Em formação

O B27 é necessário para cultivar células-tronco neurais?


Já vi muitos artigos usando B27 (por exemplo, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24694094/ & https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167488919300242), mas é muito caro e eu queria saber se é realmente necessário cultivar células-tronco neurais? De forma mais geral, qual é o meio mais simples que ainda é usado para esse propósito?


Geração de células-tronco neurais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas

As células-tronco neurais (NSCs) são definidas por três critérios necessários, mas não suficientes: (1) auto-renovável, (2) capacidade de gerar um grande número de descendentes e (3) capacidade de se diferenciar no sistema nervoso central principal (SNC ) tipos de células, neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. Existem várias abordagens para derivar linhagens neurais de células-tronco pluripotentes. É bem conhecido que o método escolhido de derivação de NSC é fundamental para responder à questão da biologia básica sob investigação, para a taxa de sucesso na descoberta de drogas e para a eficácia das células terapêuticas destinadas a reparar o SNC. Existem três atributos críticos dos NSCs: (1) composição celular bem definida e estável, (2) processo consistente de perpetuação que evita o desvio na composição e (3) fenótipo estável ou atividade terapêutica dos NSCs ou sua progênie diferenciada. Nas últimas décadas, temos desenvolvido continuamente processos consistentes para gerar NSCs estáveis ​​e auto-renováveis ​​multipotentes de várias fontes. Neste capítulo, relatamos um método para gerar NSCs a partir de células-tronco pluripotentes induzidas.

Palavras-chave: Células-tronco neurais multipotentes iPSCs de auto-renovação.


Célula-tronco neural

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Célula-tronco neural, célula amplamente indiferenciada com origem no sistema nervoso central. As células-tronco neurais (NSCs) têm o potencial de dar origem a células descendentes que crescem e se diferenciam em neurônios e células gliais (células não neuronais que isolam os neurônios e aumentam a velocidade com que os neurônios enviam sinais).

Durante anos, pensou-se que o cérebro era um sistema fechado e fixo. Até o renomado neuroanatomista espanhol Santiago Ramón y Cajal, que ganhou o Prêmio Nobel de Fisiologia em 1906 por estabelecer o neurônio como a célula fundamental do cérebro, desconhecia os mecanismos da neurogênese (a formação do tecido nervoso) durante sua carreira notável. . Houve apenas um punhado de descobertas, principalmente em ratos, pássaros e primatas, na segunda metade do século 20, que sugeriram a capacidade regenerativa das células cerebrais. Durante esse tempo, os cientistas presumiram que, uma vez que o cérebro foi danificado ou começou a se deteriorar, ele não poderia regenerar novas células da maneira que outros tipos de células, como células do fígado e da pele, são capazes de se regenerar. A geração de novas células cerebrais no cérebro adulto era considerada impossível, uma vez que uma nova célula nunca poderia se integrar totalmente ao complexo sistema existente do cérebro. Foi só em 1998 que os NSCs foram descobertos em humanos, encontrados primeiro em uma região do cérebro chamada hipocampo, que era conhecida por ser fundamental na formação de memórias. Posteriormente, as NSCs também foram encontradas ativas nos bulbos olfativos (uma área que processa o cheiro) e dormentes e inativas no septo (uma área que processa as emoções), no estriado (uma área que processa o movimento) e na medula espinhal.

Hoje, os cientistas estão investigando produtos farmacêuticos que podem ativar NSCs dormentes caso as áreas onde os neurônios estão localizados sejam danificadas. Outros caminhos de pesquisa buscam descobrir maneiras de transplantar NSCs em áreas danificadas e persuadi-los a migrar através das áreas danificadas. Ainda outros pesquisadores de células-tronco buscam obter células-tronco de outras fontes (ou seja, embriões) e influenciar essas células a se desenvolverem em neurônios ou células gliais. As mais polêmicas dessas células-tronco são as obtidas de embriões humanos, que devem ser destruídas para a obtenção das células. Os cientistas foram capazes de criar células-tronco pluripotentes induzidas por meio da reprogramação de células somáticas adultas (células do corpo, excluindo espermatozoides e óvulos) por meio da introdução de certos genes reguladores. No entanto, a geração de células reprogramadas requer o uso de um retrovírus e, portanto, essas células têm o potencial de introduzir vírus nocivos causadores de câncer nos pacientes. As células-tronco embrionárias (ESCs) possuem um potencial incrível, uma vez que são capazes de se transformar em qualquer tipo de célula encontrada no corpo humano, mas mais pesquisas são necessárias para desenvolver melhores métodos de isolamento e geração de ESCs.

A recuperação do derrame é uma área de pesquisa em que muito se descobriu sobre a promessa e as complexidades da terapia com células-tronco. Duas abordagens principais podem ser adotadas para a terapia com células-tronco: a abordagem endógena ou a abordagem exógena. A abordagem endógena depende da estimulação de NSCs adultos dentro do próprio corpo do paciente. Essas células-tronco são encontradas em duas zonas do giro denteado (parte do hipocampo) no cérebro, bem como no estriado (parte dos gânglios da base localizados nas profundezas dos hemisférios cerebrais), o neocórtex (a espessura externa do córtex cerebral altamente convoluto) e a medula espinhal. Em modelos de ratos, fatores de crescimento (substâncias mediadoras de crescimento celular), como fator de crescimento de fibroblastos-2, fator de crescimento endotelial vascular, fator neurotrófico derivado do cérebro e eritropoietina, foram administrados após acidentes vasculares cerebrais em um esforço para induzir ou aumentar a neurogênese, assim, evitando danos cerebrais e estimulando a recuperação funcional. O fator de crescimento mais promissor nos modelos de ratos foi a eritropoietina, que promove a proliferação de células progenitoras neurais e mostrou induzir neurogênese e melhora funcional após acidente vascular cerebral embólico em ratos. Isso foi seguido por ensaios clínicos nos quais a eritropoietina foi administrada a uma pequena amostra de pacientes com AVC, que eventualmente mostraram melhorias dramáticas em relação aos indivíduos do grupo de placebo. A eritropoietina também se mostrou promissora em pacientes com esquizofrenia e em pacientes com esclerose múltipla. No entanto, mais estudos precisam ser realizados em grupos maiores de pacientes para confirmar a eficácia da eritropoietina.

As terapias com células-tronco exógenas dependem da extração, cultivo in vitro e subsequente transplante de células-tronco nas regiões do cérebro afetadas pelo derrame. Estudos mostraram que NSCs adultos podem ser obtidos a partir do giro denteado, hipocampo, córtex cerebral e substância branca subcortical (camada abaixo do córtex cerebral). Estudos reais de transplante foram realizados em ratos com lesão da medula espinhal usando células-tronco biopsiadas da zona subventricular (área subjacente às paredes das cavidades cerebrais cheias de líquido, ou ventrículos) do cérebro adulto. Felizmente, não houve déficits funcionais como resultado da biópsia. Também houve estudos em ratos nos quais CTEs ou células-tronco neurais derivadas de fetais e células progenitoras (células indiferenciadas semelhantes às células-tronco, mas com capacidades de diferenciação mais estreitas) foram transplantadas para regiões do cérebro danificadas por acidente vascular cerebral. Nesses estudos, os NSCs enxertados se diferenciaram com sucesso em neurônios e células gliais, e houve alguma recuperação funcional. A principal ressalva, no entanto, com as terapias exógenas é que os cientistas ainda precisam entender completamente os mecanismos subjacentes de diferenciação das células progenitoras e sua integração nas redes neuronais existentes. Além disso, os cientistas e médicos ainda não sabem como controlar a proliferação, migração, diferenciação e sobrevivência dos NSCs e sua progênie. Isso se deve ao fato de as NSCs serem parcialmente reguladas pelo microambiente especializado, ou nicho, em que residem.

Também houve pesquisas sobre células-tronco hematopoéticas (HSCs), que geralmente se diferenciam em células sanguíneas, mas também podem ser transdiferenciadas em linhagens neurais. Esses HSCs podem ser encontrados na medula óssea, sangue do cordão umbilical e células do sangue periférico. Curiosamente, constatou-se que essas células são espontaneamente mobilizadas por certos tipos de acidentes vasculares cerebrais e também podem ser posteriormente mobilizadas pelo fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF). Estudos de G-CSF em ratos mostraram que ele pode levar à melhora funcional após acidente vascular cerebral, e os ensaios clínicos em humanos parecem promissores. Estudos exógenos também foram realizados em ratos com HSCs. Os HSCs foram administrados localmente no local do dano em alguns estudos ou administrados sistemicamente por meio de transplante intravenoso em outros estudos. O último procedimento é simplesmente mais viável, e os HSCs mais eficazes parecem ser aqueles derivados do sangue periférico.

A pesquisa que tem sido feita em terapias com células-tronco para epilepsia e doença de Parkinson também demonstra a promessa e a dificuldade de cultivar células-tronco adequadamente e introduzi-las em um sistema vivo. Com relação às ESCs, estudos mostraram que elas são capazes de ser diferenciadas em neurônios dopaminérgicos (neurônios que transmitem ou são ativados pela dopamina), neurônios motores espinhais e oligodendrócitos (células não neuronais associadas à formação de mielina). Em estudos voltados para o tratamento da epilepsia, precursores neurais derivados de células-tronco embrionárias (ESNs) de camundongo foram transplantados para o hipocampo de ratos com epilepsia crônica e ratos controle. Após o transplante, não foram encontradas diferenças nas propriedades funcionais dos ESNs, pois todos exibiam as propriedades sinápticas características dos neurônios. No entanto, ainda não se sabe se os ESNs têm a capacidade de sobreviver por períodos prolongados no hipocampo epiléptico, de se diferenciar em neurônios com as funções hipocampais adequadas e de suprimir os déficits de aprendizagem e memória na epilepsia crônica. Por outro lado, já foi observado que as NSCs sobrevivem e se diferenciam em diferentes formas funcionais de neurônios em ratos. No entanto, não está claro se os NSCs podem se diferenciar nas diferentes formas funcionais em quantidades apropriadas e se eles podem fazer sinapses adequadas com neurônios hiperexcitáveis ​​para inibi-los, reduzindo assim as convulsões.

Os tratamentos para a doença de Parkinson também se mostram promissores e enfrentam obstáculos semelhantes. A pesquisa clínica foi realizada sobre o transplante de tecido mesencefálico fetal humano (tecido derivado do mesencéfalo, que faz parte do tronco cerebral) no estriado de pacientes com Parkinson. No entanto, esse tecido é de disponibilidade limitada, o que torna o transplante de ESC mais atraente. Na verdade, a pesquisa já mostrou que os neurônios dopaminérgicos transplantáveis ​​- o tipo de neurônios afetados na doença de Parkinson - podem ser gerados a partir de ESCs de camundongos, primatas e humanos. A única diferença principal entre os ESCs de camundongos e humanos, entretanto, é que os ESCs humanos demoram muito mais para se diferenciar (até 50 dias). Além disso, os programas de diferenciação para ESCs humanos requerem a introdução de soro animal para se propagar, o que pode violar certos regulamentos médicos, dependendo do país. Os pesquisadores também precisarão descobrir uma maneira de fazer com que as células progenitoras dopaminérgicas derivadas de ESC sobrevivam por um longo período de tempo após o transplante. Finalmente, há a questão da pureza das populações de células derivadas de ESC. Todas as células devem ser certificadas como células precursoras dopaminérgicas antes que possam ser transplantadas com segurança. No entanto, as técnicas de diferenciação e purificação estão melhorando a cada estudo. De fato, a geração de grandes bancos de populações de células puras e específicas para transplante humano continua sendo uma meta alcançável.


Discussão

O transplante de NSCs oferece possibilidades empolgantes para a regeneração do SNC, mas é um desafio guiar a diferenciação de NSCs em tipos específicos de células. Os biomarcadores são comumente usados ​​para examinar a diferenciação em relação a destinos celulares distintos, baseando-se nas características das células durante o processo de neurogênese 71. Apesar de uma variedade de estudos sobre os fatores que regulam o destino dos NSCs, o processo de neurogênese ainda precisa ser totalmente elucidado, especialmente as mudanças celulares no estágio inicial de diferenciação em neurônios 72,73, portanto, é difícil identificar a direção da diferenciação no início do processo. Um processo de identificação deve ser generalizável para apoiar o desenvolvimento avançado de agentes eficientes para doenças neurodegenerativas e lesões neurológicas: ele precisa ser aplicado a qualquer substância eficaz, independente de quais sejam suas vias. A instrumentação avançada facilita a coleta de dados, mas um dos obstáculos mais desafiadores é que os dados muitas vezes não podem ser interpretados dentro das limitações dos dispositivos atuais. As abordagens existentes são baseadas principalmente na cognição humana, mas diferenciar mudanças morfológicas celulares sutis ou prever interações medicamentosas é um desafio para os seres humanos 74,75,76. O aprendizado profundo permite a extração automática de recursos utilizando vastos conjuntos de dados para oferecer soluções para problemas complexos, incluindo aqueles encontrados no campo biomédico 77,78. Assim, decidimos aproveitar ao máximo as abundantes imagens de uma única célula usando o aprendizado profundo para identificar prospectivamente a diferenciação de NSCs.

