Em formação

8C: ATP e Fosforilação Oxidativa - Biologia


objetivos de aprendizado

  • explicar as razões para a hidrólise fortemente exergônica de anidridos de ácido carboxílico, anidridos de ácido fosfórico, anidridos mistos e estruturas análogas e fornecer valores aproximados para o ΔG0 de hidrólise deles;
  • identificar moléculas de estruturas de Lewis cujas clivagens hidrolíticas são fortemente exergônicas;
  • explicar como a clivagem exergônica de ligações fosfoanidrido em ATP pode ser acoplada à síntese endergônica de macromoléculas como proteínas;
  • desenhar mecanismos para mostrar como as reações de oxidação e fosforilação são acopladas no metabolismo anaeróbico por meio da produção de um anidrido misto catalisado pela enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase;
  • explicar como o arseniato pode duplicar as reações de oxidação e fosforilação na glicólise
  • explicar como o NAD + pode ser regenerado a partir do NADH em condição anaeróbica para permitir que a glicólise continue;
  • explicar o fluxo geral de elétrons do NADH para o dioxgênio por meio de uma série de aceptores de elétrons ligados a proteínas móveis e de membrana no transporte de elétrons no membro interno da mitocôndria.
  • explicar com diagramas de imagem como as reações de oxidação e fosforilação (para produzir ATP) são acopladas no metabolismo aeróbico através da geração e colapso de um gradiente de prótons na mitocôndria;
  • desenhe diagramas de imagens explicando a estrutura de F1F0ATPase no membro interno da mitocôndria e explique usando a imagem como a síntese de ATP é acoplada ao colapso do gradiente de proteína
  • escreva uma equação para o potencial eletroquímico e use-a para calcular o ΔG0 disponível para a produção de ATP no colapso do gradiente de prótons, dados os valores típicos para ΔpH e ΔE através da membrana

As reações de oxidação biológica têm duas funções:

  1. A oxidação de moléculas orgânicas pode produzir novas moléculas com propriedades diferentes (por exemplo, um aumento na solubilidade é observado na hidroxilação de substratos aromáticos pelo citocromo P450) e da mesma forma, os aminoácidos podem ser oxidados para produzir neurotransmissores.
  2. A maioria das reações de oxidação biológica ocorre, entretanto, para produzir energia para impulsionar processos biológicos desfavorecidos termodinamicamente, como síntese de proteína e ácido nucleico, ou motilidade.

A energia potencial química não é liberada apenas em reações de oxidação biológica. Em vez disso, é transduzido em uma forma mais útil de energia química na molécula ATP (trifosfato de adenosina). Este capítulo discutirá as propriedades que tornam o ATP tão útil biologicamente e como as reações de oxidação biológica exergônica são acopladas à síntese de ATP.

  • C1. ATP
    As reações de oxidação biológica têm duas funções. A oxidação de moléculas orgânicas pode produzir novas moléculas com propriedades diferentes. Por exemplo, aumentos na solubilidade são observados na hidroxilação de substratos aromáticos pelo citocromo P450. Da mesma forma, os aminoácidos podem ser oxidados para produzir neurotransmissores. A maioria das reações de oxidação biológica ocorre, entretanto, para produzir energia para impulsionar processos biológicos desfavorecidos termodinamicamente, como síntese de proteína e ácido nucleico, ou motilidade.
  • C2. Acoplamento aneróbio de oxidação e síntese de ATP
  • C3. Acoplamento aeróbio de oxidação e síntese de ATP
  • C4. Uma Visão Geral do Transporte Mitocondrial de Elétrons
  • C5. Complexo I - NADH-quinona oxidoredutase
  • C6. Complexo III
    O Complexo III é uma proteína complicada com várias subunidades. As subunidades envolvidas na transferência de elétrons são o citocromo b, o citocromo c1 e a proteína de enxofre de ferro de Rieske (ISP). O citocromo b tem dois hemes.
  • C7. Complexo IV - Citocromo C oxidase (CCOx)
  • C8. Oxidação de acoplamento geral e síntese de ATP
  • C9. ATP sintase
  • C10. Colapso do gradiente de prótons e síntese de ATP - Estrutura
  • C11. Colapso do gradiente de prótons e síntese de ATP - Termodinâmica
  • C12. Necessidades metabólicas em células não proliferativas e proliferativas
  • C13. PPARs e a regulação do metabolismo
    No estado bem alimentado (altos níveis de carboidratos e lipídios), a síntese de glicogênio, triacilglicerídeos e ácidos graxos deve ser ativada, enquanto a degradação do glicogênio (glicogenólise), a mobilização das reservas de triglicerídeos e a oxidação dos ácidos graxos devem ser minimizadas. No estado de jejum, as vias opostas devem ser ativadas. O controle regulatório desses processos opostos é complicado, mas os PPARs (receptores ativados por proliferadores de peroxissoma) demonstraram ter um papel importante.
  • C14. Links e referências

Introdução e objetivos

Este tutorial irá descrever os mecanismos envolvidos na síntese de ATP durante a respiração celular. O estágio final da respiração celular ocorre na mitocôndria, onde os portadores de elétrons reduzidos (NADH e FADH2) doam seus elétrons ao oxigênio por meio de uma cadeia de transporte de elétrons. Conforme os elétrons viajam, um gradiente eletroquímico de hidrogênio é gerado através de uma das duas membranas mitocondriais. A energia deste gradiente eletroquímico de prótons é usada para sintetizar ATP.

