Em formação

3.3E: Micropscopia Confocal - Biologia


objetivos de aprendizado

  • Comparar e contrastar microscopia confocal e fluorescente

A microscopia confocal é uma técnica de imagem fluorescente não invasiva que usa lasers de várias cores para fazer a varredura de uma amostra com o auxílio de espelhos de varredura. O ponto de iluminação é focalizado na amostra pela lente objetiva. O processo de digitalização usa um dispositivo que está sob controle do computador. As sequências de pontos de luz do espécime são detectadas por um tubo fotomultiplicador através de um orifício. A saída é incorporada a uma imagem e transferida para uma tela de computador digital para análise posterior. A técnica emprega corte óptico para obter fatias seriais da imagem. As fatias são então empilhadas (pilha Z) para reconstruir a imagem tridimensional da amostra biológica. O seccionamento óptico é útil para determinar a localização celular de alvos. A amostra biológica a ser estudada é corada com anticorpos quimicamente ligados a corantes fluorescentes semelhantes ao método empregado em microscopia de fluorescência. Ao contrário da microscopia de fluorescência convencional, onde a fluorescência é emitida ao longo de todo o cone iluminado criando uma imagem nebulosa, na microscopia confocal o orifício é adicionado para permitir a passagem da luz que vem de um ponto focal específico na amostra e não no outro. A luz detectada cria uma imagem que está em foco com a amostra original. A microscopia confocal tem múltiplas aplicações em microbiologia, como o estudo de biofilmes e cepas de bactérias resistentes a antibióticos. O desenvolvimento de microscópios confocais modernos foi acelerado por novos avanços em tecnologia de computador e armazenamento, sistemas de laser, detectores, filtros de interferência e fluoróforos para alvos altamente específicos.

Pontos chave

  • A microscopia confocal requer a coloração por imunoflurescência de amostras biológicas.
  • A microscopia confocal serve para controlar a profundidade de campo, eliminar o fundo e coletar seções ópticas.
  • O uso de microscopia confocal se expandiu para estudar células fixas e vivas com a capacidade de quantificar alvos.

Termos chave

  • tubo fotomultiplicador: Um tubo de vácuo que detecta a luz ultravioleta, visível e infravermelha próxima e a multiplica 100 milhões de vezes.

Microscopia NMR

Michal Neeman, Laurel O. Sillerud, em NMR in Physiology and Biomedicine, 1994

II RESOLUÇÃO E SENSIBILIDADE NA MICROSCOPIA DE NMR

As principais atrações da microscopia de RMN são sua não invasão, a capacidade de sondar as camadas internas de amostras opacas que não podem ser abordadas por microscopia confocal e sua sensibilidade a parâmetros únicos, como difusão, perfusão, fluxo e metabolismo. A resolução da microscopia de RMN está na extremidade inferior dos métodos de microscopia ótica, com as melhores imagens obtidas até agora mostrando uma resolução plana de cerca de 5 μm. Nesta seção, examinamos as limitações atuais para a resolução da imagem e os possíveis caminhos para avanços.

A codificação espacial em microscopia de NMR é obtida marcando spins com uma mudança de fase dependente da posição por meio da aplicação de gradientes de campo magnético ortogonal dependente do tempo. Em contraste com a microscopia de luz e eletrônica, a resolução não está relacionada ao comprimento de onda da radiação eletromagnética. A resolução depende do menor deslocamento de fase que pode ser medido. No entanto, a diferença de deslocamento de fase entre dois pontos depende do gradiente do campo magnético aplicado. Assim, ao aumentar o gradiente do campo magnético é possível melhorar a resolução espacial.

Existe um limite fundamental para a resolução espacial na microscopia de RMN? A sensibilidade é o limite prático dominante para a resolução espacial. A perda de resolução devido ao alargamento da linha por relaxamento, suscetibilidade em massa e difusão impõe um limite mais fundamental para a resolução, mas ocorre mais lentamente do que a perda irreversível de sinal devido à redução no tamanho do pixel e dispersão de fase por difusão na presença de grandes gradientes de campo (Ahn e Cho, 1989 Cho et al., 1988 McFarland, 1992 Callaghan e Eccles, 1987, 1988 Callaghan, 1990). A taxa de perda de sinal depende muito da sequência de pulso experimental e é geralmente mais alta para codificação de frequência do que para codificação de fase. Assim, a codificação de fase 3D é provavelmente o método mais sensível que promete a mais alta resolução espacial, embora ao custo de tempos de aquisição mais longos.

Cálculos do limite de difusão fundamental para resolução previram um valor de cerca de 10 μm para água livre (Callaghan e Eccles, 1987). Essa previsão ignorou o óbvio aprimoramento da resolução devido à difusão dificultada ou restrita na maioria dos casos em que a resolução tem algum significado prático. Este ponto importante foi levantado em uma série de estudos (Hyslop e Lauterbur, 1991 Zawodzinski et al., 1992). Em aplicações biológicas e médicas, estamos interessados ​​em resolver estruturas que são fisicamente "diferentes". Isso implicaria em uma mudança no relaxamento, difusão ou composição química, ou a presença de uma membrana entre as duas estruturas. Qualquer uma dessas mudanças afetará imediatamente a imagem de uma forma que realçará a distinção entre as duas estruturas. Além disso, a água intracelular tem coeficientes de difusão significativamente mais baixos do que os da água livre, reduzindo ainda mais o efeito de “mancha” de difusão.

Uma vez que a sensibilidade é a limitação prática dominante para a resolução espacial, podemos ver uma tendência para campos magnéticos mais elevados. O ganho na resolução devido ao aumento na intensidade do sinal é um pouco perdido pelo aumento da suscetibilidade magnética. Este efeito de alargamento de linha pode ser parcialmente superado pela aplicação de gradientes de campo magnético mais elevados à custa de mais defasagem e atenuação de sinal devido à difusão molecular.

A aplicação de altos campos magnéticos em conjunto com pequenos volumes de amostra e pequenas bobinas de radiofrequência implica que o ruído devido à bobina receptora e à eletrônica domine, em contraste com o grande ruído de amostra em imagens clínicas. Assim, uma melhoria significativa no sinal para ruído pode ser obtida reduzindo o ruído devido à bobina rf. Um excelente exemplo de um possível avanço nesta direção pode ser a aplicação de bobinas rf supercondutoras de alta temperatura e frias. Esta abordagem já demonstrou uma melhoria de 10 vezes em relação às bobinas de cobre convencionais em temperatura ambiente (Preto et al., 1993 ).