Em primeiro lugar, concebemos e estruturamos de forma inovadora um conjunto de dados de diferenciação NSC marcado com muita precisão, garantindo a eficácia do treinamento do modelo. O sistema de identificação de destino do NSC foi construído com base nos dados experimentais confirmados e é fundamental para extrair com sucesso as informações características de cada tipo de célula. Uma elegante estrutura da CNN produziu um modelo altamente eficiente e fortemente generalizável. Em seguida, testamos o desempenho de nosso sistema e os resultados sugeriram que nosso modelo poderia estimar a proporção do tipo de célula diferenciada final nos estágios iniciais de diferenciação, antes que as técnicas laboratoriais comuns pudessem detectar as alterações correspondentes.

Ao coletar as imagens das células, a repetibilidade dos experimentos é importante para a aplicação posterior do modelo, portanto, o status da célula para os dados de treinamento é importante. As habilidades de proliferação e diferenciação de NSCs de cultura prolongada de passagens tardias têm diferenças com as passagens iniciais, e as células p0 – p2 da cultura primária podem não ser capazes de formar uma quantidade suficiente de neuroesferas com status estável para coletar dados de alto rendimento, portanto, as pesquisas geralmente levam NSCs de p3 a p9 79,80,81,82,83,84. Conduzimos experimentos para avaliar o estado de p3 – p5 NSCs, os resultados mostram forte expressão de marcadores específicos Nestina e PAX6 em todos os grupos (Suplementar Fig. 2a), indicando certa capacidade de proliferação. Os resultados de imunocoloração de medição da razão de diferenciação de p3 – p5 NSCs demonstraram a capacidade de diferenciação consistente (Suplementar Fig. 2b, c), indicando que NSCs em p3 – p5 são adequados para a coleta de dados de construção de modelo. Em relação aos nossos dados de treinamento, RA induz NSCs a se diferenciarem em neurônios pela ligação a receptores RA (RARs) 85, enquanto a combinação de hormônio tireoidiano (T3) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) promove a diferenciação de oligodendrócitos por meio do Wnt / β via de sinalização de -catenina 86, CNTF, com altas concentrações atuando através da via de sinalização JAK-STAT para diferenciar células em astrócitos 87. Além disso, compilamos dados de teste independentes sobre a diferenciação de NSC usando uma variedade de indutores neuronais direcionados a diferentes receptores (Fig. 1c). Primeiro, usamos várias neurotrofinas, incluindo NGF, BDNF, NT4 e NT3, para regular a diferenciação de NSC em neurônios. Neurotrofinas são fatores de crescimento de peptídeos implicados na diferenciação neuronal, eles se ligam a seus receptores tirosina quinases (Trks), que estão localizados na membrana plasmática de células responsivas. NGF liga-se preferencialmente a TrkA, BDNF e NT4 ligam-se preferencialmente a TrkB e o NT3 atua em TrkC 88,89. Em seguida, o CNTF de baixa concentração foi usado como outro indutor neuronal. Este indutor, que pertence à superfamília de citocinas hematopoiéticas, atua ligando-se ao receptor α do CNTF (CNTFRα) e gp130, em última análise, recrutando o receptor do fator inibidor de leucemia β (LIFRβ) e ativando as vias da proteína quinase ativada por mitogênio 87,90. Posteriormente, a MT foi utilizada para facilitar a diferenciação neuronal mediada pela ativação dos receptores MT 1 e 2 (MT1 e MT2) 91. Além disso, estudos recentes sobre o impacto das nanopartículas no destino do NSC foram levados em consideração 92,93. Foi demonstrado que o LDH auxilia o NT3 na regulação do destino das células-tronco 94,95 para determinar a validade geral do nosso sistema, nós o testamos com o LDH-NT3 como um tipo não convencional de indutor com um mecanismo não esclarecido.

Além disso, realizamos um estudo para minimizar a duração do tratamento do indutor a fim de melhorar a eficiência do treinamento e aplicação do modelo. Nesse estudo, diferentes momentos foram cuidadosamente selecionados para a coleta de células. A pesquisa indica que quando o aprendizado de máquina determina muito cedo se as células-tronco embrionárias se diferenciam ou não, seus julgamentos podem ser baseados em variações no nível da célula em processos biológicos 46, sugerindo que o processo fisiológico de diferenciação de NSC é o fator crítico que precisa ser considerado quando definir os pontos de tempo. Anteriormente, estudos mostram que leva tempo de diferenciação diferente quando NSCs se encobrem em cada linhagem, em torno de 7 dias para neurônios 60, 3 dias para astrócitos 61 e 5 dias para oligodendrócitos 62, respectivamente. Nesses momentos, as células começam a aparecer com sua expressão de marcadores específicos e propriedades funcionais. Nossa maior preocupação é identificar o destino do NSC no estágio inicial de diferenciação e determinar as ações dos indutores, portanto, pontos de tempo mais curtos são definidos para estabelecer o modelo previsível. Testamos os níveis de expressão gênica para observar as mudanças nos NSCs sob a ação de diferentes indutores para projetar procedimentos de coleta de dados adicionais para a construção do modelo. Como os resultados mostram na Fig. Suplementar 4, para células em diferenciação neuronal, o nível de expressão de NeuN em primeiro lugar mostrou um aumento significativo em 1 dia, entre 3 dias e 1 dia há uma diferença observável e em 5 dias também parece uma diferença significativa aumentar, embora não haja mudanças significativas em pontos de tempo anteriores de 0, 2, 4, 8 e 12 h, portanto, 1 dia foi definido como o ponto de tempo mais antigo para a detecção. Para a diferenciação astroglial e oligodendroglial, mudanças óbvias em GFAP e Olig2 apareceram em 2 dias e 3 dias, e mudanças significativas apareceram pela primeira vez em 12 he 1 dia, respectivamente.Portanto, os primeiros pontos de tempo esperados para uma previsão eficaz por nosso sistema de previsão foram definidos em 12 h para astrócitos e 1 dia para neurônios e oligodendrócitos. Os resultados mostraram que, após essas durações mínimas, nosso modelo poderia prever a direção e proporção da diferenciação das células com vários dias de antecedência, o que pode ser devido à sua sensibilidade a mudanças sutis no estado celular ou morfose organela.

Em nosso trabalho anterior, construímos uma rede neural baseada no Inception 3 que poderia analisar a distinção de células apoptóticas. No entanto, notamos que as estruturas complicadas e numerosos ramos definidos manualmente aumentaram a dificuldade de treinamento, o que pode afetar a eficiência do modelo ideal , e os resultados mostraram que seu desempenho na detecção de campo claro tinha espaço para melhorias 96. No presente estudo, usamos uma rede neural mais bem construída com base no Xception, o que reduziu a complexidade do modelo e o tornou mais conciso e claro, e essa abordagem se mostrou muito eficaz. A rede atual constrói o modelo de otimização a partir de um treinamento simples com os hiperparâmetros de parâmetros básicos de treinamento e taxa de aprendizado padrão em particular, imagens de campo claro não marcadas podem atender totalmente aos requisitos de modelagem com excelente precisão de 0,923. Os resultados dos dados de teste mistos e de vários experimentos independentes demonstraram que o mecanismo não influencia o efeito do veredicto do modelo, nem a forma do indutor (Fig. 4a e Tabelas Suplementares 1 e 2). Nosso sistema é capaz de identificar prospectivamente a direção da diferenciação de NSC em 1 dia usando imagens de células não fluorescentes, e o ROC-AUC / PR-AUC verificou sua alta robustez e precisão (Fig. 4e, f e Tabelas Suplementares 1 e 2 ) O mapeamento de ativação de classe, mostrado na Fig. 4d, sugeriu que nosso modelo pode identificar variações morfológicas muito pequenas nas estruturas celulares, portanto, ele foi capaz de classificar o destino celular discriminando diferenças entre cada tipo, que é a principal força do aprendizado de máquina. Além disso, exploramos o desempenho preditivo alcançado pelas arquiteturas CNN com várias estruturas de camadas, estratégias de ramificação, capacidades de rede e resoluções de imagens de células de entrada. Os resultados da comparação de desempenho no conjunto de teste demonstraram a superioridade das arquiteturas que nosso modelo adota.

Além das vantagens acima, nosso modelo tem potencial para expansão funcional para cobrir uma variedade de aplicações, por exemplo, prever subtipos neuronais, como neurônios motores ou neurônios dopaminérgicos, seria um desenvolvimento muito significativo. O transplante de neurônios de dopamina pode inervar o corpo estriado e melhorar a assimetria motora e é uma terapia promissora para a doença de Parkinson 97. O transplante de neurônios motores derivados de células-tronco pode promover significativamente a recuperação da função motora na esclerose lateral amiotrófica 98. O desenvolvimento de um sistema de identificação mais eficiente para populações específicas de neurônios, sem dúvida, promoverá a terapia baseada em células para doenças neurodegenerativas específicas. No momento, entretanto, existem alguns obstáculos a serem superados antes desta nova aplicação. Em primeiro lugar, a razão de diferenciação de NSCs ou células-tronco pluripotentes induzidas em uma população específica não é suficiente para reunir um conjunto de dados adequado para treinar o modelo. De acordo com um estudo relatado anteriormente, menos de 40% das células-tronco tratadas com várias citocinas podem se diferenciar em neurônios dopaminérgicos ou neurônios motores 64,99,100,101,102. Para construir um conjunto de treinamento para aprendizado de máquina, a classificação e a rotulagem corretas são necessárias. Além de isolar as subpopulações específicas, a citometria de fluxo / classificação de células deve ser usada para enriquecer as células-alvo, mas as células foram tratadas secundariamente antes da análise, o que introduz variáveis ​​não controladas e reduz a eficiência do treinamento. Enquanto isso, marcadores específicos para o perfil de subpopulação de neurônios e seleção permanecem sob investigação 60, tornando difícil marcar os dados com clareza. Outra extensão possível valiosa do modelo é explorar a heterogeneidade da região de diferenciação NSC. A heterogeneidade descreve a regionalização de nichos NSC, células progenitoras em diferentes regiões expressam diferentes genes para se tornarem diferentes subtipos de células, parece ser uma característica chave do desenvolvimento de NSC no SNC, mas como isso afeta o destino e função de NSC não é totalmente compreendido 35,103. Vale a pena considerar o isolamento de subpopulações regionais de NSC, aproveitando o modelo para identificar efetivamente a variação celular sutil durante o progresso da diferenciação e até mesmo explorar o impacto de diferentes indutores no desenvolvimento de subtipos de NSC. Algumas limitações precisam ser abordadas antes de uma exploração mais aprofundada, primeiro, para resolver camadas adicionais de heterogeneidade, protocolos otimizados são necessários para ser estabelecido para isolamento preciso e enriquecimento efetivo de subtipos regionais. 104 Além disso, a pesquisa mostra que a exploração existente de subtipos NSC heterogêneos regionais é observar as mudanças de expressão gênica usando sequenciamento de RNA de célula única, no entanto, ainda há falta de marcadores específicos reconhecidos para identificar células de diferentes regiões, incluindo a zona ventricular-subventricular. (V-SVZ) ou zona subgranular (SGZ). Além disso, estudos de rastreamento de linhagem indicam que a especificação regional é estabelecida muito cedo no desenvolvimento embrionário, mas o progresso de seu desenvolvimento ainda precisa ser mais claramente elucidado a fim de estabelecer momentos adequados para a coleta dos subtipos NSC regionais 105. Embora haja dificuldades, acreditamos que a extensão para a aplicação do modelo de base profunda vale bem a pena os esforços devido ao seu forte valor aplicado, sugerindo que nosso sistema pode ser usado não apenas na previsão do destino do NSC e na triagem dos fatores de indução neural, mas também na pesquisa na reativação e desenvolvimento do NSC.

