Em formação

Extração Metatranscriptômica


Estou tentando realizar uma análise metatranscriptômica de uma sala limpa. A entrada de DNA é conhecida por ser bastante baixa (<1pg). Apesar disso, ainda quero tentar. Estou pensando que pode ser melhor realizar testes de extração antes, onde certos parâmetros são manipulados. Posso então determinar, a partir desses testes de extração, quais valores para quais parâmetros são os melhores.

Como exemplo, estou lendo um artigo revisado por pares chamado "Validação de bibliotecas de DNA de entrada de picogramas e femtogramas para metagenômica em microescala", onde eles usaram o kit de preparação da biblioteca de DNA Illumina Nextera XT em amostras de baixa biomassa. Dois dos parâmetros que eles manipularam foram:

1) Números do ciclo PCR (Valores = 12, 14, 16, 18, 20) 2) Diluição ATM (Valores = não diluído, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:50)

Espero usar o mesmo tipo de teste de extração para determinar qual combinação de valores desses dois parâmetros é melhor para uma sala limpa. Minha primeira pergunta é: Como posso determinar qual combinação é a melhor (pois existem 25 combinações)? Tenho duas ideias (mas estou aberto a outras):

1) Verifique a quantidade de RNA derivado 2) Verifique algumas métricas de qualidade no RNA

Como espero fazer trigêmeos de cada uma das 25 combinações, terei 75 amostras. Espero não ter que fazer o sequenciamento, pois é demorado e possivelmente caro para escolher a melhor combinação. Existe uma maneira de escolher qual combinação funciona melhor sem ter de sequenciar?

Minha segunda pergunta é: Há algum outro parâmetro neste fluxo de trabalho que eu também possa testar se não estiver obtendo resultados decentes nessas salas limpas de baixa biomassa?

(Como você pode ver, eu não tenho muita experiência direta em biologia molecular, então sinta-se à vontade para corrigir ou questionar qualquer uma das minhas postagens e / ou "emburrecer" sua resposta). Obrigado por compartilhar conselhos (para qualquer pergunta)!


  1. Considere fazer triplicatas de apenas 4 combinações de ciclo / diluição: baixo + baixo, baixo + alto, alto + baixo, alto + alto. Mais simples.

  2. Mais importante: provar que você pode extrair DNA de uma sala limpa. Se você extrair de uma sala limpa real e não obtiver nenhum resultado do PCR, talvez seja porque você não conseguiu coletar nada ou talvez não houvesse nada lá. Idéia - pulverize uma quantidade conhecida de DNA em uma sala que servirá como sua sala limpa simulada. Em seguida, faça o seu protocolo de extração. Você pode testar os parâmetros de ciclo / diluição com a extração de sala limpa simulada e ter essas variáveis ​​otimizadas para quando você coletar de uma sala limpa "selvagem" real que você não dopou com DNA.


Metatranscriptômica como uma ferramenta para identificar espécies e subespécies de fungos em comunidades mistas - uma prova de conceito em condições de laboratório

O sequenciamento de alto rendimento (HTS) permite a geração de grandes quantidades de dados de sequência do genoma a um custo razoável. Organismos em comunidades microbianas mistas agora podem ser sequenciados e identificados de uma forma independente de cultura, geralmente usando sequenciamento de amplicon de um código de barras de DNA. Bulk RNA-seq (metatranscriptomics) tem várias vantagens sobre o sequenciamento de amplicons baseados em DNA: é menos suscetível a vieses de amplificação, captura apenas organismos vivos e permite que um conjunto maior de genes seja usado para identificação taxonômica. Usando um modelo de comunidade fúngica composta por 17 isolados de fungos, avaliamos se a metatranscriptômica pode identificar com precisão as espécies e subespécies de fungos em comunidades mistas. No geral, 72,9% dos transcritos de RNA foram classificados, dos quais a grande maioria (99,5%) foram identificados corretamente em nível de espécie. Das 15 espécies sequenciadas, 13 foram recuperadas e identificadas corretamente. Também detectamos variação no nível de tensão dentro do Cryptococcus complexos de espécies: 99,3% das transcrições atribuídas a Cryptococcus foram classificadas como uma das quatro cepas usadas na comunidade fictícia. Os contaminantes laboratoriais e / ou erros de classificação foram diversos, mas representaram apenas 0,44% das transcrições. Portanto, esses resultados mostram que é possível obter identificação precisa de fungos em nível de espécie e cepa a partir de dados de metatranscriptoma, desde que os táxons identificados em baixa abundância sejam descartados para evitar falsos positivos derivados de contaminação ou classificações erradas. Este estudo destaca as vantagens e os desafios atuais na aplicação da metatranscriptômica em micologia clínica e estudos ecológicos.


