Em formação

D5. Regulação de mTORC1 por Disponibilidade de Energia - AMP Kinase - Biologia


Acredite ou não, outra pequena proteína G com atividade GTPase, Rheb (homólogo de Ras enriquecido no cérebro), está envolvida tanto no recrutamento de mTORC1 para a membrana lisossomal quanto na ativação de mTOR. A atividade de ativação da mTORC1 quinase de Rheb está em contraste com o papel das proteínas Rag G, que parece ser principalmente de recrutamento.

Como a pequena proteína G Rheb é regulada? Claro, por sua interação com outro GAP, denominado complexo de esclerose tuberosa (TSC). Na ausência de fatores de crescimento, o TSC se liga ao Rheb e, agindo como um GAP, promove a hidrólise do GTP. Isso inativa o Rheb, inibindo a atividade da mTOR quinase.

Como então o Rheb é regulado? Uma maneira é por meio da fosforilação pela AMP quinase, uma enzima que é regulada pelo nível de energia das células (consulte o Capítulo 9C-10: AMP quinase). A AMPK fosforila e ativa o TSC, que, atuando como um GAP, inativa o pequeno complexo de proteína G Rheb (complexo TSC). Sestrins 1 e 2 também podem regular AMPK.

A figura abaixo mostra uma via mais completa de ativação, regulação e atividade da AMPK. A ilustração é usada com cortesia de Cell Signaling Technologies (www.cellsignal.com)

A figura também mostra que AMPK fosforila e inibe mTORC1.

AMPK ativa processos quando a energia é necessária (glicólise, lipólise) e inibe aqueles quando a energia é abundante ou quando ocorre crescimento e proliferação celular (síntese de ácidos graxos e proteínas). Portanto, a AMPK ativa o catabolismo, enquanto o mTORC1 ativa o anabolismo. Ambos podem ser vistos como reguladores mestres do metabolismo.

Contribuidores

  • Prof. Henry Jakubowski (College of St. Benedict / St. John's University)

Como o mTOR detecta a falta de glicose? AMPK é o suspeito de sempre

A glicose é um requisito importante para a vida biológica. Sua concentração é constantemente detectada no nível celular, permitindo respostas adequadas a quaisquer mudanças na disponibilidade de glicose. Essas respostas são mediadas por sensores-chave e componentes da via de sinalização que adaptam o metabolismo celular aos níveis de glicose. Um dos principais centros dessas respostas é o alvo mecanístico da rapamicina (mTOR) quinase, que forma os complexos de proteínas mTORC1 e mTORC2. Em concentrações fisiológicas de glicose, o mTORC1 é ativado e estimula uma série de proteínas e enzimas envolvidas nos processos anabólicos, enquanto restringe o processo autofágico. Por outro lado, quando os níveis de glicose estão baixos, o mTORC1 é inibido, levando à repressão de vários processos anabólicos, poupando ATP e antioxidantes. Entender como a atividade de mTORC1 é regulada pela glicose não é importante apenas para delinear melhor a função biológica de mTOR, mas também para destacar estratégias terapêuticas potenciais para o tratamento de doenças caracterizadas pela disponibilidade desregulada de glicose, como é o caso do câncer. Nesta perspectiva, representamos os diferentes sensores e proteínas a montante responsáveis ​​pelo controle da atividade de mTORC1 em resposta às mudanças na concentração de glicose. Isso inclui o sensor de energia principal da proteína quinase ativada por AMP (AMPK), bem como outros jogadores independentes. O impacto de tais modos de regulação de mTORC1 em processos celulares também é discutido.

Palavras-chave: Biologia celular Sinalização celular.

Declaração de conflito de interesse

Conflito de interessesOs autores declaram não haver conflito de interesses.

Bonecos

Fig. 1. AMPK, Rag GTPases, GADD34 e ...

Fig. 1. Regulação de AMPK, Rag GTPases, GADD34 e TBC1D7 de mTORC1 em resposta à glicose ...

Fig. 2. ULK1 e LARS regulam mTORC1 ...

Fig. 2. ULK1 e LARS regulam mTORC1 de uma maneira dependente de glicose.

Laranja corresponde a ativo ...

Fig. 3. Controle das vias PFKFB3 e HK2 ...

Fig. 3. As vias PFKFB3 e HK2 controlam mTORC1 em resposta às concentrações de glicose.