Ao final deste tutorial, você deve saber:

  • A natureza do acoplamento quimiosmótico do transporte de elétrons e síntese de ATP
  • As características de uma mitocôndria
  • O significado do potencial redox e como ele determina o fluxo de elétrons
  • Os mecanismos de transporte de elétrons (incluindo o papel dos portadores de elétrons reduzidos NADH e FADH2e oxigênio)
  • Como o gradiente eletroquímico de hidrogênio é formado
  • Como o gradiente eletroquímico de hidrogênio é usado para sintetizar ATP

Bioquímica. 5ª edição.

Figura

Mitocôndrias, coradas de verde, formam uma rede dentro de uma célula de fibroblasto (esquerda). As mitocôndrias oxidam combustíveis de carbono para formar energia celular. Esta transformação requer a transferência de elétrons através de vários grandes complexos de proteínas (acima), alguns dos quais bombeiam (mais.)

O NADH e FADH2 formadas na glicólise, na oxidação do ácido graxo e no ciclo do ácido cítrico são moléculas ricas em energia porque cada uma contém um par de elétrons com alto potencial de transferência. Quando esses elétrons são usados ​​para reduzir o oxigênio molecular à água, uma grande quantidade de energia livre é liberada, que pode ser usada para gerar ATP. A fosforilação oxidativa é o processo no qual o ATP é formado como resultado da transferência de elétrons do NADH ou FADH 2 também 2 por uma série de portadores de elétrons. Esse processo, que ocorre nas mitocôndrias, é a principal fonte de ATP em organismos aeróbios (Figura 18.1). Por exemplo, a fosforilação oxidativa gera 26 das 30 moléculas de ATP que são formadas quando a glicose é completamente oxidada em CO2 e H2O.

Figura 18.1

Micrografia Eletrônica de uma Mitocôndria. [Cortesia do Dr. George Palade.]

A fosforilação oxidativa é conceitualmente simples e mecanicamente complexa. Na verdade, desvendar o mecanismo de fosforilação oxidativa tem sido um dos problemas mais desafiadores da bioquímica. O fluxo de elétrons do NADH ou FADH2 também2 através de complexos de proteínas localizados na membrana mitocondrial interna leva ao bombeamento de prótons para fora da matriz mitocondrial. A distribuição desigual resultante de prótons gera um gradiente de pH e um potencial elétrico transmembrana que cria um força motriz próton. O ATP é sintetizado quando os prótons fluem de volta para a matriz mitocondrial através de um complexo enzimático. Assim, a oxidação de combustíveis e a fosforilação de ADP são acopladas por um gradiente de prótons através da membrana mitocondrial interna (Figura 18.2).

Figura 18.2

Essence of Oxidative Phosphorylation. A oxidação e a síntese de ATP são acopladas por fluxos de prótons transmembrana.

A fosforilação oxidativa é o culminar de uma série de transformações de energia que são chamados respiração celular ou simplesmente respiração em sua totalidade. Primeiro, os combustíveis de carbono são oxidados no ciclo do ácido cítrico para produzir elétrons com alto potencial de transferência. Então, essa força motriz de elétrons é convertida em uma força motriz de prótons e, finalmente, a força motriz de prótons é convertida em potencial de transferência de fosforila. A conversão da força motriz do elétron em força motriz do próton é realizada por três bombas de prótons acionadas por elétrons & # x02014NADH-Q oxidorredutase, Q-citocromo c oxidorredutase e citocromo c oxidase. Esses grandes complexos transmembrana contêm vários centros de redução de oxidação, incluindo quinonas, flavinas, aglomerados de ferro-enxofre, hemes e íons de cobre. A fase final da fosforilação oxidativa é realizada por ATP sintase, um conjunto de síntese de ATP que é conduzido pelo fluxo de prótons de volta para a matriz mitocondrial. Componentes desta notável enzima giram como parte de seu mecanismo catalítico. A fosforilação oxidativa mostra vividamente que gradientes de prótons são uma moeda interconvertível de energia livre em sistemas biológicos.

Respiração & # x02014

Um processo gerador de ATP no qual um composto inorgânico (como o oxigênio molecular) atua como o aceptor final de elétrons. O doador de elétrons pode ser um composto orgânico ou inorgânico.

  • 18.1. A fosforilação oxidativa em eucariotos ocorre na mitocôndria
  • 18,2. A fosforilação oxidativa depende da transferência de elétrons
  • 18,3. A cadeia respiratória consiste em quatro complexos: três bombas de prótons e uma ligação física com o ciclo do ácido cítrico
  • 18,4. Um gradiente de próton impulsiona a síntese de ATP
  • 18,5. Muitos ônibus espaciais permitem movimento através das membranas mitocondriais
  • 18.6. A regulação da respiração celular é governada principalmente pela necessidade de ATP
  • Resumo
  • Problemas
  • Leituras Selecionadas

Por acordo com a editora, este livro pode ser acessado pelo recurso de pesquisa, mas não pode ser navegado.