Artigo ORIGINAL RESEARCH

Yuhong Huang 1,2,3 & # x02020, Zhuolin Yi 2,3 & # x02020, Yanling Jin 2,3, Mengjun Huang 2,3, Kaize He 2,3, Dayu Liu 1, Huibo Luo 4, Dong Zhao 5, Hui He 6, Yang Fang 2,3 * e Hai Zhao 1,2,3 *
  • 1 Laboratório de Aplicação de Processamento de Carne da Província de Sichuan, Faculdade de Farmácia e Engenharia Biológica, Universidade de Chengdu, Chengdu, China
  • 2 Laboratório Chave de Microbiologia Ambiental da Província de Sichuan, Instituto de Biologia de Chengdu, Academia Chinesa de Ciências, Chengdu, China
  • 3 Laboratório Chave de Microbiologia Ambiental e Aplicada, Academia Chinesa de Ciências, Chengdu, China
  • 4 Bio-tecnologia de fabricação de licores e aplicação do laboratório principal da província de Sichuan, Bioengineering College, Universidade de Ciência e Engenharia de Sichuan, Zigong, China
  • 5 Grupo Wuliangye, Yibin, China
  • 6 Departamento de Engenharia de Fabricação de Licores, Moutai College, Renhuai, China

O licor chinês é um dos destilados destilados mais conhecidos do mundo e a maior categoria de destilados em vendas. A tecnologia única e tradicional de fermentação em estado sólido usada para produzir licor chinês está em uso contínuo há vários milhares de anos. A comunidade microbiana diversa e dinâmica em um licor iniciador é o principal contribuinte para a fabricação de bebidas alcoólicas. No entanto, pouco se sabe sobre a distribuição ecológica e a importância funcional desses membros da comunidade. Neste estudo, a metatranscriptômica foi usada para explorar de forma abrangente os membros ativos da comunidade microbiana e as principais transcrições com funções significativas no processo de produção do licor inicial. Descobriu-se que os fungos são os membros mais abundantes e ativos da comunidade. Um total de 932 enzimas ativas para carboidratos, incluindo proteínas da família 9 e 10 de atividades auxiliares altamente expressas, foram identificadas a 62 & # x000B0C em condições aeróbias. Algumas enzimas termoestáveis ​​potenciais foram identificadas em 50, 62 e 25 & # x000B0C (estágio maduro). Aumento do conteúdo e enzimas-chave superexpressas envolvidas na glicólise e no metabolismo do amido, piruvato e etanol foram detectados a 50 e 62 & # x000B0C. As enzimas-chave do ciclo do citrato foram reguladas positivamente a 62 & # x000B0C, e seus derivados abundantes são cruciais para a geração de sabor. Aqui, o metabolismo e as enzimas funcionais das comunidades microbianas ativas no iniciador de licor NF foram estudados, o que poderia abrir caminho para iniciar melhorias na qualidade do licor e descobrir micróbios que produzem novas enzimas ou produtos de alto valor agregado.


Upload de dados

Hands_on Hands-on: upload de dados

  1. Crie um novo histórico para este tutorial e dê a ele um nome apropriado

Dica: Criando um novo histórico

  1. Clique no ícone da galáxia -gear (Opções de história) na parte superior do painel de histórico
  2. Selecione a opção Crie um novo do menu

Dica: Renomeando um histórico

  1. Clique em História sem nome (ou o nome atual da história) (Clique para renomear o histórico) na parte superior do painel de histórico
  2. Digite o novo nome
  3. pressione Enter

Importar Ferramenta: upload1 T1A_forward e T1A_reverse do Zenodo ou da biblioteca de dados (pergunte ao seu instrutor)

Dica: Importação por meio de links

  • Copie o local do link
  • Abra o Galaxy Upload Manager (galaxy -upload no canto superior direito do painel de ferramentas)

  • Selecione Colar / buscar dados
  • Cole o link no campo de texto

  • pressione Começar

  • Fechar a janela

  • Por padrão, o Galaxy usa a URL como nome, portanto, renomeie os arquivos com um nome mais útil.

Dica: Importando dados de uma biblioteca de dados

  • Entrar Dados compartilhados (painel superior) então Bibliotecas de dados

  • Encontre a pasta correta (pergunte ao seu instrutor)

  • Selecione os arquivos desejados
  • Clique no Para a história botão próximo ao topo e selecione como conjuntos de dados no menu suspenso
  • Na janela pop-up, selecione o histórico para o qual deseja importar os arquivos (ou crie um novo)
  • Clique em Importar

Como padrão, o Galaxy leva o link como nome, portanto, renomeie-o.

Renomear galaxy - lápis os arquivos para T1A_forward e T1A_reverse

Dica: Renomeando um conjunto de dados

  • Clique na galáxia - lápis ícone de lápis para o conjunto de dados editar seus atributos
  • No painel central, altere o Nome campo
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Verifique se o tipo de dados é fastqsanger (por exemplo não fastq). Se não estiver, altere o tipo de dados para fastqsanger.

Dica: Mudando o tipo de dados

  • Clique na galáxia - lápis ícone de lápis para o conjunto de dados editar seus atributos
  • No painel central, clique em galaxy -chart-select-data Tipos de dados guia no topo
  • Selecione fastqsanger
  • Clique no Alterar tipo de dados botão

Metatranscriptômica: uma abordagem para recuperar novos genes eucarióticos de ambientes poluídos e relacionados

A metatranscriptômica, um subconjunto da metagenômica, fornece informações valiosas sobre todo o perfil de expressão gênica de comunidades microbianas complexas de um ecossistema. Os estudos metagenômicos enfocam principalmente o conteúdo genômico e a identificação de micróbios presentes em uma comunidade, enquanto a metatranscriptômica fornece a diversidade dos genes ativos dentro dessa comunidade, seu perfil de expressão e como esses níveis mudam devido à mudança nas condições ambientais. A metatranscriptômica tem sido aplicada a diferentes tipos de ambientes, desde o estudo de microbiomas humanos, até aqueles encontrados em plantas, animais, em solos e em sistemas aquáticos. A metatranscriptômica, baseada na utilização de mRNA isolado de amostras ambientais, é uma abordagem adequada para explorar o pool de genes eucarióticos em busca de genes de relevância biotecnológica. Além disso, é imperativo desenvolver diferentes dutos de bioinformática para analisar os dados obtidos na análise metatranscriptômica. Na presente revisão, resumimos a metatranscriptômica aplicada a ambientes de solo para estudar a diversidade funcional e discutir abordagens para isolar os genes envolvidos na degradação da matéria orgânica e fornecer tolerância a metais tóxicos, papel da metatranscriptômica na pesquisa de microbioma, vários dutos de bioinformática usados ​​em análise de dados e desafios técnicos para obter uma visão biologicamente significativa dessa abordagem.

