, Liu Z, Costes SV, Cho EH, Lockett S, Khanna C, Chambers AF, Green JE. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Research. August 1, 2008.


Enzyme Immunoassay

Enzyme immunoassays (EIAs) rely on the ability of antibodies to detect and attach to specific biomolecules called antigens. The detecting antibody attaches to the target antigen with a high degree of specificity in what might be a complex mixture of biomolecules. Also included in this type of assay is a colorless enzyme attached to the detecting antibody. The enzyme acts as a tag on the detecting antibody and can interact with a colorless substrate, leading to the production of a colored end product. EIAs often rely on layers of antibodies to capture and react with antigens, all of which are attached to a membrane filter (see Figure (PageIndex<8>)). EIAs for viral antigens are often used as preliminary screening tests. If the results are positive, further confirmation will require tests with even greater sensitivity, such as a western blot or an NAAT. EIAs are discussed in more detail in EIAs and ELISAs.

Figure (PageIndex<8>): Similar to rapid, over-the-counter pregnancy tests, EIAs for viral antigens require a few drops of diluted patient serum or plasma applied to a membrane filter. The membrane filter has been previously modified and embedded with antibody to viral antigen and internal controls. Antibody conjugate is added to the filter, with the targeted antibody attached to the antigen (in the case of a positive test). Excess conjugate is washed off the filter. Substrate is added to activate the enzyme-mediated reaction to reveal the color change of a positive test. (credit: modification of work by &ldquoCavitri&rdquo/Wikimedia Commons)

What typically indicates a positive EIA test?

Along with the RT/PCR analysis, David&rsquos saliva was also collected for viral cultivation. In general, no single diagnostic test is sufficient for antemortem diagnosis, since the results will depend on the sensitivity of the assay, the quantity of virions present at the time of testing, and the timing of the assay, since release of virions in the saliva can vary. As it turns out, the result was negative for viral cultivation from the saliva. This is not surprising to David&rsquos doctor, because one negative result is not an absolute indication of the absence of infection. It may be that the number of virions in the saliva is low at the time of sampling. It is not unusual to repeat the test at intervals to enhance the chance of detecting higher virus loads.

Should David&rsquos doctor modify his course of treatment based on these test results?


The Development of Cancer

One of the fundamental features of cancer is tumor clonality, the development of tumors from single cells that begin to proliferate abnormally. The single-cell origin of many tumors has been demonstrated by analysis of X chromosome inactivation (Figure 15.2). As discussed in Chapter 8, one member of the X chromosome pair is inactivated by being converted to heterochromatin in female cells. X inactivation occurs randomly during embryonic development, so one X chromosome is inactivated in some cells, while the other X chromosome is inactivated in other cells. Thus, if a female is heterozygous for an X chromosome gene, different alleles will be expressed in different cells. Normal tissues are composed of mixtures of cells with different inactive X chromosomes, so expression of both alleles is detected in normal tissues of heterozygous females. In contrast, tumor tissues generally express only one allele of a heterozygous X chromosome gene. The implication is that all of the cells constituting such a tumor were derived from a single cell of origin, in which the pattern of X inactivation was fixed before the tumor began to develop.

Figure 15.2

Tumor clonality. Normal tissue is a mosaic of cells in which different X chromosomes (X1 and X2) have been inactivated. Tumors develop from a single initially altered cell, so each tumor cell displays the same pattern of X inactivation (X1 inactive, X (more. )

The clonal origin of tumors does not, however, imply that the original progenitor cell that gives rise to a tumor has initially acquired all of the characteristics of a cancer cell. On the contrary, the development of cancer is a multistep process in which cells gradually become malignant through a progressive series of alterations. One indication of the multistep development of cancer is that most cancers develop late in life. The incidence of colon cancer, for example, increases more than tenfold between the ages of 30 and 50, and another tenfold between 50 and 70 (Figure 15.3). Such a dramatic increase of cancer incidence with age suggests that most cancers develop as a consequence of multiple abnormalities, which accumulate over periods of many years.

Figure 15.3

Increased rate of colon cancer with age. Annual death rates from colon cancer in the United States. (Data from J. Cairns, 1978. Cancer: Science and Society, New York: W. H. Freeman.)

At the cellular level, the development of cancer is viewed as a multistep process involving mutation and selection for cells with progressively increasing capacity for proliferation, survival, invasion, and metastasis (Figure 15.4). The first step in the process, tumor initiation, is thought to be the result of a genetic alteration leading to abnormal proliferation of a single cell. Cell proliferation then leads to the outgrowth of a population of clonally derived tumor cells. Tumor progression continues as additional mutations occur within cells of the tumor population. Some of these mutations confer a selective advantage to the cell, such as more rapid growth, and the descendants of a cell bearing such a mutation will consequently become dominant within the tumor population. The process is called clonal selection, since a new clone of tumor cells has evolved on the basis of its increased growth rate or other properties (such as survival, invasion, or metastasis) that confer a selective advantage. Clonal selection continues throughout tumor development, so tumors continuously become more rapid-growing and increasingly malignant.

Figure 15.4

Stages of tumor development. The development of cancer initiates when a single mutated cell begins to proliferate abnormally. Additional mutations followed by selection for more rapidly growing cells within the population then result in progression of (more. )

Studies of colon carcinomas have provided a clear example of tumor progression during the development of a common human malignancy (Figure 15.5). The earliest stage in tumor development is increased proliferation of colon epithelial cells. One of the cells within this proliferative cell population is then thought to give rise to a small benign neoplasm (an adenoma or polyp). Further rounds of clonal selection lead to the growth of adenomas of increasing size and proliferative potential. Malignant carcinomas then arise from the benign adenomas, indicated by invasion of the tumor cells through the basal lamina into underlying connective tissue. The cancer cells then continue to proliferate and spread through the connective tissues of the colon wall. Eventually the cancer cells penetrate the wall of the colon and invade other abdominal organs, such as the bladder or small intestine. In addition, the cancer cells invade blood and lymphatic vessels, allowing them to metastasize throughout the body.

Figure 15.5

Development of colon carcinomas. A single initially altered cell gives rise to a proliferative cell population, which progresses first to benign adenomas of increasing size and then to malignant carcinoma. The cancer cells invade the underlying connective (more. )


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