D6. Regulação de mTORC1 por Insulina e Fatores de Crescimento

  • Contribuição de Henry Jakubowski
  • Professor (Química) no College of St. Benedict / St. John's University

mTORC1 é claramente regulado por fatores locais (aminoácidos, estado de energia) e fatores de sistema (fatores de crescimento). Essa lista está crescendo diariamente. O seguinte demonstrou levar à ativação de mTORC1 incluindo moléculas pequenas, como aminoácidos, ATP (por meio de AMP quinase), oxigênio e glicose, e outras maiores, como insulina, outros fatores de crescimento, citocinas (fatores de crescimento imunológico e reguladores), oncogenes (que obviamente promovem a proliferação celular) e alguns agentes infecciosos. Outras moléculas ou processos inibem mTORC1, incluindo supressores de tumor e estresse.

O mTORC1 promove a síntese de mRNA e proteínas conforme descrito acima, mas também a síntese de nucleotídeos e lipídios, que não está descrita em detalhes acima. Além disso, promove a glicólise aeróbia (efeito Warburg), para fornecer não energia, mas intermediários para a biossíntese, bem como a via das pentoses, que forma NADPH para biossíntese redutiva e ribose para síntese de ácidos nucléicos.

Vamos dar uma olhada em 2 hormônios externos específicos, insulina e fator de crescimento epidérmico (EGF), e como eles afetam a atividade de mTORC1

A ligação da insulina ao seu receptor leva à ativação por meio da fosforilação da quinase Akt (também conhecida como Proteína Quinase B) após a fosforilação a montante dos fosfoinositídeos da membrana e ativação da quinase 1 dependente de fosfoinositídeo, PDK1. Atk, como mostrado na figura de sinalização para AMPK, fosforila TSC2, o GAP para Rheb. As setas na figura da quinase AMPK acima não é consistente com nosso uso anterior de flechas. Na figura de CST, as setas mostram que tanto AMPK quanto Akt fosforilam TSC2. O TSC fosforilado é mostrado inibindo Rheb, a pequena proteína G. Isso não faria sentido fisiológico. A fosforilação de TSC2 por AMPK (depleção de energia de sinalização) ativa a proteína TSC2 GAP que inibiria RheB (a proteína G) e, portanto, inibiria mTORC1. Em contraste, a fosforilação de TSC2 por Akt (sinalizando a abundância de glicose) leva ao inibição da atividade GAP de TSC2. Isso manteria o Rheb na forma ativa ligada ao GTP, o que leva à ativação do mTORC1 ligado. Uma descrição mais completa da via onde a insulina se liga ao seu receptor (um receptor tirosina quinase dependente da insulina) e leva à ativação de mTORC1 através de Akt é mostrada abaixo.

O EGF se liga ao seu receptor, ativando-o como um receptor tirosina quinase. Típico de outras quinases receptoras, ativa o sistema de proteína quinase ativada por mitógenos. Este processo é mediado pelo ativador Ras (uma pequena proteína G) de Raf (uma proteína quinase quinase quinase ativada por mitogênio ou MAP3K). O Raf ativo fosforila e ativa MEK (um MAPK2) que ativa ERK (um MAPK). Erk fosforila mTORC1 diretamente, que o ativa. Também fosforila TSC2 / TSC1, que inibe essas proteínas GAP, levando indiretamente à ativação da pequena proteína G Rheb, que também ativa mTORC1. Essas etapas são mostradas na figura abaixo.

Um resumo mostrando as quinases que ativam ou inibem TSC2 / 1 é mostrado abaixo. Temos a tendência de nos concentrar em nossa proteína favorita e conferir a ela um status especial de importância crítica em um caminho. Pode-se escolher claramente a proteína GAP TSC2 como especialmente importante na regulação da atividade de mTORC1, como mostrado abaixo.

A figura acima mostra duas proteínas adicionais. Um é REDD1 (não uma quinase), que ativa a proteína GAP TSC2, levando à inibição da pequena proteína G Rheb e, portanto, à inibição de mTORC1.

REDD1 (regulado no desenvolvimento e nas respostas de danos ao DNA 1) também é chamado de DDIT4 (DNA-Damage-Inducible Transcript 4). É um gene cuja expressão é ativada durante a hipóxia pelo fator 1 induzível por hipóxia e também durante o dano ao DNA. A hipóxia obviamente altera o metabolismo muito rapidamente. A proteína é degradada pelo proteassoma após ser direcionada para degradação pela adição pós-tradução de ubiquitina. Isso sugere mais uma maneira de regular a atividade de mTORC1.