A resolução da imagem também é limitada pela capacidade de resolver estruturas com contraste suficiente. Nesse sentido, a RMN nos fornece uma ampla gama de possíveis mecanismos de contraste. Contraste devido a variações na densidade de rotação e devido a T1 e T2 o relaxamento afeta a microscopia de RMN de maneira semelhante aos seus efeitos na ressonância magnética convencional e não são discutidos aqui. Devido aos grandes gradientes de campo magnético usados ​​na microscopia de RMN e às grandes variações na liberdade de movimento dos sistemas biológicos, a difusão é um mecanismo de contraste dominante e é tratada em detalhes na próxima seção. Os gradientes usados ​​na maioria dos estudos de microscopia de NMR de 10–50 G / cm causam atenuação significativa da intensidade do sinal em regiões de água livre, como o espaço intersticial e vacúolos. As regiões com difusão lenta de água, por outro lado, parecem brilhantes. Deve-se notar que o método de rotina para T2- imagem ponderada, ou seja, longa TE, freqüentemente resulta também em aumento da ponderação de difusão. Os efeitos de T2 e a difusão pode ser oposta e deve-se tomar cuidado para evitar a perda de contraste devido à atenuação do sinal de espécies imóveis por T2 e perda de sinal de espécies móveis por difusão.

Sentimos que a sensibilidade do sinal de NMR à difusão molecular oferece uma oportunidade única para estudar sistemas nos quais a difusão desempenha um papel vital. Para esse fim, examinamos em detalhes os efeitos da difusão na intensidade do sinal de NMR em sistemas com um único e multicompartimento e em sistemas com difusão anisotrópica.


Microscopia e Instalação de Imagem

Localizado no primeiro andar do Langley Hall, o Microscopy and Imaging Facility do departamento está equipado com instalações de última geração para manipulação de imagem e vídeo digital de microscopia óptica, confocal e eletrônica e impressão em grande formato. A suíte abriga microscópios eletrônicos de varredura e transmissão, bem como um sistema completo para microscopia confocal de varredura a laser com reconstrução de imagem 3D usando uma estação de trabalho gráfica. Esta instalação é administrada por um microscopista em tempo integral, o Sr. Tom Harper, para auxiliar alunos e pesquisadores em seus projetos e está localizada no primeiro andar do Langley Hall.

O microscópio confocal e multi-fóton Leica TCS SP5 é um microscópio de varredura a laser de última geração que apresenta ajuste de comprimento de onda de banda larga de comprimentos de onda de emissão e detecção, bem como altas velocidades de varredura e imagens de vários fótons. O mciroscópio é ideal para espécimes vivos e imagens fluorescentes mais profundas.

O microscópio biológico de varredura a laser Olympus FV1000 Fluoview é uma plataforma confocal altamente evoluída que utiliza uma série de lasers de diodo estáveis ​​e frios, múltiplos canais de imagem de corante simultânea e ótica de qualidade. O microscópio oferece excelente resolução, alta sensibilidade e quantificação precisa.


Departamento de Biologia

A instalação de microscopia confocal UNCG está localizada em SSB 353. A instalação fornece acesso a equipamentos de microscopia confocal e recursos de processamento de imagem. O acesso é baseado em uma taxa de uso.

Este microscópio confocal foi comprado e apoiado pela concessão DBI-0319021 da National Science Foundation, concessão 2003-IDG-1011 do Centro de Biotecnologia da Carolina do Norte e por fundos do Departamento de Biologia da UNCG e do Gabinete do Reitor.

Recursos de instalação

Objetivos Disponíveis:
Posição 1: UPlanApo 10x / 0,40 infinito 8 / 0,17
Posição 2: UPlanApo 20x / 0,70 infinito 8 / 0,17
Posição 3: UPlanFL 40x / 1,30 Óleo infinito 8 / 0,17
Posição 4: PlanApo 60x / 1,40 Óleo infinito 8 / 0,17
Posição 5: Aberto
Posição 6: UPlanApo 40x / 0,85 infinito 8 0,11-0,23
Disponível para uso mediante solicitação:
UplanApo 60x / 1,20 Água infinito 8 0,13-0,21

Unidades de espelho de fluorescência UIS:
DICT, TRITC, DAPI, CY5, FITC

Lasers disponíveis:
Laser de argônio multilinha (457nm, 488nm, 514nm)
Laser verde de hélio neon (543 nm)
Laser vermelho de hélio neon (633 nm)
Laser de diodo azul (405nm)

Software de análise suplementar:
Olympus Microsuite FIVE

Uma estação de trabalho de imagem separada com o software de revisão Fluoview e o software Microsuite está disponível para uso.

Políticas

Políticas de inscrição para usuários internos e externos:
Todas as políticas estão sujeitas a alterações sem aviso prévio.

Todos os usuários externos devem fazer arranjos de pagamento, arranjos de reserva e enviar um acordo de uso antes de sua primeira sessão. Todo o tempo extra do usuário deve ser negociado antes de sua primeira reserva.

O comitê confocal negociará todos os problemas de uso.

Os usuários internos e externos podem se inscrever para os horários disponíveis no máximo 48 horas antes do uso. Inscreva-se para um horário entrando em contato com o gerente da instalação com sua solicitação. Se você não puder utilizar seu tempo reservado, informe o gerente da instalação imediatamente para que possa ser removido da programação.

Ao reservar os horários disponíveis, inclua seu nome, seu nome PI (se aplicável) e um número de telefone onde você possa ser encontrado para confirmar seu compromisso.

Todos os alunos e pesquisadores devem completar uma (s) sessão (ões) de treinamento específico (s) para nossa instalação para serem aprovados para usar a instalação, além de obter a aprovação do gerente da instalação antes de solicitar o tempo.

O horário de funcionamento das instalações é de segunda a sexta, das 8h00 às 17h00. A instalação está fechada durante todos os feriados universitários reconhecidos. Após o expediente, o acesso às instalações está disponível apenas para usuários aprovados.

O corpo docente da UNCG e todos os Pesquisadores Extramuros são totalmente responsáveis ​​por seus alunos e / ou equipe técnica usando as instalações.

Informe quaisquer problemas mecânicos ou técnicos com o equipamento da instalação ao gerente da instalação imediatamente por correio de voz. Isso se aplica a todas as emergências que ocorrem a qualquer momento. Disque (336) 256-0574 (6-0574)

Algumas opções gerais do que fazer e não fazer na instalação confocal que devem ser praticadas:

Não toque em qualquer coisa na prateleira onde o laser multilinha está colocado
Fazer cubra o escopo após o uso! Não cubra a unidade epifluorescente até que esteja completamente fria!
Não alterar quaisquer configurações do instrumento no software que não serão redefinidas para o valor padrão após fechar o programa
Fazer cuidado com o uso de óleo de imersão. O 40x e o amplificador 60x localizados nas posições 3 e 4 no revólver porta-objetivas são ambos objetivos de imersão em óleo. O 40x na posição 6 é muito seco.
Fazer deixe o ventilador de resfriamento do laser de argônio multilinha ligado. Isso será interrompido após 3 minutos. Em seguida, a chave seletora pode ser desligada.
Por favor deixe a instalação como você a encontrou. Limpo e reto

Se você não tiver certeza sobre o uso adequado de qualquer equipamento na instalação de microscopia confocal, pergunte a alguém antes de fazer uma suposição cara.

