Em formação

Localização da proteína quinase-A


A proteína quinase-A está localizada no citosol / citoplasma das células ou na membrana plasmática? Além disso, é considerada uma molécula receptora, uma vez que é dependente de cAMP?

Toda e qualquer ajuda é apreciada. Obrigado!


A localização da proteína quinase A (PKA) não pode ser explicitamente respondida, pois a localização depende do estado de ativação da proteína. Vamos dar uma olhada na proteína em si primeiro, pois isso é importante para a ativação.

PKA consiste em quatro subunidades, duas subunidades catalíticas e duas subunidades regulatórias. Veja a imagem do artigo da Wikipedia sobre PKA:

Cada subunidade reguladora R está se ligando a duas moléculas de AMP cíclico (cAMP) e se dissocia do complexo de proteínas. Isso liberta as subunidades catalíticas, que podem então transferir grupos fosfato de ATP para resíduos de serina ou treonina de proteínas-alvo. Entre as proteínas alvo está também a Fosfodiesterase (PDE) que é ativada por fosforilação a partir de PKA. A PDE ativada hidrolisa cAMP em AMP, o que reduz a quantidade de cAMP livre necessária para a ativação de PKA. PKA também é inativado por fosforilação.

Na célula, você encontrará PKA em quase todos os lugares. A crença tradicional é que a proteína é ativada no citosol e entra no núcleo, onde fosforila alvos como o CREB, que posteriormente se liga à sequência do CRE nos promotores do gene e ativa esses genes. A referência 1 mostra que PKA também está ativado no núcleo, o que significa que também a forma inativa está presente lá. A referência 2 fornece um bom resumo do artigo.

A subunidade reguladora da forma inativa da PKA se liga a uma classe especial de proteínas: as proteínas âncora da quinase A (AKAP). Estes são ligados à membrana e permitem a associação de PKA às membranas, embora a própria proteína não se ligue diretamente à membrana. A família AKAP é bastante grande (pelo menos 50 membros da família são conhecidos hoje), o que provavelmente permite a localização de PKA em diferentes membranas. Dê uma olhada nas referências 3-5 para obter detalhes sobre a localização e a ancoragem.


Referências:

  1. Regulação da PKA nuclear revelada pela manipulação espaço-temporal do AMP cíclico.
  2. Proteína quinase A ativada no núcleo, bem como no citoplasma
  3. Onde e quando da ancoragem da quinase
  4. Localização de A-quinase por meio de proteínas de ancoragem.
  5. As funções biológicas das proteínas âncora da quinase A

Está presente em todo o citosol, mas também pode ser ancorado à membrana plasmática e às mitocôndrias por meio de interações indiretas. Também pode ser translocado para o núcleo. (Veja aqui).

Não é chamado de receptor para cAMP (embora o mecanismo seja homólogo).


Mobilidade e localização de proteínas em membranas excitáveis

A rede de modo padrão do cérebro consiste em áreas corticais discretas, bilaterais e simétricas, nos córtices parietal medial e lateral, pré-frontal medial e temporal medial e lateral dos cérebros humano, primata não humano, gato e roedor. Seu . consulte Mais informação

Figura 1: A evolução da literatura sobre a rede de modo padrão (DMN). Desde a publicação de “A Default Mode of Brain Function” (Raichle et al. 2001), quase 3.000 artigos foram publicados sobre isso.

Figura 2: Visualizações da rede de modo padrão da perspectiva de diminuição da atividade durante o desempenho da tarefa (a) e conectividade funcional em estado de repouso (bec) e em relação a outra rede.

Figura 3: Comparação da rede de modo padrão (DMN) em ratos, macacos e humanos. Para o DMN de rato (a, painel superior): agrupamentos significativos incluem 1, córtex orbital 2, córtex pré-límbico (PrL) 3, cingulato.


Fundo

A luz é uma faca de dois gumes: é essencial para a vida no planeta, mas também causa danos celulares e morte. Conseqüentemente, os organismos desenvolveram sistemas não apenas para coletar e converter a energia da luz em energia química, mas também para resistir aos seus efeitos tóxicos. O papel fotoprotetor da plastoquinona-9 [1] e a dissipação da luz absorvida como calor envolvendo a xantofila [2] são exemplos.

Uma ampla variedade de organismos fotossintéticos e não fotossintéticos, como fungos filamentosos, sentem e respondem à luz [3]. A adaptação ao DNA e aos danos às proteínas causados ​​pelos comprimentos de onda ultravioleta (UV, & lt 400 nm) [3, 4] podem explicar a ampla distribuição de alguns dos sistemas de proteção contra a luz na árvore da vida. UVA causa quebras de fita simples no DNA, enquanto UVB estimula a formação de dímeros de timina e citosina e causa quebra de DNA de fita dupla. Proteger o DNA desses efeitos mutagênicos da luz ultravioleta de alta energia é essencial, como ilustrado pela coevolução dos papéis sensoriais de luz e de reparo do DNA das fotolases [5]. Nas proteínas, o grupo indol do triptofano é o absorvedor de UV dominante [6, 7]. A excitação do indol danifica a estrutura e integridade das proteínas e pode converter proteínas em fotossensibilizadores que produzem espécies reativas de oxigênio (ROS). ROS, por sua vez, reage intracelularmente com muitas biomoléculas, incluindo DNA, causando disfunção celular e mutação [8]. Muitos organismos se adaptaram para evitar os efeitos tóxicos da absorção de UV por proteínas e DNA, evoluindo a produção constitutiva ou induzida por UV de pigmentos, como carotenóides ou melaninas, que são absorvedores de UV de banda larga e luz visível que são capazes de dissipação não radiativa de até 99,9% da luz absorvida [9]. Nesses organismos, genes de biossíntese de pigmentos defeituosos, conseqüentemente, conferem alta sensibilidade aos raios ultravioleta [10].

A fotobiologia da luz visível (400–700 nm) é muito menos compreendida do que a da luz ultravioleta. A toxicidade da luz visível é geralmente atribuída à produção induzida pela luz de ROS por fotossensibilizadores endógenos, como flavinas e porfirinas [11, 12]. Os fungos percebem a luz visível através do fotorreceptor White Collar 1 (WC-1), que junto com seu parceiro de interação WC-2 atua como um fator de transcrição ativado pela luz [3]. Opsinas, fitocromos e criptocromos também têm funções fotossensoriais em alguns fungos, mas estão ausentes no modelo-chave de levedura Saccharomyces cerevisiae [13]. S. cerevisiae em vez disso, sente a luz através de uma acil-CoA oxidase peroxissômica contendo flavina, Pox1, que libera H2O2 e inicia um H2O2cascata de sinalização induzida [14]. Outras proteínas associadas à flavina também podem ser excitadas pela luz visível e podem contribuir tanto para a detecção e sinalização de luz quanto para a toxicidade da luz, esta última por meio da fotossensibilização e produção de ROS [11, 12]. Apenas a succinato desidrogenase, Sdh1, e a L-arabinono-1,4-lactona oxidase, Alo1, ligam covalentemente a flavina na levedura. Ainda assim, 1% das proteínas de levedura e 1–3% das proteínas bacterianas e eucarióticas em geral, se ligam transitoriamente aos metabólitos contendo flavina FMN (mononucleotídeo de flavina) ou FAD (dinucleotídeo de flavina adenina) [15, 16] e usa-os como co -fatores para impulsionar reações químicas.

A membrana mitocondrial interna é particularmente rica em proteínas de ligação de flavina e porfirina, na forma de citocromos que absorvem luz azul. Foi relatado que a absorção de luz azul danifica os citocromos de uma maneira dependente de oxigênio, encerrando a respiração mitocondrial [17]. Além disso, a ausência de DNA mitocondrial e de citocromos confere resistência à luz [18]. A luz visível também controla a alternância metabólica oscilatória entre a fermentação e a respiração em células de levedura famintas, com os efeitos mais fortes conferidos por comprimentos de onda correspondentes aos máximos de absorvância dos citocromos [19]. Em última análise, a luz visível danifica o DNA [20], perturba as mitocôndrias [21], suprime a mitose [22] e inibe a respiração, a síntese de proteínas e o transporte de membrana [18]. Mas não se sabe se esses efeitos são direta ou indiretamente devidos à luz e quais são os mecanismos subjacentes. Essa luz visível ativa o H2O2O fator de transcrição induzido Yap1 e que as células são hipersensíveis à luz visível na ausência de Yap1 apóia um modelo em que a toxicidade da luz depende da geração de ROS [19].

Nós expusemos o S. cerevisiae coleção knockout de genes para luz visível em intensidades moderadamente estressantes comparáveis ​​àquelas que a levedura freqüentemente experimenta na natureza e mede os defeitos de crescimento. Descobrimos que a sinalização da via HOG, a transcrição, a tradução de proteínas e a resposta ao estresse oxidativo se destacam conforme necessário para a resistência normal à luz visível. A maioria dos mutantes sensíveis à luz mostraram transporte reduzido do fator de transcrição Msn2 para o núcleo e acúmulo de glicogênio diminuído, ambos marcadores de uma atividade anormalmente alta da proteína quinase A (proteína quinase dependente de AMPc, PKA). Portanto, usamos um repórter de PKA fluorescente e mutantes geneticamente modificados para ter atividade de PKA constitutivamente alta ou baixa para mostrar que a repressão de PKA é necessária para resistência à luz e, portanto, parece ser um denominador comum.


Proteína quinase A RII-like (R2D2) proteínas exibem localização diferencial e interação AKAP †

O conteúdo deste trabalho é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano ou NIH.

Resumo

As proteínas de ancoragem de A-quinase (AKAPs) se ligam à proteína quinase A (PKA) por meio de um domínio de hélice anfipático que interage com um domínio de dimerização / docking na subunidade regulatória (R) de PKA. Quatro outras proteínas de mamífero (ROPN1, ASP, SP17 e CABYR) também contêm um domínio de dimerização / docking RII altamente conservado (R2D2), sugerindo que todas as quatro proteínas podem interagir com todas as AKAPs de uma maneira semelhante a RII. Todas as quatro dessas proteínas foram detectadas originalmente no flagelo do espermatozóide de mamíferos. Neste relatório, demonstramos que todas as quatro proteínas R2D2 são expressas em uma ampla variedade de tecidos e três das proteínas SP17, CABYR e ASP estão localizadas em cílios móveis de brônquios humanos e trompas de falópio. Além disso, detectamos SP17 em cílios primários. Também fornecemos evidências de que ROPN1 e ASP se ligam a uma variedade de AKAPs e essa interação pode ser interrompida com peptídeos inibidores de ancoragem. A interação de SP17 e CABYR com AKAPs parece ser muito mais limitada. Nenhuma das proteínas R2D2 parece ligar-se ao cAMP, uma característica fundamental das subunidades regulatórias de PKA. Essas observações sugerem que as proteínas R2D2 utilizam interações de docking com AKAPs para cumprir sua função de regular cílios e flagelos. Com base na localização, afinidade para AKAPs e falta de afinidade para cAMP, parece que cada proteína R2D2 tem um papel único neste processo. Cell Motil. Citoesqueleto 2008. © 2008 Wiley-Liss, Inc.

Este artigo contém material suplementar disponível na Internet em http://www.interscience.wiley.com/jpages/0886-1544/suppmat

Nome do arquivo Descrição
cm20279-SupplementalFig1.tif8.6 MB Figura suplementar 1. Expressão da proteína R2D2 fora das células epiteliais da tuba uterina humana e brônquio. Coloração imunohistoquímica da tuba uterina humana (coluna da esquerda) e brônquios (coluna da direita) cortes transversais com CABYR (linha 1), SP17 (linha 2), ROPN1 (linha 3) e ASP (linha 4) anticorpos policlonais de coelho. As imagens representam a mesma coloração da Figura 4, em aumento inferior (40X). Na trompa de Falópio, a coloração de R2D2 é geralmente restrita ao epitélio (coluna da esquerda, linhas 1-3 CABYR, SP17 e ROPN1, respectivamente), exceto para ASP, que parece ser expresso em todo o tecido (coluna da esquerda, linha 4). CABYR, SP17 e ROPN1, mas não ASP, coram as glândulas mucinosas da mucosa brônquica (coluna da direita, linhas 1-4, respectivamente).
cm20279-SupplementalFig2.tif10,7 MB Figura suplementar 2.Padrões de expressão de proteínas R2D2 em testículos humanos e espermatozoides. Coloração imunohistoquímica de seções transversais de testículo humano com CABYR (linha 1), SP17 (linha 2), ROPN1 (linha 3) e ASP (linha 4) anticorpos policlonais de coelho. A coloração de Brown Diaminobenzidina (DAB) indica detecção de R2D2. CABYR, SP17 e ROPN1, mas não a coloração ASP, está presente nas caudas dos espermatozoides. Além disso, CABYR e ASP coram o citoplasma dos espermatócitos dentro dos túbulos seminíferos, representando vários estágios da espermatogênese. Exemplos de coloração da cauda são indicados com setas em fotografias 100X (coluna da direita). A contracoloração com hematoxilina azul cora as regiões ricas em ácido nucléico. Os asteriscos indicam regiões de atividade da peroxidase endógena que também são observadas em seções coradas apenas com o secundário (dados não mostrados).

Observação: O editor não é responsável pelo conteúdo ou funcionalidade de qualquer informação de suporte fornecida pelos autores. Quaisquer dúvidas (que não sejam de conteúdo ausente) devem ser direcionadas ao autor correspondente do artigo.


Localização Subcelular de Proteína

LocDB é um banco de dados com curadoria de especialistas que coleta anotações experimentais para a localização subcelular de proteínas em humanos (Homo sapiens) e erva daninha (Arabidopsis thaliana) O banco de dados também contém previsões de localização subcelular de uma variedade de métodos de previsão de última geração para todas as proteínas com informações experimentais.