O outro é o IKK beta, também conhecido como IKBKB (Inibidor do potenciador do gene do polipeptídeo leve Kappa em células B, quinase beta). É uma quinase que fosforila e inibe TSC2 que inibe Rheb, levando à ativação de mTORC1.

Essa quinase é ativada por muitos estímulos, incluindo inflamação (mediada por citocinas), infecções bacterianas ou virais e danos ao DNA. Fosforila um inibidor ligado de NF-kappa beta. Isso permite a ubiquitinilação do inibidor, direcionando-o para a degradação proteassomal. O NFKB livre pode então entrar na nuclease e alterar a transcrição de genes envolvidos na resposta imune e, portanto, promover a proliferação. Nessas condições, seria de se esperar a ativação de mTORC1.

Uma nota final: pouco se sabe sobre como os lipídios regulam mTORC1. Duas possíveis moléculas de sinalização de lipídios, ácido fosfatídico e fosfatidil inositol -3-fosfato estão provavelmente envolvidas. As enzimas que os formam, fosfolipase D e fosfoinositídeo 3-quinase (do gene PIK3C3), também conhecido como VPS34 (para classificação de proteína vacuolar de levedura), são encontradas em vesículas fagossomais e lisossomais e estão envolvidas em seu processamento, parecem ser envolvidos na sinalização mTOR. Obesidade e pessoas com dietas ricas em gorduras têm atividade elevada de mTOR.


Introdução

A proteína quinase ativada por monofosfato de adenosina (AMPK) é uma serina-treonina quinase que existe como um heterotrímero das subunidades catalíticas & # x03B1 e regulatórias & # x03B2 e & # x03B3 (Davies et al., 1994 Mitchelhill et al., 1994). Os mamíferos expressam duas subunidades catalíticas & # x03B11 e & # x03B12, duas subunidades regulatórias & # x03B21 e & # x03B22 e três genes reguladores de ligação de nucleotídeo adicionais & # x03B31, & # x03B32 e & # x03B33 (Viollet et al., 2010 Carling et al., 2012 Hardie, 2014a). O terminal N das subunidades & # x03B1 contém o domínio catalítico, bem como um local de fosforilação para quinases a montante que regulam sua atividade (Crute et al., 1998). As subunidades & # x03B3 ligam-se ao monofosfato de adenosina / difosfato de adenosina AMP / ADP e desempenham um papel regulador, enquanto o terminal C conservado da subunidade & # x03B2 interage com as subunidades & # x03B1 e & # x03B3 e é necessário para o complexo AMPK formação (Spasic et al., 2008 Dasgupta e Milbrandt, 2009). As sete subunidades AMPK são expressas de forma mais ou menos onipresente. No entanto, cada um dos doze complexos & # x03B1 & # x03B2 & # x03B3 AMPK possíveis exibem uma variação considerável na expressão específica do tecido, associação de subunidade, localização e função subcelular (Quentin et al., 2011 Dasgupta et al., 2012). Duas quinases upstream & # x2013 fígado quinase B1 (LKB1) Serina / treonina quinase 11 (STK11) e proteína quinase quinase dependente de cálcio calmodulina & # x03B2 (CaMKK & # x03B2) fosforilar as subunidades & # x03B3 para ativar totalmente a AMPK (Hawley et al. ., 2003, 2005 Shaw et al., 2004 Hurley et al., 2005 Oakhill et al., 2010, 2011 Xiao et al., 2011). LKB1 existe em um complexo ternário com STRAD (adaptador relacionado a STE20) e CAB39 / MO25 (proteína 25 de camundongo), e a atividade de LKB1 no complexo é 10 vezes maior do que LKB1 sozinho (Baas et al., 2003). Enquanto LKB1 ativa AMPK em resposta a AMP / ADP, CaMKK & # x03B2 ativa AMPK em resposta a Ca 2+. Ambas as vias podem atuar de forma isolada ou sinergicamente (Woods et al., 2005). A interação de LKB1 com o complexo AMPK demonstrou ser facilitada pela proteína citoplasmática AXIN (Zhang et al., 2013), que também interage com inúmeras outras proteínas. Desnecessário dizer que a regulação da transcrição das duas AMPK quinases a montante também pode determinar a ativação da AMPK.

