Em formação

Alternativas de Western blot


Dada uma amostra in vivo de uma infecção experimental, gostaria de ver se uma proteína bacteriana está presente.

Tenho pensado no Western Blot usando soros de animais infectados com a bactéria. No entanto, essa estratégia precisa de um controle positivo que requer clonagem e expressão gênica prévia.

Talvez haja um caminho mais curto.

Obrigado


Acho que o ensaio de imunoabsorção enzimática (ou ELISA) é a melhor maneira de fazer isso, dado que você tem um anticorpo contra a proteína para revestir os poços da amostra com ... Você poderia usar camundongos para criar anticorpos policlonais contra sua proteína, injetando a proteína e coletar o soro e purificá-lo ... contanto que não haja proteínas semelhantes à bacteriana na amostra que você está testando ... mas para diagnosticar uma infecção você poderia usar algo como q-PCR, presumindo que você possa obter o DNA bacteriano de a amostra (você pode usar técnicas típicas de extração de DNA bacteriano).

Para mais informações sobre ELISA, clique aqui. Aqui está uma boa animação em ELISA: http://highered.mheducation.com/sites/0072556781/student_view0/chapter33/animation_quiz_1.html


Western Blot com base em aptâmero para reconhecimento seletivo de proteínas

O reconhecimento seletivo de proteínas é fundamental em técnicas de biologia molecular, como Western blotting e ELISA. A detecção bem-sucedida das proteínas-alvo nesses métodos depende da interação específica dos anticorpos, que muitas vezes trazem um alto custo de produção e requerem um longo tempo de incubação. Os aptâmeros representam uma classe alternativa de reagentes de afinidade simples e acessíveis para o reconhecimento de proteínas, e a substituição de anticorpos por aptâmeros no Western blotting seria potencialmente mais eficaz em termos de tempo e custo. Neste trabalho, vários aptâmeros de DNA fluorescentes foram isolados por em vitro seleção para rotular seletivamente proteínas tag comumente usadas, incluindo GST, MBP e His-tag. Os aptâmeros gerados G1, M1 e H1 se ligam especificamente às suas proteínas alvo cognatas com afinidades nanomolares, respectivamente. Comparado com o immunoblotting baseado em anticorpos convencionais, tal procedimento baseado em aptâmero deu um fundo mais limpo e foi capaz de rotular seletivamente a proteína alvo em uma mistura complexa. Por último, os aptâmeros identificados também foram eficazes no reconhecimento de diferentes proteínas de fusão com a mesma etiqueta, expandindo assim muito o escopo das aplicações potenciais desses aptâmeros. Este trabalho forneceu aptâmeros como ferramentas moleculares úteis para o reconhecimento seletivo de proteínas na análise de Western blotting.

Palavras-chave: Reconhecimento de proteína de seleção in vitro de ácido nucleico de aptâmero de Western blot.

Copyright © 2020 Wang, Li e Yu.

Bonecos

Comparação de aptâmero e baseado em anticorpos ...

Comparação de análise de blotting de proteína baseada em aptâmero e anticorpo. Após a eletroforese comum, transferir e ...

Aptâmeros isolados reconhecem especificamente o alvo ...

Os aptâmeros isolados reconhecem especificamente proteínas alvo em Western blot. As estruturas secundárias do aptâmero ...

Aptamer G1 rotular seletivamente GST…

O Aptâmero G1 rotula seletivamente a proteína GST e compara-se favoravelmente com o anticorpo em Western…

Os aptâmeros selecionados são capazes de ...

Aptâmeros selecionados são capazes de rotular proteínas de fusão em Western blot. (UMA) Aptamer ...


Normalização de Western blot: uma alternativa mais rápida e confiável ao uso de proteínas de manutenção

Kenneth Oh é o Gerente de Colaborações, Aplicações e Novos Produtos de Tecnologia no Grupo de Quantificação de Proteínas da Bio-Rad Laboratories (CA, EUA). Ele recebeu seu PhD em Química Bioorgânica pela University of California, Santa Barbara (CA, EUA). Na Bio-Rad, Oh investiga novas ferramentas para quantificação de proteínas e desenvolve conteúdo educacional sobre novos produtos e aplicações.