Em resumo, fornecemos uma ferramenta avançada para a identificação do destino do NSC. Este modelo possui as principais características de alta precisão, baixa taxa de falsos positivos, velocidade, ampla aplicabilidade, operação simples e custo-benefício. Depois que os NSCs são co-cultivados por 1 dia com o indutor a ser estudado, nosso sistema pode oferecer um resultado de diferenciação preditivo com uma imagem de uma única célula. Este poderia ser um método conveniente e adequado para investigar os efeitos desconhecidos de substâncias em NSCs e prever rapidamente moléculas terapêuticas potenciais e drogas para promover a regeneração neural em doenças do SNC. Também estamos trabalhando com outras extensões e aplicações de nosso sistema, tentando desenvolver uma abordagem multifuncional para a pesquisa do NSC.


Caracterização e Análise da Multipotência de DPSCs

As DPSCs foram cultivadas em uma camada homogênea de células aderentes à placa e apresentaram morfologia fibroblástica típica e fusiforme. Os DPSCs tiveram uma alta taxa de proliferação conforme os valores de OD (450 nm) aumentaram de 0,2 no dia 1 para 1,9 no dia 9 (Figuras 1A, B). Para avaliar as propriedades semelhantes a MSCs de DPSCs, imunocitoquímica e diferenciação multilinhagem foram realizadas. A coloração por imunofluorescência indicou que DPSCs expressaram marcadores semelhantes a MSCs, como CD146 e STRO-1 (Figura 1C). A multipotência de DPSCs foi examinada por diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. A coloração com Alizarin Red e Oil Red O exibiu a deposição de nódulos mineralizados e formação de gotículas de lipídios, respectivamente. Além disso, a coloração com azul Alcian indicou que os proteoglicanos foram sintetizados durante a indução condrogênica (Figura 1D).

Figura 1. Isolamento, cultura e identificação de DPSCs. (UMA) Cultura DPSC no dia 7 (barra de escala: 500 e # x03BCm), e a primeira passagem (P1) (barra de escala: 200 e # x03BCm). (B) Proliferação de DPSCs nos dias 1, 3, 5, 7 e 9. (C) Expressão de CD146 e STRO-1 (barra de escala: 33,3 & # x03BCm). (D) Diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica de DPSCs (barra de escala: 100 & # x03BCm).

Morfologia de d-DPSCs neuronais e o efeito de diferentes meios de cultura em sua proliferação

Após diferenciação neurogênica induzida com meio Neurobasal & # x00AE-A (Thermo Fisher Scientific) contendo 2% de B27 (Thermo Fisher Scientific), 20 ng / mL de bFGF e 20 ng / mL de EGF (Thermo Fisher Scientific) por 12 dias, DPSCs mostrou morfologia celular semelhante a neurônios com um grande pericário e extensões citoplasmáticas periféricas, e expressou o marcador neuronal GFAP (Figura 2A). O efeito dos diferentes meios de cultura na proliferação de d-DPSCs foi avaliado por um ensaio de CCK-8 (Figura 2B). Os resultados indicaram que d-DPSCs cresceram lentamente nos grupos 2% B27 NM e 2% B27 + 5% FBS NM, e sua viabilidade nesses grupos foi significativamente diferente em comparação com o grupo de controle até o dia 9 e com 10% FBS & Grupo # x03B1-MEM nos dias 6 e 9. A proliferação de d-DPSCs no grupo 10% FBS & # x03B1-MEM foi significativamente diferente em comparação com o grupo controle no dia 6, mas foi semelhante à do grupo controle no dia 9. A morfologia de d-DPSCs variou nos diferentes meios de cultura, por exemplo, as células tendiam a exibir uma forma semelhante a fibroblastos no grupo FBS & # x03B1-MEM a 10% no dia 6 (Figura 2C). Além disso, a densidade celular no grupo 10% FBS & # x03B1-MEM foi semelhante à do grupo de controle, mas muito maior do que a dos grupos 2% B27 NM e 2% B27 + 5% FBS NM.

Figura 2. Diferenciação neurogênica de DPSCs e sua proliferação nos diferentes meios de comunicação. (UMA) d-DPSCs mostrou uma morfologia típica de células semelhantes a neurônios (barra de escala: 100 & # x03BCm). (B) Proliferação de d-DPSCs após cultura em diferentes meios de comunicação. (C) Morfologia de d-DPSCs cultivados em diferentes meios no dia 6 (barra de escala: 200 & # x03BCm). & # x002AP & # x003C 0,05 vs. grupo de controle # P & # x003C 0,05 vs. 10% FBS & # x03B1-MEM group & # x0026 P & # x003C 0,05 vs. grupo 2% B27 + 5% FBS NM.

Expressão de proteína e coloração de imunofluorescência de marcadores de proliferação e haste de d-DPSCs após cultura em meios diferentes

As características de proliferação e stemness de d-DPSCs nos grupos 2% B27 NM, 2% B27 + 5% FBS NM e 10% FBS & # x03B1-MEM foram verificadas por western blot e análises de coloração de imunofluorescência. Os resultados indicaram que a expressão da proteína TRPC1 foi muito maior no grupo FBS & # x03B1-MEM a 10% do que nos outros grupos experimentais e no grupo de indução neural, mas semelhante ao do grupo de controle (Figura 3). A expressão de TRPC1 não foi significativamente diferente entre os grupos de FBS & # x03B1-MEM a 10% e controle (Figura 3B). De acordo com a análise de coloração de imunofluorescência, a expressão de TRPC1 foi mantida em um nível mais alto no FBS & # x03B1-MEM a 10% e grupos de controle em comparação com os outros grupos, o que foi consistente com os dados da análise de western blot (Figura 3C).

Figura 3. Expressão do marcador de proliferação TRPC1 em d-DPSCs cultivados nos diferentes meios. (UMA) Expressão da proteína TRPC1. (B) Quantificação da expressão de TRPC1. (C) Coloração de imunofluorescência de TRPC1 (barra de escala: 100 & # x03BCm). & # x002A & # x002AP & # x003C 0,01 vs. grupo de controle ## P & # x003C 0,01 vs. grupo FBS 10% & # x03B1-MEM.

A expressão da proteína CD146 foi examinada para avaliar as propriedades de stemness de d-DPSCs cultivadas em diferentes meios. Nos grupos experimentais, a expressão de CD146 foi a mais alta no grupo 10% FBS & # x03B1-MEM, no entanto, foi menor do que no grupo de controle. Além disso, a expressão de CD146 quase não foi detectada no grupo de indução neural (Figuras 4A, B). CD146 foi expresso em um alto nível nos grupos de FBS & # x03B1-MEM a 10% e de controle, o que foi semelhante aos resultados da análise de western blot (Figura 4C).

Figura 4. Expressão do marcador de stemness CD146 em d-DPSCs cultivados em diferentes meios. (UMA) Expressão da proteína CD146. (B) Quantificação da expressão de CD146. (C) Coloração de imunofluorescência de CD146 (barra de escala: 100 & # x03BCm). & # x002A & # x002AP & # x003C 0,01 vs. grupo de controle ## P & # x003C 0,01 vs. grupo FBS 10% & # x03B1-MEM.

Expressão de proteína e coloração de imunofluorescência de marcadores neuronais de d-DPSCs após cultura em meios diferentes

A expressão de marcadores neuronais (por exemplo, Nestina e MAP-2) foi examinada em d-DPSCs nos grupos 2% B27 NM, 2% B27 + 5% FBS NM e 10% FBS & # x03B1-MEM grupos. A expressão de Nestina e MAP-2 foi maior nos grupos 2% B27 + 5% FBS NM e indução neural. Considerando que a expressão da Nestina e do MAP-2 diminuiu no FBS & # x03B1-MEM a 10% e nos grupos de controle. MAP-2 foi expresso em um nível alto no grupo B27 NM de 2%, mas a Nestina foi expressa em um nível baixo (Figuras 5A, B, 6A, B). A coloração por imunofluorescência indicou que Nestina e MAP-2 foram expressos em todos os grupos experimentais e de controle, com expressão significativamente aumentada em 2% B27 NM, 2% B27 + 5% FBS NM e grupos de indução neural (Figuras 5C, 6C).

Figura 5. Expressão do marcador semelhante a neurônios Nestina em d-DPSCs cultivados em diferentes meios. (UMA) Expressão da proteína Nestina. (B) Quantificação da expressão de Nestina. (C) Coloração de imunofluorescência de Nestina (barra de escala: 100 & # x03BCm). & # x002A & # x002AP & # x003C 0,01 vs. grupo de indução neural ## P & # x003C 0,01 vs. grupo 2% B27 + 5% FBS NM.

Figura 6. Expressão do marcador semelhante a neurônios MAP-2 em d-DPSCs cultivados em diferentes meios. (UMA) Expressão da proteína MAP-2. (B) Quantificação da expressão de MAP-2. (C) Coloração de imunofluorescência de MAP-2 (barra de escala: 100 & # x03BCm). & # x002A & # x002AP & # x003C 0,01 vs. grupo de controle ## P & # x003C 0,01 vs. 10% FBS & # x03B1-MEM group # P & # x003C 0,05 vs. grupo FBS 10% & # x03B1-MEM.

Expressão de marcadores semelhantes a MSCs por d-DPSCs no grupo 10% FBS & # x03B1-MEM

De acordo com os resultados de CCK-8, western blot e análises de coloração por imunofluorescência, as características de d-DPSCs no grupo de FBS & # x03B1-MEM a 10% foram semelhantes às do grupo de controle. Portanto, as propriedades semelhantes a MSCs de d-DPSCs no grupo 10% FBS & # x03B1-MEM foram avaliadas por citometria de fluxo usando os marcadores de MSCs CD73, CD90, CD105, CD146, CD34, CD14, CD45 e HLA-DR. A citometria de fluxo demonstrou que d-DPSCs foram positivos para CD73, CD90, CD105 e CD146 no grupo 10% FBS & # x03B1-MEM, onde a expressão de CD105 e CD146 foi reduzida em comparação com o grupo de controle CD105 e a expressão de CD146 foi diminuída de 99,37 a 58,41% e de 97,60 a 69,75%, respectivamente (Figura 7A). d-DPSCs não expressou CD34, CD14, CD45 e HLA-DR no grupo FBS & # x03B1-MEM a 10%, o que estava em linha com as propriedades de MSCs no grupo de controle (Figura 7B).

Figura 7. Expressão de marcadores semelhantes a MSCs por d-DPSCs no grupo 10% FBS & # x03B1-MEM. (UMA) Expressão positiva de marcadores de superfície d-DPSC. (B) Expressão negativa de marcadores de superfície d-DPSC.


Resultados

Efeito de Reelin recombinante na migração de HNSC em condições livres de soro.

Para investigar o papel da reelina na migração de HNSC, aplicamos reelina recombinante (200 & # x02013400 pM) a HNSCs diferenciados sob condições definidas sem soro em vitro. Anteriormente, relatamos que os HNSCs não apenas sobrevivem por pelo menos 3 semanas sob essas condições, mas também se diferenciam totalmente em células & # x003b2III-tubulina, GFAP ou células imunopositivas O4 (25). Fig. & # X200B Fig.1 1 uma mostra o padrão de diferenciação típico de HNSCs em 5 dias sob condições sem soro com imunocitoquímica com anti - & # x003b2III-tubulina e anticorpos anti-GFAP. A migração normal consiste em células gliais se diferenciando em um padrão & # x0201cspoke-wheel & # x0201d. Essas células e seus processos fornecem um arcabouço para a diferenciação posterior de neurônios. Os neurônios que se movem para frente e para trás do neuroesferóide migram em associação com os processos radiais e corpos celulares das células gliais. Fig. & # X200B Fig.1 1 b mostra fotomicroscopia de lapso de tempo do efeito da reelina recombinante em HNSCs diferenciados sob condições livres de soro. A adição de reelina recombinante induziu a retração de neurônios em diferenciação, células gliais e suas projeções de volta ao esferóide em cerca de 3 h, enquanto a adição de meio condicionado de células 293T, que não foram transfectadas com plasmídeo, não conseguiu provocar uma mudança significativa no movimento de HNSCs (Fig. & # x200B (Fig.1 1 b) Especulamos que o reelin pode ser operativo na regulação do movimento celular em nossas culturas e muito provavelmente necessário para a diferenciação. O efeito da reelina na diferenciação de HNSCs requer uma investigação mais aprofundada. Este resultado indica que a reelina pode regular a biologia do HNSC por meio de um sistema responsivo que requer a expressão de reelina nessas células.

Efeito da reelina recombinante em HNSCs diferenciados sem soro. (uma) & # x003b2III-tubulin (verde) e GFAP (vermelho) no tempo 0 (& # x000d7400). (b) Imagem de lapso de tempo típica de movimentos de HNSC na presença e ausência de reelina recombinante (& # x000d750). Os arquivos de filme quicktime dessas imagens de lapso de tempo são publicados como Filmes 1 e 2 como informações de apoio no site da PNAS, www.pnas.org.