A mTOR quinase existe em dois complexos distintos & # x2013 mTORC1 e mTORC2. O complexo C1 é composto por cinco proteínas & # x2013 mTOR quinase, RAPTOR (proteína associada à regulamentação de mTOR), mLST8 (letal para mamíferos com proteína Sec13 80), PRAS40 (substrato AKT rico em prolina 40 kDa) e Deptor (Dep- domínio contendo proteína interagindo com mTOR). O complexo C2 é composto por seis proteínas & # x2013 mTOR quinase, RICTOR (companheiro insensível à rapamicina de mTOR), mSIN1 (proteína de interação da proteína quinase ativada por estresse de mamíferos), Protor-1 (proteína observada com Rictor-1), mLST8 e Deptor (Laplante e Sabatini, 2009, 2013 Saxton e Sabatini, 2017). Em alguns tecidos, um feedback negativo de mTORC1 controla mTORC2 de modo que a ativação de mTORC1 reduz a atividade de mTORC2.

Excelentes avaliações foram escritas sobre os mecanismos de sinalização regulados pela AMPK e mTOR (Hardie, 2014b Hardie et al., 2016 Carling, 2017 Garcia e Shaw, 2017). Portanto, não iremos elaborar este tópico aqui. Em vez disso, enfatizaremos a regulação da transcrição dos genes da via AMPK & # x2013mTOR e como essas duas vias regulam a expressão gênica, além da sinalização.


Como os sensores de glicose conhecidos realmente detectam a glicose e quais são os outros sensores de glicose que controlam a atividade de mTORC1?

A resposta do mTOR à disponibilidade de glicose é quantitativa ou qualitativa?

Como podemos tirar proveito da regulação upstream de mTORC1 pela glicose para desenvolver novas estratégias anticâncer?

A glicose alimenta a vida do organismo. Os organismos desenvolveram mecanismos biológicos sofisticados para sentir e responder às mudanças na disponibilidade de glicose. No nível celular, existem moléculas-chave que detectam os níveis de glicose e controlam a atividade de vias de sinalização específicas que adaptam o metabolismo celular à quantidade de glicose disponível.

Um dos principais centros de vias de detecção de glicose é o alvo mecanístico altamente conservado da rapamicina (mTOR) quinase, que é encontrada em um ou ambos os complexos de proteína mTORC1 / mTORC2 (ref. 1). Durante os períodos de disponibilidade de glicose, o mTORC1 é ativado e fosforila uma série de alvos a jusante para estimular processos anabólicos, incluindo proteínas, nucleotídeos e síntese de lipídeos, enquanto bloqueia o processo catabólico de autofagia 2. Isso promove o crescimento e a proliferação de células induzidas por mTORC1 3,4. Durante os períodos de escassez de glicose, mTORC1 é inibido, levando ao bloqueio dos processos anabólicos mencionados acima em conjunto com uma indução de autofagia, resultando na restrição do crescimento e proliferação celular 2. Essa resposta é crítica para preservar a energia - a síntese de proteínas é o processo que mais consome ATP na célula 5 - bem como os antioxidantes e, portanto, para preservar a viabilidade celular sob tal condição de estresse 6. Na verdade, a falha em inativar mTORC1 em condições de privação de glicose leva à depleção de ATP, em parte devido à atividade de síntese protéica anormal e morte celular, indicando que a inibição de mTORC1 é absolutamente necessária para apoiar a sobrevivência celular durante a escassez de glicose 7,8,9.

A regulação de mTORC1 pela glicose tem implicações patológicas, já que se descobriu que mTORC1 é desregulado em doenças caracterizadas por metabolismo anormal da glicose 10. Esse é o caso do câncer, cujo microambiente é caracterizado pelo baixo suprimento de glicose devido à vasculatura tumoral defeituosa e ineficiente 11. Uma vez que foi relatado que mTORC1 é consistentemente hiperativo em vários cânceres 10 e com base em suas propriedades pró-anabólicas, foi proposto como um alvo terapêutico para essas doenças. Embora vários inibidores de mTORC1 tenham sido testados em uma ampla gama de tipos de câncer, seu uso em clínicas é atualmente bastante limitado 12, em particular devido ao surgimento de resistência 13. Além disso, isso é provavelmente explicado pela observação de que a inibição de mTORC1 medeia a proteção das células tumorais contra as condições de privação de glicose 7,8, comumente encontradas no microambiente tumoral. Isso foi bem ilustrado por Palm et al., Que demonstraram que em um modelo de camundongo com câncer de pâncreas, o inibidor de mTORC1 rapamicina promove a proliferação de células tumorais localizadas em áreas pouco vascularizadas do tumor 14. Portanto, aproveitando o entendimento atual da regulação de mTORC1 pela glicose, uma estratégia anticâncer atraente seria interferir na repressão da atividade de mTORC1 sob privação de glicose para prevenir a adaptação metabólica mediada pela inibição de mTORC1.