As proteínas são os componentes funcionais fundamentais das células. Eles são responsáveis ​​por transformar a informação genética em realidade física. Essas macromoléculas medeiam a regulação gênica, catálise enzimática, metabolismo celular, replicação de DNA e transporte de nutrientes, reconhecimento e transmissão de sinais. A interpretação dessa riqueza de dados para elucidar a função das proteínas na era pós-genômica é um desafio fundamental. Até o momento, mesmo para os organismos mais bem estudados, como o fermento, cerca de um quarto das proteínas permanecem não caracterizadas. O principal obstáculo na determinação experimental da função da proteína é que os estudos requerem enormes recursos. Assim, a lacuna entre a quantidade de sequências depositadas em bancos de dados e a caracterização experimental das proteínas correspondentes é cada vez maior. A bioinformática desempenha um papel central em preencher essa lacuna de função de sequência por meio do desenvolvimento de ferramentas para uma previsão mais rápida e eficaz da função da proteína. Com este repositório, estamos tentando preencher a lacuna entre anotações experimentais e previsões e fornecer um conjunto de dados maior para o teste de novos métodos de previsão.

Quem somos nós?

Rostlab: The Rost Group na TU Munich
PP: Predict Protein - análise de sequência de proteínas, estrutura, função e previsão de localização subcelular
LocTree2: Predição de LOCalização subcelular para todos os domínios da vida
LOCtree (integrado em PredictProtein): Predição de LOCalização subcelular para alvos genômicos estruturais)
PredictNLS (integrado em PredictProtein): Predição e análise de sinais de localização nuclear
LOCnet: previsão de novo da localização subcelular de proteínas


Métodos

Cepas e condições de crescimento

C. albicans as cepas estão listadas na Tabela 1 As cepas foram cultivadas em meio líquido ou sólido YPD, YPS e meio SD mínimo suplementado, conforme descrito [13]. Para induzir hifas, as cepas foram cultivadas a 37 ° C em meio YP contendo 10% de soro de cavalo. C. albicans as cepas que produzem isoformas de PKA marcadas com HA no terminal C foram construídas por transformação de cepas heterozigotas que retêm um único alelo do respectivo gene. HA-URA3 As cassetes de marcação foram amplificadas por PCR usando pares de oligonucleotídeos no plasmídeo modelo p3HA-URA3, que gerou produtos de PCR terminando em sequências homólogas para direcionar os respectivos genes [41]. Os oligonucleotídeos Tpk1-HA (para) / (rev) e Tpk2-HA (para) / (rev) foram usados ​​para gerar as cepas marcadas AF1003 (TPK1 HA /TPK1) de CAI4, AF1004 (TPK1 HA /tpk1) de FII4a e AF1005 (TPK2 HA /TPK2) de AF1001. Da mesma forma, os oligonucleotídeos Bcy1-HA (para) / (rev) foram usados ​​para marcar um dos BCY1 alelos da cepa CAI4 para gerar a cepa AF1007 (BCY1 HA /BCY1) A integração cromossômica correta de cassetes de marcação foi verificada por PCR de colônia usando os iniciadores TPK1ver, TPK2ver, BCY1ver em combinação com o iniciador 3′Test HA-tag. Os oligonucleotídeos estão listados no arquivo adicional 2: Tabela S6.

Imunodetecção

Proteínas contendo uma etiqueta antigênica de hemaglutinina (HA) foram detectadas em extratos celulares por immunoblotting usando anticorpo monoclonal anti-HA de rato (Roche 1: 1000), que foi visualizado em blots usando anticorpo de cabra acoplado a peroxidase (Pierce 1: 10000). As células utilizadas para microscopia de imunofluorescência foram fixadas em formaldeído a 4% e 1 ml de suspensão celular foi tratada com zimoliase T100 (100 μg), glucuronidase (30 μl) e DTT 10 mM por 30 min a 30 ° C. As células foram sedimentadas e tratadas com Triton X-100 a 0,1% durante 5 min à temperatura ambiente. As células (20 μl) foram fixadas em lâminas de vidro revestidas com polilisina e lavadas com PBS, seguido pelo bloqueio de sítios de ligação inespecíficos usando 2% de leite em pó em PBS. A solução de bloqueio foi removida e 40 μl de anticorpo anti-HA de rato (Roche 1: 100) foram deixados reagir 90 min em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C em uma câmara úmida. As células foram lavadas e anticorpo anti-rato de cabra acoplado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Jackson Immunologic Research Lab Inc. 1: 100) em 0,2% de leite em pó foi adicionado e deixado reagir por 90 min em temperatura ambiente. Para a coloração nuclear, 20 μl de diamidino-2-fenilindol (DAPI 1 μg / ml) foram adicionados por 15 min em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas com PBS e uma gota de anti-desbotamento (Pro-Long Anti-Fade, Sigma) foi adicionada antes de cobrir a amostra com uma lamínula, que foi selada com esmalte de unha. A inspeção microscópica da fluorescência FITC e DAPI foi feita usando um microscópio confocal de disco giratório (Cell Observer® SD Yokogawa CSU-X1) e usando o programa Zen 2011 (Carl Zeiss) para avaliação das imagens.

Imunoprecipitação da cromatina em microchips (chip ChIP)

O procedimento de chip ChIP foi realizado essencialmente conforme descrito [13], exceto que as esferas magnéticas com anticorpos ligados foram eluídas duas vezes com tampão de eluição por 20 min a 65 ° C e que o RNA foi removido pela adição de 2,5 μl de RNase A (10 mg / ml Qiagen). C. albicans microarrays de ladrilhos genômicos foram sondados em pares por cromatina imunoprecipitada de uma cepa que produz uma proteína marcada com HA e uma cepa de controle correspondente. Os seguintes pares de cepas foram usados: II (TPK1 / tpk1) / AF1004 (TPK1-3 × HA / tpk1), TPK7 (TPK2 / tpk2) / AF1005 (TPK2-3 × HA / tpk2), CAF2-1 (BCY1 / BCY1) / AF1007 (BCY1-3 × HA / BCY1) Duas culturas independentes foram testadas para cada combinação de cepas.Picos de ligação significativos foram definidos como sondas contendo quatro ou mais sinais acima do fundo em uma janela deslizante de 500 bp, o grau de significância dependia do valor de FDR. Os resultados foram visualizados por meio do programa SignalMap (versão 1.9). Os picos de ligação mais significativos (FDR ≤ 0,05), que coincidiram em ambas as réplicas, foram analisados ​​pelo programa RSAT díade-análise para prever a sequência de ligação de todos os locais de ligação genômica de pico [36]. Uso de códon de todos C. albicans genes foram derivados do Candida Genome Database [24] e o uso de códons em sequências de ORFs ligados por Tpk2 foram calculados usando Codon Usage Calculator [43].

Disponibilidade de dados de apoio

Os conjuntos de dados que suportam os resultados deste artigo estão disponíveis no repositório Candida Genome Database (CGD): http://www.candidagenome.org/download/systematic_results/Schaekel_2013/.


Resultados

Clonagem de duas isoformas AKAP18 adicionais

Rastreamos uma biblioteca de expressão de cDNA de pulmão usando RII biotinilado como sonda e identificamos um novo cDNA que compartilha homologia de sequência com AKAP18, um AKAP associado à membrana previamente identificado (Fraser et al. 1998 Gray et al. 1998). O cDNA era idêntico a AKAP18 na extremidade 3 ', mas compartilhava pouca homologia com AKAP18 na extremidade 5' (dados não mostrados). Portanto, designamos o cDNA e o produto de proteína AKAP18γ, para indicar sua relação com outros membros da família AKAP18, incluindo AKAP18 relatado anteriormente (renomeado AKAP18α) e AKAP18β (discutido abaixo). O cDNA AKAP18γ original continha uma única fase de leitura aberta, mas nenhum local de ligação ao ribossomo de consenso ou metionina iniciadora. Portanto, usamos a amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE) com cDNA de pâncreas humano como molde para obter a sequência AKAP18γ de comprimento completo. O cDNA AKAP18γ mais longo isolado tinha 2.917 nt de comprimento com um único quadro de leitura aberto de nt 107 a 1086 (esses dados de sequência foram submetidos aos bancos de dados GenBank / EMBL / DDBJ sob o número de acesso AF152929). A sequência de cDNA a montante contém três códons de parada no quadro, e há códons de parada nos quadros de leitura alternativos (dados não mostrados), sugerindo que este é o quadro de leitura aberto correto.

O cDNA AKAP18γ codifica uma proteína de 326 aminoácidos com uma massa molecular calculada de 37 kD e um pI de 5,8. Os primeiros 262 aminoácidos são únicos e não compartilham homologia significativa com nenhuma proteína conhecida nos bancos de dados GenBank / EMBL / DDBJ. No entanto, os últimos 64 aminoácidos são idênticos ao AKAP18α humano e incluem um local de ligação RII conservado (Fig. 1 A). Não há pontos de miristoilação ou palmitoilação de consenso no NH2 terminal de AKAP18γ, sugerindo que a proteína AKAP18γ não é modificada pelas cadeias laterais de lipídios. Usamos PSORT (Nakai e Kanehisa 1992) para prever potenciais sequências de direcionamento subcelular e descobrimos que os aminoácidos 37 a 54 de AKAP18γ se encaixam nas especificações de um sinal de localização nuclear de consenso (Gerace 1992 Gorlich 1997 Nigg 1997).

Em estudos anteriores, mRNAs de -2,4-, 3,6- e 4,3-kb foram observados em tecidos de rato e humanos usando a região de codificação AKAP18α como uma sonda (Fraser et al. 1998 Gray et al. 1998). Usamos a análise de Northern blot para determinar se algum desses mRNAs representava o mRNA AKAP18γ e para determinar a distribuição da mensagem no tecido (Fig. 1 B). Usando uma sonda radiomarcada direcionada contra a região única de AKAP18γ, detectamos um transcrito dominante de ∼4,3-kb no coração, cérebro, placenta, pulmão e pâncreas, e um transcrito menor de 2,4-kb, que é abundantemente expresso no pâncreas.

Para comparar ainda mais as expressões de AKAP18α e AKAP18γ, usamos primers de sentido exclusivo emparelhados com um primer antisense comum em reações de RT-PCR. Usando um primer de sentido específico para o cDNA de AKAP18γ, obtivemos um produto 979-nt cuja sequência correspondia exatamente à obtida a partir da triagem da biblioteca de cDNA e reações 5 'RACE (Fig. 2 A). Surpreendentemente, os primers projetados para amplificar especificamente AKAP18α amplificaram consistentemente duas bandas de 246 e 315 nt (Fig. 2 A). O fragmento de 246 nt tinha o tamanho esperado do produto AKAP18α, que foi confirmado por sequenciação de DNA. A sequência do fragmento 315-nt correspondeu a AKAP18α nas extremidades 5 ′ e 3 ′, mas continha uma inserção de 69 pb (esses dados de sequência foram submetidos aos bancos de dados GenBank / EMBL / DDBJ sob o número de acesso AF161075). cDNA AKAP18β. Usamos RT-PCR para determinar se AKAP18α e -β são diferencialmente expressos em linhas celulares e tecidos. Ambos os cDNAs foram detectados em fibroblastos, linhas de células endócrinas e epiteliais, indicando que os dois mRNAs são amplamente expressos (Fig. 2 B). Embora não tenhamos sido capazes de amplificar de forma confiável o cDNA de AKAP18β do cérebro humano, um sinal fraco foi observado em algumas reações (dados não mostrados).

Os primeiros 16 aminoácidos de AKAP18β humano são idênticos a AKAP18α e são seguidos por uma inserção de 23 aminoácidos únicos (Fig. 2 C). Distalmente a esta inserção de 23 aminoácidos, AKAP18α e -β são idênticos um ao outro (Fig. 2C e Fig. D). Assim, identificamos três isoformas AKAP18 (denominadas α, β e γ) que compartilham um sítio de ligação RII comum, mas têm NH exclusivo2sequências terminais (Fig. 2 D).

Usamos a análise de Southern blot para determinar se essas isoformas AKAP18 surgem de um único gene. O DNA genômico foi digerido e hibridizado com uma sonda comum a todos os três cDNAs relacionados a AKAP18. Um único fragmento foi visualizado em Southern blots, sugerindo que AKAP18α, -β e -γ mRNAs surgem como produtos alternativos de um gene (Fig. 3 A). Isso é consistente com o fato de que as regiões 3 'não traduzidas de AKAP18α, -β e -γ são idênticas (dados não mostrados).

A análise preliminar da sequência genômica do rato AKAP18 (Fig. 3 B) indica que os resíduos 1–16 do AKAP18α (também contido no AKAP18β) são codificados por um único exon, este exon contém os determinantes para a modificação lipídica. Outro exão curto codifica os resíduos de 23 aminoácidos específicos para AKAP18β. Além disso, o domínio de ligação RII do terminal COOH encontrado em todas as isoformas AKAP18 está contido em um único exon. Tomados em conjunto, os dados indicam que o splicing alternativo de um único gene AKAP18 dá origem a (pelo menos) três mRNAs AKAP18 distintos que codificam diferentes produtos de proteína.

Análise de proteína de isoformas AKAP18

Para determinar se cada isoforma AKAP18 é capaz de se ligar a PKA, transfectamos transitoriamente células HEK-293 com cDNA que codifica cada isoforma e imunoprecipitamos as proteínas expressas com anti-soros específicos de AKAP18. Como esperado, cada uma das isoformas de AKAP18 imunoprecipitadas foi capaz de se ligar à subunidade RII em ensaios de sobreposição (Fig. 4 A). No entanto, uma nova classificação para AKAPs foi proposta, em que as proteínas de ancoragem devem ser capazes de interagir com a holoenzima PKA dentro das células (Colledge e Scott 1999). Portanto, também investigamos imunoprecipitados específicos de AKAP18 com anti-soros direcionados contra a subunidade C de PKA. A subunidade C foi detectada em imunoprecipitados para cada isoforma, mas estava ausente das experiências de controle com soros pré-imunes (Fig. 4 B). Assim, cada uma das isoformas AKAP18 funciona como uma AKAP genuína nas células.