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Discussão

Demonstramos que o estresse oxidativo leve induzido por tratamento PQ ou nocaute SOD1 reduz o acoplamento da fosforilação oxidativa na Vivo e interrompe a energia do músculo esquelético. Esses resultados fornecem um na Vivo teste do acoplamento & # x0201 para sobreviver & # x0201d hipótese, que propõe que o estresse oxidativo ativa o vazamento de prótons mitocondrial e reduz o acoplamento da fosforilação oxidativa [26]. A produção de ATP e ROS está ligada ao potencial da membrana mitocondrial interna (& # x00394 & # x003c8), que é gerado conforme os prótons são bombeados da matriz para o espaço da membrana interna pelas reações redox consumidoras de oxigênio da cadeia de transporte de elétrons [ 27], [28]. O acoplamento & # x0201 para sobreviver & # x0201d sugere que o estresse oxidativo leva a um aumento no vazamento de prótons mitocondrial e, portanto, uma redução de & # x00394 & # x003c8, como um mecanismo de feedback negativo que mitiga a produção adicional de ROS mitocondrial [19]. Como resultado desse vazamento de prótons, o F1F0A sintase de ATP é contornada e o resultado líquido é uma redução no ATP produzido por oxigênio consumido (menor P / O).

Na Vivo Os valores de P / O foram significativamente reduzidos em modelos de curto prazo (2 semanas de tratamento PQ) e crônicos (SOD1 & # x02212 / & # x02212). Os 10 mg / kg de PQ administrados uma ou duas vezes por semana neste estudo foram suficientes para induzir um aumento nos marcadores de estresse oxidativo, mas esta dose de PQ está bem abaixo do LD50 de 70 mg / kg relatado para camundongos quando PQ é dissolvido em solução salina e administrada por via intraperitoneal [29]. Assim, a ausência de um efeito agudo no fornecimento de oxigênio ao músculo esquelético ou disfunção mitocondrial grave não é surpreendente. Em vez disso, observamos um controle significativo do metabolismo mitocondrial e da energética. A taxa de produção de ATP mitocondrial em repouso flutuou menos de 15 & # x00025 com o tratamento PQ, indicando que este nível de estresse oxidativo não alterou muito a demanda de ATP em repouso do músculo esquelético. No entanto, o consumo de oxigênio aumentou 43 & # x00025 em PQ1 e 71 & # x00025 em PQ2 para atender a essa demanda de ATP inalterada como resultado do acoplamento reduzido da oxidação à fosforilação. Esses resultados são semelhantes aos de mitocôndrias e células isoladas, onde o aumento do vazamento de prótons pode ser induzido pela adição de oxidantes exógenos ao ensaio [21], [30].

Usamos fibras musculares permeabilizadas para testar se o na Vivo os efeitos na função mitocondrial foram devidos a alterações intrínsecas às mitocôndrias ou foram o resultado da interação entre as mitocôndrias e o ambiente celular. Nenhuma diferença na respiração mitocondrial em EDL permeabilizado entre os grupos tratados com PQ e de controle, incluindo respiração conduzida por vazamento de prótons, indica que o acoplamento diminuído observado na Vivo não foi devido a dano oxidativo ou uma mudança na composição da mitocôndria. Essas mudanças seriam intrínsecas à mitocôndria e persistiriam depois que as fibras fossem permeabilizadas e o ambiente celular substituído por tampão de respiração. Além disso, a análise da expressão de genes e proteínas em gastrocnêmios mistos não revelou diferenças nos reguladores da biogênese mitocondrial (PGC1 & # x003b1 e TFAM), conteúdo mitocondrial (DCR e complexos I, II e IV), ou desacopladores mitocondriais (UCP3 e ANT1) em Camundongos tratados com PQ. Portanto, concluímos que o reduzido na Vivo P / O é devido ao controle direto da função mitocondrial por ROS ou um subproduto relacionado.

Reduzido na Vivo o acoplamento com PQ não foi devido a uma regulação positiva da expressão de UCP3 ou ANT1 no músculo. A diferença entre nossos resultados e relatórios anteriores indicando que UCP3 e ANT1 são regulados positivamente em resposta ao estresse oxidativo pode ser devido às diferenças na magnitude do estresse oxidativo ou à curta duração do tratamento. Os estudos anteriores em cultura de células mediram os níveis de expressão horas após um estresse oxidativo de alta dose aguda [8], enquanto o tratamento PQ empregado neste estudo envolveu um nível relativamente baixo de estresse induzido ao longo de um período de duas semanas. A falta de diferença nos níveis de expressão de UCP3 e ANT1 não impede um papel dessas proteínas na redução da P / O mitocondrial na Vivo. Ativação de vazamento de prótons mediado por UCP3 ou ANT1 por estresse oxidativo ou peróxidos lipídicos [20], [21], [31] na Vivo fornece um mecanismo potencial para explicar a diferença entre nossos na Vivo e resultados de fibra permeabilizada. A troca do ambiente celular e a perda de ativadores potenciais de UCP3 ou ANT1 durante o processo de permeabilização reverteriam o aumento do vazamento de prótons medido na Vivo com tratamento PQ.