Taxas de recursos de instalação

Todos os usuários externos devem tomar providências para agendamento, cobrança e pagamento antes de usar as instalações.
Todas as taxas são cobradas por quarto de hora.
As taxas listadas abaixo são cobradas das contas de usuário UNCG trimestralmente a partir de 01/01/2010

Do utilizador Taxa horária Incluir:
UNCG Interno $30.00 Instrução técnica limitada e supervisão
UNCG Interno $60.00 Assistência técnica
Usuário extramural $110.00 Instrução técnica limitada e supervisão
Usuário extramural $170.00 Assistência técnica

Reserva de recursos

Se você for um usuário interno interessado em reservar horários, entre em contato com o gerente da unidade para fazê-lo.

Ao reservar os horários disponíveis através do Calcium, inclua seu nome, seu nome PI (se aplicável) e um número de telefone onde você possa ser encontrado para confirmar sua consulta.

Contatos das instalações

Chefe do Comitê Confocal: John Tomkiel Dean, Ph.D.

Equipe técnica / gerente de instalação / contato de emergência
Lee Griffin
Telefone do escritório (336) 334-4976


3.3E: Micropscopia Confocal - Biologia

A microscopia confocal oferece várias vantagens em relação à microscopia ótica convencional, incluindo profundidade de campo controlável, a eliminação de informações fora de foco que degradam a imagem e a capacidade de coletar seções óticas em série de espécimes espessos. A chave para a abordagem confocal é o uso de filtragem espacial para eliminar a luz fora de foco ou reflexos em espécimes que são mais grossos do que o plano de foco. Tem havido uma tremenda explosão na popularidade da microscopia confocal nos últimos anos, devido em parte à relativa facilidade com que imagens de qualidade extremamente alta podem ser obtidas de espécimes preparados para microscopia óptica convencional, e em seu grande número de aplicações em muitos áreas de interesse de pesquisa atual. Visite os artigos, galerias, tutoriais interativos e referências da Web em Expressões moleculares e Nikon MicroscopyU usando os links fornecidos abaixo.

Simulador de microscópio confocal de varredura a laser - talvez o avanço mais significativo na microscopia óptica durante a última década tenha sido o refinamento das técnicas convencionais de microscópio confocal de varredura a laser (LSCM) usando sondas fluorescentes sintéticas aprimoradas e proteínas geneticamente modificadas, um espectro mais amplo de fontes de luz laser acopladas ao controle de filtro sintonizável acústico-óptico altamente preciso e à combinação de pacotes de software mais avançados com computadores modernos de alto desempenho. Este tutorial interativo explora a imagem confocal de fluorescência multi-laser e contraste de interferência diferencial (DIC) usando a interface de software de microscópio confocal Olympus FluoView FV1000 como modelo.

Introdução à Microscopia Confocal - A microscopia confocal oferece várias vantagens sobre a microscopia óptica de campo amplo convencional, incluindo a capacidade de controlar a profundidade de campo, eliminação ou redução de informações de fundo fora do plano focal (que leva à degradação da imagem) e a capacidade de coletar séries seções ópticas de espécimes grossos. A chave básica para a abordagem confocal é o uso de técnicas de filtragem espacial para eliminar a luz fora de foco ou brilho em espécimes cuja espessura excede o plano de foco imediato. Houve uma explosão tremenda na popularidade da microscopia confocal nos últimos anos, devido em parte à relativa facilidade com que imagens de qualidade extremamente alta podem ser obtidas de espécimes preparados para microscopia de fluorescência convencional e ao número crescente de aplicações em biologia celular que dependem de imagens de células e tecidos fixos e vivos. Na verdade, a tecnologia confocal está provando ser um dos avanços mais importantes já alcançados na microscopia óptica.

Conceitos básicos - Os instrumentos atuais são altamente evoluídos desde as primeiras versões, mas o princípio de imagem confocal desenvolvido por Marvin Minsky, e patenteado em 1957, é empregado em todos os microscópios confocais modernos. Em um microscópio de campo amplo convencional, todo o espécime é banhado pela luz de uma fonte de mercúrio ou xenônio, e a imagem pode ser vista diretamente a olho nu ou projetada em um dispositivo de captura de imagem ou filme fotográfico. Em contraste, o método de formação de imagem em um microscópio confocal é fundamentalmente diferente. A iluminação é obtida pela varredura de um ou mais feixes de luz focalizados, geralmente de um laser ou fonte de descarga de arco, através da amostra. Este ponto de iluminação é colocado em foco na amostra pela lente objetiva e lateralmente escaneado usando alguma forma de dispositivo de escaneamento sob controle de computador. As sequências de pontos de luz do espécime são detectadas por um tubo fotomultiplicador (PMT) por meio de um orifício (ou, em alguns casos, uma fenda), e a saída do PMT é embutida em uma imagem e exibida pelo computador. Embora as amostras não coradas possam ser vistas usando a luz refletida de volta da amostra, geralmente são marcadas com uma ou mais sondas fluorescentes.

Modos de imagem - vários modos de imagem diferentes são usados ​​na aplicação de microscopia confocal a uma grande variedade de tipos de espécimes. Todos eles contam com a capacidade da técnica de produzir imagens de alta resolução, denominadas seções ópticas, em sequência através de seções relativamente grossas ou espécimes de montagem completa. Com base na seção óptica como unidade básica de imagem, os dados podem ser coletados de espécimes fixos e corados em modos de iluminação de comprimento de onda único, duplo, triplo ou múltiplo, e as imagens coletadas com as várias estratégias de iluminação e rotulagem serão registradas com uns aos outros. Imagens de células vivas e sequências de lapso de tempo são possíveis, e os métodos de processamento de imagem digital aplicados a sequências de imagens permitem a representação em série z e tridimensional de espécimes, bem como a apresentação de sequência de tempo de dados 3D como imagens quadridimensionais. A imagem de luz refletida era o modo usado nos primeiros instrumentos confocais, mas qualquer um dos modos de imagem de luz transmitida comumente empregados em microscopia podem ser utilizados no microscópio confocal de varredura a laser.