Em seguida determinamos se cada uma das novas isoformas de AKAP18 foi expressa em tecidos de rato. Escolhemos o rim como um tecido onde o mRNA foi detectado para todas as três isoformas AKAP18, e o cérebro como uma fonte de tecido onde os níveis de mRNA AKAP18β eram baixos (Fig. 1 B e 2 B). Extratos solúveis em detergente foram preparados a partir de cérebro e rim, imunoprecipitações foram realizadas com anti-soros específicos de AKAP18 (VO57 ou R4570) e AKAPs foram detectados por sobreposição de RII (Fig. 4 C). Embora houvesse menos proteína AKAP18β no cérebro, duas bandas imunoprecipitaram do cérebro e do rim com anti-soro VO57 correspondendo a AKAP18α e -β. Ambas as proteínas foram preferencialmente acumuladas na fração particulada de rim de rato (Fig. 4 D). As bandas correspondentes a AKAP18α e -γ foram imunoprecipitadas de ambos os tecidos utilizando anti-soros R4570 (Fig. 4 C). Também examinamos a distribuição de AKAP18γ no rim de rato, e foi igualmente distribuído nas frações solúveis e particuladas (Fig. 4 D). Coletivamente, esses resultados sugerem que todas as três isoformas de AKAP18 clonadas são expressas como proteínas em células.

Localização de isoformas AKAP18 em células

O acúmulo de evidências sugere que os AKAPs compartimentalizam a PKA em compartimentos subcelulares discretos para facilitar os eventos responsivos ao cAMP e controlar a especificidade da sinalização intracelular (Colledge e Scott 1999). Portanto, cada AKAP contém um domínio de direcionamento responsável por localizar PKA em organelas específicas ou compartimentos subcelulares (Schillace e Scott 1999a). O direcionamento de AKAP18α é dependente da modificação lipídica através da miristilação de Gly e palmitoilação de Cys 4 e Cys 5 (Fraser et al. 1998). Consequentemente, os primeiros dez aminoácidos de AKAP18α abrangem a sequência mínima necessária para direcionar uma proteína repórter para a membrana plasmática (Fraser et al. 1998). Para determinar se as isoformas AKAP18 são direcionadas diferencialmente, transfectamos transitoriamente cDNAs que codificam cada construção em células HEK-293 e comparamos a distribuição intracelular das proteínas por fracionamento diferencial e microscopia imunofluorescente. AKAP18α e -β fracionados exclusivamente com as membranas celulares em tampões sem detergente (Fig. 5 A) e ambas as proteínas foram distribuídas na superfície da célula (Fig. 5 B). Isso é consistente com a segregação de AKAP18α e -β endógenos com a fração particulada de rim de rato (Fig. 4 D). Em contraste, uma fração significativa do AKAP18γ superexpresso particionado com a fração solúvel, embora ∼20% foi encontrado na fração particulada (Fig. 5 A). A proteína AKAP18γ expressa foi visualizada ao longo do citoplasma das células, mas não se acumulou significativamente no núcleo (Fig. 5 B). A distribuição uniforme do AKAP18γ endógeno nas frações solúveis e particuladas de rim de rato sugere que a superexpressão de AKAP18γ em células HEK-293 satura uma interação proteína-proteína necessária para manter um pool de partículas desta isoforma.

Localização de AKAP18α e AKAP18β em células epiteliais

Embora AKAP18α e -β sejam direcionados para membranas em células HEK-293, dados recentes indicam que a formação de microdomínios de membrana plasmática especializados é crucial para a sinalização intracelular eficiente em muitos tipos de células (Shaul e Anderson 1998 Fanning e Anderson 1999 Ostrom e Insel 1999 ) Portanto, consideramos se a inserção única de 23 aminoácidos presente em AKAP18β direciona esta isoforma para alvos específicos ou microdomínios da membrana plasmática. As células MDCK, uma linha de células epiteliais renais bem caracterizadas, formam uma monocamada compacta com superfícies apicais, basolaterais e juncionais distintas quando cultivadas em suportes de filtro permeáveis. Expressamos estavelmente cDNAs que codificam AKAP18α e -β marcados com GFP em células MDCK para comparar suas distribuições em células polarizadas. Experimentos anteriores estabeleceram que a fusão de GFP ao terminal COOH de AKAP18α não interrompe o direcionamento de membrana da proteína quimérica (Fraser et al. 1998).

A microscopia confocal realizada em culturas de células MDCK bem polarizadas indicou que as distribuições de AKAP18α e -β marcadas com GFP diferiam. AKAP18α / GFP foi acumulado predominantemente ao longo das margens laterais das células transfectadas. Em contraste, AKAP18β / GFP estava presente na membrana apical (Fig. 6 A) e se sobrepôs à distribuição da glicoproteína da membrana apical gp135 (Ojakian e Schwimmer 1988 Fig. 6 B). As proteínas AKAP18α / GFP e AKAP18β / GFP foram expressas em níveis relativamente iguais, e ambas as proteínas estavam presentes na fração particulada quando as células foram lisadas em tampões hipotônicos sem detergente (dados não mostrados). As membranas laterais das células epiteliais polarizadas são compostas por duas especializações de membrana, as junções tight e aderentes. A distribuição de AKAP18α se sobrepôs significativamente à distribuição de β-catenina, uma proteína que se acumula nas junções aderentes (Nathke et al. 1994 Fig. 6 B). Quando a distribuição de AKAP18α e -β foi comparada com a distribuição de ZO-1, um marcador para junções apertadas (Willott et al. 1992 Itoh et al. 1993), nenhuma proteína foi encontrada para se sobrepor significativamente (Fig. 6 B). Distribuições laterais e apicais de AKAP18α / GFP e AKAP18β / GFP, respectivamente, foram observadas em várias linhas celulares clonais independentes e em ensaios de transfecção transitória (dados não mostrados). AKAP18β foi observado em superfícies laterais de células MDCK bem polarizadas em clones que expressaram altos níveis da proteína transfectada (dados não mostrados), sugerindo que uma interação proteína-proteína saturável ou proteína-lipídio medeia a associação seletiva de AKAP18β / GFP com apical membranas.

O direcionamento diferencial de AKAP18α e -β não foi devido à superexpressão das proteínas nas células MDCK, uma vez que descobrimos que as proteínas endógenas também estavam distribuídas diferencialmente (Fig. 7). Para comparar as distribuições de AKAP18α e -β em células MDCK, geramos um anticorpo direcionado contra os resíduos 15-43 de AKAP18β (NC 257), este anticorpo reconhece especificamente o AKAP18β / GFP superexpresso de forma estável em células MDCK (Fig. 7 A). Além disso, o anticorpo não detecta AKAP18α / GFP nas bordas laterais das células MDCK transfectadas de forma estável, embora tenhamos observado a marcação da membrana apical dessas células, bem como alguma coloração pontilhada em direção ao pólo apical (Fig. 7 A). Em contraste, os anti-soros VO64 gerados contra AKAP18α recombinante, que detecta múltiplas isoformas de AKAP18 em Western blots (dados não mostrados), reconheceram AKAP18β / GFP e AKAP18α / GFP em células MDCK estavelmente transfectadas (Fig. 7 B). Tendo estabelecido que NC257 reconheceu seletivamente AKAP18β enquanto VO64 reconheceu ambas as isoformas AKAP18, nós coramos células MDCK de tipo selvagem com cada anti-soro e comparamos a distribuição de AKAP18 endógeno nessas células. Em células coradas com VO64, proteínas AKAP18 foram encontradas distribuídas ao longo das membranas celulares laterais (Fig. 7 C) com um padrão de coloração semelhante à distribuição de AKAP18α / GFP. A coloração pontilhada também foi observada na superfície da célula apical em seções confocais (dados não mostrados), que é consistente com a coloração (presumivelmente de AKAP18β endógeno) observada em células AKAP18α / GFP (Fig. 7 B). Em contraste, nenhuma coloração da superfície lateral da célula foi observada quando as células foram coradas com NC257 direcionado contra o exon específico β, embora uma coloração robusta de vesículas subapicais e apicais tenha sido observada (Fig. 7 C). Portanto, concluímos que em células MDCK polarizadas, AKAP18α e -β endógenos são direcionados diferencialmente às superfícies celulares lateral e apical, respectivamente. A formação de membranas resistentes a detergentes ou jangadas lipídicas está envolvida na transdução de sinal e na classificação de proteínas para a superfície apical da célula (Brown e London 1998). Portanto, testamos se o direcionamento diferencial de AKAP18α e -β correlacionou-se com o acúmulo seletivo de AKAP18β em jangadas lipídicas insolúveis em detergente. Para isso, realizamos experimentos de fracionamento subcelular na presença de diferentes concentrações de Triton X-100 e comparamos as solubilidades de AKAP18α e -β. Uma vez que ambas as proteínas foram facilmente extraídas em tampões contendo 0,2% de Triton X-100 (dados não mostrados), concluímos que AKAP18β não está associado a complexos insolúveis em detergente na superfície apical de células MDCK.

A sequência única de AKAP18β contém informações de direcionamento apical

Nossos estudos de expressão mostram que AKAP18α e -β são direcionados diferencialmente em células epiteliais polarizadas, mas eles apenas diferem pela presença de um exon alternativo que codifica 23 aminoácidos (Fig. 2 e Fig. 3). Para explorar ainda mais a função desta sequência específica de AKAP18β, geramos três proteínas de fusão GFP correspondentes a exons no gene AKAP18: 1-16αβ / GFP, que abrange o domínio de segmentação de membrana comum 17-44β / GFP, que abrange o específico AKAP18β sequência e 1-44β / GFP, que inclui ambos os exões (Fig. 8 A). Em primeiro lugar, expressamos transitoriamente cada uma das quimeras GFP em células HEK-293 para comparar a eficiência com a qual as proteínas expressas foram direcionadas para a superfície celular. Ambos 1-16αβ / GFP e 1-44β / GFP foram detectados na superfície da célula, enquanto a proteína 17-44β / GFP foi uniformemente distribuída por toda a célula (Fig. 8 B). Da mesma forma, quando a quimera 17-44β / GFP foi expressa de forma estável em células MDCK, a proteína foi distribuída por todo o citoplasma e núcleo (Fig. 8 C). Estes resultados indicam que a inserção de 23 aminoácidos única para AKAP18β não é suficiente para mediar o direcionamento de membrana. No entanto, a localização das proteínas 1-16αβ / GFP e 1-44β / GFP diferiram claramente quando expressas de forma estável em células MDCK. A proteína 1-16αβ / GFP teve como alvo a membrana plasmática, e a maior parte da proteína expressa foi distribuída ao longo das bordas laterais das células (Fig. 8 C). A proteína 1-44β / GFP também foi direcionada para a membrana plasmática em células MDCK. No entanto, uma fração significativa da proteína 1-44β / GFP estava presente na superfície apical da célula, embora a proteína tenha sido detectada ao longo das bordas laterais. Coletivamente, esses dados indicam que a inserção de 23 aminoácidos única para AKAP18β facilita o direcionamento de AKAP18β para a membrana apical.


Proteína Quinase A

As proteínas quinases são enzimas encontradas dentro do nosso corpo responsáveis ​​por catalisar as reações de fosforilação. A fosforilação é um exemplo de modificação covalente e este é um mecanismo que nossas células usam para regular e controlar basicamente a atividade de enzimas e a funcionalidade de proteínas. A proteína quinase é a proteína quinase dependente de cAMP, também conhecida como proteína quinase A ou PKA.

Como a adrenalina viaja pelo nosso sistema cardiovascular quando em situação estressante, ela basicamente estimula nossas células a transformar as moléculas de ATP em outra molécula conhecida como monofosfato de adenosina cíclico ou simplesmente cAMP. cAMP é um nucleotídeo cíclico que atua como um "segundo mensageiro" intracelular e, em alguns casos, extracelular, mediando a ação de muitos peptídeos ou hormônios amina, regulado por vários receptores como GPCRs, incluindo Alfa e Beta-ADRs (receptores adrenérgicos), CRHR ( Receptor de hormônio liberador de corticotropina), GcgR (receptor de glucagon), Smo (suavizado) etc.É também um regulador alostérico da proteína quinase A e se liga à versão inativa da proteína quinase A e ativa a proteína quinase A que se torna responsável por ativar muitos tipos diferentes de enzimas através do processo de fosforilação e fosforila um dos dois tipos de resíduos quer o resíduo de serina quer os resíduos de treonina.

Se a molécula de substrato contém a sequência de aminoácidos de consenso de -arginina-arginina-X-serina ou treonina-Y-, em que X é basicamente qualquer pequeno aminoácido, por exemplo glicina e Y é basicamente qualquer grande aminoácido hidrofóbico, é basicamente onde a proteína quinase A se ligará e o que ela fosforilará neste lado alvo, a serina ou treonina. A primeira arginina na sequência de consenso pode ser alterada para lisina e isso também permitirá que a proteína quinase A se ligue. Mas a afinidade da sequência alterada pelo resíduo não será tão boa quanto no caso em que esses dois são resíduos de arginina. Ela pode basicamente alterar a atividade e a funcionalidade dessa molécula de substrato alvo.

A PKA é composta por dois tipos de subunidades, subunidade catalítica contendo o lado ativo e subunidade reguladora contendo sítio alostérico que se liga ao AMP cíclico. A subunidade catalítica realiza a reação de adição de fosfato. A subunidade regulatória detecta o nível de AMP cíclico e, em seguida, ativa ou desativa as subunidades catalíticas com base nesse nível. Quando os níveis de cAMP são baixos, um dímero das subunidades regulatórias se liga a duas cópias da subunidade catalítica, formando um complexo inativo. Quando os níveis de cAMP aumentam, ele se liga à subunidade reguladora, liberando a subunidade catalítica em uma forma ativa. Para ser mais especificamente, na ausência de um efetor alostérico, a estrutura quaternária de PKA consiste em duas subunidades catalíticas e duas subunidades regulatórias (complexo R2C2). Em condições estressantes, a adrenalina é liberada e estimula a produção de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), que é um efetor alostérico de PKA. Quando o cAMP se liga a todos esses locais regulatórios, resulta em uma mudança conformacional que permite que as seções regulatórias se dissociem das seções catalíticas. Sítios ativos de subunidades catalíticas têm sido ocupados pela sequência de aminoácidos, que é conhecida como sequência de pseudo substrato, encontrada na subunidade regulatória do complexo PKA inativo. Uma vez que os sítios ativos estão livres, essas subunidades catalíticas catalisam todos esses diferentes tipos de enzimas alvo por meio do processo de fosforilação.