Expressão de Reelin, & # x003b13-Subunidades do receptor de integrina e Dab-1 em HNSCs.

Para estudar o papel que reelina e sua via de sinalização podem ter na diferenciação e migração de HNSCs, realizamos análise imunocitoquímica e Western blot usando anticorpos que reconhecem reelina, subunidades do receptor de integrina & # x003b13 e Dab-1. Fig. & # X200B Fig.2 2 mostra que HNSCs diferenciados em vitro por 5 dias expressa imunorreatividade de reelina em pequenas células bipolares, que exibiam um fenótipo morfológico sugestivo de diferenciação neuronal. No entanto, a imunorreatividade de reelin não foi detectável em células GFAP-positivas (Fig. & # X200B (Fig.2 2 uma) A imunorreatividade para as subunidades do receptor da integrina & # x003b13 também foi expressa por essas células bipolares pequenas, mas não pelas células GFAP-positivas, indicando a expressão das subunidades do receptor da integrina & # x003b13 que era maior em fenótipos neuronais do que em fenótipos gliais (Fig. & # x200B (Fig.2 2 b) Usando microscopia eletrônica, detectamos que a imunorreatividade da subunidade do receptor da integrina & # x003b13 foi localizada na superfície da membrana plasmática de neurônios em diferenciação (Fig. & # X200B (Fig.2 2 c) A análise de Western blot de extratos de proteína preparados por imunoprecipitação com o anticorpo monoclonal reelin 142 de HNSCs após 7 dias de diferenciação permitiu a identificação de reelin, a subunidade do receptor de integrina & # x003b13 e as bandas imunopositivas Dab-1 (Fig. & # X200B (Fig.3). 3).

Expressão de reelina e subunidades do receptor de integrina & # x003b13 em culturas de HNSCs. (uma) Imunorreatividade de Reelin (verde) expressa por fenótipos semelhantes aos neuronais e não por células GFAP-positivas (vermelho) (& # x000d7400). (b) Imagem microscópica de elétrons (& # x000d717,500) de & # x003b13 & # x02212 imunorreatividade da subunidade do receptor de integração localizada na membrana plasmática de HNSC (setas). (c) & # x003b13-Imunorreatividade da subunidade do receptor da integrina (verde) expressa especificamente por fenótipos semelhantes aos neurônios (& # x000d7400). Os núcleos foram contrastados com DAPI (azul).

Análise de Western blot de reelin (uma), & # x003b13-integrina (b), e proteína Dab-1 (c) extraído de HNSCs por imunoprecipitação com anticorpo anti-reelin 142 após diferenciação não sérica (basal) ou sérica.

Transplante de células-tronco para camundongos bobinadores.

Um estudo anterior com roedores usando o modelo de injeção intraventricular de HNSC (6) não só demonstrou que o cérebro de ratos senis fornece o ambiente necessário para a migração e diferenciação de HNSC com sucesso, mas também que o transplante de HNSC melhorou a função cognitiva dos hospedeiros idosos.

Para investigar o efeito do reelin nos padrões de migração e diferenciação de HNSCs na Vivo, HNSCs foram expandidos sem diferenciação em vitro como descrito (25) e marcado por meio de uma incorporação BrdUrd no DNA nuclear. Os HNSCs marcados com BrdUrd foram subsequentemente injetados nos ventrículos laterais (6) de camundongos do tipo selvagem de 3 meses (B6C3F) e camundongos bobinadores nulos (mutação de Edimburg ref. 23). Analisamos os cortes do cérebro com imunohistoquímica para & # x003b2III-tubulin, GFAP e BrdUrd 4 semanas após a injeção. Os camundongos de tipo selvagem mostraram um padrão de diferenciação e distribuição de HNSCs transplantados semelhante ao previamente detectado em experimentos de transplante de rato (Fig. & # X200B (Fig.4). 4). Em contraste, HNSCs transplantados em camundongos reeler não conseguiram migrar no cérebro do hospedeiro. A maioria das células positivas para BrdUrd permaneceu no local da injeção na área do ventrículo. No córtex, algumas células GFAP-positivas foram detectadas (Fig. & # X200B (Fig.5 5 d), mas & # x003b2III-tubulina-HNSCs positivos estavam ausentes (Fig. & # x200B (Fig.5 5 uma) Além disso, os HNSCs & # x003b2III-tubulina-positivos localizados perto do trajeto da agulha exibiram uma morfologia particular caracterizada por um déficit grave da expressão do processo neuronal (Fig. & # X200B (Fig.5 5 b e e) No entanto, uma população de HNSCs reelin-positivos localizados perto do SVZ mostrou um padrão de migração em cadeia de fenótipos semelhantes a neurônios ao longo de uma trilha de reelin (Fig. & # X200B (Fig.5 5 c) Estes resultados indicam que ECM reelin é necessário para promover a migração de células-tronco, e também que as células que expressam reelin podem migrar no rato carretel.

Imunohistoquímica do córtex cerebral em um camundongo do tipo selvagem 4 semanas após o transplante de HNSC no cérebro. (uma) HNSCs migraram para o córtex e se diferenciaram em fenótipos semelhantes a neurônios que expressam imunorreatividade de & # x003b2III-tubulina (verde) (& # x000d7100). (b) Fenótipos semelhantes a neurônios piramidais, com a presença de dendritos apicais (verde) expressando núcleos positivos para BrdUrd (vermelho) (& # x000d7400). (c) Observe uma camada de HNSCs GFAP-positivos (marrom) (& # x000d7100). (d) Imunocoloração dupla GFAP e & # x003b2III-tubulina revelando uma camada de GFAP-positivo (vermelho) e uma camada de células & # x003b2III-tubulina-positivas (verdes) (& # x000d7100). Os núcleos foram contrastados com DAPI (azul).

Imunohistoquímica de um cérebro de camundongo carretel 4 semanas após o transplante de HNSC. (uma) Baixa ampliação (& # x000d7100) do córtex corado com anticorpo anti - & # x003b2III-tubulina e contrastado com DAPI para revelar núcleos. Observe que as células positivas para a tubulina & # x003b2III (verdes) são virtualmente indetectáveis. (b) Grupos de células positivas para BrdUrd perto do local da injeção (& # x000d7400). Observe que a morfologia dessas células difere daquela das células expressas no córtex de camundongos do tipo selvagem (ver Fig. & # X200B Fig.4). 4). (c) Migração em cadeia de células transplantadas que expressam reelina (verde) no córtex (& # x000d7400). (d) Poucos HNSCs GFAP-positivos (marrom) detectados no córtex (& # x000d7100). (e) Diferenciação de HNSCs em células positivas para & # x003b2III-tubulina (verde) perto do local da injeção (& # x000d7400). Os núcleos foram contrastados com DAPI (azul).

Análise da população de células-tronco em camundongos Reeler.

Como nosso estudo indicou a capacidade migratória ineficaz de células-tronco transplantadas em camundongos reeler, formulamos a hipótese de que as células-tronco endógenas de camundongos reeler podem ter deficiências migratórias. Para comparar a migração de células-tronco expressas em camundongos reeler com a de camundongos do tipo selvagem, injetamos BrdUrd em reeler homozigoto, reeler heterozigoto (haploinsuficiente para reelina ref. 23) e camundongos de tipo selvagem por 4 dias. Posteriormente, uma coloração de BrdUrd imunofluorescente de seções do cérebro, incluindo a formação do hipocampo, bulbo olfatório e SVZ foi realizada. Os NSCs de camundongo que proliferaram durante e após a injeção de BrdUrd podem ser identificados por coloração de fluorescência de núcleos BrdUrd. Descobrimos que o número de células positivas para BrdUrd no hipocampo e bulbo olfatório de camundongos reeler homozigotos e heterozigotos era menor do que em camundongos do tipo selvagem (Fig. & # X200B (Fig. 6 6 e Fig. & # X200B Fig. 7). 7). Em contraste, a densidade da população de células-tronco na SVZ de camundongos reeler homozigotos e heterozigotos foi semelhante à dos camundongos de tipo selvagem (Figs. & # X200B (Figs. 6 6 e & # x200B e 7). 7). Esses resultados indicam que a proliferação de células-tronco não foi afetada em camundongos reeler, no entanto, a migração dessas células do SVZ para o bulbo olfatório e hipocampo foi dramaticamente diminuída, presumivelmente por causa da falta de reelina.

Comparação de populações endógenas de NSC em camundongos bobinadores e de tipo selvagem (& # x000d7100). O BrdUrd incorporado aos núcleos das células em proliferação foi detectado por imunohistoquímica fluorescente (vermelho), e todos os núcleos foram contrastados com DAPI (azul). (Superior) População dramaticamente reduzida de células-tronco no hipocampo de homozigotos (uma) e heterozigoto (b) camundongos reeler em comparação com camundongos do tipo selvagem (c). (Diminuir) População semelhante de células-tronco no SVZ de reeler homozigoto (d) e camundongos de tipo selvagem (e) Observe a estrutura desorganizada do giro dentado em camundongos reeler homozigotos (uma) Os núcleos foram contrastados com DAPI (azul).

Número de células BrdUrd-positivas no enrolador heterozigoto (& # x0002b & # x0002f & # x02212), enrolador homozigoto (& # x02212 & # x0002f & # x02212) e camundongos do tipo selvagem no hipocampo, bulbo olfatório e SVZ. Redução significativa da população de células-tronco foi observada no hipocampo (P & # x0003c 0,001) e bulbo olfatório (P & # x0003c 0,01), mas não no SVZ do carretel (& # x0002b & # x0002f & # x02212) e carretel (& # x02212 & # x0002f & # x02212) camundongos em comparação com camundongos de tipo selvagem pela análise post hoc LSD protegida de Fisher após ANOVA.


Introdução

As células-tronco neurais (NSCs) têm a capacidade de autorrenovação porque pelo menos uma das células-filhas mantém o potencial das células-tronco neurais por divisão celular assimétrica. As NSCs se diferenciam em três tipos principais de células neurais, neurônios, oligodendrócitos e astrócitos 1. No entanto, as propriedades de proliferação e autorrenovação das NSCs podem causar transformação maligna 2. Embora a transformação maligna espontânea tenha sido raramente observada, tem sido sugerido que a transformação espontânea de células-tronco adultas, como células-tronco mesenquimais humanas (BM-hMSCs) e NSCs, pode induzir a formação de tumor 3 - 4. A transformação espontânea de células precursoras neurais murinas foi relatada por Johnson 5 e Florian 6. Os NSCs têm sido considerados uma ferramenta promissora para a terapia de transplante de células e engenharia de tecidos 7. Para obter uma quantidade suficiente de NSCs para uso clínico, a expansão in vitro extensa de NSCs geralmente é necessária. No entanto, continua sendo uma preocupação com relação à segurança dos NSCs. Um relatório recente revelou que as células-tronco neurais fetais transplantadas em um paciente com doença neurodegenerativa hereditária se transformaram em tumores não cancerosos no cérebro e na medula espinhal 8. As células-tronco cancerosas foram recentemente identificadas como células iniciadoras de câncer para malignidades sólidas, como câncer de mama 10 e tumores cerebrais pediátricos 11. Assim, NSCs normais podem ser propensos a instabilidade genômica e transformação maligna, particularmente durante a cultura de longo prazo in vitro. Devido à instabilidade genômica, pode ocorrer acúmulo de danos ao DNA, perda de regulação no ciclo celular e desregulação da assinatura epigenética.

Para investigar se NSCs normais têm potencial tumorigênico, inoculamos células-tronco neurais do estriado fetal humano (hsNSCs) 12 por via subcutânea em camundongos nude imunodeficientes. Observamos uma transformação espontânea de hsNSCs após 17 passagens in vitro. Além disso, uma linha celular de tumor T1 que foi derivada de hsNSCs após a formação de tumor de xenoenxerto subcutâneo foi estabelecida e caracterizada. Descobrimos que a tumorigenicidade de células T1 cultivadas a longo prazo apresentou forte seletividade no microambiente, que se associou à amplificação do gene do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e a uma forma mutante constitutivamente ativa do receptor, EGFRvIII.


Materiais e métodos

Esta pesquisa foi conduzida sob protocolo do Comitê de Ética em Pesquisa no. 2001–0316 para seres humanos e protocolo no. 01–197 para uso em animais, aprovado pelo Escritório para a Proteção de Assuntos de Pesquisa da Universidade de Illinois em Chicago.

Culturas de células.