Preparação e geração de imagens das amostras - Os procedimentos de preparação e geração de imagens das amostras no microscópio confocal são em grande parte derivados daqueles que foram desenvolvidos ao longo de muitos anos para uso com o microscópio de campo amplo convencional. Nas ciências biomédicas, uma das principais aplicações da microscopia confocal envolve a geração de imagens de células e tecidos fixos ou vivos que geralmente foram marcados com uma ou mais sondas fluorescentes. Um grande número de sondas fluorescentes estão disponíveis que, quando incorporadas em protocolos relativamente simples, tingem especificamente certas organelas e estruturas celulares. Entre a infinidade de sondas disponíveis, estão os corantes que marcam os núcleos, o aparelho de Golgi, o retículo endoplasmático e as mitocôndrias, e também corantes, como faloidinas marcadas com fluorescência, que têm como alvo a actina polimerizada nas células. Independentemente do protocolo de preparação da amostra empregado, um benefício principal da maneira como a microscopia confocal é realizada é a flexibilidade na exibição e análise de imagens que resulta da coleta simultânea de várias imagens, em formato digital, em um computador.

Fluoróforos para microscopia confocal - microscopia confocal de varredura a laser biológica depende fortemente da fluorescência como um modo de imagem, principalmente devido ao alto grau de sensibilidade proporcionado pela técnica, juntamente com a capacidade de direcionar especificamente componentes estruturais e processos dinâmicos em quimicamente fixos, bem como vivos células e tecidos. Muitas sondas fluorescentes são construídas em torno de produtos químicos orgânicos aromáticos sintéticos projetados para se ligar a uma macromolécula biológica (por exemplo, uma proteína ou ácido nucleico) ou para localizar dentro de uma região estrutural específica, como o citoesqueleto, mitocôndria, aparelho de Golgi, retículo endoplasmático e núcleo. Outras sondas são empregadas para monitorar processos dinâmicos e variáveis ​​ambientais localizadas, incluindo concentrações de íons metálicos inorgânicos, pH, espécies reativas de oxigênio e potencial de membrana. Os corantes fluorescentes também são úteis no monitoramento da integridade celular (vivo versus morto e apoptose), endocitose, exocitose, fluidez da membrana, tráfego de proteínas, transdução de sinal e atividade enzimática. Além disso, as sondas fluorescentes têm sido amplamente aplicadas ao mapeamento genético e à análise de cromossomos no campo da genética molecular.

Artefatos de sangramento espectral em microscopia confocal - O sangramento espectral de emissão de fluorescência (muitas vezes denominado cruzamento ou diafonia), que ocorre devido às larguras de banda muito largas e perfis espectrais assimétricos exibidos por muitos dos fluoróforos comuns, é um problema fundamental que deve ser abordado em microscopia de fluorescência confocal de varredura a laser e de campo amplo. O fenômeno geralmente se manifesta pela emissão de um fluoróforo sendo detectado no canal do fotomultiplicador ou através da combinação de filtros reservada para um segundo fluoróforo. Artefatos de sangramento frequentemente complicam a interpretação dos resultados experimentais, particularmente se a co-localização subcelular de fluoróforos estiver sob investigação ou medições quantitativas forem necessárias, como em estudos de transferência de energia de ressonância (FRET) e fotodegradação (FRAP).

Escolhendo combinações de fluoróforo para microscopia confocal - No planejamento de protocolos de coloração com fluorescência de rótulo múltiplo para experimentos de microscopia de fluorescência confocal de varredura ampla e a laser, a escolha criteriosa das sondas é fundamental para obter o melhor sinal de destino e, ao mesmo tempo, minimizar os artefatos de sangramento. Este tutorial interativo é projetado para explorar a combinação de fluoróforos duplos com linhas de excitação de laser eficientes, cálculo de valores de sobreposição espectral de emissão e determinação do nível de sangramento aproximado que pode ser esperado como uma função dos perfis de comprimento de onda da janela de detecção.

Sistemas de laser para microscopia ótica - Os lasers comumente empregados em microscopia ótica são fontes de luz monocromática de alta intensidade, que são úteis como ferramentas para uma variedade de técnicas, incluindo captura ótica, estudos de imagem vitalícios, recuperação de fotodegradação e fluorescência de reflexão interna total. Além disso, os lasers também são a fonte de luz mais comum para microscopia de fluorescência confocal de varredura e têm sido utilizados, embora com menos frequência, em investigações convencionais de fluorescência de campo largo.

Segurança do laser - As duas principais preocupações na operação segura do laser são a exposição ao feixe e os riscos elétricos associados a altas tensões dentro do laser e sua fonte de alimentação. Embora não haja casos conhecidos de um feixe de laser contribuindo para a morte de uma pessoa, houve vários casos de mortes atribuíveis ao contato com componentes relacionados ao laser de alta tensão. Os feixes de potência suficientemente alta podem queimar a pele ou, em alguns casos, criar um perigo ao queimar ou danificar outros materiais, mas a principal preocupação com relação ao feixe de laser é o dano potencial aos olhos, que são a parte do corpo mais sensível acender.

Filtros sintonizáveis ​​acústico-ópticos (AOTFs) - Vários benefícios do AOTF se combinam para aumentar muito a versatilidade da última geração de instrumentos confocais, e esses dispositivos estão se tornando cada vez mais populares para o controle de faixas de comprimento de onda de excitação e intensidade. A principal característica que facilita quase todas as vantagens do AOTF é sua capacidade de permitir ao microscopista o controle da intensidade e / ou comprimento de onda de iluminação pixel a pixel, mantendo uma alta taxa de varredura. Esse único recurso se traduz em uma ampla variedade de ferramentas úteis de microscopia analítica, que são ainda mais aprimoradas em flexibilidade quando a iluminação a laser é empregada.

Resolução e contraste na microscopia confocal - Todos os microscópios ópticos, incluindo instrumentos convencionais de campo amplo, confocal e de dois fótons, são limitados por fatores físicos fundamentais na resolução que podem atingir. Em um sistema óptico perfeito, a resolução é limitada pela abertura numérica dos componentes ópticos e pelo comprimento de onda da luz, tanto incidente quanto detectada. O conceito de resolução é indissociável do contraste e é definido como a separação mínima entre dois pontos que resulta em certo contraste entre eles. Em um microscópio de fluorescência real, o contraste é determinado pelo número de fótons coletados da amostra, a faixa dinâmica do sinal, as aberrações ópticas do sistema de imagem e o número de elementos de imagem (pixels) por unidade de área.

Fontes de luz não coerentes para microscopia confocal - O sistema de iluminação tradicional no microscópio de campo amplo moderno utiliza uma fonte de halogênio de tungstênio para luz transmitida e uma lâmpada de arco curto para excitação de fluorescência. Vários lasers têm sido utilizados como fonte de luz para a observação de campo amplo por alguns investigadores, mas o advento do microscópio confocal aumentou enormemente o uso do laser em microscopia. Esta discussão revisa os méritos e limitações das fontes de luz não coerentes (ou não laser) em microscopia confocal, tanto como fontes de luz para iluminação confocal quanto como fontes secundárias para microscopia de campo amplo em microscópios confocais. Dois problemas iniciais freqüentemente surgem quando os sistemas de iluminação para microscópios confocais são considerados, e estes têm uma influência direta na escolha das fontes de luz para um instrumento específico.