Quanto à família da proteína quinase A, existem vários genes que codificam subunidades do complexo PKA. PKA-cat alfa (PKACa) e PKA-cat beta (PKACb), bem como PKA-cat gama (PKACg), codificam duas subunidades catalíticas de PKA inativa existente como um complexo tetramérico. As outras duas subunidades regulatórias de PKA inativa são codificadas por PKAR1A e PRKAR1B ou PRKAR2A e PKAR2B.

Nome do Gene Enzimas e subunidades
PKAR1A proteína quinase, dependente de cAMP, regulatória, tipo I, subunidade alfa
PRKAR1B proteína quinase, dependente de cAMP, regulatória, tipo I, subunidade beta
PRKAR2A proteína quinase, dependente de cAMP, regulatório, tipo II, subunidade alfa
PKAR2B proteína quinase, dependente de cAMP, regulatório, tipo II, subunidade beta
PKACa proteína quinase, dependente de cAMP, catalítico, subunidade alfa
PKACb proteína quinase, dependente de cAMP, catalítico, subunidade beta
PKACg proteína quinase, dependente de cAMP, catalítico, subunidade gama
PRKX proteína quinase, ligada ao X
PRKY proteína quinase, ligada a Y, pseudogene

Produtos enzimáticos relacionados em enzimas criativas

Gato. Não. Nome do Produto
NATE-0571 Proteína quinase A subunidade catalítica humana, recombinante
NATE-0572 Proteína quinase A subunidade catalítica β, humano ativo, recombinante

Além disso, a proteína quinase A desempenha um papel fundamental em vários processos celulares. Participa na regulação do ciclo e proliferação celular, metabolismo, transmissão de impulsos nervosos, remodelação do citoesqueleto, contração muscular, sobrevivência celular e outros processos celulares. PKA pode estar localizada no citoplasma ou associada a estruturas celulares e organelas dependendo do tipo de subunidades regulatórias de PKA (PKA-reg). PKA é ancorado em locais específicos dentro da célula por proteínas específicas chamadas proteínas âncora de quinase A (AKAPs). Além disso, os AKAPs podem participar da regulação da PKA e / ou governar a atividade da PKA. O polipeptídeo 1 da proteína ribossomal S6 quinase 90kDa (p90RSK1) pode regular a capacidade de PKA para se ligar a cAMP. O p90RSK1 inativo interage com a subunidade tipo I reguladora de PKA. Por outro lado, o p90RSK1 ativo interage com a subunidade catalítica PKA (PKA-cat). A ligação de p90RSK1 a PKA-reg diminui as interações entre PKA-reg e PKA-cat, enquanto a ligação de p90RSK1 ativo a PKA-cat aumenta as interações entre PKA-cat e PKA-reg e diminui a capacidade de cAMP para estimular PKA. Além disso, PKA-cat pode ser regulado por proteína quinase-1 dependente de 3-fosfoinositídeo (PDK-1), inibidores de proteína quinase (dependente de cAMP, catalítico) (PKI), proteína fosfatase 1, subunidade reguladora (inibidor) 1B (DARPP -32).

Além disso, existem duas vias de regulação de PKA independentes de cAMP. O um é o fator nuclear do potenciador do gene do polipeptídeo kappa light na cascata dependente do inibidor de células B (I-kB). Certo pool de PKA-cat existe em um complexo com I-kB alfa e beta (NFKBIA e NFKBIB). Em condições basais, NFKBIA e NFKBIB retêm PKA-cat alfa no estado inativo, presumivelmente mascarando seu sítio de ligação de ATP. A fosforilação e degradação de NFKBIA e NFKBIB resultam na liberação e ativação de PKA-cat alfa. Essa via pode ser uma resposta geral aos peptídeos vasoativos. O outro é realizado por meio do fator de crescimento transformador-beta (TGF-beta) / membro da família SMAD 3 e 4 (SMAD3 e SMAD4). O SMAD3 ativado liga-se ao SMAD4 e este complexo liga-se ao PKA-reg. Isso resulta na liberação de PKA-cat e ativação dos genes alvo a jusante.

  1. Cooper DM. Compartimentação de adenilato ciclase e sinalização de cAMP. Transações da Biochemical Society, 33 de dezembro de 2005 (Pt 6): 1319-22.
  2. Dell'Acqua ML, Smith KE, Gorski JA, Horne EA, Gibson ES, Gomez LL. Regulação da sinalização neuronal de PKA por meio da dinâmica de direcionamento de AKAP. European Journal of Cell Biology 2006 Jul 85 (7): 627-33.
  3. McConnachie G, Langeberg LK, Scott JD. Complexos de sinalização AKAP: indo ao cerne da questão. Trends in molecular medicine, 12 de julho de 2006 (7): 317-23.
  4. Landsverk HB, Carlson CR, Steen RL, Vossebein L, Herberg FW, Tasken K, Collas P. Regulamento de ancoragem da subunidade reguladora RIIalpha de PKA para AKAP95 por fosforilação de treonina de RIIalpha: implicações para a dinâmica cromossômica na mitose. Journal of Cell Science 2001 Set 114 (Pt 18): 3255-64.
  5. Tanji C, Yamamoto H, Yorioka N, Kohno N, Kikuchi K, Kikuchi A. A proteína de ancoragem de A-quinase AKAP220 se liga a glicogênio sintase quinase-3beta (GSK-3 beta) e medeia a inibição dependente de proteína quinase A de GSK-3beta. The Journal of Biological Chemicals 2002 Out 4 277 (40): 36955-61. & Lt
  6. Chaturvedi D, Poppleton HM, Stringfield T, Barbier A, Patel TB. A localização subcelular e as ações biológicas da RSK1 ativada são determinadas por suas interações com subunidades da proteína quinase dependente de AMP cíclico. Biologia molecular e celular 2006, 26 de junho (12): 4586-600.
  7. Zhong H, SuYang H, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Ghosh S. A atividade transcricional de NF-kappaB é regulada pela subunidade PKAc associada a IkappaB por meio de um mecanismo independente de AMP cíclico. Cell, 2 de maio de 1997, 89 (3): 413-24.
  8. Zhang L, Duan CJ, Binkley C, Li G, Uhler MD, Logsdon CD, Simeone DM. Um complexo Smad3 / Smad4 induzido por fator de crescimento de transformação beta ativa diretamente a proteína quinase A. Biologia molecular e celular 2004 Mar 24 (5): 2169-80.
  9. Yang H, Lee CJ, Zhang L, Sans MD, Simeone DM. Regulação das respostas induzidas pelo fator de crescimento transformador beta pela proteína quinase A em células acinares pancreáticas. Jornal americano de fisiologia. Fisiologia gastrointestinal e hepática 2008 Jul 295 (1): G170-G178.

A proteína quinase A está envolvida na dor neuropática ao ativar a via p38MAPK para mediar a apoptose de células da medula espinhal

A dor neuropática é um problema clínico sério a ser resolvido. O objetivo deste estudo é investigar a expressão da proteína quinase A (PKA) na dor neuropática e seus possíveis mecanismos de envolvimento. Um conjunto de dados de expressão de genes relacionados à dor neuropática foi baixado do Gene Expression Omnibus, e genes diferencialmente expressos foram selecionados usando o software R. cytoHubba foi usado para rastrear genes hub. Um modelo de rato com lesão do nervo poupado (SNI) foi estabelecido, e o limiar de retirada da pata foi determinado usando filamentos de von Frey. Western blotting e imunofluorescência foram usados ​​para detectar a expressão e a localização celular, respectivamente, de proteínas-chave na medula espinhal. Os ensaios de Western blot, ELISA e TUNEL foram usados ​​para detectar transdução de sinal celular, inflamação e apoptose, respectivamente. Pka foi identificado como um gene-chave envolvido na dor neuropática. Após SNI, ocorreu alodinia mecânica, a expressão de PKA na medula espinhal aumentou, a via de p38MAPK foi ativada e a inflamação da medula espinhal e apoptose ocorreram em ratos. PKA colocalizada com neurônios, astrócitos e microglia, e as células apoptóticas eram principalmente neurônios. A injeção intratecal de um inibidor de PKA não apenas aliviou a hiperalgesia mecânica, reação inflamatória e apoptose em ratos SNI, mas também inibiu a ativação da via p38MAPK. No entanto, a injeção intratecal de um inibidor de p38MAPK atenuou a hiperalgesia mecânica, a inflamação e a apoptose, mas não afetou a expressão de PKA. Em conclusão, PKA está envolvido na dor neuropática, ativando a via p38MAPK para mediar a apoptose das células da medula espinhal.

1. Introdução

A dor neuropática é um estado de dor crônica causado por dano primário ou disfunção do sistema nervoso [1]. Os sintomas comuns incluem dor em queimação espontânea ou dor induzida por irritação [2]. A dor neuropática é um estado gravemente debilitante que afeta seriamente a qualidade de vida dos pacientes [3]. Embora vários estudos aprofundados tenham sido conduzidos sobre a dor neuropática, sua patogênese ainda não foi totalmente elucidada. Evidências recentes sugerem que a geração de dor neuropática está relacionada a mudanças na expressão de genes relacionados à dor, como COMT, TRPV1, MC1R, GCH1, e CACNA2D3 [4]. Estudos têm mostrado que TNF- mediada por vetor de vírus herpes simplexα a expressão do receptor atenuou significativamente a dor neuropática [5, 6]. Assim, estudar a expressão gênica é importante para elucidar os mecanismos moleculares da dor neuropática e descobrir potenciais alvos terapêuticos.

Com o rápido desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento e bioinformática, a análise de microarranjos tem sido amplamente utilizada na pesquisa biomédica e na triagem clínica da variação genética [7, 8]. Neste estudo, baixamos um conjunto de dados de expressão gênica relacionada à dor neuropática do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) [9] e identificamos genes diferencialmente expressos (DEGs) usando o software R. Os DEGs foram submetidos ao termo Gene Ontology (GO) e análises de enriquecimento da via da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG). Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi construída e os genes hub foram selecionados para explorar os principais genes envolvidos na dor neuropática após lesão do nervo.

Com base na análise de bioinformática, identificamos a proteína quinase A (PKA) como uma proteína-chave envolvida na dor neuropática. PKA é um complexo tetramérico composto por duas subunidades catalíticas e duas subunidades regulatórias. Ele transfere grupos fosfato de ATP para resíduos de serina ou treonina de uma proteína específica para fosforilação, e as proteínas fosforiladas podem regular a atividade das proteínas alvo [10]. Estudos têm mostrado que PKA está intimamente relacionado à dor inflamatória e dor do câncer ósseo [11, 12]. No entanto, não está claro se o PKA está envolvido na dor neuropática causada por lesão nervosa.

Proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) são uma classe de quinases que medeiam as respostas celulares a estímulos externos [13]. p38MAPK é uma molécula sinalizadora importante na dor neuropática [14]. A p38MAPK ativada desempenha um papel importante na geração e manutenção da dor neuropática ao regular a transcrição, a síntese de proteínas e a expressão do receptor nas células [15, 16]. Persaud et al. [17] descobriram que PKA dependente de cAMP medeia apoptose induzida por IL-24 em células de câncer de mama por fosforilação de p38MAPK. No entanto, os mecanismos de PKA e p38MAPK na dor neuropática são desconhecidos.

Na dor neuropática, as células da medula espinhal podem sofrer apoptose [18, 19], que está intimamente relacionada à via da MAPK p38 [20, 21]. Portanto, formulamos a hipótese de que a PKA está envolvida na dor neuropática ao ativar a via p38MAPK para mediar a apoptose das células da medula espinhal. Para testar essa hipótese, estabelecemos um modelo de rato de dor neuropática com lesão do nervo poupado (SNI), observamos expressão de PKA e p38MAPK e apoptose de células da medula espinhal e exploramos a interação entre PKA e p38MAPK. O objetivo deste estudo foi investigar a expressão de PKA na dor neuropática e seus possíveis mecanismos de envolvimento, a fim de fornecer novos insights para elucidar a patogênese da dor neuropática.

2. Materiais e métodos

2.1. Dados de expressão de mRNA

O conjunto de dados GSE24982 [22], que é baseado na plataforma GPL1355 (Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array) e inclui dados de 40 amostras de gânglios da raiz dorsal (DRG), incluindo 20 amostras de DRG de ligadura do nervo espinhal (SNL) e 20 amostras de operação simulada Amostras DRG foram baixadas do banco de dados GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). Incluímos amostras DRG ipsilaterais e excluímos amostras com grandes valores discrepantes e, finalmente, selecionamos 14 amostras DRG (sete amostras SNL e sete amostras de operação simulada) para análise de bioinformática.

2.2. Pré-processamento de dados e triagem DEG

Os dados brutos do conjunto de dados GSE24982 foram lidos usando o pacote affy [23] em R (versão 3.6.1, https://www.r-project.org/) para conversão de formato de dados brutos, preenchimento de valor ausente e correção de fundo . Um mapa de violino foi gerado em R usando o pacote ggplot2 [24] para visualizar os resultados da normalização do conjunto de dados. A análise de expressão diferencial foi realizada usando o pacote limma [25], e DEGs foram identificados com base nos seguintes critérios: ajustados

. Usamos o pacote pheatmap (https://www.cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html) para traçar um mapa de calor de correlação das amostras e o pacote gplots (https: // www. cran.r-project.org/web/packages/gplots/index.html) para desenhar um mapa de calor dos DEGs.