O estresse oxidativo crônico devido à ausência de SOD1 também reduziu a eficiência da fosforilação oxidativa. Em estudos anteriores, as taxas de controle respiratório (respiração estado 3 / estado 4) em mitocôndrias isoladas foram significativamente reduzidas em camundongos SOD1 & # x02212 / & # x02212 com 20 meses de idade, associadas à diminuição da produção de ATP mitocondrial, perda de massa muscular esquelética e aumento mitocondrial H2O2 produção [5], [32]. Neste estudo, o ATPmax elevado e a expressão aumentada de proteínas mitocondriais e transcritos em camundongos SOD1 & # x02212 / & # x02212 sugere que o estresse oxidativo e desacoplamento em camundongos SOD1 & # x02212 / & # x02212 adultos jovens induzem um aumento compensatório na capacidade mitocondrial . Os efeitos mais graves na disfunção mitocondrial relatados em camundongos SOD1 & # x02212 / & # x02212 em idades mais velhas são provavelmente devido ao acúmulo de dano oxidativo nas mitocôndrias e declínio no ATP produzido por mitocôndria [32]. O aumento das proteínas mitocondriais em camundongos SOD1 & # x02212 / & # x02212 é apoiado pela crescente evidência de que ROS são reguladores importantes da biogênese mitocondrial. Tratamento de células tubulares proximais renais e células neurais com H2O2 em cultura induz biogênese mitocondrial e regulação positiva de antioxidantes mitocondriais [7], [8]. A ausência de um efeito do tratamento PQ na biogênese mitocondrial neste estudo pode ser devido ao baixo nível ou curta duração do estresse.

A redução da P / O está associada à interrupção da homeostase energética, conforme indicado pelas razões PCr / ATP mais baixas em camundongos tratados com PQ. O potencial da membrana mitocondrial fornece uma ligação mecanicista entre o estado de energia da célula e o acoplamento da fosforilação oxidativa e impõe um limite termodinâmico na razão ATP / ADP que pode ser mantido [33]. Portanto, como o potencial de membrana em repouso diminui devido ao aumento do vazamento de prótons através da membrana mitocondrial interna, a relação ATP / ADP em repouso também diminui, levando a um PCr / ATP mais baixo e níveis elevados de AMP através das reações de creatina quinase e adenilato quinase [34]. Assim, descobrimos que o estresse oxidativo leve está associado ao aumento do estresse energético e ao elevado consumo de oxigênio em repouso no músculo esquelético em repouso.

Embora a razão PCr / ATP tenha sido mantida em camundongos SOD1 & # x02212 / & # x02212, a diminuição significativa na concentração de ATP fornece evidências de estresse energético no caso de estresse oxidativo crônico. Nós relatamos anteriormente uma perda dos níveis de ATP em repouso na Vivo associado à redução da P / O no músculo esquelético envelhecido de camundongos [35] e humanos [36]. No entanto, não podemos descartar a possibilidade de que as concentrações mais baixas de ATP sejam devidas à heterogeneidade da saúde celular e da concentração de ATP no músculo esquelético do membro posterior. Nosso na Vivo As medições de ATP por MR e HPLC são feitas em todo o membro posterior distal, portanto, não podemos contabilizar as diferenças locais ou a perda de ATP em fibras gravemente danificadas. Esses tipos de variação podem reduzir o volume médio dos níveis de ATP em repouso e fornecer uma explicação alternativa para o ATP mais baixo em camundongos SOD1 & # x02212 / & # x02212.

A manutenção da homeostase da energia celular é um importante determinante da saúde e sobrevivência celular [37]. Assim, o estresse energético é um sinal adaptativo chave que modifica a expressão de genes e proteínas por meio de várias moléculas de sinalização de detecção de energia, como AMPK e quinases relacionadas [38]. A fosforilação de AMPK é sensível à razão ATP / AMP celular [39], que está bioquimicamente ligada à razão PCr / ATP por meio das reações de creatina quinase e adenilato quinase [40], [41]. A ativação da AMPK através do aumento da fosforilação controla as vias a jusante para reduzir o uso de energia [42] e aumentar a produção de energia [43] para restaurar a homeostase energética [39], [43]. No entanto, o aumento da ativação da AMPK também demonstrou contribuir para o aumento da morte celular e atrofia muscular [44], [45], [46]. Portanto, uma resposta adaptativa inicial da célula para restaurar a homeostase energética pode, em última análise, ter resultados patológicos na presença de uma energia crônica ou estresse oxidativo.

Em conclusão, demonstramos que o estresse oxidativo leve leva à redução do acoplamento mitocondrial e ao estresse de energia celular na Vivo. Assim reduzido na Vivo P / O pode fornecer um mecanismo que liga o estresse oxidativo moderado à ativação de processos de sinalização sensíveis à energia. Demonstramos que este desacoplamento mitocondrial e estresse energético precede defeitos graves na função mitocondrial ou produção de ATP prejudicada e pode servir como um biomarcador precoce para a interrupção da função mitocondrial normal por estresse oxidativo.


Respiração

A respiração aeróbica é composta por quatro estágios: glicolise, a reação do link, a ciclo de Krebs e fosforilação oxidativa. Durante a respiração aeróbica, a glicose é efetivamente queimada dentro de nossos corpos (ela reage com o oxigênio) para produzir dióxido de carbono, água e muita energia na forma de ATP. o equação geral para respiração aeróbica é:

Glicolise

O primeiro estágio da respiração aeróbica é glicolise, que ocorre no citoplasma. A glicólise converte glicose, uma molécula de seis carbonos, em duas moléculas menores de três carbonos chamadas piruvato. Este estágio não requer oxigênio, por isso é um processo anaeróbico e está envolvido nas vias respiratórias aeróbias e anaeróbicas.