Objetivos do microscópio confocal - Para qualquer configuração de microscópio óptico convencional, o objetivo é o componente mais crítico do sistema na determinação do conteúdo de informação da imagem. O contraste e a resolução dos detalhes finos da amostra, a profundidade dentro da amostra a partir da qual as informações podem ser obtidas e a extensão lateral do campo da imagem são todos determinados pelo projeto da objetiva e seu desempenho nas condições específicas empregadas para a observação. Exigências adicionais são impostas ao objetivo na varredura de técnicas confocais, nas quais este componente de imagem crucial também serve como o condensador de iluminação e muitas vezes é necessário para executar com alta precisão em uma ampla faixa de comprimentos de onda e em níveis de luz muito baixos, sem a introdução de imagens inaceitáveis. ruído degradante.

Sistemas de varredura de microscópio confocal - a imagem confocal depende da coleta sequencial de luz de pontos de espécimes individuais filtrados espacialmente, seguida por processamento de sinal eletrônico e, finalmente, a exibição visual como pontos de imagem correspondentes. O processo de coleta de sinal ponto a ponto requer um mecanismo de varredura do feixe de iluminação focalizado através do volume da amostra sob observação. Três variações principais de varredura são comumente empregadas para produzir imagens de microscópio confocal. A operação confocal fundamentalmente equivalente pode ser alcançada empregando um estágio de amostra de translação lateral acoplado a um feixe de luz estacionário (varredura de estágio), um feixe de luz escaneado com um estágio estacionário (varredura de feixe) ou mantendo o estágio e a fonte de luz estacionários enquanto escaneando o espécime com uma série de pontos de luz transmitidos através de aberturas em um disco Nipkow giratório. Cada técnica possui recursos de desempenho que a tornam vantajosa para aplicativos confocais específicos, mas que limitam a utilidade em outros.

Considerações sobre sinal para ruído - Em qualquer avaliação quantitativa das capacidades de imagem utilizando técnicas de microscopia digital, incluindo métodos confocais, o efeito da amostragem do sinal no contraste e na resolução deve ser considerado. Os valores de nível de sinal medidos não representam diretamente o número de fótons emitidos ou espalhados pela amostra, mas são proporcionais a esse número. Além disso, cada amostra individual de intensidade de sinal é apenas uma aproximação do número de fótons coletados e irá variar com a medição repetida. A variação, conhecida como ruído, transmite uma incerteza na quantificação da intensidade e, portanto, no contraste e na resolução dos dados da imagem.

Detectores eletrônicos de luz: fotomultiplicadores - Na moderna fluorescência de campo amplo e microscopia óptica confocal de varredura a laser, a coleta e medição da emissão secundária coletada pela objetiva pode ser realizada por várias classes de detectores fotossensíveis, incluindo fotomultiplicadores, fotodiodos e acoplamento de carga de estado sólido dispositivos (CCDs). Na microscopia confocal, a emissão de fluorescência é direcionada através de uma abertura de orifício posicionada perto do plano da imagem para excluir a luz das estruturas fluorescentes localizadas longe do plano focal objetivo, reduzindo assim a quantidade de luz disponível para a formação da imagem. Como resultado, os níveis de luz extremamente baixos mais frequentemente encontrados na microscopia confocal requerem o uso de detectores de fótons altamente sensíveis que não requerem discriminação espacial, mas em vez disso respondem muito rapidamente com um alto nível de sensibilidade a um fluxo contínuo de intensidade de luz variável.

Aspectos críticos da microscopia confocal - A imagem tridimensional quantitativa em microscopia de fluorescência é frequentemente complicada por artefatos devido à preparação da amostra, variáveis ​​experimentais controláveis ​​e incontroláveis ​​ou problemas de configuração com o microscópio. Este artigo, escrito pelo Dr. James B. Pawley, cataloga os fatores estranhos mais comuns que muitas vezes servem para obscurecer os resultados coletados em campo amplo de fluorescência e microscopia confocal. Entre os tópicos discutidos estão o sistema de laser, alinhamento do componente óptico, ampliação da objetiva, artefatos de branqueamento, aberrações, óleo de imersão, espessura da lamela, eficiência quântica e o meio de incorporação da amostra.

Aberrações na Microscopia Confocal Multicolor - Refinamentos no design simplificaram a microscopia confocal a ponto de se tornar uma ferramenta de pesquisa padrão em biologia celular. No entanto, à medida que os microscópios confocais se tornaram mais poderosos, eles também se tornaram mais exigentes com seus componentes ópticos. In fact, optical aberrations that cause subtle defects in image quality in widefield microscopy can have devastating effects in confocal microscopy. Unfortunately, the exacting optical requirements of confocal microscopy are often hidden by the optical system that guarantees a sharp image, even when the microscope is performing poorly. Optics manufacturers provide a wide range of microscope objectives, each designed for specific applications. This report demonstrates how the trade-offs involved in objective design can affect confocal microscopy.

Three-Color Imaging for Confocal Microscopy - The laser scanning confocal microscope ( LSCM ) is routinely used to produce digital images of single-, double-, and triple-labeled fluorescent samples. The use of red, green and blue ( RGB ) color is most informative for displaying the distribution of up to three fluorescent probes labeling a cell, where any colocalization is observed as a different additive color when the images are colorized and merged into a single three-color image. In this section we present a simplified version of a previously published method for producing three-color confocal images using the popular image manipulation program, Adobe Photoshop. In addition, several applications of the three-color merging protocol for displaying confocal images are discussed. Note that these digital methods are not confined to images produced using the LSCM and can be applied to digital images imported into Photoshop from many different sources.

Basics of Confocal Reflection Microscopy - Confocal reflection microscopy can be utilized to gather additional information from a specimen with relatively little extra effort, since the technique requires minimum specimen preparation and instrument re-configuration. In addition, information from unstained tissues is readily available with confocal reflection microscopy, as is data from tissues labeled with probes that reflect light. The method can also be utilized in combination with more common classical fluorescence techniques. Examples of the latter application are detection of unlabeled cells in a population of fluorescently labeled cells and for imaging the interactions between fluorescently labeled cells growing on opaque, patterned substrata.