2.3. Análise de Enriquecimento do Termo GO e do Caminho KEGG

As análises de enriquecimento do termo GO e da via KEGG dos DEGs foram conduzidas usando o pacote clusterProfile [26]. O pacote de enriquecimento (https://www.github.com/GuangchuangYu/enrichplot) foi usado para visualizar os resultados de enriquecimento. foi usado como um critério significativo de enriquecimento de genes.

2.4. Construção da rede PPI e seleção do gene do hub

Uma rede PPI foi construída usando a plataforma NetworkAnalyst (versão 3.0, https://www.networkanalyst.ca/) [27], com um

. Também conduzimos a análise de PPI usando o banco de dados STRING (versão 11.0, https://www.string-db.org/) [28]. O Cytoscape (versão 3.7.1) [29] foi usado para visualizar a rede PPI. O plug-in Cytoscape cytoHubba [30] foi usado para selecionar os 20 principais genes hub com base no algoritmo de critério de correlação máxima.

2,5. Exibição de expressão diferencial do gene Hub

Mapas de calor e vulcão dos genes hub foram desenhados usando os pacotes pheatmap e ggplot2 para visualizar a expressão diferencial do gene hub.

2.6. Animais

Ratos Sprague-Dawley machos adultos, pesando 200–220 g, foram adquiridos do Instituto de Pesquisa Veterinária de Lanzhou da Academia Chinesa de Ciências Agrícolas (Licença do Centro Animal: SCXK (Gan) 2015-0001). Os ratos foram alojados no Centro de Animais Experimentais do Segundo Hospital da Universidade de Lanzhou (número de licença da unidade: SYXK (Gan) 2018-0003) em uma sala com temperatura controlada em

, em um ciclo claro / escuro de 12 h, com livre acesso a alimentos e água. Todos os protocolos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais do Segundo Hospital da Universidade de Lanzhou e foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Associação Internacional para o Estudo da Dor.

2.7. Construção do modelo de dor neuropática

Um modelo de dor neuropática SNI foi estabelecido no nervo ciático esquerdo de ratos usando o método descrito por Decosterd e Woolf [31]. Resumidamente, os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico (injeção intraperitoneal de 1% 50 mg / kg). A pele foi desinfetada e cortada perpendicularmente à pata traseira esquerda, e o tecido muscular foi separado sem corte. Os nervos fibular sacral e comum foram ligados, o nervo sural foi preservado e um nervo de aproximadamente 2 mm foi cortado na extremidade telecêntrica da ligadura para evitar que o nervo cortado cicatrize. Os músculos e a pele foram suturados e as feridas desinfetadas para prevenir infecções. Os ratos do grupo Sham foram submetidos ao mesmo procedimento, exceto que o nervo ciático não foi cortado.

2.8. Medição de hiperalgesia mecânica

A hiperalgesia mecânica em ratos foi medida pelo limiar de retirada da pata (PWT), conforme descrito por Chaplan et al. [32]. Os ratos foram colocados em uma gaiola de plástico transparente com fundo de malha de metal e aclimatados por 30 min. Os ratos foram estimulados na borda lateral da pata traseira esquerda com filamentos de von Frey de forças variadas (0,6, 1, 1,4, 2, 4, 6, 8, 10 e 15 g) (North Coast Medical, Morgan Hill, CA , EUA). Os filamentos foram dobrados em forma de S por 5–8 s, e respostas de contração, incluindo levantamento do pé e claudicação, foram observadas. Realizamos três medições em cada rato e registramos a média das três medições como o PWT final.

2.9. Injeção intratecal de H89 e SB203580

O inibidor de PKA H89 e o inibidor de p38 MAPK SB203580 (ambos da Selleck Chemicals, Houston, TX, EUA) foram injetados por via intratecal de acordo com o método descrito por Mestre et al. [33]. Depois que os ratos foram anestesiados, um 25 µA microsseringa foi inserida no espaço subaracnóideo através do espaço intervertebral L4 e L5, e o reagente foi administrado ao líquido cefalorraquidiano. Um reflexo apêndice típico (movimento lateral repentino da cauda) confirmou que a seringa havia sido inserida com sucesso no espaço subaracnóideo.Ratos nos grupos SNI, SNI + H89 e SNI + SB203580 receberam 2% de dimetilsulfóxido, H89 (5 µg / 10 µl), e SB203580 (5 µg / 10 µl), respectivamente, no 3º dia de pós-operatório, uma vez ao dia por cinco dias.

2,10. Western Blotting

Os ratos foram sacrificados após anestesia profunda com pentobarbital sódico e o tecido da medula espinhal do segmento L4-L6 foi rapidamente separado. Os tecidos da medula espinhal foram homogeneizados em tampão de lise contendo inibidor de protease por 30 min. Os lisados ​​de tecido foram centrifugados a 12000 rpm a 4 ° C durante 15 min e os sobrenadantes foram recolhidos. As concentrações de proteínas foram medidas usando o método de Bradford [34]. Quantidades iguais de proteína foram separadas por eletroforese em gel de dodecil-poliacrilamida de sódio a 10% e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno. A membrana foi bloqueada em leite em pó desnatado a 5% à temperatura ambiente por 1 h e depois incubada a 4 ° C durante a noite com anticorpos primários contra as seguintes proteínas: PKA (anti-camundongo, 1: 500, Santa Cruz, Dallas, TX, EUA ), p38 (anti-coelho, 1: 1000, Proteintech, Wuhan, China), p-p38 (anti-coelho, 1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), TNF-α (anti-coelho, 1: 1000, Proteintech, Wuhan, China), IL-1β (anti-coelho, 1: 1000, Bioss, Pequim, China), caspase3 (anti-coelho, 1: 1000, Bioss, Pequim, China), caspase9 (anti-coelho, 1: 1000, Bioss, Pequim, China), bax (anti-coelho, 1: 2000, Proteintech, Wuhan, China), bcl-2 (anti-coelho, 1: 1000, Proteintech, Wuhan, China) e β-actina (anti-rato, 1: 1000, Beyotime, Xangai, China). A membrana foi lavada três vezes com solução salina tamponada com Tris-Tween 20 e incubada com anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase de rábano (1: 5000 Beyotime, Shanghai, China) ou anticorpo anti-rato de cabra conjugado com peroxidase de rábano (1: 5000 Beyotime, Xangai, China) à temperatura ambiente por 1 h. Bandas de proteínas imunomarcadas em membranas foram detectadas usando um kit de quimioluminescência aprimorado e o software ImageJ (Versão: 1.52q, https://www.imagej.en.softonic.com/) foi usado para processar os valores da escala de cinza das bandas de proteínas.

2,11. Imunohistoquímica

Sob anestesia profunda, os ratos foram perfundidos com solução salina 0,9% através do coração e, em seguida, com paraformaldeído 4%. O tecido da medula espinhal segmentar L4-L6 foi coletado e fixado em paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante a noite. O tecido espinhal foi continuamente desidratado em 20% e 30% de sacarose e cortado em 10-µM seções grossas em um criostato. As seções foram bloqueadas em soro de cabra a 10% à temperatura ambiente por 2 h e incubadas a 4 ° C durante a noite com anticorpos primários contra as seguintes proteínas: PKA (anti-camundongo, 1: 100, Santa Cruz, Dallas, TX, EUA), núcleos neuronais (NeuN) (anti-coelho, 1: 50, Proteintech, Wuhan, China), proteína glial fibrilar ácida (GFAP) (anti-coelho, 1: 500, Servicebio, Wuhan, China) e molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizado 1 (Iba1) (anti-coelho, 1: 500, Servicebio, Wuhan, China). Em seguida, as seções foram incubadas com anti-coelho de cabra marcado com CY3 (1: 300, Servicebio, Wuhan, China), anti-camundongo de cabra marcado com 488 (1: 400, Servicebio, Wuhan, China), anticorpo secundário fluorescente ou um mistura dos dois à temperatura ambiente durante 1 h. Os cortes foram lavados três vezes com PBS e observados em microscópio de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão), e as imagens foram adquiridas.

2,12 Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)

O tecido segmentar da medula espinhal L4-L6 foi aterrado e a pasta foi centrifugada a 3.000 rpm a 4 ° C por 10 min. Os sobrenadantes foram coletados como amostras de proteínas. Os níveis de TNF-α e IL-1β foram medidos usando um TNF-α Kit ELISA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e um IL-1β Kit ELISA (MultiSciences, Hangzhou, China), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante.

2,13. Detecção de TUNEL

As seções de tecido foram preparadas conforme descrito acima. As seções foram incubadas a 4 ° C durante a noite com anticorpos primários contra as seguintes proteínas: NeuN (anti-coelho, 1: 50, Proteintech, Wuhan, China), GFAP (anti-coelho, 1: 1000, Servicebio, Wuhan, China) e Iba1 (anti-coelho, 1: 500, Servicebio, Wuhan, China). Em seguida, as seções foram incubadas com anticorpo secundário fluorescente de cabra anti-coelho marcado com CY3 (1: 300, Servicebio, Wuhan, China) em temperatura ambiente por 50 min. A coloração TUNEL foi então realizada usando um kit de ensaio de morte celular in situ (Roche, Mannheim, Alemanha). Os núcleos foram contrastados usando DAPI (Servicebio, Wuhan, China). Os cortes foram observados em microscópio de fluorescência (Olympus).

2,14. Análise estatística

Os dados foram analisados ​​usando o software SPSS (versão: 23.0, https://www.ibm.com/cn-zh/analytics/spss-statistics-software) e são expressos como o

(SD). Os dados comportamentais foram testados por Shapiro-Wilk, e os dados de cada grupo obedeceram à distribuição normal. Em seguida, os dados comportamentais foram analisados ​​por uma análise de variância de medidas repetidas de duas vias seguida por testes de Bonferroni para comparações múltiplas. As médias dos dois grupos foram comparadas com as do aluno

- teste. foi considerado estatisticamente significativo.

3. Resultados

3.1. Pré-processamento de dados e triagem DEG

Após a padronização dos dados da amostra no conjunto de dados GSE24982, o nível médio de expressão gênica foi o mesmo em cada amostra, indicando que a consistência era alta (Figura 1 (a)). Um mapa de calor de correlação de amostra mostrou que a fonte de amostra era confiável (Figura 1 (b)). No total, 449 DEGs foram extraídos, e um mapa de calor desses DEGs revelou diferenças significativas em sua expressão (Figura 1 (c)).

3.2. Análise de Enriquecimento do Termo GO e do Caminho KEGG

Os resultados da análise de GO mostraram que os DEGs foram significativamente enriquecidos nos processos biológicos de sinalização de organismo multicelular, resposta a estímulos mecânicos e regulação do transporte transmembrana de íons (Figura 2 (a)), em componentes celulares relacionados ao complexo de canais iônicos e transportador transmembrana complexo (Figura 2 (b)), e nas funções moleculares da atividade do canal específico da substância e atividade do transportador transmembrana passivo (Figura 2 (c)). Na análise de enriquecimento da via KEGG, as vias enriquecidas foram relacionadas à agregação de leucócitos, resposta a estímulos mecânicos e percepção sensorial das vias de dor (Figura 2 (d)).

3.3. Análise de rede PPI e seleção do gene do hub

A análise da rede PPI revelou que PKA tinha nódulos relativamente grandes e múltiplas conexões, indicando que pode desempenhar um papel importante na progressão da dor neuropática (Figuras 3 (a) e 3 (b)). Os 20 principais genes do hub são mostrados na Figura 3 (c). Com base nesta análise, especulamos que Pka pode ser um gene chave na progressão da dor neuropática.

3.4. Expressão Diferencial dos Genes Hub

Para visualizar a expressão diferencial dos genes hub, geramos um mapa de calor (Figura 4 (a)) e um gráfico de vulcão (Figura 4 (b)). Pode-se ver na Figura 4 que Pka foi significativamente regulado positivamente em amostras de SNL, sugerindo que pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento de dor neuropática. Assim, postulamos Pka como um gene chave na dor neuropática.

3,5. SNI induz dor neuropática, regulação positiva de PKA da medula espinhal e ativação de p38MAPK

Conforme mostrado na Figura 5 (a), não houve diferença significativa no PWT ipsilateral entre os grupos SNI e Sham três dias antes da operação (). Em comparação com o grupo Sham, o PWT ipsilateral no grupo SNI foi significativamente reduzido (

,) (Figura 5 (a)). Não houve diferença significativa no PWT contralateral entre os dois grupos () de três dias antes a 21 dias após a cirurgia (Figura 5 (b)). Esses dados comportamentais indicam que o modelo SNI foi estabelecido com sucesso. Os resultados de Western blotting mostraram que a expressão de PKA na medula espinhal aumentou rápida e persistentemente no grupo SNI. Comparado ao grupo Sham, o PKA aumentou significativamente e atingiu o pico no 3º dia de pós-operatório (), que se manteve até o 21º dia () (Figuras 5 (c) e 5 (d)). Os resultados de imunofluorescência mostraram que PKA foi expresso principalmente no corno espinhal dorsal ipsilateral no grupo SNI, e a tendência de expressão foi consistente com os resultados de western blotting (Figura 5 (f)). Os níveis de p-p38 no grupo SNI atingiram o pico no 3º e 7º dias após a cirurgia () e diminuíram gradativamente até o 21º dia () (Figuras 5 (c) e 5 (e)). Esses resultados foram consistentes com as mudanças comportamentais em ratos, sugerindo que as vias PKA e p38 MAPK podem estar envolvidas na indução e manutenção da dor neuropática.

versus grupo Sham. (c – e) Western blots e quantificação da expressão de PKA e p-p38 na medula espinhal (). ,, versus grupo Sham. (f) Imagens de imunofluorescência mostrando a expressão de PKA (verde) no corno dorsal da medula espinhal. (g) Imagens de imunofluorescência mostrando a distribuição de PKA nas células do corno dorsal da medula espinhal. PKA é verde, NeuN, GFAP e Iba-1 são vermelhos.