Um método para o crescimento a longo prazo de células precursoras neurais humanas usado neste estudo foi publicado por Svendsen et al. (26). Resumidamente, HNSCs (25) proliferaram em um meio definido contendo fator de crescimento epidérmico (20 ng / ml, R & amp D Systems), fator de crescimento de fibroblastos (FGF, 20 ng / ml, R & amp D Systems), B27 (1:50, GIBCO), heparina (5 μg / ml, Sigma), mistura de antibiótico-antimicótico (1: 100, GIBCO), DMEM e Ham's F-12 (ambos da GIBCO). Posteriormente, os HNSCs foram diferenciados por 5–7 dias em uma incubadora umidificada com meio de Eagle suplementado com FBS a 10% (vol / vol) (GIBCO) ou meio sem soro (basal) (GIBCO).

Imunocitoquímica.

Para imunocitoquímica, HNSCs foram fixados em metanol 100% a −20 ° C por 20 min. Após a lavagem, as células foram bloqueadas por 1 h a 4 ° C com PBS contendo 0,25% de Triton X-100 e 2,0% de soro de burro normal (PBSTS, Jackson ImmunoResearch). Em seguida, as células foram incubadas durante a noite a 4 ° C com a solução de anticorpo primário diluída em PBSTS. Em seguida, as células foram incubadas com anticorpo secundário diluído em PBSTS por 1 h a 4 ° C no escuro. Após lavagem com PBS, as células foram cobertas por lamínulas com meio de montagem Vectashield 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories). As imagens microscópicas foram obtidas por uma câmera digital Axiocam montada em um Axioscop 2 com o software AXIOVISION (Zeiss).

Immunocytochemistry for Electron Microscopy.

Os NSCs diferenciados foram fixados com 4% (wt / vol) de fixador de paraformaldeído (pH 7,4 com tampão fosfato 0,1 mM) por 30 min em temperatura ambiente (RT). Após a lavagem, as células foram bloqueadas por 1 h em PBS com 1,5% de soro de cabra. As células foram então transferidas para a solução de anticorpo primário diluída em solução de soro PBS durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, as células foram incubadas sequencialmente com um anticorpo secundário biotinilado e solução de complexo avidina-biotina (Vector Laboratories) por 1 h cada em temperatura ambiente. As células foram então incubadas com uma solução de diaminobenzidina (Sigma).

Imunoprecipitação.

Para imunoprecipitação, ambos os lisados ​​celulares e meios celulares foram amostrados em condições nativas após um período de diferenciação de 7 dias. As células foram lisadas durante 30 min com agitação constante em tampão de imunoprecipitação gelado contendo Tris 10 mM a pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM e Triton X-100 a 1%. O material insolúvel foi removido dos lisados ​​celulares por centrifugação por 30 segundos a 14.000 × g. Os lisados ​​celulares foram incubados com anticorpo monoclonal anti-reelin 142 durante a noite a 4 ° C em um rotador. O complexo antígeno-anticorpo foi então incubado com 50 μl de suspensão de esferas de IgG Sepharose (Amersham Pharmacia) durante a noite a 4 ° C em um rotador. O terceiro dia incluiu a lavagem das células com tampão de imunoprecipitação três vezes, com Tris 10 mM a pH 7,5, NaCl 500 mM, EDTA 2 mM e Triton X-100 a 1% duas vezes, e com Tris 10 mM a pH 7,5 três vezes. Após cada lavagem, os grânulos ligados às células foram centrifugados por 30 s a 14.000 × g. Após a última lavagem, o sobrenadante foi cuidadosamente removido e os grânulos foram aquecidos por 3-5 min a 95 ° C com 100 μl de tampão de amostra SDS (Invitrogen) para eluição da amostra de proteína.

Western Blot.

HNSCs diferenciados em condições séricas e não séricas (basais) por 7 dias. As amostras de proteínas foram preparadas com Tri reagente de acordo com o protocolo do fabricante (Molecular Research Center, Cincinnati). As concentrações da amostra de proteína foram medidas usando o kit de análise de proteína Bio-Rad de acordo com o protocolo do fabricante. Quantidades iguais de amostras de proteína foram carregadas em quatro géis de 12% bis / Tris (Invitrogen). As proteínas foram transferidas para membranas de poli (difluoreto de vinilideno) (Invitrogen) durante a noite a 4 ° C a uma constante de 15 mV. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em PBS, 0,05% de Tween 20 (Sigma) por 8 h. Posteriormente, as membranas foram incubadas com solução de anticorpo primário diluída em 5% de leite / mistura de PBS-Tween 20 durante a noite a 4 ° C. As membranas foram lavadas três vezes com 5% de leite / PBS-Tween 20 por 5 min cada. Em seguida, as membranas incubadas na solução de anticorpo secundário também foram diluídas em mistura de leite a 5% / PBS-Tween 20 por 1 h a 4 ° C. As proteínas de interesse foram detectadas por quimioluminescência intensificada com o substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico (Pierce).

Anticorpos.

Os anticorpos primários foram usados ​​nas seguintes diluições: anticorpo monoclonal anti-reelin 142 de camundongo (1: 100, um presente de AM Goffinet, Univ. De Namur, Bruxelas, Bélgica) anticorpo monoclonal de subunidade do receptor de integrina α3 anti-α3 de camundongo (1: 500 , Chemicon) anticorpo policlonal anti-Dab-1 de coelho (1: 500, da Pascale Lacor na Univ. De Illinois em Chicago) anticorpo anti-tubulina βIII de camundongo (1: 1.000, Sigma) e anticorpo anti-proteína de filamento glial de cabra (GFAP , 1: 500, Research Diagnostics, Flanders, NJ)

Os anticorpos secundários adquiridos na Jackson ImmunoResearch foram usados ​​com as seguintes diluições: IgG anti-camundongo de burro conjugado com fluoresceína (FITC) (1: 200) IgG de burro conjugado com rodamina (TRITC) anti-cabra de burro (1: 200) e burro conjugado com peroxidase IgG anti-rato (1: 5.000).

Transplante de HNSCs em camundongos Reeler e Wild-Type.

Camundongos machos de três meses de idade foram anestesiados com 50 mg / kg de pentobarbital (i.p.) e montados em um aparelho estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Após a retirada dos pelos do sítio cirúrgico por barbeador elétrico, foi realizada incisão cirúrgica de 0,5 cm caudal a rostral na pele da superfície do crânio. Os ventrículos foram localizados estereotaxicamente usando as seguintes coordenadas: AP = −0,1 mm do bregma, ML = ± 1 mm e 1,4 mm abaixo da dura. Um furo de 0,4 mm foi feito no crânio usando uma broca de precisão. NSCs (5 × 10 4) em 5 μl de PBS foram injetados no ventrículo usando uma microsseringa anexada ao aparelho estereotáxico. A injeção foi aplicada por um período de 10 minutos e a agulha foi deixada no local por mais 5 minutos após a injeção. Após a injeção, a pele incisada cirurgicamente foi fechada por 1 clipes de sutura Michel (2,5 × 1,75 mm). Quatro semanas após a cirurgia, os animais foram profundamente anestesiados com pentobarbital 70 mg / kg (i.p.) e perfundidos com soro fisiológico e fixador de paraformaldeído a 4%. Os cérebros foram removidos e posteriormente processados ​​para análise imuno-histoquímica.

Na Vivo Análise de proliferação celular.

Ratinhos adultos (4 meses de idade) foram injectados i.p. com bromodeoxiuridina (BrdUrd, 100 mg / kg / dia Sigma) por 3 dias. Vinte e quatro horas após a última injeção, os animais foram profundamente anestesiados com 70 mg / kg de pentobarbital (i.p.) e perfundidos com solução salina fisiológica e fixador de paraformaldeído a 4%. Os cérebros foram removidos e posteriormente processados ​​para análise imunohistoquímica.

Immunohistochemistry of the Mouse Brain.

Os cérebros removidos foram colocados em fixador de paraformaldeído a 4% (peso / volume) contendo sacarose a 20% (peso / volume) durante a noite. Os cérebros foram fatiados em seções coronais de 20 μm usando um micrótomo criostato. As seções foram lavadas brevemente em PBS e tratadas com HCl 1M por 30 min à temperatura ambiente para aumentar a acessibilidade do anticorpo anti-BrdUrd aos núcleos das células. Após enxágue com PBS, as seções foram transferidas para um PBS contendo 0,25% de Triton X-100 (PBST) por 30 min. Em seguida, as seções foram bloqueadas em PBST contendo soro normal de burro a 3% por 1 h e incubadas com anti-BrdUrd de ovelha durante a noite a 4 ° C. Após lavagem em PBS, anti-ovelha de burro conjugado com rodamina IgG foi adicionado a uma diluição de 1: 200 em PBST por 2 h de incubação em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, as seções foram lavadas com PBS e incubadas com IgG2b monoclonal de camundongo anti-tubulina βIII humana, clone SDL3D10 (1: 500, Sigma), e anti-GFAP humano de cabra, N-terminal purificado por afinidade humana (1: 200, Pesquisa Diagnóstico), respectivamente, durante a noite a 4 ° C no escuro. Os anticorpos secundários correspondentes para estas seções foram IgG de burro anti-camundongo ou anti-cabra de burro conjugado com FITC ou rodamina. Após uma breve lavagem com PBS, os anticorpos secundários foram adicionados em seções para uma incubação de 2 h em temperatura ambiente no escuro. As seções foram então lavadas com PBS completamente antes da montagem em lâminas de vidro e cobertas com Vectashield com DAPI (Vector Laboratories) para observação microscópica fluorescente.

Production and Purification of Recombinant Reelin.

Construções de cDNA de reelina de camundongo de comprimento total, com ou sem uma inserção de epítopo Myc interna, foram um presente de G. D'Arcangelo (Baylor College of Medicine, Houston, TX ref. 27). O cDNA de Reelin foi transfectado em células 293T em ~ 90% de confluência usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Rockville, MD) por 6 h em meio DMEM / F12 livre de proteína, então substituído por meio neurobasal / B-27 livre de soro e realimentado a cada 2 dias. O meio condicionado foi centrifugado em baixa velocidade para remover detritos celulares e, em seguida, dividido em alíquotas e armazenado a -80 ° C. Como controlo negativo, o meio condicionado foi retirado de células não transfectadas ou de células expostas apenas a lipofectamina (sem plasmídeo).


Resultados

Reentrada do ciclo celular de astrócitos maduros sob condições definidas

Para investigar a reentrada no ciclo celular de astrócitos murinos, as células foram expostas aos fatores de crescimento EGF e FGF2, e a incorporação do análogo de timidina EdU foi medida para detectar a síntese / proliferação de DNA. Astrócitos primários padrão 14, 17, normalmente mantidos em meio contendo 10% de soro, foram cultivados em meio N2B27 sem soro para excluir efeitos de outros fatores de crescimento. Em tais culturas, alguma proliferação básica foi observada, e esta foi aumentada pela exposição ao EGF por 8 dias (cerca de 10% das células). O FGF2 induziu a proliferação de uma fração significativamente maior de células (Fig.1A, 1B) e EGF atenuou a resposta ao FGF2. Os astrócitos afetados nessas condições se dividiram uma ou duas vezes em 10 dias e, em seguida, saíram do ciclo celular novamente. Observações além desse período de tempo não foram realizadas, devido à dificuldade de manter nossas culturas primárias sem soro e fatores derivados do endotélio 56 por mais de duas semanas (dados não mostrados).

Reentrada no ciclo celular de astrócitos maduros sob condições controladas. (UMA): Astrócitos murinos primários foram expostos a 20 ng / ml de FGF2 ou 20 ng / ml de EGF ou combinações dos mesmos por 8 dias. O análogo de nucleosídeo EdU (10 µM) foi adicionado durante as últimas 48 horas. A incorporação de EdU no DNA foi visualizada por imunocitoquímica e o número de núcleos positivos para EdU foi contado por um microscópio de triagem automatizado (1000 núcleos / condição). Os dados são médias ± SEM para três preparações de células. ***, p & lt .0001 *, p & lt .01 (pós-teste de Tukey). (B): Imagens representativas são mostradas para células tratadas como em (A). Esquerda: a incorporação de EdU foi visualizada por imunocitoquímica (verde) e os núcleos foram corados com H-33342 (vermelho). À direita: GFAP (verde) e nestina (vermelho) foram visualizados por imunocitoquímica, e os núcleos foram corados com H-33342 (azul). (C): Três lotes diferentes de mAGES foram tratados e analisados ​​como em (A). Em culturas de controle (N2B27, meio sem soro sem fatores adicionais), menos de uma célula por condição foi considerada positiva para EdU (& lt 0,1%). Os dados para células expostas a fatores de crescimento são os indicados (dados como médias ± SEM). ***, p & lt .0001 ns, não significativo (pós-teste de Tukey). (D): As mAGES foram imunocoradas como em (B) uma barra de escala e teclas coloridas são exibidas nas imagens. (E): Resumo do procedimento experimental e descobertas de AD: FGF2 conduz a transformação de astrócitos GFAP-positivos, não proliferantes (aqui exemplificado pela população pura e definida de mAGES em células-tronco neurais positivas para nestina em proliferação (aqui chamadas NSC2). Abreviações: EdU , 5-etinil-2'-desoxiuridina GFAP, proteína glial fibrilar ácida mAGES, astrócitos murinos gerados a partir de células-tronco embrionárias NSC2, células semelhantes a tronco neurais.