Esta é uma prévia do conteúdo da assinatura, acesso através de sua instituição.


Uma tecnologia metatranscriptômica robusta para estudos em escala populacional de dieta, microbioma intestinal e saúde humana

Uma leitura funcional do microbioma intestinal é necessária para permitir o controle preciso das funções do microbioma intestinal, que apoiam a saúde humana e previnem ou minimizam uma ampla gama de doenças crônicas. A análise metatranscriptômica das fezes oferece uma visão funcional abrangente do microbioma intestinal, mas, apesar de sua utilidade, raramente foi usada em estudos clínicos devido à sua complexidade, custo e desafios bioinformáticos. Este método também recebeu críticas devido à potencial variabilidade intra-amostra, mudanças rápidas e degradação do RNA. Aqui, descrevemos um método metatranscriptômico de fezes robusto e automatizado, denominado Viomega, que foi desenvolvido especificamente para estudos em escala populacional. Viomega inclui coleta de amostra, preservação de amostra à temperatura ambiente, extração de RNA total, remoção física de RNAs ribossômicos (rRNAs), preparação de bibliotecas direcionais de Illumina, sequenciamento de Illumina, classificação taxonômica baseada em um banco de dados de & gt110.000 genomas microbianos e expressão quantitativa de genes microbianos análise usando um banco de dados de

100 milhões de genes microbianos. Aplicamos este método a 10.000 amostras de fezes humanas e realizamos vários estudos em pequena escala para demonstrar a estabilidade e consistência da amostra. Em resumo, Viomega é uma plataforma de tecnologia metatranscriptômica de fezes de amostra a resultado, de alto rendimento, automatizada e precisa para estudos em grande escala e uma ampla gama de aplicações.

1. Introdução

O intestino humano contém um grande número de microrganismos comensais que desempenham uma ampla variedade de funções metabólicas. Os metabólitos produzidos por esses microrganismos podem ter efeitos profundos na fisiologia humana, com ligações diretas ao estado de saúde e doença [1–4]. A disbiose intestinal provavelmente contribui para o desenvolvimento e progressão de muitas doenças e distúrbios, como doenças cardiovasculares, hipertensão, obesidade, diabetes e doenças autoimunes [5-9]. Também há fortes evidências de que os microrganismos intestinais interagem diretamente com o sistema nervoso, estabelecendo o eixo intestino-cérebro [10]. O eixo intestino-cérebro foi mostrado para modular o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer, transtorno do espectro do autismo (ASD) e doença de Parkinson [11-14].

O microbioma intestinal desempenha um papel crítico na homeostase fisiológica, resultando no aumento da investigação científica sobre a extensão do papel do microbioma intestinal na saúde e doenças humanas. Os humanos evoluíram com o microbioma e se tornaram dependentes de sua produção bioquímica, como certas vitaminas e ácidos graxos de cadeia curta [15, 16]. O microbioma intestinal também pode produzir produtos bioquímicos prejudiciais que têm sido implicados em vários estados de doença [15]. Para compreender totalmente as relações entre o microbioma intestinal e o estado de saúde humana, as funções bioquímicas dos microrganismos devem ser identificadas e quantificadas. Vários métodos baseados em sequenciamento de próxima geração têm sido usados ​​para analisar o microbioma intestinal, cada um com vantagens e desvantagens claras. O método mais simples, menos caro e mais comum é o sequenciamento do gene 16S rRNA [17], que sequencia uma pequena porção do gene do RNA ribossômico 16S procariótico altamente conservado [18]. Este método pode fornecer resolução taxonômica para o nível de gênero [19, 20], mas não mede as funções bioquímicas dos microrganismos [18] ou distingue organismos vivos de mortos. Além disso, o sequenciamento de rRNA 16S tradicional exclui algumas bactérias, a maioria das arquéias e todos os organismos eucarióticos e vírus [21], resultando em uma visão limitada do ecossistema do microbioma intestinal.

O sequenciamento metagenômico (DNA shotgun) fornece resolução em nível de cepa de todos os microrganismos baseados em DNA [18] (ele não detecta vírus de RNA ou bacteriófagos de RNA). No entanto, ele só pode identificar o potencial funções bioquímicas do microbioma e não podem identificar nem quantificar as vias bioquímicas ativas. Esta é uma desvantagem para estudar os estados de doença relacionados à disbiose, como a doença inflamatória intestinal (DII), que demonstrou ter uma disparidade entre as vias do potencial metagenômico e as vias bioquímicas reais expressas na doença e nas populações de controle [22].