Western blotting é uma técnica popular para análise de proteínas, mas obter dados quantitativos pode ser problemático. O método dominante de western blot, conhecido como normalização da proteína de manutenção (HKP), é difícil de usar e requer testes cuidadosos para produzir resultados precisos. No entanto, um método alternativo chamado normalização total de proteínas (TPN) está disponível para os pesquisadores que é mais rápido e confiável.

A normalização de Western blot é usada para determinar as diferenças nos níveis de uma proteína alvo em condições experimentais, tecidos, pontos de tempo ou estágios de desenvolvimento específicos. Os cientistas executam este método para controlar as variações da amostra causadas por erros durante a preparação da amostra, carregamento da amostra ou transferência do gel, o que pode distorcer os resultados. O objetivo de normalizar os dados é garantir que os resultados reflitam as verdadeiras diferenças entre as amostras.

Por mais de 30 anos, o método dominante tem sido a normalização HKP. Muitos pesquisadores usam HKPs como actina, tubulina e GAPDH como controles internos para normalização porque essas proteínas são supostamente expressas nos mesmos níveis, independentemente das condições experimentais e anticorpos comerciais estão prontamente disponíveis.

A normalização HKP não é fácil de realizar, no entanto. Existem várias etapas tecnicamente complicadas que são necessárias para que os HKPs tenham um desempenho adequado. Os HKPs devem ser validados experimentalmente usando uma série de testes que incluem:

  • UMA controle positivo teste usando um lisado que expressa o HKP
  • UMA controle negativo teste usando um lisado em que o HKP não é expresso
  • Um teste de nível de expressão para verificar se o HKP é constante nas condições experimentais
  • UMA teste de linearidade para determinar as quantidades de carregamento de amostra que fornecem um sinal linearmente proporcional do HKP.

Os pesquisadores também devem estar cientes de algumas desvantagens da normalização HKP:

  • HKPs nem sempre são constantes: vários estudos revisados ​​por pares mostram que os HKPs podem ser afetados por condições experimentais [1-7].
  • HKPs são altamente abundantes em comparação com proteínas-alvo: grandes quantidades de amostra são frequentemente necessárias para detectar proteínas alvo menos abundantes, o que resulta em supersaturação de bandas de HKP e quantificação incorreta.
  • A detecção de HKP adiciona etapas ao protocolo de western blot padrão: os pesquisadores precisam retirar e sondar novamente a membrana com anticorpos específicos para HKP, o que aumenta significativamente o tempo e a variabilidade dos resultados.

Ao contrário dos HKPs, as técnicas de normalização mais recentes baseadas no TPN são mais simples de executar e podem aumentar a confiança nos resultados.

No TPN, todas as proteínas contidas em uma amostra fornecem a base para a normalização. Comparado aos HKPs, o TPN não requer otimização extensiva e fornece um sinal mais robusto e preciso.

TPN detecta proteínas usando manchas de proteína total ou tecnologias sem manchas. Algumas manchas, como Coomassie Blue e Amido Black, são irreversíveis e precisam ser executadas em duplicata porque podem interferir na coloração subsequente de anticorpos. Outras manchas, como Sypro Ruby e Ponceau S, são reversíveis, mas geralmente resultam em sinais não uniformes e envolvem várias etapas de coloração e descoloração para detectar proteínas.

A compatibilidade do TPN com tecnologias sem manchas é talvez uma de suas maiores vantagens. Em apenas 6 anos, o TPN sem manchas apareceu em quase 900 trabalhos de pesquisa [8] e está se tornando o novo padrão para normalizar os dados de western blot por uma série de razões:


Baixe a nota de aplicação ou visite a página do produto Nano-Glo & reg HiBiT Blotting System para saber mais sobre a sensibilidade e vantagens de economia de tempo da etiqueta HiBiT em comparação com os métodos de transferência tradicionais que usam um anticorpo para uma etiqueta de epítopo (por exemplo, etiqueta FLAG).