Applications in Confocal Microscopy - The broad range of applications available to laser scanning confocal microscopy includes a wide variety of studies in neuroanatomy and neurophysiology, as well as morphological studies of a wide spectrum of cells and tissues. In addition, the growing use of new fluorescent proteins is rapidly expanding the number of original research reports coupling these useful tools to modern microscopic investigations. Other applications include resonance energy transfer, stem cell research, photobleaching studies, lifetime imaging, multiphoton microscopy, total internal reflection, DNA hybridization, membrane and ion probes, bioluminescent proteins, and epitope tagging. Many of these powerful techniques are described in these reviews.

Confocal Microscopy Image Gallery - The Nikon MicroscopyU Confocal Image Gallery features digital image sequences captured using a Nikon PCM-2000 confocal microscope scanning system coupled to an Eclipse E-600 upright microscope. Successive serial optical sections were recorded along the optical axis of the microscope over a range of specimen planes. These sequences are presented as interactive Java tutorials that allow the visitor to either "play" the series of sections automatically, or to utilize a slider to scroll back and forth through the images.

Olympus FluoView Laser Scanning Confocal Microscopy - The new Olympus FluoView TM FV1000 is the latest in point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscopes designed for today's intensive and demanding biological research investigations. Excellent resolution, bright and crisp optics, and high efficiency of excitation, coupled to an intuitive user interface and affordability are key characteristics of this state-of-the-art optical microscopy system.

Marvin Lee Minsky (1927-Present) - While at Harvard University, Marvin Minsky made his primary contribution to the field of optics by inventing the confocal scanning microscope. Despite the theoretical benefits of the confocal approach for biological purposes, Minsky's microscope originally generated little interest. In hindsight it has become apparent that the technology of the period limited Minsky's demonstration of the potential of the confocal approach. Yet, years later, with the advent of such applicable devices as lasers, sensitive low-noise photodetectors, and fast microcomputers with image processing capabilities, Minsky's microscopy technique has become widespread in biological research.

Interactive Java Tutorials

Laser Scanning Confocal Microscopy - (approximately a 30 second download on 28.8K modems) Several methods have been developed to overcome the poor contrast inherent with imaging thick specimens in a conventional microscope. Specimens having a moderate degree of thickness (5 to 15 microns) will produce dramatically improved images with either with confocal or deconvolution techniques. The thickest specimens (20 microns and above) will suffer from a tremendous amount of extraneous light in out-of-focus regions, and are probably best-imaged using confocal techniques. This tutorial explores imaging specimens through serial z-axis optical sections utilizing a virtual confocal microscope.

Comparing Confocal and Widefield Fluorescence Microscopy - Confocal microscopy offers several distinct advantages over traditional widefield fluorescence microscopy, including the ability to control depth of field, elimination or reduction of background information away from the focal plane (that leads to image degradation), and the capability to collect serial optical sections from thick specimens. The basic key to the confocal approach is the use of spatial filtering techniques to eliminate out-of-focus light or glare in specimens whose thickness exceeds the dimensions of the focal plane. This interactive tutorial explores and compares the differences between specimens when viewed in a confocal versus a widefield fluorescence microscope.

Colocalization of Fluorophores in Confocal Microscopy - Two or more fluorescence emission signals can often overlap in digital images recorded by confocal microscopy due to their close proximity within the specimen. This effect is known as colocalization and usually occurs when fluorescently labeled molecules bind to targets that lie in very close or identical spatial positions. This interactive tutorial explores the quantitative analysis of colocalization in a wide spectrum of specimens that were specifically designed either to demonstrate the phenomenon, or to alternatively provide examples of fluorophore targets that lack any significant degree of colocalization.

Reflected Confocal Microscopy: Integrated Circuit Inspection - Examine individual layers on the surface of integrated circuits with this interactive tutorial. Digital images for the tutorial were collected with a Nikon Optiphot C200 reflected light confocal microscope. For each sequence, a series of z-axis optical sections was recorded as the microscope was successively focused (at 1-micrometer steps) deeper within the patchwork of circuitry on the surface of the silicon chips.

Excitation Photobleaching Patterns - Multiphoton fluorescence microscopy utilizes diffraction-limited focusing by a high numerical aperture objective to localize the spatial concentration of excitation light to narrow region near the focal point. In contrast, the excitation region of a laser scanning confocal microscope is similar to that of a widefield microscope. This tutorial compares excitation-induced photobleaching patterns that occur near the focal region in both multiphoton and confocal microscopy systems.

Olympus FluoView Resource Center Interactive Java Tutorials - Explanations for many of the exceedingly complex concepts in laser scanning confocal microscopy can significantly benefit from the assistance of interactive tutorials that enable the student to obtain instanteous (real-time) response to changes in variables. The tutorials in section address the basic aspects of confocal microscopy instrumentation, laser systems, detectors, image processing, resolution, contrast, and many other aspects of the technique. All interactive Java tutorials require the Java Virtual Machine, which is available without cost as a browser plug-in from Sun Microsystems.

References and Resources

Recommended Books on Confocal Microscopy - A surprisingly limited number of books dealing with various aspects of laser scanning and spinning disk confocal microscopy and related techniques are currently available from the booksellers. This section lists the FluoView Resource Center website development team's top 12 recommended books. Although the volumes listed in this section deal pricipally with confocal microscopy and related methodology, there exist a number of additional books that contain focused treatments of the materials described below, and these should also be consulted for specific techniques and timely review articles.

ZEISS Campus Confocal Microscopy Reference Library - A majority of the literature pertaining to review articles on laser scanning confocal microscopy has been published in textbooks, edited article collections, and symposia, with only an intermittent sprinkling of papers in the scientific journals. The reviews listed in this section should be available to students and investigators who have access to subscriptions through their host institutions.

Confocal Microscopy Web Resources - Laser scanning confocal microscopy ( LSCM ), a tool that has been extensively utilized for inspection of semiconductors, is now becoming a mainstream application in cell biology. The links provided in this section from the Molecular Expressions web site offer tutorials, instrumentation, application notes, technical support, glossaries, and reference materials on confocal microscopy and related techniques.

Basic Concepts in Laser Scanning Confocal Microscopy (PDF 2.8 Mb) - Laser scanning confocal microscopy has become an invaluable tool for a wide range of investigations in the biological and medical sciences for imaging thin optical sections in living and fixed specimens ranging in thickness up to 100 micrometers. Modern instruments are equipped with 3-5 laser systems controlled by high-speed acousto-optic tunable filters (AOTFs), which allow very precise regulation of wavelength and excitation intensity. Coupled with photomultipliers that have high quantum efficiency in the near-ultraviolet, visible and near-infrared spectral regions, these microscopes are capable of examining fluorescence emission ranging from 400 to 750 nanometers. Download this review article to learn more.

Kenneth W. Dunn and Exing Wang - Department of Medicine, Indiana University, School of Medicine, 1120 South Drive, FH115, Indianapolis, Indiana 46202-5116.