Glicose é fosforilado usando os grupos fosfato de duas moléculas de ATP. O ATP é hidrolisado em ADP e fosfato inorgânico. Isso forma uma molécula que é instável e imediatamente se divide em duas moléculas de três carbonos chamadas fosfato triose (TP). O hidrogênio é removido do TP para convertê-lo em piruvato. O hidrogênio é transferido para um coenzima chamado NAD formar NAD reduzido (NADH). A remoção do hidrogênio do TP oxida-o. O NAD reduzido é usado no último estágio da respiração aeróbica, a fosforilação oxidativa, enquanto o piruvato se move para a mitocôndria para o próximo estágio da respiração, a reação de ligação.

A conversão da triose fosfato em piruvato produziu quatro moléculas de ATP. Uma vez que duas moléculas foram usadas para a fosforilação da glicose na primeira etapa, isso significa que há um ganho líquido de dois ATP moléculas na glicólise.

A reação do link

A reação de ligação ocorre na matriz mitocondrial.

o reação do link ocorre no matriz mitocondrial e converte o piruvato em uma molécula chamada acetil coenzima A (acetil CoA). Este estágio não produz energia na forma de ATP, mas produz NAD reduzido e acetil CoA. O NAD reduzido será usado na fosforilação oxidativa enquanto o acetil CoA será usado na próxima etapa da respiração aeróbia, o ciclo de Krebs.

Durante a reação de ligação, um átomo de carbono é removido do piruvato, formando dióxido de carbono. Isso converte o piruvato em uma molécula de dois carbonos chamada acetato. O hidrogênio também é removido do piruvato na conversão em acetato, que é captado pela coenzima NAD para formar NAD reduzido. O acetato é combinado com coenzima A (CoA) para formar acetil CoA.

Uma vez que uma molécula de glicose é convertida em 2x piruvato, a reação de ligação acontece duas vezes para cada molécula de glicose. Isso significa que cada molécula de glicose produz duas moléculas de acetil CoA (junto com 2x dióxido de carbono e 2x NADH).

O ciclo de Krebs

o Ciclo de Krebs (também conhecido como ciclo do ácido cítrico) é uma série de reações que geram NAD reduzido e uma molécula semelhante chamada FAD reduzido que são necessários para a fosforilação oxidativa. Acetil CoA da reação de ligação reage com uma molécula de quatro carbonos chamada oxaloacetato. A porção da coenzima A do acetil CoA é removida e retorna à reação de ligação para ser reutilizada. Uma molécula de 6 carbonos chamada citrato é produzido. Carbono e hidrogênio são removidos do citrato, formando dióxido de carbono e NAD reduzido. O citrato é convertido em um composto de 5 carbonos. Descarboxilação e desidrogenação ocorrer mais uma vez, o que converte os compostos de 5 carbonos na molécula de 4 carbonos oxaloacetato com o qual começamos. ATP, 2 moléculas de NAD reduzido, uma molécula de FAD e dióxido de carbono também são formados nesta etapa. Este ciclo ocorre duas vezes para cada glicose molécula que é respirada aerobicamente.

Fosforilação oxidativa

Fosforilação oxidativa é o último estágio da respiração aeróbica e é a parte onde a maior parte do ATP é feito. Usa o elétrons que estão sendo carregados por NAD reduzido e FAD reduzido que foram gerados nas três primeiras etapas. Acontece em todo o membrana mitocondrial interna e envolve dois processos - o cadeia de transporte de elétrons e quimiosmose.

As coenzimas NAD reduzido e FAD reduzido liberam átomos de hidrogênio que se dividem em íons de hidrogênio e elétrons. Os elétrons são passados ​​para portadores de elétrons que estão embutidos na membrana mitocondrial interna e viajam ao longo de uma série de transportadores de elétrons conhecidos como cadeia de transporte de elétrons. À medida que viajam entre os portadores de elétrons, eles perder energia. Esta energia é usada pelos portadores para bombear íons de hidrogênio da matriz mitocondrial através da membrana interna. Os íons de hidrogênio se acumulam no espaço intermembrana e isso gera um gradiente de prótons (às vezes referido como gradiente eletroquímico) através da membrana. Os íons de hidrogênio então fluem de volta para a matriz através da enzima ATP sintase que usa o movimento de íons de hidrogênio (o força motriz de prótons) para adicionar um grupo fosfato ao ADP para formulário ATP. O processo pelo qual o movimento dos íons de hidrogênio produz ATP é denominado quimiosmose. Uma vez que os elétrons alcançam o final da cadeia de transporte de elétrons, eles são passados ​​para oxigênio, que é conhecido como ‘Receptor final de elétrons’. O oxigênio se combina com elétrons e íons de hidrogênio para formar agua, um dos produtos da respiração aeróbia.