Uma questão importante que permanece é como a atividade de mTORC1 é controlada pelos níveis de glicose e quais sensores estão envolvidos. Embora isso tenha sido bem caracterizado no caso dos aminoácidos, atualmente não há um quadro geral claro para o controle de mTORC1 em resposta à glicose.

Aqui, representamos os componentes e reguladores atualmente conhecidos a montante da atividade de mTORC1 em resposta à glicose, oferecendo possíveis suspeitos para o papel dos sensores de privação de glicose que podem representar potenciais alvos terapêuticos.

Um dos reguladores upstream mais bem caracterizados da atividade de mTORC1 em resposta à glicose é a proteína quinase ativada por AMP do sensor de energia (AMPK). Na escassez de glicose, que induz a depleção de energia, a AMPK detecta diretamente aumentos nas relações AMP: ATP e ADP: ATP, levando à sua ativação 15,16,17. O modelo atual é que AMPK inibe mTORC1 em resposta à fome de glicose por meio da fosforilação e ativação do complexo de esclerose tuberosa regulador negativo de mTOR 2 (TSC2) 18, por um lado, e por meio da fosforilação e inibição da proteína associada regulatória do componente mTORC1 de mTOR (Raptor) 19, por outro lado (Fig. 1). Demonstrou-se que tal regulação inibe a síntese de proteínas e a progressão do ciclo celular, controlando o tamanho das células e prevenindo a apoptose, a jusante da inibição de mTORC1, em momentos de crise energética 7,18,19. Essas descobertas fornecem suporte adicional para o modelo pelo qual mTORC1 detecta a privação de glicose por meio da AMPK. No entanto, em células nocaute de AMPK, mTORC1 ainda está inativado após a privação de glicose, indicando que AMPK não é essencial para a detecção de glicose por mTORC1 (refs. 20,21) e, portanto, que outros sensores de níveis de glicose controlam mTORC1.

Laranja corresponde a moléculas ativas cinza corresponde a moléculas inativas.


Sensores de aminoácidos

Cada um dos sensores de aminoácidos se liga diretamente a um aminoácido ou molécula derivada de aminoácido e retransmite esse sinal para mTORC1 através das Rag GTPases (ver pôster). Aminoácidos específicos parecem ser mais importantes para a sinalização de mTORC1 do que outros, embora as razões para isso sejam amplamente especulativas. Por exemplo, a fome de leucina tem um efeito inibitório potente sobre mTORC1 e o sensor de leucina Sestrin2 medeia este sinal (Anthony et al., 2000 Wolfson et al., 2016). Mecanicamente, após a privação de leucina, o Sestrin2 monomérico se liga e antagoniza GATOR2, o que leva à inibição de mTORC1. Quando a leucina está presente, Sestrin2 liga-se diretamente à leucina, o que resulta em sua dissociação do GATOR2 (Saxton et al., 2016b). Sestrin2 tem dois homólogos, Sestrin1 e Sestrin3. Destes, acredita-se que Sestrin1 atue de maneira semelhante a Sestrin2, enquanto Sestrin3 se liga a GATOR2, mas não se liga a leucina em alta afinidade (Wolfson et al., 2016). Como Sestrin3 é um inibidor endógeno da via mTORC1, seria interessante investigar se a expressão de Sestrin3 poderia impactar a gama de níveis de leucina detectados.