A análise metatranscriptômica (metatranscriptômica, sequenciamento de RNA e RNAseq) oferece insights sobre as atividades bioquímicas do microbioma intestinal, quantificando os níveis de expressão de genes microbianos ativos, permitindo a avaliação das atividades da via, ao mesmo tempo que fornece resolução taxonômica em nível de cepa para todos os metabolicamente ativos organismos e vírus [23, 24]. Até o momento, as análises metatranscriptômicas de amostras de fezes têm sido limitadas devido ao custo e à complexidade dos métodos laboratoriais e bioinformáticos [25]. Ao remover rRNA menos informativo, dados de transcriptoma mais valiosos podem ser gerados com menos profundidade de sequenciamento [24, 26], resultando em custos de sequenciamento por amostra reduzidos.

Uma tecnologia automatizada foi desenvolvida para análise metatranscriptômica de amostras clínicas humanas, chamada Viomega. Neste estudo, Viomega foi aplicado a 10.000 amostras de fezes humanas para obter uma melhor compreensão das taxonomias de nível de tensão e funções microbianas. Vários estudos em pequena escala foram realizados para quantificar a estabilidade metatranscriptômica no cólon inferior e medir a variabilidade intra-amostra das análises metatranscriptômicas.

2. Materiais e métodos

2.1. Participantes do estudo, ética e coleta e transporte de amostras

Para este estudo, a Viome usou dados de 10.000 participantes. Todos os participantes do estudo deram consentimento para participar do estudo, e todos os procedimentos do estudo foram aprovados por um Comitê de Revisão Institucional (IRB) credenciado federalmente. Os participantes foram recrutados de qualquer idade, sexo e grupo étnico.

Amostras de fezes foram coletadas usando o kit Gut Intelligence da Viome por cada participante do estudo em suas próprias residências. O kit incluía um tubo de coleta de amostra com uma colher integrada, um conservante de RNA patenteado e esferas de vidro estéreis. Uma amostra de fezes do tamanho de uma ervilha foi coletada e colocada dentro do tubo e agitada vigorosamente para homogeneizar a amostra, expondo-a ao conservante de RNA. A amostra foi então enviada em temperatura ambiente usando um mensageiro comum para os laboratórios da Viome para análise. Os prazos de envio variaram de um a doze dias. Cada participante preencheu um questionário com informações gerais sobre estilo de vida e saúde.

2.2. Análise metatranscriptômica de amostras de fezes

Para a análise metatranscriptômica de 10.000 amostras de fezes, foi usada uma plataforma automatizada proprietária de amostra para resultado chamada Viomega. As amostras de fezes foram lisadas usando batimento de contas em um desnaturante químico forte e, em seguida, colocadas em um manipulador automático de líquidos, que executou todos os métodos laboratoriais posteriores. As amostras foram processadas em lotes em uma microplaca de 96 poços, cada lote consistia em noventa e quatro amostras de fezes humanas, um controle de processo negativo (NPC, água) e um controle de processo positivo (PPC, RNA sintético personalizado). O RNA foi extraído usando um método proprietário. Resumidamente, grânulos revestidos com sílica e uma série de lavagens foram usados ​​para purificar o RNA após a lise e o RNA foi eluído em água. O DNA foi degradado usando DNase livre de RNase.

A maioria dos RNAs ribossômicos procarióticos (rRNAs: 16S e 23S) foram removidos usando um método de hibridização subtrativa customizado. Sondas de DNA biotinilado com sequências complementares a rRNAs foram adicionadas ao RNA total, a mistura foi aquecida e resfriada, e os complexos sonda-rRNA foram removidos usando esferas magnéticas de estreptavidina. Os RNAs restantes foram convertidos em bibliotecas de sequenciamento direcional com adaptadores de código de barras duplo exclusivos e reagentes ultrapuros. As bibliotecas foram agrupadas e de qualidade controlada com dsDNA Qubit (Thermo Fisher Scientific) e Fragment Analyzer (Advanced Analytical). Os pools da biblioteca foram sequenciados em instrumentos Illumina NextSeq ou NovaSeq usando kits de 300 ciclos.

O módulo de bioinformática da Viomega opera na Amazon Web Services e inclui controle de qualidade, perfil taxonômico e análise funcional. As ferramentas de controle de qualidade cortam e filtram as leituras brutas e quantificam as quantidades de cross-talk amostra a amostra e contaminação de fundo por taxa microbiana. Viomega gera atribuições de taxonomia baseadas em leitura usando um processo de várias etapas. As leituras de sequenciamento são alinhadas a um banco de dados proprietário de assinaturas genômicas pré-computadas em três níveis taxonômicos: cepa, espécie e gênero. As assinaturas únicas são calculadas a partir de genomas completos, removendo subseqüências curtas de comprimento definido,

(- mers), compartilhado entre mais de um genoma e mantendo os únicos - mers que compõem a assinatura [27]. O banco de dados de taxonomia Viomega foi gerado a partir de um grande banco de dados RefSeq contendo mais de 110.000 genomas microbianos. Depois que as atribuições taxonômicas iniciais foram geradas, potenciais falsos positivos foram removidos usando o algoritmo Auto-Blast que usa um banco de dados ainda maior de organismos.

A identidade e a atividade relativa de genes microbianos e funções enzimáticas nas amostras de fezes foram avaliadas usando um algoritmo proprietário. Em um alto nível, isso envolve uma abordagem multicamadas para alinhar as leituras da amostra à biblioteca de genes do catálogo integrado de genes (IGC) [28] para primeiro identificar e, em seguida, quantificar os genes na amostra. Genes informativos (ou seja, não rRNA) foram quantificados em unidades de transcrições por milhão (TPM) para permitir comparações entre amostras. Usando a Enciclopédia de Quioto de Genes e Genomas (KEGG) [29], mapeamento de anotação de genes IGC para ortologias KEGG (KOs), as funções e atividades enzimáticas foram quantificadas nessas amostras como o TPM agregado. O mapeamento KEGG também permite módulos funcionais e análise de caminho.