Venenos metabólicos, como o cianeto, interrompe a fosforilação oxidativa pela ligação a transportadores de elétrons e inibindo o movimento dos elétrons ao longo da cadeia de transporte de elétrons. Isso reduz a quimiosmose, uma vez que um gradiente de prótons não é estabelecido e também inibe o ciclo de Krebs, uma vez que NAD e FAD não são regenerados. A produção de ATP é interrompida, de modo que processos que requerem energia (como a contração do músculo cardíaco) não podem ocorrer, o que pode ser mortal para o organismo que ingeriu o veneno.

Produção total de ATP

A respiração aeróbica produz um total de 38 ATP moléculas por uma molécula de glicose respirada. Aqui está uma análise da produção de ATP em cada um dos diferentes estágios. Cada molécula de NAD reduzido produz 3 ATP e cada molécula de FAD reduzido produz 2 ATP. Lembre-se de que a reação de ligação e o ciclo de Krebs acontecem duas vezes para cada molécula de glicose, pois ela é convertida em 2x piruvato.

Glicólise: produção direta de 2 ATP

Glicólise: 2 NAD reduzidos são convertidos em 6 ATP (2 x 3) em fosforilação oxidativa

Reação de ligação: 2 NAD reduzidos são convertidos em 6 ATP (2 x 3) em fosforilação oxidativa

Ciclo de Krebs: produção direta de 2 ATP

Ciclo de Krebs: 6 NAD reduzidos são convertidos em 18 ATP (6 x 3) em fosforilação oxidativa

Ciclo de Krebs: 2 FAD reduzidos são convertidos em 4 ATP (2 x 2) em fosforilação oxidativa

ATP total = 2 + 6 + 6 + 2 + 18 + 4 = 38 ATP

Medindo a taxa de respiração

A taxa de respiração é medida usando um aparelho chamado respirômetro e funciona medindo o quantidade de oxigênio usada por um organismo ou o quantidade de dióxido de carbono produzida. Quanto mais rápido for a quantidade de oxigênio consumido, mais rápida será a taxa de respiração.

Você configuraria o respirômetro conforme mostrado no diagrama, com organismos respirando (como piolhos) em um tubo de ensaio conectado a outro tubo de ensaio por um manômetro. O manômetro contém um líquido colorido que se aproxima do tubo de ensaio de respiração à medida que o oxigênio é consumido. O tubo de ensaio à direita é um ao controle tubo de ensaio, contendo uma substância que não respira, como contas de vidro. The purpose of the control tube is to ensure that only respiration is causing the movement of liquid in the manometer. The control tube should be as similar as possible to the test tube e.g. the glass beads should be the same mass as the woodlice. In each test tube you need to add the same volume of potassium hydroxide solution which absorbs carbon dioxide - this ensures that the movement of the liquid is only affected by the decreasing levels of oxygen.

Once the apparatus has been set up, it is left for a certain period of time (e.g. 30 minutes). This will allow for the potassium hydroxide to absorb all of the carbon dioxide in the test tubes. You then record the distance moved by the liquid in the manometer in a given time, using the calibrated scale and a stopwatch. You then calculate the volume of oxygen taken in by the woodlice per minute. Repeat the experiment at least three times and calculate a mean.

Anaerobic respiration

Respiration can also occur in the absence of oxygen - this is called anaerobic respiration. In mammals, glucose can be converted into lactato (aka lactic acid) which releases a small amount of energy in the form of ATP.

The first step of anaerobic respiration is the same as aerobic respiration: glycolysis. Glucose is converted into pyruvate with the net release of 2 ATP molecules. 2 molecules of reduced NAD are also formed. In the second step, reduced NAD donates hydrogen (and electrons) to pyruvate, producing lactate and NAD. Esse regenerates more oxidised NAD for glycolysis. This enables anaerobic respiration to continue and ensures that small amounts of energy can still be made in the absence of oxygen, allowing biological reactions to keep ticking over.

Continued anaerobic respiration results in the build up of lactate, which needs to be broken down. Cells can convert lactate back into pyruvate, which is then able to enter aerobic respiration at the Krebs cycle. Além disso, liver cells have the ability to convert lactate into glucose, which can then be respired aerobically (if oxygen is now present) or stored for later use.


8C: ATP and Oxidative Phosphorylation - Biology

Oxidative phosphorylation , incorporating two interdependent processes – the flow of electrons through cadeia de transporte de elétrons down to the oxygen and chemiosmotic coupling -, is the final stage of cellular respiration.

Highly energetic electrons that are extracted during the decomposition of food molecules by cellular metabolic pathways are stored in electron carriers – NADH and FADH2. Energy stored in these molecules is converted into cellular energy currency (i.e. ATP) only via oxidative phosphorylation . Actually, most of the ATP production during cellular respiration happens here. Take a look at the diagram below that shows the interconnectedness between cellular energy pathways.

In the mitochondrial matrix, the electron carriers NADH and FADH2 deposit the electrons they gained from glycolysis and the citric acid cycle in the electron transport chain – a series of proteins embedded in the inner mitochondrial membrane. In the electron transport chain, electrons are passed from one molecule to another as a series of redox reactions. The energetically “downhill” movement of electrons through the chain causes pumping of protons into the intermembrane space by the first, third, and fourth complexes. As a result, the electrochemical gradient (i.e. proton gradient) forms across the inner membrane of mitochondria.