Semelhante ao que é visto para Sestrin2, o sensor de arginina citosólica, CASTOR1, se liga diretamente à arginina citosólica e inibe mTORC1 por meio de sua interação com GATOR2 e subsequente oposição da atividade de GATOR2 (Chantranupong et al., 2016). O modo de interação difere dos Sestrins em que CASTOR1 atua como um homodímero e se liga a duas moléculas de arginina na interface da aspartato quinase corismato mutase, domínios TyrA (ACT) (Saxton et al., 2016a). Da mesma forma, o homólogo CASTOR1 CASTOR2 pode formar um heterodímero com CASTOR1 e ligar GATOR2, mas sua interação com GATOR2 é insensível à arginina. Curiosamente, CASTOR1 não é o único sensor de arginina a se comunicar com mTORC1. SLC38A9 é um transportador essencial de aminoácidos lisossomais gated arginina que permite que o mTORC1 detecte os níveis citosólicos e lisossomais de arginina (Jung et al., 2015 Wang et al., 2015 Wyant et al., 2017). SLC38A9 afeta diretamente o estado de nucleotídeo RagA ou RagB por meio de um mecanismo GEF regulado por arginina. Além disso, o SLC38A9 se liga diretamente à arginina dentro de sua primeira hélice transmembranar (TM1) (Lei et al., 2018). Após a ligação da arginina, o terminal N de SLC38A9 promove RagA e / ou RagB ligado a GTP, que empurra os Rags para um estado ativo (Shen e Sabatini, 2018).

A identificação do sensor SAMTOR de S-adenosilmetionina (SAM) indica que o mTORC1 não responde apenas aos próprios aminoácidos, mas também aos seus produtos metabólicos. SAMTOR se liga diretamente ao SAM, que é gerado a partir da metionina e serve como um metabólito celular essencial no metabolismo de um carbono (Gu et al., 2017). Este sensor difere dos outros sensores de aminoácidos citosólicos Sestrin2 e CASTOR1 porque não parece interagir com GATOR2. Embora os detalhes moleculares não sejam totalmente compreendidos, SAMTOR atua por meio de uma interação física com KICSTOR e GATOR1 para inibir mTORC1 na ausência de SAM.


Materiais e métodos

Cultura de células e linhas celulares

Dictyostelium Cepa AX3 [46, 47], Rheb - KO, tsc2 - KO, fkbp12 - KO, lst8 - KO, ARREBATADO OE, e YakA - / YakA −GFP células foram cultivadas axenicamente em meio HL5 com glicose (ForMedium # HLG0102) contendo 100 μg / ml de ampicilina e 100 μg / ml de estreptomicina, a 22 ° C em cultura em suspensão, agitando a

180 rpm, a uma densidade de 1–1,5 × 10 6 células / ml. YakA - Células / YakA-GFP [46, 47] foram cultivadas sob seleção em 5 μg / ml de blasticidina (Invivogen # ant-bl) e 50 μg / ml de G418 (Gold Biotechnology # G-418-5). Rheb - KO, tsc2 - KO, fkbp12 - KO, e lst8 - Células KO [24] foram mantidas sob seleção em 5 μg / ml de blasticidina, assim como os mutantes em DDB_G0292028 (GWDI_354_B_11), DDB_G0272965 (GWDI_188_C_7), DDB_G0281913 (GWDI_48_H_4), DDB_G028_DI_B_7521_7521_DIB_D7521_DIB821) (G7521_G8DI_DI_DI_DI821) (G7521_G8DI_DI_DI_DI821) (GWDI_DI_7518821 D752188182183 DDI_DI 7521) D752188DI_DI811821 D75821_DIBD7511821 DDB2182186 DDB2182182182186 DDB02-D7521-D75221 DDB0218-D75218218218-D7521 DDB0218-D7521-DDB221. , DDB_G0274245 (GWDI_424_B_9), DDB_G0276309 (GWDI_423_E_8), DDB_G0269572 (GWDI_165_C_11), DDB_G0288957 (GWDI_526_D_1), DDB_G0292188 (GWDI_526_A2), DDB_G0280921 (GWDI_491_A4), DDB_G0269670 (GWDI_189_C8), DDB_G0267942 (GWDI_483_D2), e DDB_G0281781 (GWDI_477_H6) [46, 47 ]

