Em formação

15.4: Ativação e inativação do complexo ciclina-cdk - Biologia


À medida que mais leveduras mutantes estavam sendo examinadas quanto a alterações em seu ciclo celular, dois outros genes foram encontrados nos quais as mutações deram origem a fenótipos semelhantes. Atuando junto com mais uma enzima, CAK (cinase ativadora de cdk), eles ativam o cdk (Figura ( PageIndex {3} )).

Usando o complexo mitótico ciclina / cdk como exemplo, a ciclina (cdc13) e o cdk (cdc2) se unem para formar um complexo inativo. O cdk é então fosforilado por wee1, uma quinase. O fosfato que coloca na tirosina-15 é necessário para o resto da sequência de ativação, mas é inibitório: na verdade, impede ativação final. Mas uma vez que Tyr-15 é fosforilado, CAK pode fosforilar uma treonina vizinha (Thr-161), que é necessária para a ativação. Finalmente, o cdc25, uma proteína fosfatase, remove o fosfato de Tyr-15, permitindo a ativação do cdk pelo Thr-161 fosforilado, e o MPF está finalmente a caminho. Há autoamplificação da ativação também, porque um dos alvos de MPF é cdc25, então há um loop de feedback positivo no qual a atividade de cdc25 é regulada positivamente por fosforilação.

Como você verá em uma seção posterior deste capítulo, o MPF executa muitas funções, algumas das quais evitam o progresso da mitose após a anáfase. Portanto, deve haver uma maneira de desligar o MPF (e, nesse caso, qualquer complexo ciclina / cdk) rápida e completamente quando a célula atingir o estágio apropriado do ciclo celular. Isso é confirmado por estudos ao longo do tempo da atividade do MPF, que mostram uma queda abrupta na atividade na anáfase. Isso coincide com o esgotamento da ciclina B (cdc13 em S. pombe) devido a uma combinação de desativação da transcrição do gene e degradação proteolítica específica. O caminho da degradação agora é bem compreendido e é um exemplo interessante de uma espécie de regulação por feedback.

Essencialmente, o MPF garante sua própria destruição: um de seus alvos de fosforilação é o cdc20. Após a fosforilação, o cdc20 é ativado e, em seguida, ativa o complexo promotor de anáfase (APC). APC é uma ubiquitina ligase (tipo E3) que poliubiquitina a ciclina do complexo MPF, tornando-a um alvo para degradação proteolítica por um proteossomo. Observe que apenas a ciclina é destruída, enquanto a quinase é deixada sozinha. Sem a ciclina, a quinase fica inativa e deve esperar que os níveis de ciclina aumentem novamente antes de ser reativada por uma nova rodada de fosforilação e desfosforilação.


15.4: Ativação e inativação do complexo ciclina-cdk - Biologia

As proteínas inibidoras da quinase dependente de ciclina (Cdk) estão envolvidas na parada do ciclo celular induzida por fatores antiproliferantes ou produtos químicos. A alta densidade celular também induz a parada do ciclo celular em que o DNA genômico não é replicado, mesmo na presença de uma dose mitótica de fatores de crescimento, isso é denominado inibição de contato. Embora o ciclo celular da linha celular de fibroblastos de rato, 3Y1, tenha sido interrompido em quiescência por inibição de contato, o Cdk4 ligou-se à sua subunidade reguladora, ciclina D1 ou D3. No entanto, esses complexos eram enzimaticamente inativos. A fosforilação do Cdk4 ligado a ciclina D1 pela cinase ativadora de Cdk poderia converter o complexo de ciclina D1-Cdk4 inativo em sua forma ativa em vitro, sugerindo que a treonina 172 do Cdk4, da qual a fosforilação é necessária para sua ativação, foi em parte não fosforilada em células 3Y1 inibidas por contato. Embora MO15 tenha sido ativo em extratos celulares preparados a partir de células 3Y1 presas, a ativação de Cdk4 produzida por bactérias nos extratos celulares foi inibida. Remoção de p27 kip1 dos extratos celulares permitiu que a holoenzima MO15 fosforilasse o Cdk4 e, por sua vez, o ativasse, indicando que o p27 kip1 desempenha um papel na inibição da fosforilação de Cdk4 por MO15 nas células 3Y1 inibidas por contato.