This gradient is used by chemiosmotic coupling to make ATP through phosphorylation of ADP. In this process, protons flow down their concentration gradient into the matrix through the membrane protein ATP synthase, causing it to spin (like a water wheel) and catalyze conversion of ADP to ATP. Take a look at the diagram below which summarizes oxidative phosphorylation.

You may wonder where the oxygen takes role in cellular “respiration”? As electrons complete their flow through electron transport chain elements, oxygen accepts them. Also taking up protons from the environment, oxygen forms water in this process. If oxygen isn’t there to accept electrons (for instance, because a person is not breathing in enough oxygen), the electron transport chain will stop running, and ATP will no longer be produced by chemiosmosis. Without enough ATP, cells can’t carry out the reactions they need to function, and, after a long enough period of time, may even die.


The electron transport chain or ETC is tightly coupled to the process of oxidative phosphorylation via the atp synthase system for the production of useful energy for metabolism in the form of ATP. These coupled processes are present in all mitochondria, which are present in all plant and animal life above the level of microbes. Even in the microbes, there are ETCs embedded in the cell membranes, even though they don't possess mitochondria.

A normal animal cell will have on the order of a thousand mitochondria, and each mitochondrion has on the order of a thousand ETCs, so a cell has something on the order of a million of these coupled energy tools! (Ahern)


Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements

Partitioning of ATP generation between glycolysis and oxidative phosphorylation is central to cellular bioenergetics but cumbersome to measure. We describe here how rates of ATP generation by each pathway can be calculated from simultaneous measurements of extracellular acidification and oxygen consumption. We update theoretical maximum ATP yields by mitochondria and cells catabolizing different substrates. Mitochondrial P/O ratios (mol of ATP generated per mol of [O] consumed) are 2.73 for oxidation of pyruvate plus malate and 1.64 for oxidation of succinate. Complete oxidation of glucose by cells yields up to 33.45 ATP/glucose with a maximum P/O of 2.79. We introduce novel indices to quantify bioenergetic phenotypes. The glycolytic index reports the proportion of ATP production from glycolysis and identifies cells as primarily glycolytic (glycolytic index > 50%) or primarily oxidative. The Warburg effect is a chronic increase in glycolytic index, quantified by the Warburg index. Additional indices quantify the acute flexibility of ATP supply. The Crabtree index and Pasteur index quantify the responses of oxidative and glycolytic ATP production to alterations in glycolysis and oxidative reactions, respectively the supply flexibility index quantifies overall flexibility of ATP supply and the bioenergetic capacity quantifies the maximum rate of total ATP production. We illustrate the determination of these indices using C2C12 myoblasts. Measurement of ATP use revealed no significant preference for glycolytic or oxidative ATP by specific ATP consumers. Overall, we demonstrate how extracellular fluxes quantitatively reflect intracellular ATP turnover and cellular bioenergetics. We provide a simple spreadsheet to calculate glycolytic and oxidative ATP production rates from raw extracellular acidification and respiration data.

Palavras-chave: ATP ECAR OCR bioenergetics energy metabolism glycolysis metabolic index mitochondria oxidative phosphorylation.

© 2017 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

Declaração de conflito de interesse

The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article


Discussão

Major thrombotic and hemorrhagic events are associated with changes in platelet metabolism and function including aggregation [6,8–10,41–44]. Understanding these metabolic changes is important in designing new therapeutic approaches to modulate platelet function, and assessing the impact of current interventions for cancer or other diseases on platelet bioenergetic capacity. Although it is clear that both glycolysis and oxidative phosphorylation are active metabolic pathways in platelets, the metabolic plasticity in the use of oxidative substrates for platelet aggregation remains unexplored [6,11–15]. The focus of this study is to elucidate how fatty acids and Gln interact with glucose in regulating the metabolic changes that accompany thrombin mediated platelet aggregation. The advantage of the approach taken here is that the changes in platelet metabolism can be followed over time, and mitochondrial function can be determined in intact and permeabilized platelets, thereby avoiding artifacts introduced by disruptive isolation techniques.

Using platelets isolated from healthy human volunteers, we simultaneously measured mitochondrial function and glycolysis after exposing platelets to thrombin and found a rapid stimulation of both metabolic pathways (Fig 1). Interestingly, thrombin increases ATP-linked respiration which is direct evidence for the contribution of the mitochondrion to the energetic demand associated with thrombin stimulated aggregation. Other oxygen consuming processes such as the cyclooxygenases were probably below the limit of detection. It has been suggested that high levels of thrombin can lead to opening of the mitochondrial permeability transition pore during platelet aggregation, leading to decreased mitochondrial membrane potential and reduced ATP output [45,46]. However, we have shown that over the first 30 min after thrombin exposure there is no change in proton leak (Fig 1C and 1D). This indicates that the mitochondrial permeability transition pore has not opened under these conditions, since it would increase proton leak and decrease ATP linked respiration. Further, measurement of mitochondrial function after thrombin exposure revealed only minor changes in RCR and oxidation of complex I and II linked substrates, which suggests that a major mitochondrial dysfunction is not normally associated with the early stages of platelet aggregation (Fig 2). There is a decrease in total ATP and ADP levels in thrombin treated platelets indicative of granule release (Fig 3A), but bioenergetic parameters such as the energy charge and ATP/ADP ratio are maintained indicating that the energy demand of the platelet can be met under these conditions of increased demand (Fig 3).