John M. Murray - Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, 19104.

Stephen W. Paddock , Eric J. Hazen , and Peter J. DeVries - Laboratory of Molecular Biology, Howard Hughes Medical Institute, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin 53706.

James B. Pawley - Department of Zoology, 1117 W. Johnson Dr., University of Wisconsin, Madison, Wisconsin 53706.

David W. Piston - Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 702 Light Hall, Nashville, Tennessee, 37212.

Kenneth R. Spring - Scientific Consultant, Lusby, Maryland, 20657.

Matthew J. Parry-Hill , Thomas J. Fellers , and Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.


Características principais

See More of the Specimen

Whole mouse bladder optically cleared with iDISCO and acquired at 8192 x 8192 pixels using a 2x Plan Apo objective, effective pixel size 0.6 μm (over 5x the spatial resolution of a typical monochrome CMOS camera).
Courtesy of Dr. Gerry Apodaca, Integrative Systems Biology, Department of Medicine, University of Pittsburgh in collaboration with Dr. Alan Watson at the Center for Biological Imaging, University of Pittsburgh.

With the largest field-of-view on both inverted and upright microscope stands available (25mm diagonal), more specimens fit in one FOV with more objective lens choices than ever before.

Coupled with scanning sizes up to 8192 x 8192 pixels, sampling beyond the optical diffraction limit is possible even at low magnifications with the AX/AX R.

Using lower magnifications with longer working distances and high numerical apertures enables more flexible specimen preparations to be used, while the large FOV allows simultaneous high resolution in one image. Collect more data in every image, and at faster rates.

The AX/AX R has a 25mm diagonal FOV, much larger than other confocal instruments.

Cleared adult mouse brain acquired with 1x objective in one acquisition of one FOV*

Drosófila sp. Embryo development easily fits within the FOV using a high NA 25x SIL 1.05 NA objective*

* It would not be possible to capture this sample in one FOV or at this resolution with other commercial confocal systems

Observe with Minimal Disturbance

Laser scanning confocal imaging is principally challenging on specimen viability, as it applies focused laser illumination point by point on a sample.

The AX R’s high speed resonant scanning, which decreases the illumination time by more than 20x typical confocal scanning times, greatly reduces biases caused by merely acquiring images. Reducing the acquisition time also allows for extremely high-speed imaging (up to 720 fps @ 2048 x 16).

The result: longer imaging and/or more frequent imaging at high speed of living samples which allows capture of dynamic events, but also allows longer time-lapse imaging or significantly faster collection times on fixed specimens.

Time-lapse Z series maximum intensity projection images of a developing Drosófila embryo expressing PLC-PH::GFP (PIP2) acquired every 10 minutes for 12 hours at 2K x 1K pixels using a 25x silicone immersion objective.
Courtesy of Yang Hong Laboratory, Department of Cell Biology, University of Pittsburgh in collaboration with the Center for Biological Imaging.

Acquire More Rapidly

Confocal imaging, notoriously slow because of its point-scanning requirement for high quality 3-dimensional imaging at high resolution, is greatly changed by fast imaging with the AX R’s resonant scanning capabilities.

Utilizing 2048 x2048 pixel resonant scanning and a 25mm FOV on a large intestinal sample montage, acquiring 25 high-resolution images and merging them in under 2 minutes.

Ultrafine Detail

With a full 25mm FOV, up to 8192 x 8192 pixels, and the capability for supravideo frame rates, the AX/AX R allows for spectacular imaging with high resolution, at both low and high magnifications.

The entire range of a whole organism or system biology down to intracellular imaging is achievable on one instrument.

Mouse muscle acquired with a 25x SIL immersion objective using 2048 x 2048 pixel resonant scanning

Detectors In Tune with Labels

Maximum intensity projection of Z stack images of marmoset brain acquired with a 60x 1.27 NA water immersion objective using 2048 x 2048 pixel resonant scanning and a DUX-VB detector with user-defined emission bands.

The AX/AX R’s all new DUX-VB detector custom-tunes emission bandwidths to a library of labels and probes, and provides the freedom to fine-tune emission bands to minimize unwanted fluorescence.

Simply select the number of labels in your specimen and their catalog names. Alternatively, you can define the desired emission ranges, or even simply the emission color: the AX/AX R and NIS-Elements software does the rest, including optimizing the dichroic mirror and laser excitation choices best suited for imaging. Or, acquire hyperspectral images in up to 66 emission channels for unmixing.

Optionally, the AX/AX R’s base DUX-ST detector allows up to 12 discreet bandpasses of emission, upgradable to 18.

And all detector systems can be customized with high sensitivity and low noise GaAsP or Multi-alkali PMT detectors to provide the best detector for sensitivity and wavelength response requirements as well as budgets.

Superior optical technologies to support all confocal applications

Nikon provides a broad range of high-NA objectives with unrivaled optical quality to redefine the boundaries of confocal imaging. Options include silicone oil immersion objectives for thick live cell imaging, large-FOV low-magnification objectives and easy-to-use dry objectives. Chromatic aberrations are corrected from ultraviolet to near infrared range, enabling excellent multicolor imaging.

Maximum intensity projection of Z stack images, color-coded by depth, of vascular development in embryonic zebrafish acquired with a 10X 0.45 NA Plan Apo Lambda S objective using 1024x2048 pixel resonant scanning. Courtesy of Erika Driekorn and Dr. Beth Roman, Department of Human Genetics, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health.

Componentes Opcionais

Water Immersion Dispenser

A software-controlled, automatic water dispenser enables long-term time-lapse imaging using refractive-index matching water immersion objectives in any environment, including incubation.

Automatic Correction Collar

Moves the objective correction collar to the optimum position for best resolution both remotely and by software control. Motorized collars allow users to adjust the correction collar without disturbing the specimen position, even in incubated enclosures or environmental chambers.

Multiple Modalites

Ti2-LAPP Modular Illumination System

The Ti2-E microscope supports up to 5 episcopic illumination sources, which can be used in tandem with AX/AX R confocal imaging: total internal reflection fluorescence (TIRF), point, raster or field stimulation devices, and fluorescence light sources can all be integrated onto the same microscope stand, and used in the same experiments.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)

The incident angle of a laser and corresponding penetration depth of the evanescent field can be controlled via NIS-Elements software. When multiple TIRF modules are mounted, the penetration depth can be independently set for each wavelength.

Photostimulation: Point and Raster Scanner

The XY galvano scanning unit can stimulate the desired area of a sample using laser point scanning. It allows simultaneous photostimulation and confocal imaging.