3,6. SNI aumenta a expressão de PKA em neurônios e células gliais

Observamos a distribuição de PKA nas células do corno dorsal da medula espinhal por dupla marcação por imunofluorescência. Os tecidos da medula espinhal de rato foram coletados no dia sete após SNI e corados duas vezes para PKA e Neun, GFAP ou Iba-1. Conforme mostrado na Figura 5 (g), PKA foi co-localizado com Neun, GFAP e Iba-1. PKA foi expressa principalmente em neurônios e em baixo nível em astrócitos e microglia.

3,7. SNI induz inflamação e apoptose na medula espinhal

Para avaliar a reação inflamatória do tecido medular após SNI, determinamos os níveis de expressão de TNF-α e IL-1β. O Western blotting mostrou que, em comparação com o grupo Sham, o TNF-α os níveis aumentaram a partir do 3º dia após SNI, atingiram um pico no 7º dia () que se manteve até o 14º dia (), e voltaram aos níveis observados no grupo Sham no 21º dia (Figuras 6 (a) e 6 (b)). IL-1β a expressão aumentou a partir do 3º dia () e atingiu um pico no 14º dia () que se manteve até o 21º dia () (Figuras 6 (a) e 6 (c)). TNF-α e IL-1β Os resultados do ELISA foram consistentes com os resultados do Western blotting (Figuras 6 (d) e 6 (e)). Para avaliar a apoptose das células da medula espinhal após SNI, examinamos a expressão de bax, bcl-2, caspase3 e caspase9. Os resultados mostraram que os níveis de bax aumentaram a partir do 3º dia após SNI (), com pico no 14º dia (), e diminuíram para níveis normais no 21º dia () (Figuras 6 (f) e 6 (g)). Em contrapartida, os níveis de bcl-2 diminuíram gradativamente, com diferença estatisticamente significativa no 14º dia (), e os menores níveis observados no 21º dia () (Figuras 6 (f) e 6 (g)). A expressão da caspase3 aumentou gradativamente, atingindo um pico no 14º dia () que se manteve até o 21º dia () (Figuras 6 (f) e 6 (h)). Assim como a caspase3, a expressão da caspase9 foi significativamente elevada () no 3º dia após SNI e atingiu um nível de pico no 7º dia () que se manteve até o 21º dia () (Figuras 6 (f) e 6 (i)). Esses dados indicam que SNI induz inflamação e apoptose na medula espinhal.

3,8. Neurônios e células da glia sofrem apoptose

Para esclarecer ainda mais os tipos de células apoptóticas, submetemos os tecidos da medula espinhal a dupla marcação para TUNEL e GFAP, Iba-1 ou Neun. Os resultados mostraram que as células TUNEL-positivas co-localizaram principalmente com neurônios (Figura 6 (k)), e um pequeno número co-localizou com astrócitos e microglia (Figura 6 (j)), indicando que a apoptose da medula espinhal ocorreu principalmente nos neurônios. A apoptose ocorreu principalmente no 7º e 14º dias após SNI (Figura 6 (k)), o que foi consistente com os resultados de western blotting.

3.9. Os inibidores de PKA e p38MAPK reduzem a dor neuropática

Para verificar se as vias PKA e p38MAPK desempenham papéis importantes na manutenção da dor neuropática, os inibidores de PKA e p38MAPK foram injetados continuamente por cinco dias a partir do terceiro dia após SNI, e alterações comportamentais foram observadas 2 h após a injeção. Conforme mostrado na Figura 7 (a), o SNI ipsilateral PWT foi significativamente aumentado no grupo SNI + H89 (

,) e grupo SNI + SB203580 (,) quando comparado com o grupo SNI. No entanto, não houve diferenças significativas no SNI contralateral PWT entre os grupos SNI + H89 e SNI + SB203580 e o grupo SNI () (Figura 7 (b)). Esses dados indicaram que os inibidores de PKA e p38MAPK podem reduzir a dor neuropática.

3,10. Inibição dos resultados de ativação de PKA na regulação negativa da expressão de p-p38

Para explorar mais a relação entre PKA e p-p38, examinamos a expressão de PKA e p-p38 em tecidos da medula espinhal de ratos após a injeção de inibidores de PKA e p38MAPK. A expressão de PKA e p-p38 foi aumentada no grupo SNI quando comparado com o grupo Sham (ambos) (Figura 7 (c)). Em comparação com o grupo SNI, a ativação de PKA foi inibida e a expressão de p-p38 diminuiu significativamente no grupo SNI + H89 (,, respectivamente) (Figura 7 (c)). No grupo SNI + SB203580, o inibidor de p38MAPK inibiu significativamente a ativação de p-p38 (), mas não teve efeito sobre PKA () (Figura 7 (c)). Estes dados sugeriram que PKA está a montante da via p38MAPK e pode estar envolvida na manutenção da dor neuropática pela modulação de p38MAPK. Além disso, a imunofluorescência foi usada para detectar a expressão de PKA em cada grupo, e os resultados foram consistentes com aqueles de western blotting (Figura 7 (d)).

3,11. Os inibidores de PKA e p38MAPK reduzem a inflamação e a apoptose

Para validar os papéis das vias PKA e p38MAPK na dor neuropática, observamos reações inflamatórias e apoptose em tecidos da medula espinhal após injeção intratecal de inibidores de PKA e p38MAPK. Western blotting foi usado para detectar mudanças na reação inflamatória. Os resultados mostraram que o TNF-α e IL-1β foram significativamente aumentados no grupo SNI em comparação com o grupo Sham (ambos) (Figuras 8 (a) –8 (c)). Em comparação com os níveis no grupo SNI, TNF-α e IL-1β a expressão foi diminuída no grupo SNI + H89 (,, respectivamente) e no grupo SNI + SB203580 (,, respectivamente) (Figuras 8 (a) –8 (c)). Os resultados do ELISA foram consistentes com os do Western blotting (Figuras 8 (d) e 8 (e)). Os dados acima indicaram que a inibição de PKA e p38 MAPK pode atenuar a inflamação da medula espinhal.

Além disso, usamos western blotting e TUNEL double labeling para detectar apoptose. O Western blotting mostrou que a expressão de bax, caspase3 e caspase9 foi maior no grupo SNI do que no grupo Sham (,,, respectivamente) (Figuras 8 (f) –8 (h)), enquanto a expressão de bcl-2 foi significativamente inferior () (Figuras 8 (f) e 8 (i)). Em comparação com o grupo SNI, a expressão de bax, caspase3 e caspase9 foi diminuída no grupo SNI + H89 (,,) (Figuras 8 (f) –8 (h)), enquanto a expressão de bcl-2 foi aumentada () ( Figuras 8 (f) e 8 (i)). A expressão de bcl-2, bax, caspase3 e caspase9 no grupo SNI + SB203580 foi consistente com a do grupo SNI + H89 (Figuras 8 (f) –8 (i)). Como mostrado na Figura 8 (j), a marcação dupla TUNEL e NeuN revelou um aumento significativo nas células TUNEL-positivas no grupo SNI em comparação com o grupo Sham. As células TUNEL-positivas nos grupos SNI + H89 e SNI + SB203580 foram menores do que as do grupo SNI. Estes resultados sugerem que a inibição de PKA e p38MAPK pode atenuar a apoptose.

4. Discussão

A dor neuropática é causada por danos ao sistema nervoso e pode ser intensa [1]. Os tratamentos com medicamentos tradicionais tendem a ter efeitos fracos, portanto, é importante encontrar novos alvos terapêuticos para a dor neuropática. Com o rápido desenvolvimento da biotecnologia molecular, o papel dos genes relacionados à dor no desenvolvimento da dor neuropática tornou-se um importante tópico de pesquisa. Um estudo mostrou que a dor neuropática é freqüentemente acompanhada por mudanças na expressão de genes envolvidos na via sensorial [35]. A análise aprofundada dos dados de expressão gênica por métodos de bioinformática pode ajudar a desvendar as complexas relações regulatórias entre os genes e nos ajudar a encontrar melhores alvos terapêuticos para a dor neuropática.

Neste estudo, com base em dados de expressão de mRNA relacionada à dor neuropática em ratos, identificamos 449 DEGs em dor neuropática. Com base na análise da rede PPI e na identificação do gene hub, descobrimos que Pka pode desempenhar um papel importante na ocorrência e progressão da dor neuropática. Portanto, especulamos preliminarmente que Pka pode ser um gene chave na patogênese da dor neuropática. Para verificar essa especulação, estabelecemos um modelo de rato SNI. O limiar de dor mecânica de ratos diminuiu significativamente após SNI, que foi acompanhado por suprarregulação de PKA no corno dorsal espinhal ipsilateral. PKA foi encontrado para ser expresso em neurônios e células da glia. Isso sugere que a PKA pode estar envolvida na manutenção da dor neuropática. Após a injeção intratecal de um inibidor de PKA em ratos, não apenas a expressão de PKA foi suprimida, mas também a resposta à dor foi aliviada. Esses dados sugerem que PKA desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da dor neuropática.

Na dor neuropática, a via p38MAPK é ativada, o que foi confirmado em modelos animais SNL [36], lesão por constrição crônica [37] e SNI [38]. Os resultados dos estudos acima são consistentes com nosso achado experimental de que a expressão de p-p38 é regulada positivamente na medula espinhal de ratos SNI. Quando os ratos foram injetados intratecalmente com o inibidor de p38MAPK, a expressão de p-p38 diminuiu, o que foi acompanhado por uma redução na resposta à dor induzida por SNI. Esses dados sugerem que a via p38MAPK está envolvida na manutenção da dor neuropática.

Existe uma relação importante entre PKA e p38MAPK. Foi relatado que o p38MAPK atua como um mediador a jusante da sinalização de cAMP / PKA e regula o processo termogênico em adipócitos marrons [39]. A IL-24 está envolvida na progressão do câncer de mama através da via PKA dependente de cAMP, que regula a via p38MAPK [17], sugerindo que a via de sinalização p38MAPK pode ser a jusante de PKA. Para determinar a relação entre PKA e p38MAPK na dor neuropática, injetamos intratecalmente um inibidor de PKA em ratos.Descobrimos que a expressão de p-p38 foi regulada para baixo com uma diminuição em PKA, e a dor mecânica foi aliviada. Após a injeção de um inibidor de p38 MAPK, a diminuição de p-p38 não afetou a expressão de PKA, apesar da redução da dor mecânica nos ratos. Estes dados indicam que a via de sinalização p38MAPK está a jusante de PKA e é regulada positivamente por PKA.

A apoptose de células da medula espinhal relatada é observada durante o desenvolvimento de dor neuropática [18, 19]. Whiteside et al. [40] descobriram que o desenvolvimento de dor neuropática induzida por lesão de constrição crônica está associado ao aumento da apoptose nas células da medula espinhal, que se acredita ser a causa da dor. Nossos dados fornecem novas evidências para isso, pois no modelo de dor neuropática induzida por SNI, no 7º e 14º dias após a cirurgia, foi observada apoptose significativa no tecido do corno dorsal da medula espinhal ipsilateral, enquanto a apoptose foi aliviada no 21º dia. Além disso, as células TUNEL-positivas principalmente co-localizadas com neurônios, e apenas algumas co-localizadas com astrócitos e microglia, indicando que neurônios principalmente na medula espinhal sofrem apoptose. Quando ocorre dor neuropática, a sensibilização central pode reduzir o limiar de dor dos neurônios do corno dorsal e aumentar o campo receptivo [41]. Os neurônios do corno dorsal podem exibir desempenho e metabolismo patologicamente elevados, o que pode ser uma das razões para a apoptose neuronal. A apoptose supressiva do interneurônio atenua a inibição da transmissão da informação nociceptiva, aumentando assim a excitabilidade dos neurônios nociceptivos e produzindo hiperalgesia [42]. Nossos dados sugerem que a apoptose ocorre nos estágios iniciais da indução e manutenção da dor. Depois disso, o processo de apoptose parece desacelerar, o que pode ser devido a mecanismos neuroprotetores do próprio sistema nervoso [43]. Inflamação induzida por SNI na medula espinhal e aumento de TNF-α e IL-1β expressão. Em consonância com isto, numerosos estudos têm mostrado que os fatores pró-inflamatórios TNF-α e IL-1β pode induzir apoptose [44, 45].

5. Conclusões

Nossos resultados sugerem que SNI induz um aumento significativo na expressão de PKA na medula espinhal, e PKA está envolvido na dor neuropática ativando a via p38MAPK para mediar a apoptose de células da medula espinhal (Figura 9). Este estudo fornece novos insights que podem auxiliar na elucidação da patogênese da dor neuropática.

Disponibilidade de dados

Os dados usados ​​para apoiar as conclusões deste estudo estão disponíveis junto do autor para correspondência, mediante solicitação.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflito de interesses quanto à publicação deste artigo.

Contribuições dos autores

Yajun Deng, Liang Yang e Qiqi Xie contribuíram igualmente para este trabalho.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Yinian Zhang e ao Dr. Guoqiang Yuan do Instituto de Neurologia da Província de Gansu pelo suporte ao equipamento. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Pesquisa em Administração de Medicina Chinesa da Província de Gansu (GZK-2019-46).