Biologia Celular Funcional

Entrada não programada na mitose

A quinase 1 dependente de ciclina (CDK1) é a principal proteína quinase que leva as células à mitose normal. O CDK1 é ativado pela ligação a ciclinas do tipo B (principalmente ciclina B1), que então fosforila substratos críticos para a entrada na mitose. A destruição da ciclina B1 fornece um mecanismo para inativar rapidamente o CDK1 e permitir que a célula saia da mitose (Fung e Poon, 2005).

CDK1 está presente em todo o ciclo celular. Em contraste, a ciclina B1 se acumula e forma um complexo com CDK1 após entrar na fase S. O complexo é mantido inativo antes da mitose por MYT1 e WEE1 através da fosforilação de CDK1 Thr14 / Tyr15. No final de G2 fase, o estoque de ciclina B1-CDK1 inativa é ativado abruptamente por membros da família da fosfatase CDC25. A ciclina B1-CDK1 catalisa sua própria ativação ao estimular simultaneamente a ativação de CDC25 e a inativação de WEE1 (Lindqvist et al., 2009). Acredita-se que este sistema biestável seja iniciado por PLK1, iniciando a ativação de CDC25 e inativação de WEE1 / MYT1 (van Vugt e Medema, 2005). A ativação de PLK1, por sua vez, requer fosforilação de PLK1 Thr210 por Aurora A, um evento que é assistido por Bora. A ligação de Bora a PLK1 é estimulada pela fosforilação dependente de ciclina B1-CDK1, criando ainda outro ciclo de feedback positivo na ativação de CDK1 (Lindqvist et al., 2009 ).

Para manter a estabilidade do genoma, é vital prevenir a entrada mitótica antes que a replicação ou reparo do DNA seja concluído. Vários pontos de verificação participam do monitoramento da integridade do DNA e evitam a entrada precoce na mitose. Agora está claro que princípios subjacentes semelhantes estão envolvidos nesses pontos de verificação para evitar a ativação do CDK1 (Kastan e Bartek, 2004).

Após a exposição à radiação ionizante ou outros insultos genotóxicos que provocam quebras de fita dupla de DNA, o ATM é autofosforilado em Ser1981, levando à liberação de monômeros ativos de complexos de homodímero. A quinase ATR relacionada à ATM é ativada por um espectro mais amplo de estresse, incluindo hipóxia e estresse de replicação. ATM / ATR então fosforila resíduos no domínio SQ / TQ de CHK1 / CHK2, estimulando assim a atividade dessas quinases efetoras (Smith et al., 2010 ).

Bifurcações de replicação paralisadas, que podem ser induzidas por fornecimento insuficiente de nucleotídeos ou lesões e obstáculos no DNA, ativam principalmente a via ATR-CHK1. Esta via é essencial mesmo na ausência de estresse exógeno durante a fase S não perturbada, provavelmente para manter altas taxas de progressão de bifurcação de replicação (Petermann e Caldecott, 2006).