Photostimulation: Digital Micromirror Device (DMD)

The DMD module enables photoactivation of user-specified patterns rather than photoactivation of a single spot. This allows stimulation of multiple points and tracking of their behavior. The DMD module can be used with either laser illumination or less phototoxic LED illumination.


Confocal Microscopy

In Confocal Microscopy Methods and Protocols, Stephen Paddock and a highly skilled panel of experts lead the researcher using confocal techniques from the bench top, through the imaging process, to the journal page. They concisely describe all the key stages of confocal imaging-from tissue sampling methods, through the staining process, to the manipulation, presentation, and publication of the realized image. Written in a user-friendly, nontechnical style, the methods specifically cover most of the commonly used model organisms: worms, sea urchins, flies, plants, yeast, frogs, and zebrafish.

Centered in the many biological applications of the confocal microscope, the book makes possible the successful imaging of both fixed and living specimens using primarily the laser scanning confocal microscope. The powerful hands-on methods collected in Confocal Microscopy Methods and Protocols will help even the novice to produce first-class cover-quality confocal images.

"This book is an essential reference for anyone who is involved in the production of laser scanning confocal (LSCM) images. . . Exceptionally useful information on a great variety of methodologies that can be employed with LSCM is provided. . . In consideration of the vast quantity of useful information on all aspects of LSCM that is presented in this volume, and the fact that it is the first comprehensive book on this topic, it is highly recommended."-Quarterly Review of Biology

". almost every research institute has a confocal microscope, and many are developing much larger multi-user biomedical imaging facilities. The publication of this collection of methods and protocols for confocal microscopy is therefore very timely. The tips and tricks used on the various systems should prove useful to a diverse range of confocal microscope users and would be a beneficial reference volume for any imaging unit and reasonable value for money."-Cell Biology International

" This is an excellent source for anyone who wants to explore techniques in confocal microscopy. It is a practical manual with many gems that will help both new and experienced users. The principles are efficiently and accessibly explained and there is a useful chapter on fluorescent probes. there is a wealth of ideas here waiting to be applied to prokaryotic biology and many would be equally useful for simple fluorescence rather than confocal studies. I would certainly recommend it to any lab that uses fluorescence microscopy extensively."-Microbiology Today

". The texts are aimed at the biological user. for the user for whom they are intended, these essays contain a wealth of down-to-earth practical information. The book is well-produced and contains colour illustrations. "-Ultramicroscopy

". excellent information as an introductory basis for confocal microscopy."-Cellular and Molecular Biology


  • Microscope stand: Nikon Ti Eclipse inverted
  • Recursos:
    • Motorized XY Stage, allowing mosaic images and multi-point time-lapse imaging
    • Fast live imaging with resonant scanner and piezoelectric focus
    • Spectral unmixing of overlapping fluorophores or autofluorescence
    • Autofocus using the Perfect Focus System
    • Tokai Hit stage-top incubator and objective heater
    • Targeted photobleaching, FRAP, FRET and FLIP capability
    • 2-photon microscopy with non-descanned detector: Best for deep (up to 1mm) or long-term imaging
    • Spectral fingerprinting, multiphoton excitation fingerprinting, unmixing of multiple fluorophores/autofluorescence sources
    • 1-photon: 458, 488, 514, 561, 639 nm
    • 2-photon: Software-tunable Chameleon II laser (680-1040 nm)
    • 1-photon: Similar to DAPI, DyLight 405, CFP, FITC, YFP, mOrange, TRITC, Cy5
    • 2-photon: Compatible with most red, green and blue fluorophores
    • 1-photon: Nikon Objectives
    • 2-photon: 25x/1.10 coverslip-corrected water-immersion IR lens
    • Microscope standNikon Ti Eclipse inverted
    • Recursos:
      • SIM provides double the resolution of the conventional confocal microscope (lateral

      Confocal 1 - Zeiss LSM 880 with Airyscan on an Axio Observer.Z1 invert (B/K035)

      • Airyscan detector for high resolution imaging
      • fully automated microscope
      • 4 independent lasers, 6 laser lines including (405, 458, 488, 514, 561, and 633 nm)
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • an array of lenses ranging from 100 x oil down to 10 x air to suit most needs
      • stage adapted for use with Incubator S system for live cell imaging
      • ZEN 2.1 software

      Confocal 2 - Zeiss LSM 780 multiphoton on an Axio Observer.Z1 invert (B/K029)

      • fully automated microscope
      • Coherent Chameleon pulsed Ti:Sa IR Laser (range 690-1040nm)
      • 4 independent lasers, 6 laser lines including (405, 458, 488, 514, 561 and 633 nm)
      • 4 external non-descanned detectors (NDD) for increased sensitivity at greater depth
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • Objective lenses ranging from 10x air through to 63x oil as well as 40x/1.1 and 63x/1.2 water immersion and 20x/1.0 and 40x/0.8 water dipping objectives ideal for deep tissue imaging
      • Solent light tight incubation chamber with full temperature and CO2 ao controle
      • ZEN 2010 software

      Zeiss LSM 780 multiphoton

      Confocal 3 - Zeiss LSM 710 on an AxioImager.M2 (B/K034)

      • fully automated upright microscope
      • 5 independent lasers, 7 laser lines including (405, 458, 488, 514, 561, 594 and 633 nm)
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • an array of lenses ranging from 100 x oil down to 10 x air to suit most needs
      • stage adapted for use with Incubator S system for live cell imaging
      • ZEN 2011 software

      Confocal 4 - Zeiss LSM 510 meta on an Axiovert 200M (B/K037)

      • fully automated microscope
      • 3 independent lasers, 6 laser lines including (458, 477, 488, 514, 543 and 633 nm)
      • Spectral head for spectral imaging - allowing the easy differentiation of very similar fluorescence dyes and fluorescence from autofluorescence
      • an array of lenses ranging from 100 x oil down to 10 x air to suit most needs
      • stage adapted for use with Incubator S system for live cell imaging
      • LSM510 and ZEN 2009 software

      Zeiss LSM 510 meta invert

      Zeiss on-stage incubation system


      Confocal Microscope

      The UCA Department of Biology received a National Science Foundation grant in June 2002 to equip the facilities with a confocal laser scanning microscope (CLSM). This system provides the new means for research in biochemistry, cell biology and neuroscience for faculty and students.

      Various avenues of research include studies of the neural networks in mammalian brains, monitoring intracellular pH in cancer cells, and tracking mitochondrial proteins in yeast and slime mold. Visiting researchers from the University of Arkansas for Medical Sciences have been studying effects of ethanol on early neural development. As of spring 2005 we have started working with the “Saturdays with SEM” program to introduce high school students and educators to confocal microscopy. Here, visitors spend the day working with both the Scanning Electron Microscope (SEM) and the CLSM. During the day, they are taught the principles microscope operation and are allowed to visualize samples with the equipment.