Referências

  1. T. S. Jensen e N. B. Finnerup, "Alodinia e hiperalgesia na dor neuropática: manifestações clínicas e mecanismos", The Lancet Neurology, vol. 13, não. 9, pp. 924–935, 2014. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  2. T. S. Jensen, R. Baron, M. Haanpaa et al., “A new definition of neuropathic pain,” Dor, vol. 152, não. 10, pp. 2204-2205, 2011. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  3. L. C. Loram, F. R. Taylor, K. A. Strand et al., "A injeção intratecal de agonistas do receptor de adenosina 2A reverteu a alodinia neuropática por meio de proteína quinase (PK) A / PKC sinalização," Cérebro, comportamento e imunidade, vol. 33, pp. 112–122, 2013. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  4. E. E. Young, W. R. Lariviere, e I. Belfer, "Genetic basis of pain variability: recent Advances", Journal of Medical Genetics, vol. 49, no. 1, pp. 1–9, 2012. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  5. K. L. Ortmann e M. Chattopadhyay, “Diminuição da ativação neuroimune por transferência de gene mediada por HSV de TNFα receptor solúvel alivia a dor em ratos com neuropatia diabética, ” Cérebro, comportamento e imunidade, vol. 41, pp. 144–151, 2014. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  6. S. Hao, M. Mata, J. C. Glorioso, e D. J. Fink, "Gene transfer to interfere with TNFalpha signaling in neuropathic pain", Terapia de genes, vol. 14, não. 13, pp. 1010–1016, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  7. Z. K. Liu, R. Y. Zhang, Y. L. Yong et al., "Identificação de genes cruciais com base em perfis de expressão de carcinomas hepatocelulares por análise de bioinformática", PeerJ, vol. 7, artigo e7436, 2019. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  8. H. Wang, M. Zhang, Q. Xie, J. Yu, Y. Qi e Q. Yue, "Identificação de marcadores de diagnóstico para transtorno depressivo maior por validação cruzada de dados de amostras de sangue total", PeerJ, vol. 7, artigo e7171, 2019. Ver em: Site da Editora | Google Scholar
  9. T. Barrett, S. E. Wilhite, P. Ledoux et al., “NCBI GEO: arquivo para conjuntos de dados de genômica funcional - atualização”, Pesquisa de ácidos nucléicos, vol. 41, no. D1, pp. D991 – D995, 2013. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  10. I. Bossis e C. A. Stratakis, "Minireview: PRKAR1A: funções normais e anormais," Endocrinologia, vol. 145, não. 12, pp. 5452–5458, 2004. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  11. P. S. Siqueira-Lima, J. S. S. Quintans, L. Heimfarth et al., “Envolvimento da via PKA e inibição dos canais de Ca2 + dependentes de voltagem na atividade anti-hiperalgésica de Lippia grata /β-ciclodextrina, ” Ciências da Vida, vol. 239, artigo 116961, 2019. Ver em: Site da Editora | Google Scholar
  12. G. Q. Zhu, S. Liu, D. D. He, Y. P. Liu e X. J. Song, "Ativação da via de sinalização cAMP-PKA no gânglio da raiz dorsal de rato e medula espinhal contribui para a indução e manutenção da dor do câncer ósseo", Farmacologia Comportamental, vol. 25, não. 4, pp. 267-276, 2014. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  13. E. K. Kim e E. J. Choi, "Pathological roles of MAPK signaling pathways in human disease," Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, vol. 1802, pp. 396–405, 2010. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  14. J. Shin, Y. Yin, H. Park et al., "Nanopartículas de PLGA encapsuladas por p38 siRNA aliviam o comportamento de dor neuropática em ratos inibindo a ativação da microglia", Nanomedicina, vol. 13, não. 13, pp. 1607–1621, 2018. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  15. K. M. Lee, S. M. Jeon e H. J. Cho, "Interleucina-6 induz a expressão de CX3CR1 microglial na medula espinhal após lesão de nervo periférico através da ativação de p 38 MAPK", European Journal of Pain, vol. 14, pp. 682.e1–682.e12, 2010. Veja em: Site do Editor | Google Scholar
  16. S. Agthong, A. Kaewsema e V. Chentanez, "A inibição de p 38 MAPK reduz a perda de neurônios sensoriais primários após a transecção do nervo", Pesquisa Neurológica, vol. 34, nº 7, pp. 714–720, 2012. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  17. L. Persaud, J. Mighty, X. Zhong et al., "IL-24 promove apoptose através de vias PKA dependentes de cAMP em células de câncer de mama humano", Jornal Internacional de Ciências Moleculares, vol. 19, não. 11, pág. 3561, 2018. Visualize em: Site da Editora | Google Scholar
  18. Y. Gao, N. Sun, L. Wang et al., "Análise de bioinformática identifica p 53 como um candidato a biomarcador prognóstico para dor neuropática", Fronteiras em genética, vol. 9, pág. 320, 2018. Visualize em: Site da Editora | Google Scholar
  19. E. Polgár, D. I. Hughes, A. Z. Arham, e A. J. Todd, "A perda de neurônios das lâminas I-III do corno dorsal espinhal não é necessária para o desenvolvimento de alodinia tátil no modelo de lesão do nervo poupado de dor neuropática," The Journal of Neuroscience, vol. 25, não. 28, pp. 6658–6666, 2005. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  20. G. Zhou, Z. Li, S. Sun, Y. Fang e Z. Wei, “TGF-β1 alivia HgCl2 apoptose induzida através da via de sinalização P38 MAPK em células trofoblásticas humanas, ” Toxicologia In Vitro, vol. 61, artigo 104626, 2019. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  21. X. Liu, J. Zhuang, D. Wang et al., "Glycyrrhizin suprime inflamação e apoptose celular por inibição de HMGB1 via p 38 / p-JUK sinalizando via na atenuação da degeneração do disco intervertebral", American Journal of Translational Research, vol. 11, não. 8, pp. 5105–5113, 2019. Ver em: Google Scholar
  22. D. von Schack, M. J. Agostino, B. S. Murray et al., "Alterações dinâmicas no perfil de expressão de MicroRNA revelam vários mecanismos reguladores no modelo de ligadura do nervo espinhal de dor neuropática", PLoS One, vol. 6, não. 3, artigo e17670, 2011. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  23. L. Gautier, L. Cope e B. M. Bolstad, "affy - análise de Affymetrix GeneChip dados no nível da sonda, ” Bioinformática, vol. 20, não. 3, pp. 307–315, 2004. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  24. C. Ginestet, “ggplot 2: gráficos elegantes para análise de dados,” Journal of the Royal Statistical Society: Series A (Statistics in Society), vol. 174, no. 1, pp. 245-246, 2011. Visualizar em: Site da Editora | Google Scholar
  25. M. E. Ritchie, B. Phipson, D. Wu, Y. Hu, C. W. Law e W. Shi, "limma potencia análises de expressão diferencial para sequenciamento de RNA e estudos de microarray," Pesquisa de ácidos nucléicos, vol. 43, não. 7, artigo e47, 2015. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  26. G. Yu, L. G. Wang, Y. Han e Q. Y. He, "cluster Profiler: an R package for comparing biological themes between gene clusters", OMICS: a Journal of Integrative Biology, vol. 16, não. 5, pp. 284–287, 2012. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  27. J. Xia, E. E. Gill e R. E. Hancock, "NetworkAnalyst for statistics, visual and network-based meta-analysis of gene expression data", Nature Protocols, vol. 10, não. 6, pp. 823–844, 2015. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  28. D. Szklarczyk, A. L. Gable, D. Lyon et al., "STRING v11: redes de associação de proteína-proteína com maior cobertura, apoiando descoberta funcional em conjuntos de dados experimentais de todo o genoma," Pesquisa de ácidos nucléicos, vol. 47, no. D1, pp. D607 – d613, 2019. Veja em: Site da Editora | Google Scholar
  29. M. E. Smoot, K. Ono, J. Ruscheinski, P. L. Wang e T. Ideker, "Cytoscape 2.8: novos recursos para integração de dados e visualização de rede", Bioinformática, vol. 27, não. 3, pp. 431-432, 2011. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  30. C. H. Chin, S. H. Chen, H. H. Wu, C. W. Ho, M. T. Ko e C. Y. Lin, "cyto Hubba: identificando objetos de hub e sub-redes de interatividade complexa, ” BMC Systems Biology, vol. 8, artigo S11, Suplemento 4, 2014. Ver em: Site da Editora | Google Scholar
  31. I. Decosterd e C. J. Woolf, "Spared Nervo Lesão: um modelo animal de dor neuropática periférica persistente", Dor, vol. 87, não. 2, pp. 149–158, 2000. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  32. S. R. Chaplan, F. W. Bach, J. W. Pogrel, J. M. Chung e T. L. Yaksh, "Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw", Journal of Neuroscience Methods, vol. 53, não. 1, pp. 55–63, 1994. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  33. C. Mestre, T. Pelissier, J. Fialip, G. Wilcox e A. Eschalier, "Um método para realizar injeção intratecal transcutânea direta em ratos", Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, vol. 32, não. 4, pp. 197–200, 1994. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  34. M. M. Bradford, "Um método rápido e sensível para a quantificação de quantidades de microgramas de proteína utilizando o princípio da ligação proteína-corante", Bioquímica Analítica, vol. 72, pp. 248–254, 1976. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  35. C. A. von Hehn, R. Baron e C. J. Woolf, "Desconstruindo o fenótipo da dor neuropática para revelar mecanismos neurais", Neurônio, vol. 73, pp. 638–652, 2012. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  36. Y. Liang, J. Y. Du, Y. J. Qiu, J. F. Fang, J. Liu, e J. Q. Fang, "Electroacupuncture atenuates spinal nerv ligation -uced microglial activation mediated by p 38 mitogen-enabled protein quinase", Jornal Chinês de Medicina Integrativa, vol. 22, não. 9, pp. 704–713, 2016. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  37. C. H. Zhou, X. Li, Y. Z. Zhu et al., "Ghrelin alleviates neuropathic pain through GHSR-1a-mediated supression of the p38 MAPK / NF-κVia B em um modelo de lesão por constrição crônica em rato ”, Anestesia Regional e Medicina da Dor, vol. 39, no. 2, pp. 137–148, 2014. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  38. T. T. Zhou, J. R. Wu, Z. Y. Chen, Z. X. Liu, e B. Miao, "Effects of dexmedetomidine on P2X4Rs, p38-MAPK and BDNF in spinal microglia in ratats with spared nerv graves", Brain Research, vol. 1568, pp. 21–30, 2014. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  39. W. Cao, K. W. Daniel, J. Robidoux et al., "Proteína quinase ativada por mitogênio p38 é o regulador central da transcrição dependente de AMP cíclico do gene da proteína 1 desacopladora de gordura marrom," Biologia Molecular e Celular, vol. 24, não. 7, pp. 3057–3067, 2004. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  40. G. T. Whiteside e R. Munglani, "Morte celular no corno dorsal superficial em um modelo de dor neuropática", Journal of Neuroscience Research, vol. 64, nº 2, pp. 168–173, 2001. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  41. S. B. McMahon, G. R. Lewin e P. D. Wall, "Central hyperexcitability desencadeada por entradas nocivas", Opinião Atual em Neurobiologia, vol. 3, não. 4, pp. 602–610, 1993. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  42. J. Mao, B. Sung, R.-R. Ji, e G. Lim, "Neuronal apoptosis associated with morphine tolerance: Evidence for an opioid-associated neurotoxic mecanic", The Journal of Neuroscience, vol. 22, não. 17, pp. 7650–7661, 2002. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  43. V. de Novellis, D. Siniscalco, U. Galderisi et al., "Blockade of glutamate mGlu5 receptors in a rat model of neuropathic pain impede a superexpressão precoce de genes pró-apoptóticos e mudanças morfológicas na lâmina II do corno dorsal", Neurofarmacologia, vol. 46, não. 4, pp. 468–479, 2004. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  44. J. Zhu, M. Jin, J. Wang et al., “TNFα induz o influxo de Ca 2+ para acelerar a apoptose extrínseca em células de carcinoma hepatocelular, ” Journal of Experimental & amp Clinical Cancer Research, vol. 37, no. 1, pág. 43, 2018. Visualize em: Site da Editora | Google Scholar
  45. B. W. Wang, Y. Jiang, Z. L. Yao, P. S. Chen, B. Yu e S. N. Wang, “Aucubin protege condrócitos contra IL-1β-Apoptose induzida in vitro e inibe a osteoartrite em modelo de camundongo, ” Projeto, desenvolvimento e terapia de medicamentos, vol. 13, pp. 3529–3538, 2019. Ver em: Publisher Site | Google Scholar

Direito autoral

Copyright & # x00A9 2020 Yajun Deng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.


Aula 14: Localização de Proteínas

Baixe o vídeo do iTunes U ou do Internet Archive.

Assuntos abordados: Localização de proteínas

Instrutores: Dra. Claudette Gardel

Aula 10: Biolo molecular.

Aula 11: Biolo Molecular.

Aula 12: Biolo Molecular.

Aula 13: Regulação do Gene

Aula 14: Localização de Proteínas.

Aula 15: DNA recombinante 1

Aula 16: DNA recombinante 2

Aula 17: DNA recombinante 3

Aula 18: DNA recombinante 4

Aula 19: Ciclo / Sinal Celular.

Aula 26: Sistema Nervoso 1

Aula 27: Sistema Nervoso 2

Aula 28: Sistema Nervoso 3

Aula 29: Células-tronco / Clon.

Aula 30: Células-tronco / Clon.

Aula 31: Molecular Medic.

Aula 32: Evolu Molecular.

Aula 33: Molecular Medic.

Aula 34: Polimorfo Humano.

Aula 35: Polimorfo Humano.

Bom Dia. Bom Dia. Hoje vou falar sobre, esta é a aula 14, e vou falar sobre localização de proteínas.

Agora, alguns de vocês devem se lembrar que no início do semestre eu estava andando por aí com esta tipoia. E para me ajudar a escrever no quadro, mesmo sendo este braço, fiz uma apresentação em PowerPoint da maioria das coisas que teria escrito no quadro. E para sua facilidade e conforto, esta apresentação em PowerPoint será postada online para que você não precise anotar tudo em meus slides. Então, apenas relaxe. E vou escrever algumas coisas no quadro, para que você possa anotá-las.

OK. Então, agora vocês ouviram sobre o dogma central do professor Eric Lander e sobre a regulamentação dos genes na última sexta-feira.

Aqui está algo com o qual você está familiarizado, esta imagem aqui retratando o dogma central.

O DNA se replica em DNA. Isso é replicação. Replicação.

O DNA é traduzido, desculpe-me, transcrito em RNA.

Transcrição. E o RNA é traduzido em proteína.

Dogma central. Onde isso ocorre? Onde ocorre a replicação em uma célula? Núcleo. Boa.

Onde ocorre a transcrição em uma célula? Núcleo.

Eu ouvi núcleo. Está correto. E onde ocorre a tradução? Citoplasma. Ah, mas sabemos que esses processos requerem proteínas para realizá-los.