2.3. Estudos em pequena escala

Para a validação da lise da amostra no oleoduto Viomega, os seguintes organismos foram cultivados em caldo de nutrientes a 37 ° C e 450 rpm em um minishaker de incubação VWR: Bacillus subtilis Cepa de Marburg (ATCC 6051-U), Corynebacterium stationis cepa NCTC 2399 (ATCC 6872), Citrobacter freundii cepa ATCC 13316, NCTC 9750 (ATCC 8090), e Serratia liquefaciens estirpe CDC 1284-57 ATCC 12926 (ATCC 27592). Além disso, os seguintes organismos foram cultivados em caldo de bolor de levedura a 37 ° C e 450 rpm em um minishaker de incubação VWR: Saccharomyces cerevisiae cepa S288C (ATCC 204508) e Candida dubliniensis estirpe CBS 7987 (ATCC MYA-646).

Para ilustrar a precisão da classificação taxonômica no nível de espécie da tecnologia Viomega, o produto 10 Strain Even Mix Whole Cell Material (ATCC® MSA-2003 ™) foi utilizado. Conforme declarado pelo fabricante, este produto é composto de uma mistura uniforme dos seguintes organismos: Bacillus cereus (ATCC 10987), Bifidobacterium adolescentis (ATCC 15703), Clostridium beijerinckii (ATCC 35702), Deinococcus radiodurans (ATCC BAA816), Enterococcus faecalis (ATCC 47077), Escherichia coli (ATCC 700926), Lactobacillus gasseri (ATCC 33323), Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), e Streptococcus mutans (ATCC 700610).

3 Resultados e discussão

3.1. Validação da Tecnologia Viomega
3.1.1. Lise de Amostra

A lise irregular da amostra pode introduzir erros graves em qualquer método, uma vez que a composição da amostra pode variar amplamente em termos de microorganismos fáceis de lisar (vírus e bactérias Gram (-)) e bactérias Gram (+) difíceis de muito difíceis de lisar e fermento. A Viomega utiliza uma combinação de lise de amostra química (desnaturante) e física (batimento de grânulo), que demonstrou ter a melhor eficiência. Para testar este método, duas cepas de bactérias Gram (-), duas cepas de bactérias Gram (+) e duas cepas de levedura foram cultivadas até uma faixa de densidade óptica de 0,4-0,8 UA. Quantidades iguais de cada organismo em triplicado foram então submetidas a lise química e física da amostra, e o RNA total foi extraído de cada amostra. Os rendimentos de RNA obtidos foram consistentes e não mostram tendências contra bactérias Gram (+) ou leveduras (rendimento médio:


A análise metatranscriptômica de raízes ectomicorrízicas revela genes associados com Piloderma–Pem nós simbiose: melhores metodologias para avaliar a expressão gênica no local

Fungos ectomicorrízicos (EM) formam associações simbióticas com raízes de plantas que regulam a troca de nutrientes entre as plantas da floresta e o solo. Abordagens metagenômicas ambientais que empregam sequenciamento de próxima geração mostram uma grande promessa para estudar simbioses EM, no entanto, estudos metatranscriptômicos foram limitados pelas dificuldades inerentes associadas ao isolamento e sequenciamento de RNA de micorrizas. Aqui, aplicamos um método otimizado para extração combinada de DNA / RNA usando agrupamentos de raízes de pinheiro-fungos EM coletados em campo, juntamente com protocolos para identificação taxonômica de RNA ribossômico expresso e inferência da função EM com base na metatranscriptômica de plantas e fungos. Usamos porções transcritas de genes de RNA ribossômico para identificar vários táxons fúngicos transcricionalmente dominantes associados a pinheiro loblolly, incluindo UMAmphinema, Russula e Piloderma spp. Um táxon, Piloderma croceum, tem um genoma disponível publicamente que nos permitiu identificar padrões de conteúdo genético e abundância de transcritos. Mais de 1.500 expressos abundantemente Piloderma genes foram detectados a partir de raízes micorrízicas, incluindo genes para metabolismo de proteínas, sinalização celular, transporte de elétrons, síntese de terpeno e outras atividades extracelulares. Em contraste, Piloderma O gene que codifica um transportador de amônia apresentou maior abundância de transcritos em amostras de solo. Nossa metodologia destaca o potencial da metatranscriptômica para identificar genes associados à simbiose e função do ecossistema usando amostras coletadas em campo.

Fig. S1. Localização dos locais de coleta.

Fig. S2. Sequências parciais de subunidades grandes de RNA ribossômico (região D2, ∼ 180 pb) para os táxons fúngicos mais dominantes detectados em aglomerados de raízes micorrízicas (Fig. 3).

Fig. S3. Colocação filogenética de sequências de RNA LSU para três Piloderma spp. com base na região D2 da subunidade grande ribossomal. As sequências foram alinhadas contra sequências de referência taxonomicamente identificadas de Piloderma spp. do GenBank com análises filogenéticas ClustalW realizadas usando o critério de parcimônia no PAUP 3.0. A árvore de bootstrap ('bootstrap rápido' com 300 réplicas) mostra a colocação de três Piloderma spp.