Como segundo sistema experimental, foram utilizadas culturas homogêneas de astrócitos murinos gerados a partir de células-tronco embrionárias (mAGES) 51. Nessas células, nenhuma proliferação básica foi observada e o EGF adicionado não teve efeito. No entanto, a maioria das células começou a proliferar quando exposta ao FGF2 (Fig. 1C, 1D), e o EGF não atenuou esse efeito. A reentrada do ciclo celular foi sustentável, uma vez que os mAGES expostos ao FGF2 por 8 dias puderam ser replantados e posteriormente expandidos em meio N2B27 contendo FGF2 (Informações de Apoio Fig. 1). Assim, os mAGES, bem como os astrócitos primários, reentram no ciclo celular em resposta ao FGF2, embora o curso do tempo e a eficiência de reentrada difiram entre os dois tipos de células.

Conversão de mAGES em células-tronco neurais por FGF2

Alterações fenotípicas associadas à reentrada no ciclo celular foram investigadas por imunocitoquímica. As culturas de astrócitos primários padrão, como também observado por outros 57-59, sempre continham algumas células positivas para nestina (marcador de células-tronco neurais) e alguma proteína glial fibrilar ácida (GFAP, marcador de astrócito) -nestina astrócitos imaturos duplo-positivos. Após a exposição a FGF2, a coloração de nestina aumentou, enquanto a expressão de GFAP diminuiu. Esta mudança de um fenótipo astrocítico genuíno para um tipo de célula precursora mais imatura também foi observada em mAGES (Fig. 1B, 1D Informações de Apoio Fig. 2A, 2B). Nas últimas culturas, astrócitos em forma de estrela com processos radiais finos adotaram processos hipertróficos (tipicamente vistos em astrócitos reativos) nos primeiros dias de exposição ao FGF2. No dia 6, eles adotaram uma morfologia bipolar com dois processos alongados e, finalmente, a morfologia típica das células-tronco neurais (NSC) foi observada (Informações de Apoio Fig. 3). Assim, os astrócitos expostos ao FGF2 não apenas reentraram no ciclo celular, mas também geraram células semelhantes a tronco neurais (NSC2), que puderam ser mantidas (por FGF2 ou FGF2 mais EGF) em um estado de auto-renovação por ≥14 passagens (Fig. 1E, Informações de Apoio Fig. 1).

Uma quantificação desta conversão mostrou que a incorporação de EdU e a regulação negativa de GFAP começaram do dia 5 a 6. A regulação positiva da expressão de nestina começou diretamente após a exposição a FGF2 e aumentou continuamente (Fig. 2A, 2B).

Conversão de mAGES em células-tronco neurais por FGF2. (UMA): Culturas de mAGES foram expostas a 20 ng / ml de FGF2 por 1-9 dias, antes de serem fixadas. EdU foi adicionado 48 horas antes do término da experiência. A porcentagem de núcleos positivos para EdU foi determinada. (B): GFAP e nestina foram visualizados por imunocitoquímica em células tratadas como em (A). A porcentagem de células positivas é exibida. (C): Conforme mostrado no esquema, NSC foram diferenciados por 30 dias para mAGES pela exposição a BMP4, antes de serem expostos ao FGF2 (0 ou 20 ng / ml) por 8 dias. EdU foi adicionado ao meio nas últimas 48 horas. GFAP e nestina foram visualizados por imunocitoquímica. Os núcleos foram corados com H-33342. FGF2 induziu uma conversão de mAGES totalmente maduras em NSC2. Observe que a exposição de NSC a BMP4 por 5 dias leva a culturas homogêneas de mAGES não proliferantes, a diferenciação de longo prazo foi escolhida para tornar improvável a presença de NSC remanescente. (D): NSC derivado de células-tronco embrionárias (pool), três clones de células individuais destes NSC (# 1-3) e NSC derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) foram diferenciados para mAGES (o lado esquerdo do diagrama mostra um típico resultado fenotípico para células de pool). Tais mAGES foram expostas ao FGF2 por 8 dias e incubadas com EdU nas últimas 48 horas. A incorporação de GFAP, nestina e EdU foram visualizados por imunocitoquímica, e a porcentagem de células positivas foi determinada por um microscópio de triagem automatizado (médias ± SEM). Abreviaturas: EdU, 5-etinil-2′-desoxiuridina GFAP, proteína glial fibrilar ácida mAGES, astrócitos murinos gerados a partir de células-tronco embrionárias NSC, células-tronco neurais NSC2, células semelhantes a tronco neurais n.d, não detectáveis.

As culturas mAGES foram selecionadas para estudos adicionais sobre a reentrada no ciclo celular, pois são mais homogêneas, não mostram proliferação básica e não precisam de soro. Para verificar se todas as células nessas culturas eram astrócitos totalmente diferenciados, os mAGES foram cultivados por um mês em meio contendo BMP4, sob condições em que as células precursoras com silenciamento transitório são improváveis ​​de sobreviver 60. A retirada subsequente de BMP4 e a exposição ao FGF2 resultou em uma conversão em NSC2 com o mesmo curso de tempo e eficiência de mAGES de 5 dias (Fig. 2C). A remoção de BMP4 não induziu uma desdiferenciação em 8 dias, como mostrado pela falta de incorporação de EdU. Além disso, repetimos o processo com mAGES derivadas de três clones de células únicas de NSC e com mAGES derivadas de iPS. Em todas as culturas, a incorporação de nestina e EdU foi regulada positivamente por FGF2, enquanto a expressão de GFAP foi regulada para baixo (Fig. 2D). Assim, a conversão de mAGES em NSC2 exigia FGF2 e era generalizável para vários NSC.

Necessidade de sinalização de FGF2, mas não de EGF, para desdiferenciação de mAGES

Para investigação dos eventos de sinalização envolvidos na conversão de mAGES em NSC2, a fosforilação de proteínas-chave foi quantificada na ausência ou presença de inibidores de quinase específicos da via (Fig. 3A). Uma fosforilação aumentada de ERK (pERK) e AKT (pAKT) foi observada em resposta a FGF2 (Fig. 3B), os níveis de p38 fosforilado, JNK ou c-jun não se alteraram (Informação de Suporte Fig. 4A). SU5402 (inibidor do receptor de FGF (FGFR1) tirosina quinase) inibiu a fosforilação induzida por FGF2 de ERK e AKT (Fig. 3B, 3C) em concentrações não citotóxicas (Informações de Apoio Fig. 4B). Isso foi acompanhado por uma inibição da desdiferenciação de mAGES na presença de FGF2, conforme visto a partir da proliferação reduzida, incorporação de EdU inibida e expressão reduzida de nestina (Fig. 3D, 3E). Assim, a atividade da quinase do receptor de FGF foi necessária para a conversão de mAGES em NSC2.

Necessidade de sinalização de FGF2, mas não de EGF, para desdiferenciação de mAGES. (UMA): Visão geral de alvos inibidores e vias de sinalização que afetam a desdiferenciação de mAGES para NSC2. (B): Culturas de mAGES foram pré-incubadas por 30 minutos com SU5402 (10 µM) e expostas a FGF2 (20 ng / ml) por 20 minutos. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por Western blot para AKT e ERK, e suas formas fosforiladas (pAKT, pERK). (C): Quantificação densitométrica da razão entre proteínas fosforiladas e não fosforiladas de três experimentos como em (B). ***, p & lt .0001 **, p & lt .001 (vs. FGF2). (D): Para medir a proliferação, os mAGES foram expostos por 8 dias a 0 (ctrl) ou 20 ng / ml de FGF2 mais concentrações crescentes de SU5402 e redução de resazurina foram usadas como medida substituta do número de células. Os dados indicam a porcentagem de aumento do sinal de fluorescência da resazurina (proporcional ao número de células) em relação às condições de controle. (E): A proteína Nestina e a incorporação de EdU foram visualizadas em mAGES tratadas como em (D), e incubadas com EdU nas últimas 48 horas. As células positivas foram contadas por um microscópio de triagem automatizado. (F): Os mAGES foram pré-incubados por 30 minutos com Gef e expostos a 20 ng / ml de EGF ou FGF2 por 20 minutos, antes de AKT, ERK e suas formas fosforiladas serem determinadas por Western blot. (G): Os mAGES foram expostos por 8 dias a 0 (ctrl) ou 20 ng / ml de FGF2 mais concentrações crescentes de gefitinib EdU foram adicionadas nas últimas 48 horas. A incorporação de EdU e a proteína nestina foram visualizadas por imunocitoquímica. As células positivas foram contadas por um microscópio de triagem automatizado. Os dados são médias ± SEM. Abreviaturas: EdU, 5-etinil-2′-desoxiuridina Gef, gefitinib GFAP, proteína glial fibrilar ácida mAGES, astrócitos murinos gerados a partir de células-tronco embrionárias NSC2, células semelhantes a tronco neurais.

Enquanto Ly294002 (inibidor de fosforilação de AKT) não afetou a resposta de mAGES expostas a FGF2 (dados não mostrados), o inibidor de MEK1 / 2 U0126 (prevenção da formação de pERK) (Informação de Apoio Fig. 5A) inibiu a proliferação induzida por FGF2 de mAGES (Informações de Apoio Fig. 5B). U0126 também inibiu a síntese de DNA em mAGES expostas a FGF2 (Informações de Apoio Fig. 5C) em concentrações não citotóxicas (Informações de Apoio Fig. 5D), enquanto a regulação positiva induzida por FGF2 de nestina não foi afetada (Informações de Apoio Fig. 5C). Isso sugere que a fosforilação induzida pelo receptor de FGF de ERK, mas não AKT, conduz a reentrada no ciclo celular, mas não necessariamente a aquisição de outras propriedades das células-tronco (regulação da nestina).

Uma vez que outros estudos descreveram um envolvimento de EGF em vez de FGF2 na desdiferenciação de astrócitos, investigamos um papel putativo do EGF produzido endogenamente 38, 39. O inibidor da quinase do receptor de EGF gefitinib inibiu a fosforilação induzida por EGF de ERK e AKT em concentração não citotóxica de 0,1 µM (Fig. 3F, Informação de Suporte Fig. 6A), enquanto a fosforilação de ERK e AKT induzida por FGF2 não foi afetada (Fig. 3F, Informações de Apoio Fig. 6D). Para testar se alguma ativação indireta do receptor de EGF é necessária para a desdiferenciação de mAGES, as células foram coexpostas ao FGF2 mais gefitinib (1 µM). O inibidor do receptor de EGF não teve efeito na incorporação de EdU, expressão de nestina (Fig. 3G) ou proliferação (Informações de Apoio Fig. 6B, 6C). Assim, o EGF não é suficiente (Fig. 1C) nem necessário para a conversão de mAGES em NSC2.

Caracterização de NSC2 como células-tronco neurais multipotentes

Depois de descobrir que NSC2 são capazes de se auto-renovar (& gt14 passagens), investigamos sua potência de desenvolvimento com relação à neurogênese e gliogênese: quando NSC2 foi exposto a BMP4, eles adotaram a morfologia em forma de estrela típica dos astrócitos em 3 dias, e expressou GFAP e aquaporina 4 (Aqp4) em uma extensão semelhante a mAGES (Fig. 4A, 4B). A população de astrócitos resultante foi, portanto, denominada "mAGES2". Para investigar o potencial neurogênico de NSC2, eles foram plaqueados em poli-ornitina / laminina e o FGF2 foi gradualmente retirado do meio para permitir a diferenciação espontânea. Após 14 dias, a cultura consistia em 60% de neurônios positivos para βIII-tubulina (TUJ1) e cerca de 30% de astrócitos positivos para GFAP (Fig. 4C, 4D). A expressão da Nestina diminuiu para 20% após uma cultura adicional de uma semana (não mostrado). Por outro lado, a maioria das células TUJ1-positivas expressaram o marcador neuronal pós-mitótico NeuN no núcleo (Fig. 4E). Em resumo, descobriu-se que as NSC2 são células-tronco multipotentes, dando origem a astrócitos e neurônios com a mesma eficiência de diferenciação da população de NSC original.