OK. Você acabou de descrever onde esses processos ocorrem em uma célula eucariótica. Digamos que você seja uma bactéria.

Nas bactérias, onde ocorre a replicação, a transcrição e a tradução?

Onde? Citoplasma. OK. Agora, tornamos as bactérias muito simples. Mas eles não são tão simples. E então vamos dar uma olhada aqui.

Aqui está uma célula bacteriana. Desenhei o que poderia ser E.

coli. I tem uma membrana externa, uma membrana interna, e o espaço entre elas é o perisoplasma. Agora, aqui está seu cromossomo circular. Eu transcrevi alguns genes para um RNA e um ribossomal estalou e fiz uma proteína que está no citoplasma.

No entanto, algumas proteínas estão localizadas na membrana interna, outras estão localizadas no periplasma e algumas estão localizadas na membrana externa, e outras são realmente exportadas completamente para fora da célula.Ainda mais complicada é uma proteína eucariótica, porque não só tem uma membrana plasmática onde as proteínas estão localizadas. Tem um monte de organelas. Tem o núcleo e tem as mitocôndrias e tem o retículo endoplasmático e o aparelho de Golgi.

E também traduz o RNA por ribossomos no citoplasma.

Então, como essas proteínas voltam para o núcleo ou vão para as mitocôndrias ou para as organelas? Então, o que faremos nos próximos slides é acompanhar o processo, porque eles são tão semelhantes em bactérias e células eucarióticas, de como as proteínas chegam à membrana e como saem da célula.

E então vou voltar e falar sobre como as proteínas entram em algumas das organelas. Deixe-me mostrar o que são algumas das proteínas.

Portanto, um exemplo de proteína citoplasmática em bactérias é a beta galactosidase. Você já ouviu falar sobre isso.

Ele decompõe a lactose. Está no citoplasma. E um exemplo de proteína de membrana é um receptor de lactose.

A lacY permease que está na superfície da célula traz a lactose. Um exemplo de proteína totalmente secretada é uma toxina.

Por exemplo, o bacillus anthracis produz a toxina do antraz.

É totalmente exportado da célula. Em uma célula eucariótica, há um monte de proteínas citoplasmáticas. Existem todas as enzimas glicolíticas. E, por exemplo, enzimas de aminoácidos biossintéticos como enzimas de síntese de histidina, que são citoplasmáticas. Para uma proteína de membrana, existem receptores, como o receptor de insulina, um hormônio, um hormônio peptídico ou receptores de fator de crescimento, todos os receptores ligados à membrana. E uma proteína totalmente secretada.

Algumas células, como as células pancreáticas, secretam insulina.

Algumas células, como algumas das células do sistema imunológico, secretam anticorpos.

OK. Portanto, não ficou claro como essas proteínas produzidas no citoplasma, proteínas que foram feitas no citoplasma, chegaram a esse local.

E a pessoa que trabalhou nisso foi George Palade.

E isso foi nos anos cinquenta. E ele estudou as células pancreáticas porque elas são secretoras mestres. E ele foi capaz de aperfeiçoar sua técnica microscópica. E você pode ver aqui que esta é uma célula pancreática. Este é o retículo endoplasmático cravejado de ribossomos. Estas são as mitocôndrias.

Este é o núcleo. Aqui está outra foto que ele tirou.

E aqui está o retículo endoplasmático rugoso cravejado de ribossomos.

Aqui está o aparelho de Golgi. E então há como pequenas vesículas.

Então ele fez este experimento no qual decidiu que pulsaria as proteínas marcadas à medida que fossem sintetizadas em um pâncreas, diretamente no pâncreas. Então o que ele fez foi injetar aminoácidos radioativos diretamente no pâncreas de hamsters.

Acho que poderia desenhar um pequeno hamster aqui. E ele injetou isótopos radioativos diretamente.

E o que ele está fazendo é que esses aminoácidos radioativos serão incorporados às proteínas conforme estão sendo traduzidos, e ele pode seguir a população de proteínas recentemente traduzidas através da célula. Então ele injeta hamsters com os aminoácidos radioativos.

E então, em vários momentos, ele acrescenta, ele também injeta glutaraldeído.

Então, primeiro o rótulo, depois o glutaraldeído. E o que isso faz é fixar as células em suas trilhas. O que quer que a célula esteja fazendo, ele simplesmente para. E ele remove o pâncreas e olha as células. Isso corrige as células.

Então, Tom, não sei o que está acontecendo aqui. Não podemos usar isso, Tom? Tudo bem. Ele está apenas fazendo isso por conta própria. Tem alguma coisa de tempo?

Oh. Tudo bem. Então o que ele descobriu foi nos primeiros momentos, agora, o que eu fiz, eu fiz isso, ok? Ele não viu amarelo. O que fiz foi adicionar amarelo ao slide original para mostrar a você no primeiro momento em que ele encontrou o rótulo associado ao retículo endoplasmático. No momento seguinte, ele encontrou o rótulo associado ao aparelho de Golgi. E então, em momentos ainda posteriores, ele encontrou o rótulo em vesículas secretoras.

Portanto, esta é a minha representação do que ele encontrou.

Então aqui está uma célula, núcleo, mitocôndria.

Nos primeiros momentos em que o rótulo estava no ER seguido pelo Golgi.

Eu não fiz isso. Sim, tire.

Seguido por vesículas. Não está funcionando. OK.

Desculpe por isso. Eu sinto Muito. Então, ele ganhou um Prêmio Nobel por este trabalho porque é o caminho que ainda é válido hoje.

Agora, ele ganhou o Prêmio Nobel em '74. E por volta dessa época, talvez 1971, outro cientista chamado Cesar Milstein estava trabalhando com imunologia.

E o que ele fez foi fundir uma célula cancerosa com uma célula que secretava anticorpos constantemente, então ele acabou tendo uma célula produtora de anticorpos imortalizada. E ele estava fazendo pesquisas e análises in vitro. E ele descobriu que os anticorpos produzidos in vitro eram mais longos do que os que realmente saíam da célula. Então ele propôs que havia uma extremidade N-terminal. Ele olhou e viu que o terminal N era diferente e propôs que possivelmente seria clivado na exportação. OK? E assim é, ele ganhou um Prêmio Nobel, não por este trabalho, mas por seu trabalho em imunologia.

E isso também estava correto. E isso vem de sua palestra, palestra do Nobel. Diz a síntese in vitro de cadeias leves de imunoglobulina, é isso que ele estava fazendo, para nossa alegria, deparamos com a observação inesperada da existência de um precursor biossintético de cadeia leve. Experimentos posteriores nos levaram a propor que a sequência N-terminal extra era um sinal para o transporte vetorial através da membrana durante a síntese de proteínas.

Esta foi a primeira evidência que indicava que o sinal para secreção era um segmento N-terminal rapidamente clivado após a síntese de proteínas.

OK. Então agora havia um aluno de Palade. Ele era um estudante de pós-doutorado. Seu nome era Guther Blobel.

E ele viu esse experimento em 1971. E ele pensou como sabemos que não é um artefato da ciência in vitro? Bem, como você sabe que os ribossomos não estão apenas esperando no início da mensagem?

Talvez seja por isso que é uma proteína mais longa. E ele não acreditou.

Então ele queria prosseguir com isso. E ele fez isso no estilo Palade. Então o que ele fez foi pegar um tubo de ensaio e adicionar uma mensagem para proteínas exportadas, ribossomos e tRNAs carregados. E quando digo tRNAs carregados, quero dizer tRNAs que têm aminoácidos anexados a eles. E então, se você adicionar essas três coisas a um tubo de ensaio, descobrirá que uma proteína foi produzida. Então ele adicionou microssomas. O que são microssomas?

OK. Vamos pausar isso.

Agora, eu disse a você o que Palade descobriu. Ele descobriu que as proteínas foram vistas pela primeira vez no ER rugoso no lúmen. Este é o lúmen bem aqui. Foi aqui que ele observou a radioatividade pela primeira vez.

Agora, se você pegar o retículo endoplasmático e compartilhá-lo, ele formará pequenas vesículas, pequenas vesículas com ribossomos do lado de fora. E eles são chamados de microssomas para pequenas coisas. Microssomas. E são essencialmente pequenas vesículas de retículo endoplasmático rugoso. Então, quando Blobel adicionou ao mesmo tubo de ensaio que tinha o RNA, os ribossomos, o tRNA.

Ao adicionar microssomas, descobriu que a proteína ainda estava no sobrenadante. Nenhuma proteína foi encontrada no lúmen dos microssomas.

Então ele pensou, OK, isso precisa de algo.

Deixe-me extrair algo do citoplasma.

E ele extraiu muitas frações. E ele acrescentou essas frações citoplasmáticas. E ele descobriu que uma facção realmente era capaz de fazer com que o peptídeo entrasse no microssoma. E se ele adicionasse essa fração no final da reação, a proteína nunca entraria no lúmen do microssoma. Mas se ele adicionasse a fração mais tarde, quero dizer, desculpe-me, mais cedo, se ele adicionasse a facção mais cedo, eles entrariam. Então, deixe-me apenas resumir. Então, envie mensagem aos ribossomos, tRNA, você encontra proteína no sobrenadante. Ribossomos de mensagem, tRNAs, mais microssomas, proteína no sobrenadante, não nos microssomas.

Você adiciona uma fração que funciona às vezes, mas se for adicionada tarde, a proteína estará no sobrenadante. Mas se você adicionar essa fração no início, a proteína estará no lúmen dos microssomas. Ele interpretou esse resultado como se houvesse uma sequência de aminoácidos no início de uma proteína exportada. E isso é reconhecido por um complexo que estava na fração. Este complexo é necessário para levar a proteína ao lúmen do RE. E para chegar ao lúmen do RE, a proteína precisa estar apenas começando a ser traduzida.

Agora, uma vez que nem todas as proteínas têm o mesmo N-terminal, Blobel predicou, como Milstein, qualquer que fosse a sequência, ela seria clivada mais tarde. E ele ganhou um Prêmio Nobel por isso em 1999. E não foi só por isso, porque ele continuou e realmente descobriu todo o caminho.

Nos próximos slides, mostrarei o que ele discerniu.

Uma coisa que eu quero apenas apontar, porém, o experimento que ele fez foi heterólogo. Portanto, o extrato veio do gérmen de trigo, os microssomas vieram do cão e, mesmo assim, funcionou. E estava certo porque esse caminho é universal. E deixe-me mostrar como é universal. É usado em bactérias e em células eucarióticas.

Então aqui está uma bactéria, está traduzindo uma mensagem.

Aqui está o sinal começando a ser traduzido, é uma proteína exportada.

A mesma coisa, no citoplasma uma sequência de sinal está sendo feita de novo. E aqui está uma visão mais detalhada da sequência do sinal. Tem cerca de 20 aminoácidos de comprimento.

Ele tem algumas cargas positivas em seu N-terminal extremo.

No meio, há cerca de sete a doze aminoácidos hidrofóbicos variáveis. E isso é chamado de sequência de sinal. OK, então vamos dar uma olhada no que acontece. OK. Agora estamos no citoplasma de uma célula eucariótica. Aqui está uma sequência de sinal emergindo de um ribossomo aqui. O que o reconhece é SRP.

Foi assim que ele chamou seu complexo de partícula de reconhecimento de sinal.

Portanto, o SRP se liga à sequência do sinal. E, se você se lembra, leva para o pronto-socorro para ser traduzido. Aqui está uma foto do pronto-socorro.

E há uma proteína docking ou receptor SRP. Assim, o SRP se liga à proteína docking, traz consigo a sequência de sinal que é anexada ao ribossomo, que é anexada à mensagem. Adjacente à proteína docking está um translocon, que é um canal composto de proteínas. O ribossomo aparece no translocon. O SRP flutua para longe. E note que a sequência do sinal está na membrana, desculpe, começa a entrar pela membrana e a tradução é retomada.

A sequência de sinal é clivada por uma peptidase de sinal dentro do ER, ela cliva o sinal e a tradução continua.

E se for uma proteína totalmente secretada, ela é totalmente internalizada no lúmen do ER e o ribossomo aparece.

Se for uma proteína de membrana, o sinal é clivado novamente, a tradução é retomada e, em seguida, fica embutido na membrana.

E então vou desligar isso, caso contrário, vai continuar por conta própria aqui. Então, se é uma proteína de membrana, o que ela contém? Possui um trecho transmembrana.

Você já viu isso antes em conjuntos de problemas. Portanto, é um trecho transmembrana.

Ou domínio transmembranar. Tem cerca de 20, 22 aminoácidos de comprimento.

Pode ser 30, talvez. Portanto, diremos de 20 a 25 aminoácidos de resíduos hidrofóbicos.

É uma seqüência de parada de transferência. Pare a transferência para atravessar uma membrana ER. Ele o ancora na membrana.

Se esta parte for o lúmen do ER bem aqui, então este é o citoplasma.

OK. Então é assim que as membranas e proteínas são desse tipo. Agora, como você pode ver aqui, está na membrana. Está embutido na membrana.

E eu desenhei uma proteína de membrana diferente aqui porque esta proteína vai trabalhar seu caminho para o outro lado do retículo endoplasmático. OK? Como a proteína totalmente secretada também funciona do seu jeito. No retículo endoplasmático, os açúcares são colocados nessas proteínas. Então, quando eles chegam ao outro lado, eles se transformam em pequenas vesículas de transporte.

OK? Então aqui está a proteína citoplasmática completamente dentro do lúmen da vesícula. Aqui está a proteína de membrana embutida na membrana da vesícula. E se você se lembra da sequência do Palade, a próxima parada é o Golgi. Então a cabeça para o Golgi, eles se ligam, eles se fundem, e o que estava embutido na membrana ainda está embutido na membrana. E a proteína totalmente secretada está dentro do lúmen do Golgi. Aqui os açúcares são modificados. Eu coloquei pequenos arcos neles. E eles vão até o outro lado do Golgi, onde borbulham novamente em vesículas secretoras.


Assista o vídeo: Human Physiology - cAMP Second Messenger (Novembro 2021).