Fig. S4. Sequências de nucleotídeos e peptídeos de Piloderma efetores: (A) PiCr1, (B) PiBas, (C) PiSs1 e (D) PiEsp. As sequências de sinal putativas são mostradas na sequência de peptídeo (negrito e sublinhado). Em (A), o arranjo simétrico de resíduos de cisteína (C) é mostrado em negrito.

Fig. S5. Os diagramas de fita mostraram as estruturas terciárias previstas para (A) PiCr, (B) PiBas, (C) PiSs1 e (D) PiEsp. A hélice (rosa) e as estruturas de folha (amarelo) foram mostradas. Os terminais N e C são identificados. As estruturas terciárias da proteína foram previstas usando I-TASSER v 3.0 (Zhang 2008 Roy et al., 2010 Roy et al., 2012). A pontuação C é uma pontuação de confiança para estimar a qualidade dos modelos previstos pelo I-TASSER. É calculado com base na importância dos alinhamentos do modelo de rosqueamento e nos parâmetros de convergência das simulações de montagem da estrutura. A pontuação C está na faixa de –5 a 2, onde uma pontuação C de valor mais alto significa um modelo com alta confiança.

Fig. S6. Imagens parciais de visualização para leituras de amostras de raiz mapeadas por Bowtie para uma referência de rRNA 28S (gi300394395, Piloderma fallax) usando o Integrative Genomics Viewer 2.2 × (Thorvaldsdóttir et al. 2013). Menos sequências variáveis ​​foram encontradas na região variável (D1 e D2) em comparação com as regiões conservadas de 28S. A caixa vermelha indica a região (∼ 180 bp) onde as leituras foram extraídas para a identificação de táxons de fungos neste estudo. As barras mapeadas em azul indicam que o tamanho do inserto inferido no gene de referência é menor do que o esperado, dado o tamanho real do inserto vermelho é que o tamanho do inserto inferido no gene de referência é maior do que o esperado, dado o tamanho real do inserto.

Fig. S7. Sequência de aminoácidos prevista de PiAMT.

Tabela S1. Comparação de métodos de extração de RNA para raízes de pinheiro (EM) e agulhas.

Tabela S2. Leitura e porcentagem de leitura associada a transcrições de fungos, bactérias e pinheiros em aglomerados de raízes EM detectados por Illumina HiSeq.

Tabela S3. Composição taxonômica de agrupamentos de raiz EM com base em (A) sequências de amplicon de DNA ITS (B) sequências de RNA ITS transcritas e (C) RNA ribossômico (região LSU D2). (A – C) As contagens absolutas (contagens de leitura) e o valor relativo (% de leituras) são mostradas.

Tabela S4. Alta expressão de grupos gênicos de Piloderma em amostras de solo e raízes.

As famílias de genes com% leituras & gt0.02 em pelo menos uma amostra foram selecionadas. A Tabela S4A mostrou o número de leituras de famílias de genes individuais obtidas a partir de amostras de raízes e solo. A Tabela S4B mostrou a lista de ID da proteína Piloderma do banco de dados PilCr1 para cada grupo de genes.

Tabela S5. Expressão relativa de Pinus taeda genes de aglomerados de raízes micorrízicas. O pacote Deseq 1.14.0 (Anders e Huber, 2010) foi aplicado para normalizar as leituras mapeadas para Pinus taeda Banco de dados EST (Deseq & gt 100 cutoff). Simon Anders e Wolfgang Huber (2010): Análise de expressão diferencial para dados de contagem de sequência. Genome Biology 11: R106.

Observação: O editor não é responsável pelo conteúdo ou funcionalidade de qualquer informação de suporte fornecida pelos autores. Quaisquer dúvidas (que não sejam de conteúdo ausente) devem ser direcionadas ao autor correspondente do artigo.


Reconhecimentos

Os autores agradecem sinceramente aos drs. C. Li e C. Fitzsimmons por fornecerem todos os registros fenotípicos de novilhos de corte. Muito obrigado a X. Sun e F. Cox por sua assistência no isolamento de DNA / RNA e construção de biblioteca de sequenciamento. Agradecemos a todos os membros do grupo do Dr. L. L. Guan por sua ajuda na amostragem.

Financiamento

Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Alberta Livestock and Meat Agency (Edmonton, Canadá) sob os números de concessão 2013R029R e 2015P008R. Além disso, o FL e o LLG também foram apoiados pela bolsa de estudos para estudantes de graduação do Alberta Innovates-Technology Futures e pela NSERC Discovery Grant, respectivamente. O CJC foi financiado pelo Conselho de Pesquisa de Biotecnologia e Ciências Biológicas do Reino Unido (BBSRC) com os números das bolsas: BB / E / W / 10964A01 e BBS / OS / GC / 000011B. O TCAH foi financiado pelo fundo da Nova Zelândia para Parcerias Globais em Pesquisa de Emissões de Gado (GPLER).

Disponibilidade de dados e materiais

Metagenoma ruminal, metatranscriptoma baseado em RNA total e sequências de metatranscritoma enriquecido com mRNA foram depositados no NCBI Sequence Read Archive (SRA) com o número de acesso PRJNA448333.