Rapamicina (Sigma-Aldrich # 37094) foi usada a 500 nM, conforme estabelecido previamente [24, 26]. pAICAR (ribonucleotídeo fosfo 5-aminoimidazol-4-carboxamida Sigma-Aldrich # A1393) foi usado a 1 mM, com base em estudos de dose anteriores [37] e otimização para ativação de pAMPK. Oitenta milimolar de 2-desoxi-d-glicose (2-DG Sigma-Aldrich # D6134), a 1: 1 com glicose no meio, foi suficiente para reduzir rapidamente (em & lt 10 min) os níveis celulares de ATP para 0,1 × e, assim, ative AMPK. Ativação de pAMPK semelhante foi observada em 2-DG de 320 mM, enquanto nenhuma ativação de pAMPK foi detectada em 2-DG de 40 mM na presença de glicose de 80 mM. Dorsomorfina (TOCRIS # 3093) foi usada a 40 μM. Quarenta dorsomorfina micromolar não alterou a taxa de crescimento ao longo de 48 h, enquanto 120 μM de dorsomorfina causou letalidade durante a noite.

Ensaio de taxas de crescimento celular

Para medir as taxas de crescimento celular, diluímos as células do crescimento de fase logarítmica (1–1,5 × 10 6 células / ml) para o meio de crescimento fresco a 0,1 × 10 6 células / ml e incubamos a 22 ° C com agitação constante a

180 rpm. O crescimento celular foi monitorado por contagem de células usando uma máquina de contagem de células [Cellometer Vision-Nexcelom Bioscience] em intervalos de tempo regulares ao longo de vários dias. Os ensaios de crescimento celular foram realizados em conjuntos triplicados em cada experimento independente (N = 3).

Immunoblotting

Para imunotransferência, lisados ​​de células inteiras foram preparados em tampão de lise Laemmli (Bio-Rad # 161-0747) contendo 2,5% de β-mercaptoetanol e fervidos durante 10 min a 95 ° C. O estado de fosforilação das proteínas S6K, 4EBP1, AMPKα e ERK1 / 2 foi monitorado em lisados ​​de células inteiras por imunoblotting após eletroforese em gel (Bio-Rad, gradientes de 4 a 20% em géis de Tris-glicina), com anticorpos contra pSGK1 S422 humano para S6K ( a uma diluição de 1: 1000 Abcam # ab55281), p4EBP1 T70 (1: 500 Cell Signaling # 9455), pAMPKα T172 (1: 2000 Cell Signaling # 2535) e pERK T202 / Y204 (1: 1000 Cell Signaling # 9101) [24, 60]. Para as proteínas 4EBP1, os géis foram transferidos para membranas de PVDF de 0,2 μm, seguido pelo bloqueio com leite em pó desnatado (Thermo-Scientific # 37530) por 1 h em temperatura ambiente. A fosforilação de YakA foi estudada em lisados ​​de células YakA - / YakA-GFP, usando anticorpos contra GFP (Cell Signaling # 2956) e resíduo de fosfoTirosina (pY) (BD Transduction laboratories # PY20).

Os níveis de expressão de pS6K, p4EBP1 e pY foram detectados usando o substrato ECL de nível Femto (Thermo-Scientific # 34096). A cinética de desenvolvimento celular foi monitorada por imunoblotting com anticorpos contra Dictyostelium PKAr (DSHB # 112-315-26), csA (DSHB # 12-120-94 / 6), ACA (a uma diluição de 1: 5000 diluição [61]), CAR1 (a uma diluição de 1: 5000 [62 ]) e proteínas de actina (Santa Cruz Biotechnology Sc-1616 HRP). Para as proteínas CAR1, as células após a lise com tampão de lise Laemmli contendo 2,5% de β-mercaptoetanol não foram seguidas da etapa de fervura.

Quantificação dos níveis de AMP e ATP

Para quantificar o conteúdo de AMP e ATP nas células, lisamos 1 × 10 7 células peletizadas por congelamento-descongelamento em nitrogênio líquido e subsequente mudança para -80 ° C durante a noite. Os pellets de células lisados ​​foram ressuspensos em 50 μl de água, centrifugados a 10.000 rpm por 10 min a 4 ° C e os sobrenadantes ensaiados. Os níveis de AMP foram medidos por detecção de luminescência usando o kit de ensaio AMP-Glo ​​(Promega # V5011), seguindo as instruções do fabricante. Dez microlitros de sobrenadante foram misturados com 10,0 μl de AMP-glow reagent-I por 1 min e incubados a 22 ° C por 1 h. Vinte microlitros de solução de detecção de AMP foram adicionados, misturados, incubados a 22 ° C por 1 h, e a luminescência medida conforme descrito. Os níveis de ATP foram medidos usando o sistema de ensaio de luminescência ATPlite (PerkinElmer # 6016943), seguindo as instruções do fabricante. Dez microlitros de sobrenadante foram misturados com 10,0 μl de solução de substrato ATPlite no escuro por 10 min e a luminescência medida. Normalizamos os níveis de AMP e ATP com as concentrações de proteínas em cada amostra. Dois microlitros de sobrenadante foram misturados com 100 μl de reagente de ensaio de proteína de Bradford (Bio-Rad # 5000201), incubados por 15 min, e a concentração medida por absorbância a 595 nm.