Caracterização de NSC2 como células-tronco neurais multipotentes. NSC2, isto é, células-tronco neurais obtidas de mAGES, foram diferenciadas em astrócitos (mAGES2) com BMP4 por 3 dias (A, B) ou em neurônios (C, D, E). (UMA): Imagens de contraste de fase mostram morfologia típica de células-tronco neurais de NSC e NSC2 e morfologia astrocítica de mAGES e mAGES2. (B): Imagens ressentativas de imunofluorescência de mAGES2, geradas a partir de NSC2 pela exposição a BMP4 (por 3 dias): GFAP (verde) e Aqp4 ou nestina são mostradas (vermelho). Os núcleos foram corados com H-33342 (azul). (C): NSC2 foram diferenciados em neurônios por uma redução gradual e subseqüente retirada de FGF2 por 14 dias. Após a fixação, TUJ1 (vermelho) e GFAP ou nestin (verde) foram visualizados por imunocitoquímica. Os núcleos foram corados com H-33342 (azul). (D): NSC ou NSC2 foram diferenciados em neurônios e corados como em (C). Em seguida, a porcentagem de células positivas para o antígeno foi contada por um microscópio de triagem automatizado em três experimentos diferentes (os dados são médias ± SEM). (E): Fenotipagem de neurônios gerados a partir de NSC2 por coimunomarcação para βIII-tubulina (TUJ1, vermelho) e NeuN (verde). As imagens em preto / branco mostram canais fluorescentes individuais para maior clareza, a imagem composta colorida combina os dois canais. Abreviaturas: Aqp4, aquaporina 4 EdU, 5-etinil-2′-desoxiuridina GFAP, proteína glial fibrilar ácida IFNγ, interferon-γ mAGES, astrócitos murinos gerados a partir de células-tronco embrionárias NSC, células-tronco neurais NSC2, células semelhantes a tronco neurais TUJ1, βIII-tubulina.

Comparação de NSC2 com NSC em relação à expressão e função gênica

Para caracterizar ainda mais o fenótipo de NSC2, vários genes marcadores de tipo de célula foram selecionados e seus níveis de expressão foram comparados com aqueles encontrados em mAGES e NSC (Fig. 5A). Todos os marcadores de astrócitos foram menores em NSC / NSC2 do que em mAGES. O transportador de glutamato Glt-1 (SLC1A2) e a proteína de ligação ao cálcio S100B foram ainda menos expressos em NSC2 do que em NSC. Marcadores de células-tronco neurais (Nestin, Blbp, Olig2) foram regulados positivamente em NSC2 (e NSC) em comparação com mAGES. Assim, a análise qPCR confirmou a semelhança de NSC2 com NSC.

Comparação de células-tronco neurais primárias (NSC) e secundárias (NSC2) para expressão gênica, metabolismo e competência inflamatória. (UMA): Níveis de expressão (mRNA, medido por qPCR) em NSC, NSC2 e mAGES de marcadores de astrócitos (Gfap, Aqp4 (aquaporina), Glt-1 (Slc1A2, transportador de glutamato), Kir4.1 (canal de potássio retificador interno), Aldh1L1 , S100b), ou marcadores NSC (nestin, Olig2, Blbp). ***, p & lt .0001 **, p & lt .001 *, p & lt .01 ns, não significativo (vs. NSC2). (B): Dados de transcriptoma (microarray) obtidos para células-tronco embrionárias murinas (mESC), NSC, mAGES e NSC2. O gráfico de análise de componente principal 2D mostra 4 réplicas biológicas de cada tipo de célula e o intervalo de confiança de 95% como elipses sombreadas. (C): Mapa de calor de valores de expressão gênica para genes marcadores de astrócitos (azul) e NSC (vermelho) conhecidos (listados verticalmente) 51. Escores Z de dados de expressão normalizados plotados para quatro amostras NSC, quatro mAGES e três NSC2 (listadas horizontalmente). As cores azuis representam baixa expressão, as cores vermelhas são de alta expressão, com escores z variando de 1,4 a -1,4. Os nomes completos dos genes e os valores de expressão correspondentes estão listados na Fig. 7 de Informações de Apoio. (D): As células foram expostas a uma mistura de citocinas (= 10 ng / ml TNFα, 10 ng / ml IL1β, 20 ng / ml IFNγ) por 30 minutos e imunocoradas para o fator de transcrição NFκB. A razão citosol / núcleo de NFkB foi medida por um microscópio de triagem automatizado para identificar células com translocação nuclear de NFkB. (E): Citrato foi medido no sobrenadante após 3 e 24 horas para calcular a liberação de citrato (normalizado para o conteúdo de proteína total). (F): As concentrações de glicose / lactato foram medidas no sobrenadante após 3 e 24 horas. Taxas de captação / liberação (normalizadas para o conteúdo de proteína total) foram calculadas. Os dados são médias ± SEM de duas réplicas biológicas. Abreviações: mAGES, astrócitos murinos gerados a partir de células-tronco embrionárias mESC, células-tronco embrionárias de murino NSC, células-tronco neurais NSC2, células-tronco neurais.

Em seguida, a expressão de mais de 34.000 genes (cobertos por 45.000 conjuntos de sondas) foi medida em mESC, NSC, mAGES e NSC2 por hibridização de microarranjos. A análise do componente principal da expressão gênica global mostrou agrupamento de amostras de NSC2 e NSC em oposição a agrupamentos distintos para as amostras de mESC e mAGES e, assim, demonstrou a similaridade de NSC2 e NSC (Fig. 5B). Isto foi ainda confirmado por análise de genes expressos de forma significativa diferencial (DEG): nenhum DEG foi encontrado para a comparação NSC / NSC2.

Para uma comparação direcionada, genes identificados anteriormente para distinguir astrócitos de células-tronco neurais 51 foram selecionados. Um mapa de calor de seus valores de expressão normalizados, extraídos dos dados de microarray, confirmou a similaridade de NSC2 e NSC, e suas diferenças pronunciadas para mAGES (Fig. 5C).

A alta proporção de genes de astrócitos nas comparações acima pode obscurecer pequenas diferenças entre as populações de NSC. Portanto, usamos um conjunto recentemente identificado de genes específicos de NSC 32 in vivo para comparar NSC2 com NSC e mAGES. Mais de 70% desses genes marcadores mostraram maior expressão em NSC2 / NSC do que em mAGES (Informações de Apoio Fig. 8), demonstrando conformidade de NSC2 e NSC. Os 30% restantes mostraram alta variabilidade nas amostras de mAGES e não eram adequados para distinguir claramente NSC de mAGES.

Após esta fenotipagem detalhada, comparações funcionais foram realizadas com base em características já conhecidas por diferirem entre NSC e mAGES 51. Primeiro, a sinalização relacionada à inflamação foi explorada. As células foram expostas a uma mistura de citocinas inflamatórias (TNFα, IL1β e IFNγ) por 30 minutos, e a translocação de NFkB foi medida. NSC2 / NSC não mostrou nenhuma resposta, enquanto mais de 90% das células em culturas mAGES / mAGES2 mostraram translocação de NFkB para o núcleo (Fig. 5D). Assim, NSC2 claramente não são astrócitos reativos. Uma comparação do metabolismo mostrou que mAGES2 / mAGES liberou citrato e exibiu consumo de glicose e taxas de liberação de lactato semelhantes (Fig. 5E, 5F).Em contraste, NSC / NSC2 não liberou citrato e apresentou taxas metabólicas mais altas em comparação com mAGES / mAGES2. Esses dados confirmam uma conversão completa de uma identidade de células astrocíticas para células-tronco neurais, quando as mAGES são desdiferenciadas em NSC2.

Evidência para geração direta de NSC2 a partir de astrócitos diferenciados

Embora a população mAGES compreenda & gt99% de astrócitos (GFAP-positivo) 51, não pode ser totalmente excluído que NSC2 surja de uma subpopulação menor de células não diferenciadas que é reativada por FGF2. Portanto, duas hipóteses concorrentes podem explicar a geração de NSC2 (Fig. 6A): a primeira assume que algumas células dentro da população mAGES não se diferenciaram em astrócitos maduros após a exposição a BMP4, mas permaneceram em um estado de células-tronco dormentes. Eles podem começar a proliferar após a exposição ao FGF2, e supercrescer os mAGES. A segunda hipótese assume que uma grande proporção de mAGES entra novamente no ciclo celular e se converte em NSC2.

Evidência para geração de NSC2 a partir de astrócitos diferenciados. (UMA): Duas hipóteses de trabalho sobre a origem do NSC2 foram formuladas para testes adicionais. Hipótese-1: células-tronco quiescentes putativas positivas para nestina (vermelho) dentro da população mAGES (& lt1%) são estimuladas pelo FGF2 a proliferar (núcleos verdes), enquanto os mAGES originais (azul) morrem. Hipótese 2: o FGF2 induz a reentrada no ciclo celular de uma grande subpopulação de mAGES (núcleos verdes), que se convertem em células GFAP + / nestina + -positivas e, posteriormente, em células nestina + / GFAP - NSC. (B): Desenho experimental para investigar o fenótipo de células de transição: mAGES foram expostas a FGF2 (0 (azul) / 20 ng / ml (vermelho)) por até 7 dias EdU foi adicionado nas últimas 48 horas antes da imunocoloração. (C): As células foram tratadas como em (B). As células EdU + / GFAP + e EdU + / GFAP - foram contadas por imagem de alto conteúdo. (D): O experimento descrito em (C) foi realizado com coloração Aqp4 em vez de GFAP. (E): Os mAGES foram expostos a FGF2 (20 ng / ml) por 10 dias, e a porcentagem de células (da população original) que se dividiu pelo menos uma vez durante este período foi avaliada. Para identificar as células em divisão, dois métodos diferentes foram usados. Esquerda: mAGES foram coradas com CFSE antes da quantificação do experimento de fluorescência CFSE por célula após o experimento ter sido usado para identificar células que se dividiram 0, 1, 2, 3 ou várias vezes, com base na diluição do marcador. Direita: imagem de lapso de tempo contínuo de células vivas (rastreamento de 84 células únicas transfectadas com DsRed foi usado (detalhes nas informações de suporte Figs. 10, 11). Todos os dados são médias ± SEM de três (esquerda) ou dois (direita) biológicos replica Abreviaturas: Aqp4, aquaporina 4 CFSE, carboxifluoresceína EdU, 5-etinil-2´-desoxiuridina GFAP, proteína glial fibrilar ácida.

Para que a hipótese 1 seja verdadeira, os mAGES originais precisariam morrer após a exposição ao FGF2, a fim de abrir espaço para o NSC em expansão e explicar a perda observada de células positivas para GFAP. Portanto, examinamos cuidadosamente os sinais de morte celular e também medimos a liberação de LDH no meio como medida integral da morte celular putativamente contínua. Nenhuma indicação de morte celular foi observada (Informação de Apoio Fig. 10A). A hipótese-1 seria reforçada, se as células-tronco quiescentes pudessem ser identificadas. No entanto, não identificamos nenhuma célula CD133 +, e as culturas de mAGES foram homogeneamente Ki67 -, p27 +, dentro da faixa de nossos limites de detecção 51.

A hipótese 2 seria suportada, se os estágios celulares intermediários fossem identificados que combinam propriedades de astrócitos e células em proliferação, por exemplo, astrócitos GFAP- e / ou Aqp4-positivos devem ser observados para reentrar no ciclo celular e incorporar EdU no DNA após exposição ao FGF2. Para este propósito, células duplamente positivas para EdU e um marcador de astrócitos foram identificados em diferentes pontos de tempo durante o processo de desdiferenciação de 8 dias (Fig. 6B). Em todos os pontos de tempo, a maioria das células em proliferação (positivas para EdU) coexpressaram GFAP e / ou Aqp4 (Fig. 6C, 6D). Após o dia 7, a proporção de células duplamente positivas GFAP e EdU diminuiu, consistente com a regulação negativa de GFAP após exposição prolongada a FGF2. Esses dados indicam que astrócitos maduros, positivos para GFAP e Aqp4, reentraram no ciclo celular em resposta ao FGF2.

Três abordagens de imagem foram usadas para obter mais informações: primeiro, usamos um método estabelecido de diluição de rótulo fluorescente (CFSE) 61 (adaptado à cultura aderente) para calcular a porcentagem de células em divisão. Um histograma da intensidade total de CFSE em 20.000 células mostrou que a intensidade do marcador diminuiu em 72% das células em culturas expostas ao FGF2 (para indicar pelo menos uma divisão), em comparação com as células de controle não expostas ao FGF2. Levando em consideração a quantificação das etapas de diluição do marcador (2x, 4x, 8x) nas células, e calculando os números de células respectivamente aumentados no momento da análise, descobrimos que & gt50% dos mAGES originalmente presentes no dia 0 tinham se dividido no pelo menos uma vez (Fig. 6E, Informações de Apoio Fig. 10B).