Resultados

Composição da comunidade de supergrupos protistas

No total, 32.808 transcritos de rRNA SSU de protistas foram obtidos a partir de 12 metatranscriptomas de solo (Tabela 1). Em todos os casos, as réplicas biológicas de cada local produziram uma composição de comunidade muito semelhante (Figura 1) e agrupadas em uma análise de cluster (Figura 2). Todos os cinco supergrupos protistas de acordo com Adl et al. (2012) foram encontrados em cada site (Tabela 1 Figura 1). O grupo SAR, que consiste nos supergrupos anteriormente independentes Stramenopiles, UMAlveolata e Rhizaria, dominou as comunidades ativas em todos os locais com sequências de Rhizaria sendo as mais numerosas. Observamos uma dicotomia clara na composição da comunidade protista (Figura 2) com dominância de Alveolata em solos turfosos com alta umidade e alto teor de matéria orgânica, versus dominância de Rhizaria e Amoebozoa em solos de pastagem e floresta, incluindo serapilheira (Figura 1).

Composição da comunidade de supergrupos protistas nos solos investigados. Para obter informações detalhadas sobre os parâmetros do solo, consulte a Tabela 1.

Análise de agrupamento do Método de Grupo de Pares Não Pesados ​​(UPGMA) para avaliar as diferenças entre as comunidades de protistas do solo. Para obter informações detalhadas sobre as características e abreviaturas do solo, consulte a Tabela 1.

Os Rhizaria eram quase exclusivamente compostos de Cercozoa (Figura 3a) com dominância de rRNAs dos pequenos flagelados pertencentes à classe Filosa-Sarcomonadea (anteriormente combinados em Cercomonadida) e ambos, Cercozoários flagelados e amebóides na classe Filosa-Imbricatea (anteriormente Silicofilosea) . Os rRNAs de SSU de foraminíferos ocorreram de forma relativamente constante, embora em baixa abundância em todas as amostras (Figura 3a), exceto no sítio de turfeiras 'Knutsen', onde foram mais abundantes e representaram 22% de todos os Cercozoários. Os rRNAs SSU alveolados foram bastante variáveis ​​entre as amostras e dominados nos solos turfosos (Figura 1) com o filo Ciliophora e suas ordens principais Spirotrichea, Colpodea e Oligohymenophorea sendo os mais abundantes, enquanto o Apicomplexa exclusivamente parasita ainda representou até 11% de todos os Alveolata ( Figura 3b). O terceiro grupo em SAR, Stramenopiles, foi menos abundante, com Oomycetes representando os stramenopiles dominantes em solos florestais (Figura 3c), enquanto transcritos abundantes de Bacillariophyta fotossintéticos foram característicos em solos de turfeiras inundadas. Os rRNAs SSU de crisofíceas foram encontrados abundantemente em solos de pastagem e serapilheira, assim como foram transcritos da Bicosoecida. O supergrupo Amoebozoa representou até 30% dos rRNAs SSU, com maiores abundâncias nas pastagens e nas amostras de solo da floresta (Figura 1 e Tabela 1). The other protist supergroups, that is, Excavata, Archaeplastida and Opisthokonta (excluding fungi and animals) were generally less abundant (Figure 1 and Table 1 see Supplementary Table 1 for more information).

Community composition within the SAR supergroup independently showing the community compositions within the individual clades of SAR, i.e., Rhizaria (uma), Alveolata (b) and Stramenopiles (c) Shown are means of biological replicates. Labels and sites as described in Table 1 and Figures 1 and 2.

SSU rRNA transcripts of protist clades highly represented in cultivation-based approaches were analysed to evaluate whether these clades were also recovered in our metatranscriptomes. Among the clades targeted were flagellates of the supergroups SAR (Glissonomadida and Cercomonadida (Sarcomonadea Rhizaria), Chrysophyceae and Bicosoecida (Stramenopiles) and Excavata (Bodonidae and Euglenida), as well as amoebae in the supergroup Excavata (Heterolobosea). All clades were found at each location, with cercomonads being highly abundant in grassland and forest habitats. Glissomonads were abundant especially in grasslands (5% of all protists). Bodonids were also common (1.9% of all protists) whereas euglenids, chrysophytes, bicosoecids and heteroloboseans comprised only about 1% of all protist transcripts (Supplementary Table 1). Exhaustive analyses of the most abundant clades of amoebae are presented in the next section.

Community composition of amoebozoa

The supergroup Amoebozoa was of particular interest, as no comprehensive molecular taxonomic analysis of this protist supergroup in soil exists to date because of PCR-primer biases (Baldwin et al., 2013 Bates et al., 2013). For this purpose, we constructed a high-resolution reference database and taxonomy of Amoebozoa (see Table 2 and Materials and Methods for details). Using this taxonomic assignment approach, the rather short SSU rRNA sequence reads could reliably be classified at least to the order, often even to the genus level. Amoebozoa were highly diverse at each sampling site, with rRNAs assigned to four classes, that is, Tubulinea, Discosea, Variosea and Mycetozoa with major orders Euamoebida, Leptomyxida, Arcellinida and Centramoebida (Smirnov et al., 2011) (Figure 4). The community composition within Amoebozoa differed significantly between sites. For instance, sequences assigned to the dominant class Tubulinea made up between 27.4% and 69.2% in Solvatn peat and forest soils, respectively, and were inversely related to Discosea with 41.6–12.7% in Solvatn peat and forest soils. Similar to the patterns observed at the class level, the proportional distribution within classes differed between sites. Among Tubulinea, the dominant order Euamoebida reached highest relative abundances in grasslands and forest mineral soils, while testate amoebae of the order Arcellinida became more abundant in organic rich substrates of litter and peat soils, and Leptomyxida were characteristic of forest habitats. The remaining tubulinean orders Echinamoebida and Nolandida were generally rare. Among the class Discosea, SSU rRNAs assigned to the subclass Longamoebia were almost entirely (96.1%) composed of the order Centramoebida. Sequences of the discosean subclass Flabellinia were generally less abundant (7.0% oas) and mostly derived from the order Vannellida (50.1% of flabellinian SSU rRNAs). Sequences assigned to the subphylum Conosa could only reliably be assigned to the class level, as taxonomy and the phylogenetic affiliations, especially of protists in the class Variosea, are still largely unresolved (Adl et al., 2012). Variosea was the dominant conosan class in grassland, forest and the Solvatn peat soil, while Mycetozoa were more abundant in forest litter and Knutsen peat soil (Figure 4).