  1. Nakashoji, A. et al. (2020) Identification of a Modified HOXB9 mRNA in Breast Cancer. Journal of Oncology. Artigo ID 6065736,
  2. Schwinn, M.K. et al. (2020) Uma Estratégia Simples e Escalável para Análise de Dinâmica de Proteínas Endógenas. Sci. Representante. 10(1), 8953.
  3. Tange, N. et al. (2020) Estaurosporina e venetoclax induzem a proteólise dependente de caspase de proteínas de fusão MEF2D e apoptose em células de fusão MEF2D (+) ALL. Farmacêutico Biomédico. 128, 110330.
  4. Ranawakage D.C. et al. (2019) HiBiT-qIP, imunoprecipitação quantitativa baseada em HiBiT, facilita a determinação da afinidade do anticorpo em condições de imunoprecipitação. Sci. Representante. 9(1) 6895.
  5. Sasak, M. et al. (2018) Desenvolvimento de um método rápido e quantitativo para a análise de entrada e liberação viral usando um ensaio de complementação de luciferase NanoLuc. Res de vírus. 243, 69-74.
  6. Tamura, T. et al. (2019) In Vivo Dynamics of Reporter Flaviviridae Viruses. J Virol. 93(22), e01191-19.

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O que é Western Blot?

& # 8216Western blot & # 8217 é outro nome para immunoblot, que detecta proteínas específicas em uma amostra. No entanto, o termo & # 8216western blot & # 8217 foi cunhado por W. Neal Burnette em 1981, após o Southern blot homônimo para DNA. Enquanto isso, o Southern blot foi desenvolvido pelo biólogo britânico Edwin Southern para detectar sequências de DNA específicas em um blot de membrana. Além disso, & # 8216norte blot & # 8217 é a técnica para a detecção de RNA desenvolvida em 1977 por James Alwine, David Kemp e George Stark na Universidade de Stanford, com contribuições de Gerhard Heinrich.


Separação de proteínas e transferência de membrana com géis pré-moldados mPAGE ™

Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é uma técnica ubíqua usada para separar proteínas por mobilidade eletroforética. Embora as proteínas possam ser separadas em seu estado nativo (ou dobrado) por meio de PAGE nativo, as proteínas são tipicamente desnaturadas quimicamente (ou não dobradas) usando dodecil sulfato de sódio (SDS) com um agente redutor como ditiotreitol (DTT) antes da separação. Os géis SDS PAGE são usados ​​para separar proteínas com base em seu peso molecular, comparando amostras com padrões (escadas) contendo proteínas de peso molecular conhecido.

O tempo de execução da eletroforese em gel é variável, dependendo do gel e das condições de execução. Os géis pré-moldados mPAGE ™ bis-tris demonstraram ter um tempo de execução mais curto (até 15 minutos), do que os géis pré-moldados semelhantes disponíveis no mercado (figura 1), sem perder a resolução - ajudando você a economizar tempo e dinheiro.

Concorrente T
Tempo de execução de 50 minutos

Gel pré-fabricado mPAGE ™
Tempo de execução de 35 minutos

Figura 1. Separação de proteínas usando tampão de corrida MOPS comparando gel pré-moldado mPAGE ™ Bis-Tris (4-12%) a um gel bis-tris pré-moldado concorrente. Amostras: marcador de proteína não corado e diluição em série do extrato de E. coli.

Transferência para membranas

Após a separação, as proteínas são transferidas para uma membrana, normalmente para Western blotting (immunoblotting) ou outra técnica de detecção. Em protocolos de Western blotting, as proteínas são mais comumente transferidas eletroforeticamente usando um método de transferência úmido (tanque) ou semi-seco. Os géis pré-moldados bis-tris mPAGE ™ fornecem transferência de proteína eficiente para transferência úmida e semi-seca (Figura 2).

Figura 2. Diluições em série de lisado de células A431 carregadas em um gel mPAGE ™ 4-12% e transferidas para a membrana Immobilon®-P por meio de métodos padrão. Blots sondados com anticorpos contra EGFR (180 kDa), AKT1 (60 kDa) e histona (17 kDa). Anticorpos detectados com anticorpos secundários conjugados com peroxidase e substrato de quimioluminescência Immobilon® Forte.