It is not known which substrates support the rapid and sustained stimulation of mitochondrial respiration and glycolysis upon addition of thrombin in platelets. The XF DMEM media used in these experiments did not contain free fatty acids. The source of fatty acids for oxidative phosphorylation is likely derived from endogenous free fatty acids and triglycerides stores that release fatty acids upon lipase activity [47,48]. It is important to note that fatty acid oxidation also occurs in the peroxisomes and with enzymes such as cyclooxygenase [49,50]. However, the oxygen consumption rate reported here can largely be ascribed to mitochondrial oxidative phosphorylation, since it is inhibited by antimycin A. Exogenous supplementation with the fatty acid palmitate, increased basal and maximal respiration, indicating that platelets are able to transport extracellular fatty acids and utilize them for respiration (Fig 4). Fatty acid supplementation also increases proton leak, which has been described previously [51–53]. However, supplementation of fatty acids do not change thrombin stimulated respiration, indicating that the platelets are not relying on exogenous fatty acids to support the metabolic requirements for thrombin stimulation (Fig 4). To elucidate the contribution of endogenous stores of fatty acids to platelet bioenergetics, using etomoxir, an inhibitor of CPT-1, we found that fatty acid oxidation is making a major contribution to basal respiration and is required for the thrombin stimulated oxygen consumption (Fig 5B). Using TMZ which inhibits 3-ketoacyl-CoA thiolase, we similarly found that fatty acid oxidation is required for thrombin linked increase in OCR, albeit to a lower extent than etomoxir (Fig 5D). The reasons for this difference are not clear, and could be due to an off-target effect of etomoxir or compensation in the presence of TMZ.

Gln depletion from the media or inhibition of glutaminase with Aza resulted in a small but significant effect on platelet bioenergetics (Fig 6A and 6E). Further, a Gln concentration dependent effect was found on bioenergetic parameters in the presence of thrombin (Fig 6D). In the absence of thrombin, bioenergetic parameters showed minimal dependence on Gln, with the exception of maximal respiration which exhibited an EC50 of 367 μM (data not shown). Since the physiological concentrations of Gln in plasma of healthy subjects are 500–750 μM [54], then Gln could become limiting for platelet bioenergetics. This may be important under conditions of Gln deficiency, which have been reported to occur after infections or injury [55]. Interestingly, although glucose oxidation is substantially increased on addition of thrombin it is not making a significant contribution to the thrombin-dependent stimulation of mitochondrial function (Fig 7).

An interesting feature of these studies is the plasticity of platelet metabolism. For example, Gln depletion and inhibition of fatty acid oxidation both caused a compensatory increase in basal ECAR (Fig 5C and 6C). The acidification of the media, measured as an increase in ECAR, is potentially derived from several sources including proton production during glycolysis and from mitochondrial respiration derived CO2 that forms carbonic acid [56]. Using 2DG, an inhibitor of hexokinase, the contribution of glycolysis to ECAR was confirmed, since in resting platelets, 36% of the ECAR and in thrombin stimulated platelets 90% of the ECAR, was inhibitable by 2DG (Fig 7C) Further, inhibition of mitochondrial fatty acid oxidation also causes a compensatory increase in thrombin stimulated glycolysis, but this effect is not observed in the absence of Gln (Fig 5C and 6C). As expected, inhibiting glycolysis decreased basal and thrombin stimulated ECAR (Fig 7C).

The mitochondrial metabolism inhibitors antimycin A, etomoxir, TMZ, Gln depletion, Aza alone or in combination do not prevent platelet aggregation (Fig 8B). We ascribe this effect to a switch to glycolytic metabolism, to compensate for the decrease in oxidative phosphorylation. However, it appears that platelets have a requirement for glucose oxidation which cannot be compensated for by mitochondrial function, since hexokinase inhibition with 2DG and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase inhibition with koningic acid, significantly inhibit platelet aggregation (Fig 8A). The mechanisms underlying these effects are not clear, since both compounds act on different steps in glycolysis, it is likely that the pentose phosphate pathway, which is inhibited by 2DG but not koningic acid, is not playing a major role regulating the energetics of platelets. The combined effects of 2DG or koningic and antimycin are synergistic in the inhibition of platelet aggregation consistent with published studies (Fig 8A) [10]. In contrast, combining inhibition of glycolysis, with etomoxir and/or Gln depletion, or TMZ and/or Aza, decreases aggregation by a further 10%, compared to glycolytic inhibition alone, providing further evidence for multiple oxidative substrate usage in platelet metabolism (Fig 8C).

In summary, we have used a novel approach to measure the oxidative and glycolytic changes that occur with thrombin stimulation of platelets. Here, we show that fatty acids and Gln are required for the rapid thrombin-dependent stimulation of oxidative phosphorylation but not for thrombin-dependent aggregation. Thrombin-dependent activation of platelets initiates a metabolic reprogramming of the platelet towards aerobic glycolysis, increased fatty acid oxidation and glutaminolysis, which is fully capable of meeting the energetic demand imposed by aggregation and underlines the metabolic plasticity of the platelet.


Assista o vídeo: SYNTAZA ATP-fosforylacja substratowa i oksydacyjna-mechanizm działania-o co chodzi?? (Dezembro 2021).