Análise quantitativa de fosfo-proteoma por espectrometria de massa

As amostras para análise de fosfo-proteoma foram comparadas a partir de células em meio de crescimento ou após 15 min de privação em DB. Para preparar as amostras, as células foram lisadas em tampão RIPA (ThermoFisher # 89900) contendo Coquetel Inibidor de Fosfatase (PhosSTOP a 1 × Roche # 04906837001) e Coquetel Inibidor de Protease (a 1 × Roche # 04639159001), seguido por congelamento imediato em nitrogênio líquido. As amostras foram marcadas com TMT, enriquecidas com fosfopeptídeos usando TiO2 e processadas por MyOmicsDx, Inc. (Towson, MD) para análises de espectrometria de massa.

Dictyostelium desenvolvimento

Examinar Dictyostelium desenvolvimento multicelular em condição de fome, células de crescimento em fase logarítmica (1–1,5 × 10 6 células / ml) foram aderidas em placas de 6 poços (3,5 × 10 6 células / poço ou 0,4 × 10 6 células / cm 2), reabastecido com meio de crescimento completo fresco ou meio de crescimento GDT e incubado por 2 h. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de desenvolvimento (DB 5 mM Na2HPO4, NaH 5 mM2PO4, CaCl 0,2 mM2, 2 mM MgCl2, ajuste para pH 6,6) e, em seguida, reabasteça com 2,0 ml de DB. O progresso do desenvolvimento foi então monitorado em intervalos regulares.

Para examinar a transição de crescimento para desenvolvimento induzida pela rapamicina sem retirada de nutrientes, as células aderidas em placas de 6 poços foram lavadas duas vezes com meio de crescimento GDT, reabastecido com 2 ml de meio GDT [50% Glc [-] (meio HL5 sem glicose , Formedium # HLB0102), glicose 27 mM, MgCl 1 mM2, CaCl 0,5 mM2, ajustar a pH 6,6] e incubar a 22 ° C por 2 h, seguido de tratamento com rapamicina (Sigma-Aldrich # 37094) no meio GDT. O progresso do desenvolvimento foi então monitorado em intervalos regulares.


AMPK e mTOR na homeostase de energia celular e alvos de drogas

O alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é um controlador central do crescimento e proliferação celular. mTOR forma dois complexos distintos, complexo mTOR 1 (mTORC1) e complexo mTOR 2 (mTORC2). mTORC1 é regulado por vários sinais, como fatores de crescimento, aminoácidos e energia celular e regula vários processos celulares essenciais, incluindo tradução, transcrição e autofagia. A proteína quinase ativada por AMP (AMPK) é um sensor de energia celular e transdutor de sinal que é regulado por uma ampla gama de estresses metabólicos. Essas duas vias servem como um nexo de sinalização para regular o metabolismo celular, a homeostase energética e o crescimento celular, e a desregulação de cada via pode contribuir para o desenvolvimento de distúrbios metabólicos, como obesidade, diabetes tipo 2 e câncer. Esta revisão enfoca nossa compreensão atual da relação entre a sinalização de AMPK e mTORC1 e discute seus papéis na homeostase energética celular e orgânica.


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Perspectivas

Over the last decade, knowledge of the mTOR signaling pathway has greatly progressed, enabling researchers to better understand the mechanism of diseases such as cancer and type 2 diabetes. Despite these advances, our understanding of this signaling network is far from complete and many important questions remain to be answered. For example, how is mTORC2 regulated and which biological processes does it control? How are the mTORC1 and mTORC2 signaling pathways integrated with each other? What are the functions of these complexes in adult tissues and organs and what are the implications of their dysfunction or dysregulation in health and disease? Are there additional mTOR complexes that regulate other biological processes? Finding answers to these important questions will advance our understanding of cellular biology, and will also help the development of therapeutic avenues to treat many human diseases.


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