Escolhendo anticorpos de controle de carga

A beta-actina e a beta-tubulina têm sido consistentemente empregadas como controles de carga, porque sua expressão é relativamente constitutiva na maioria dos sistemas modelo. No entanto, algumas publicações questionaram a validade do uso de β-actina como um controle de carga padrão (Ditmar e Ditmar, 2006 Eaton et al., 2013 Li e Shen, 2013) com o fundamento de que os níveis de β-actina e β-tubulina diferem entre os tecidos e sua expressão pode ser afetada por condições patológicas. Os autores desta publicação sugerem uma análise de proteína total como uma técnica alternativa em Western blotting quantitativo e recomendam que produtos genéticos de "manutenção" devem ser usados ​​com cuidado após estudar o padrão de expressão do gene sob investigação. No entanto, β-actina e β-tubulina oferecem certas vantagens como controles de carregamento: eles são altamente conservados, exibem alto nível de expressão e exibem estabilidade na maioria das condições experimentais. É importante observar que deve-se selecionar um controle com base no tecido específico ou tipo de célula em estudo, e testes empíricos podem ser necessários para verificar a uniformidade do controle de carga.


Alternativas de Western blot - Biologia

o mancha ocidental é uma técnica analítica usada para detectar proteínas específicas em uma determinada amostra de homogenato ou extrato de tecido. Ele usa eletroforese em gel para separar proteínas nativas ou desnaturadas pelo comprimento do polipeptídeo ou pela estrutura 3-D da proteína.
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Informações sobre o ocidental Borrão técnica. Aprenda o ocidental borrando protocolo e método, solucionar problemas de westernblot.
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ocidental borrão n.pr Um teste confirmatório para exposição ao HIV que identifica anticorpos para proteínas do HIV e. o ocidental borrão (alternativamente, imunotransferência de proteína).
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Procedimentos detalhados para detecção de um ocidental borrão variar amplamente. . perfurar ocidental Borrão Melhorador de sinal (Produto # 21050). Restaurar ocidental Borrão Decapagem.
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. técnicas - exemplos de ocidental borrando as aplicações incluem análise de. Um procedimento mais complexo, ocidental borrando, envolve a separação de uma proteína.
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Coloque 200 ml de borrão buffer em uma bandeja e adicione um pedaço de papel de filtro ligeiramente. Norte e então ocidental borrões foram nomeados por analogia. .
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UMA ocidental borrão é um método em biologia molecular para detectar uma certa proteína em a. O teste de HIV conhecido como "ocidental Borrão"usa uma variante da técnica, onde o.
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ocidental borrão protocolos, solução de problemas, recursos científicos e pesquisa. 3. O primeiro artigo a usar o termo ocidental borrão. Burnette WN. .
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ocidental borrando informa quanta proteína se acumulou nas células. . uma proteína é degradada rapidamente, ocidental borrando não irá detectá-lo bem, você precisará.
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Pall Corporation fabrica ocidental borrando membranas feitas de. Parte 1 - ocidental Blotting Interação de ligação às membranas, método de.
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ocidental Blotting Reagente Luminol para quimioluminescência. Padrões de peso molecular pré-avaliados. Anticorpos secundários específicos de isotipo para ocidental Blotting .
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Misc. ocidental Blotting Kits. Multiplex Borrão Kits de detecção. VERIFY Tagged Antigen ™ As ocidental Borrão Controles positivos da OriGene Technologies.
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Automação, novos métodos de detecção dão o velho favorito ocidental borrando um novo visual. . Isso significa que o ocidental borrão não vai a lugar nenhum agora. .
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O IgG ocidental Borrão é um imunoensaio do tipo sanduíche realizado de uma maneira que. IgM ELISA é ambíguo ou positivo, o IgM ocidental borrão deve ser executado. .
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ocidental Borrão Procedimento. de como um ocidental borrão (mais formalmente chamado de a. ocidental borrões permitem que os investigadores determinem o peso molecular de uma proteína.
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Protocolos de Imunoquímica: ocidental borrão Anticorpo. Passo 1 . Contate-nos • Anticorpo de Ubiquitinação • ocidental Borrão Anticorpos • Acetilação.
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Assista o vídeo: Western Blotting Animation - Part III (Dezembro 2021).