Em segundo lugar, para confirmar os dados de rotulagem CFSE e para seguir diretamente a divisão de mAGES, a imagem de lapso de tempo de célula viva foi realizada. Os mAGES foram transfectados com DsRed para rastrear células individuais (usando a ferramenta de rastreamento de Timm, que foi desenvolvida para rastrear células-tronco neurais isoladas in vitro 54, 55) (Informações de apoio Fig. 11B, 11D, Vídeo de informação de apoio 1). Árvores de linhagem foram produzidas para 84 células, das quais 42 (50%) divididas durante 10 dias de exposição ao FGF2. Muitas das células se dividiram uma vez (19%), enquanto outra grande subpopulação (19%) se dividiu ≥3 vezes (Informações de Apoio Fig. 10C). A maioria das células (60%) iniciou sua primeira divisão celular nos dias 6-8 de exposição ao FGF2 (Informações de Apoio Fig. 10D), o que é consistente com a incorporação de EdU começando a aumentar no dia 5.

Como terceira abordagem de imagem, seguimos as células por microscopia de lapso de tempo de contraste de fase em culturas de baixa densidade, para garantir que toda a população pudesse ser capturada. Este conjunto independente de experimentos também mostrou que cerca de 50% dos mAGES (células planas com uma morfologia em forma de estrela) se dividiram (Informações de Apoio Fig. 11A, 11C, Informações de Apoio Vídeo 2). Após duas a três divisões, as células mudaram sua aparência e adotaram uma morfologia semelhante à do NSC (Supporting Information video 2, Supporting Information Fig. 3). Nenhuma divisão celular foi observada em culturas de controle mantidas em meio que não continha fatores (Supporting Information Video 3). Assim, um grande corpo de evidências apóia a hipótese-2.

Bloqueando a geração de NSC2 de mAGES por sinalização IFNγ

Para investigar como a desdiferenciação de astrócitos pode ser afetada por mediadores presentes em um ambiente patológico, os mAGES foram expostos a citocinas inflamatórias (TNFα, IL1β, IFNγ) durante a desdiferenciação com FGF2. Para uma primeira visão geral, a redução da resazurina foi medida para avaliar a proliferação celular em resposta ao FGF2. TNFα ou IL1β por si só não reduziram a proliferação, mas uma combinação de ambas as citocinas foi eficaz. IFNγ, sozinho ou em combinação com outras citocinas, também atenuou a proliferação de mAGES (Fig. 7A). Esses dados foram confirmados, quando a incorporação de EdU foi medida: a mistura completa de citocinas (CCM) ou várias combinações das três citocinas reduziram em grande parte a síntese de DNA (Fig. 7B). IFNα ou IFNβ não mostraram qualquer efeito na desdiferenciação induzida por FGF2 de mAGES (não mostrado). Assim, o receptor de IFNγ afetou especificamente a desdiferenciação de astrócitos, além de seu efeito descrito diretamente no NSC 62 quiescente. Notavelmente, a regulação negativa de GFAP e a regulação positiva de nestina durante a desdiferenciação foram afetadas pelas mesmas combinações de citocinas quanto à proliferação / síntese de DNA, mas o tamanho do efeito geral foi menor (Informações de Apoio Fig. 12).

Bloco de geração de NSC2 a partir de mAGES por sinalização IFNγ. (UMA): Os mAGES foram expostos a 20 ng / ml de FGF2 por 8 dias, e a redução de resazurina foi usada como medida substituta do número de células. Os dados indicam a porcentagem de aumento do sinal de fluorescência da resazurina (proporcional ao número de células) em relação às condições de controle (sem FGF2). As células expostas ao FGF2 foram co-tratadas com várias combinações de citocinas inflamatórias (10 ng / ml TNFα, 10 ng / ml IL1β, 20 ng / ml IFNγ) ou mistura completa de citocinas (CCM). Os dados são médias ± SEM ***, p & lt .0001 *, p & lt .01 ns, não significativo (vs. FGF2). (B): O experimento foi realizado como em (A), com adição de EdU nas últimas 48 horas e coloração dos núcleos com H-33342. A porcentagem de células positivas para EdU foi quantificada. (C): Os mAGES foram expostos a 20 ng / ml de FGF2 por 8 dias. As células expostas a FGF2 foram co-tratadas com 20 ng / ml de IFNγ e várias concentrações de ruxolitinib (Rux). EdU foi quantificado como em (B). (D): O experimento foi realizado como em (C), com CCM em vez de IFNγ. (E): Os mAGES foram pré-incubados por 30 minutos com ruxolitinibe (1 µM) e expostos a FGF2 (20 ng / ml) e / ou IFNγ (20 ng / ml) por 20 minutos. Phospho-STAT1 (pSTAT1) foi analisado por Western blot (actina como controle de carga). O experimento foi repetido uma vez com resultado semelhante. (F): O experimento foi realizado como em (E), com CCM em vez de IFNγ. O experimento foi repetido uma vez com resultado semelhante. Abreviaturas: CCM, mistura completa de citocinas EdU, 5-etinil-2´-desoxiuridina IFNγ, interferon-γ pSTAT1, Phospho-STAT1.

Como o IFNγ sozinho foi suficiente para inibir a desdiferenciação de mAGES, seu mecanismo de ação foi explorado posteriormente. Nenhum efeito do óxido nítrico (NO) devido à indução da sintase do óxido nítrico induzível (iNOS) após a exposição à citocina pode ser observado, conforme testado por vários inibidores de iNOS (L-NNA, AMT, 7-NINA) ou doadores de NO em mAGES durante exposição ao FGF2 (dados não mostrados). Ruxolitinibe (Rux), um inibidor de JAK1 / 2 (Fig. 3A), foi usado para testar o papel da via JAK / STAT. Em mAGES expostas a FGF2 mais IFNγ ou CCM, o co-tratamento com ruxolitinib evitou a atenuação da proliferação e da incorporação de EdU, que de outra forma é desencadeada por IFNγ ou CCM (Fig. 7C, 7D, Informação de Apoio Fig. 13A, 13B). A análise de Western blot revelou que a mesma concentração de Rux, que mostrou fortes efeitos no destino celular (1 µM), também bloqueou completamente a fosforilação de STAT1 após exposição de curto prazo a IFNγ ou CCM (Fig. 7E, 7F), ou após exposição prolongada (Informações de apoio Fig. 13C). Também descobrimos que nem IFNγ nem ruxolitinibe afetaram a sinalização de FGF2 a montante (fosforilação de ERK) (Informação de Apoio Fig. 13D). A partir disso, concluímos que a via JAK / STAT, desencadeada por IFNγ, atenua a desdiferenciação de astrócitos a jusante da expressão da superfície do receptor de FGF2 e sinalização proximal (Fig. 3A).


Conclusão

Há uma necessidade crítica de revisar os métodos de cultura, a mídia e os componentes usados ​​na cultura de células-tronco de glioma. Nesta revisão, resumimos os meios de cultura mais comumente usados ​​e seus componentes. Também enfatizamos a função de cada componente usado nos meios de cultura. Além disso, destacamos a necessidade de um sistema de cultivo de células-tronco de glioma padronizado. Propomos que um meio de cultura de células-tronco de glioma padrão deve incluir meio neurobasal com N2 (Gibco), EGF, bFGF, fator inibidor de leucemia e heparina para evitar inconsistências na pesquisa de células-tronco de glioma devido a problemas técnicos de cultura.

Para evitar discrepâncias na pesquisa relacionada a células-tronco de glioma, um procedimento de cultura de células-tronco de glioma padronizado é essencial. Recomendamos meio neurobasal como meio basal em vez de DMEM / F-12. As razões para esta recomendação são as seguintes: Em primeiro lugar, o meio neurobasal está disponível comercialmente, é uniforme e está pronto para ser usado. Portanto, pode reduzir o viés devido à variabilidade do usuário na fabricação do meio. Em segundo lugar, os componentes do meio neurobasal são semelhantes aos do DMEM / F-12, embora haja reduções em NaCl, cisteína / cistina e glutamina. Por último, o meio neurobasal também contém os antioxidantes vitamina E, glutationa, piruvato, catalase e superóxido dismutase, que ajudam a melhorar a sobrevivência das células de glioma. A adição de fator de sobrevivência neuronal-1 e N-acetilcisteína não é necessária no meio de cultura.

Além do meio basal, os suplementos também são componentes importantes. O suplemento que recomendamos é Gibco N2, e não recomendamos a adição de B27. Uma vez que existem componentes sobrepostos em N2 e B27, os componentes sobrepostos podem afetar os resultados de quaisquer ensaios a jusante. Além disso, foi relatado que o acetato de retinila e a triiodo-1-tironina em B27 promovem a diferenciação de várias células precursoras.

Para manter o crescimento a longo prazo das células-tronco de glioma, o coquetel de fator de crescimento de EGF (20 ng / ml), bFGF (20 ng / ml), fator inibidor de leucemia e heparina também é recomendado para cultura de células-tronco de glioma. O EGF pode manter as células-tronco do glioma responsivas ao EGF em suspensão e o bFGF pode promover o crescimento de longo prazo das células-tronco do glioma [24]. O bFGF é instável em um meio de cultura, portanto, heparina (5 μg / mL) deve ser incluída no meio para estabilizar o bFGF e prevenir sua degradação [54]. As diferenças fundamentais entre os requisitos de crescimento para células-tronco de glioma e células-tronco neurais já foram relatadas pelo grupo de Weiss [36]. As células-tronco de glioma são células independentes de mitógenos exógenos, enquanto as células-tronco neurais são dependentes de mitógenos e requerem mitógenos exógenos para proliferar. A adição de EGF e bFGF ao meio de cultura pode aumentar a sobrevivência e proliferação de células-tronco de glioma e pode alterar seu potencial fenotípico em direção ao de neurônios, astrócitos e oligodendrócitos após diferenciação in vitro. É importante notar que as células-tronco do glioma podem iniciar tumores altamente invasivos que se assemelham aos glioblastomas humanos quando as células-tronco do glioma são transplantadas para camundongos imunocomprometidos [36]. Ao contrário, as células-tronco neurais não poderiam formar esses tumores em camundongos.

Carpinteiro et al. observaram que as células-tronco neurais responsivas a bFGF não podiam crescer por um longo período de tempo, mas isso poderia ser superado pela adição de fator inibidor de leucemia (10 mg / m) ao meio [50]. Além disso, o fator inibidor da leucemia pode manter a stemness das células-tronco do glioma, e o EGF, bFGF e o fator inibidor da leucemia, juntos, permitem a expansão das células-tronco neurais em cultura e permitem que retenham sua multipotência por pelo menos 1 ano in vitro [50 ] Portanto, o uso do fator inibidor da leucemia nos meios de cultura padrão também é recomendado.

Além das diferenças características entre as células-tronco de glioma e as células-tronco neurais, elas também têm sensibilidades diferentes à quimioterapia e à radioterapia. Gongo et al. relataram que a temozolomida diminuiu a viabilidade das células-tronco neurais enquanto afetava minimamente as células-tronco de glioma. Além disso, a temozolomida pode induzir a morte celular em células-tronco neurais, mas não em células-tronco de glioma [70, 71]. A redução ou morte de células-tronco neurais pode, pelo menos parcialmente, explicar os prejuízos cognitivos vistos em pacientes com glioblastoma após o tratamento com temozolomida. Além disso, os efeitos da radioterapia nas células-tronco neurais também são diferentes de seus efeitos nas células-tronco de glioma. A radioterapia induz apoptose aguda em células em divisão e reduz o pool de células-tronco neurais mitóticas, principalmente as células-tronco neurais ativadas e as células progenitoras neurais [72]. As células-tronco do glioma são, no entanto, resistentes à radioterapia [15]. Para estudar mais o mecanismo de resistência das células-tronco do glioma à quimiorradioterapia, mais pesquisas são necessárias neste campo e meios e procedimentos padronizados são cruciais.

Em resumo, há uma necessidade de padronização da cultura de células-tronco de glioma para evitar resultados tendenciosos causados ​​pelos componentes do meio e propomos um meio de cultura de células-tronco de glioma padrão, que deve incluir meio neurobasal com N2 (Gibco), EGF, bFGF, leucemia fator inibitório e heparina para evitar discrepâncias nos resultados dos estudos com células-tronco de glioma devido a problemas técnicos de cultura.


Assista o vídeo: Regenerative Medicine and Stem Cells (Novembro 2021).