Community composition within the supergroup Amoebozoa in the investigated soils. Shown are means of biological replicates. Labels and sites as described in Table 1 and Figures 1 and 2.

Widespread were amoebozoan SSU rRNA sequences with high sequence identity to potential parasites. At all sites occurred diverse sequences related to facultative human pathogens of the genus Acanthamoeba ( ⩾ 97% sequence identity 1.1–4.4% oas) while sequences most closely resembling Balamuthia were discovered in low relative abundance (0.1–0.5% oas) in all except the grassland soils. Transcripts related to groups of non-Amoebozoan parasitic taxa were also found, such as sequences most closely resembling the human pathogen Naegleria fowleri (Heterolobosea in the supergroup Excavata ⩾ 97% sequence identity) in all four arctic peat samples. Further, opisthokonta Ichthyosporea (mainly animal parasites) were ubiquitously found (0.4–3.3% oas Supplementary Table 1) as well as predominantly plant-parasitic plasmodiophorans (up to 0.8% oas).

Widespread presence of foraminifera and choanoflagellida in soils

SSU rRNA transcripts of the typically marine groups Foraminifera and Choanoflagellida revealed their general presence and activity in all samples (Figure 5), and for the first time, allowed to estimate the relative abundance of these taxa in soils. They comprised between 0.1% and 3.5% of all protist SSU rRNAs.

SSU rRNA transcript abundance±s.d. of Foraminifera and Choanoflagellida in the soil metatranscriptomes. Labels and sites as described in Figure 2 and Table 1.

To enable better taxonomic assignment and phylogenetic placement of these enigmatic soil protist groups we, assembled larger SSU rRNA sequences from the short 454 reads. Three assembled SSU rRNA contigs of Foraminifera (742–890 bp length) were quite similar ( ⩾ 91%) to sequences obtained in a recent focused PCR-based molecular survey targeting soil Foraminifera (Lejzerowicz et al., 2010), but showed substantial sequence dissimilarity to described species (maximum SSU rRNA sequence identity of ≤76%). Several unassembled SSU rRNA sequences, however, closely matched sequences typically obtained from freshwater and marine environments, such as the genera Astrammina, Bathysiphon, Allogromia and diverse uncultured species (Supplementary Table 2).

Many Choanoflagellida-affiliated SSU rRNA sequences closely matched (with ⩾ 99% maximum identity) published sequences of uncultivated choanoflagellates (for example, with GenBank accession numbers HQ219439 (freshwater), EF024012 (soil), JF706236 and GQ330606 (peat soil)) while others reached similarities of >95% with uncultivated choanoflagellate sequences among typical freshwater and marine genera, such as Monosiga, Codonosiga, Salpingoeca, and more rarely with Lagenoeca, Stephanoeca, Didymoeca, Diaphanoeca, Desmarella e Acanthoeca. Five assembled long SSU rRNAs (763–1163 bp) had high sequence similarities of 96–99% to uncultivated freshwater choanoflagellates (Figure 6), but the closest hit to a formally described species was <92%.

Maximum likelihood tree of Choanoflagellida placing assembled long SSU rRNA contigs (red) with sequences of described and uncultivated choanoflagellates. Seventy-one sequences with 1232 unambiguously aligned positions were used the tree is unrooted values higher than 50 for maximum likelihood analyses (left) and 0.50 for Bayesian analyses (right) shown. Black circles indicate full support.


Informação sobre o autor

Afiliações

Canadian Center for Computational Genomics, McGill University and Genome Quebec Innovation Center, Montréal, H3A 1A4, Canada

Department of Human Genetics, McGill University, Montreal, H3A 1B1, Canada

Institut de recherche en biologie végétale, University of Montreal, Montreal, QC, H1X 2B2, Canada

F. E. Pitre, J. Marleau, M. St-Arnaud, M. Labrecque, S. Joly & N. J. B. Brereton

Montreal Botanical Garden, Montreal, QC, H1X 2B2, Canada

F. E. Pitre, M. St-Arnaud, M. Labrecque & S. Joly

Aquatic and Crop Resource Development (ACRD), National Research Council Canada, Montréal, QC, H4P 2R2, Canada

Department of Agri-food and Environmental Science, University of Florence, Viale delle Idee, Sesto Fiorentino, FI, Italy

Institut National de la Recherche Scientifique, Centre INRS–Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada

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Contribuições

EY, MSA, SJ, ML and FP conceived and designed the study. JM, WGN and AP performed the plant growth trials, sample and sequencing preparation. EG and NJBB analysed the data and drafted the manuscript. All authors commented on and approved the final manuscript.


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