Uma vez que a cascata ATM / ATR – CHK1 / CHK2 é ativada, a atividade de CDK1 é suprimida por fosforilação inibitória (Chen e Poon, 2008). CHK1 fosforila e ativa WEE1 ao promover a ligação de 14-3-3. Além disso, CHK1 / CHK2 também reprime todas as três isoformas da família da fosfatase CDC25. Especificamente, a fosforilação de CDC25C por CHK1 / CHK2 inativa sua atividade de fosfatase tanto direta quanto indiretamente por meio da criação de um sítio de ligação 14-3-3. A ligação de 14-3-3 mascara uma sequência de localização nuclear proximal e ancora CDC25C no citoplasma, impedindo o acesso eficiente de CDC25C ao seu substrato ciclina B1-CDK1. CDC25B, que possui um papel único na ativação da ciclina B1-CDK1 no centrossoma, também é inativado pela ligação de 14-3-3 após fosforilação dependente de CHK1. Finalmente, CDC25A é direcionado para degradação rápida por ubiquitinação dependente de β-TrCP de SCF após fosforilação dependente de CHK1. Coletivamente, esses mecanismos suprimem a atividade de CDK1 quando a replicação ou reparo do DNA não é concluído.

Prevê-se que a mitose prematura de períodos distintos do ciclo celular pode exercer diferentes efeitos na catástrofe mitótica. Enquanto G normal1 as células provavelmente contêm complexos de ciclina B1-CDK1 insuficientes para suportar a mitose precoce, as células na fase S começam a acumular ciclina B1. A estimulação da mitose em células com DNA replicado incompletamente deve gerar defeitos extensos na segregação cromossômica. Da mesma forma, a presença de danos não reparados ao DNA deve afetar profundamente a mitose. Conceitualmente, é menos claro se a catástrofe mitótica é induzida pela aceleração de G2 células em mitose.

O desacoplamento dos pontos de verificação de integridade do DNA promove a entrada não programada na mitose. Tornou-se cada vez mais claro que a catástrofe mitótica é um resultado importante da mitose não programada (Chan et al., 1999 Castedo et al., 2004 Vogel et al., 2007). As células que possuem pontos de verificação defeituosos, como aquelas derivadas de ataxia-telangiectasia, freqüentemente exibem síntese de DNA resistente a rádio e catástrofe mitótica (Lavin e Khanna, 1999). Uma vez que o efeito final dos pontos de verificação é um acúmulo de fosforilação inibitória de CDK1, não é surpreendente que a expressão de um mutante não fosforilável de CDK1 também possa desencadear uma catástrofe mitótica (Blasina et al., 1997 Niida et al., 2005 Chow et al., 2003 ).

Os agentes que visam os componentes do eixo ATM / ATR – CHK1 / CHK2 podem induzir uma catástrofe mitótica. Na verdade, vários desses inibidores de moléculas pequenas são agentes anticâncer promissores (Furgason e Bahassi el, 2013). O ponto de verificação da montagem do fuso é necessário para a catástrofe mitótica induzida pela revogação dos pontos de verificação de integridade do DNA (On et al., 2011 Nitta et al., 2004 Vogel et al., 2004 Chen et al., 2012), sugerindo que uma armadilha na mitose é indispensável para esses tipos de morte celular.


Reparo de DNA

Kaoru Sugasawa, em The Enzymes, 2019

4.1 Fatores envolvidos na verificação da lesão

4.1.1 TFIIH

TFIIH, um grande complexo de proteínas que consiste em 10 subunidades, é funcionalmente dividido em dois subcomplexos (Tabela 1) [99]: o núcleo de sete subunidades, que contém três produtos de genes relacionados a doenças, XPB (ERCC3), XPD (ERCC2), e TTDA (GTF2H5) [100–102] e o módulo da cinase de ativação de CDK (CAK), composto de CDK7, ciclina H e MAT1 [103,104]. TFIIH é essencial para a transcrição geral e NER, e 3 das 10 subunidades estão associadas a atividades enzimáticas: as atividades ATPase / helicase dependentes de DNA de XPB e XPD e a atividade de proteína quinase de CDK7. A caracterização bioquímica inicial revelou que a helicase XPB pode se mover em uma fita de DNA na direção 3′ – 5 ′, enquanto a helicase XPD tem a polaridade oposta, 5′ – 3 ′ [101,105]. Embora essas atividades estejam implicadas no desenrolamento do duplex de DNA no promotor (para transcrição), bem como no local da lesão (para NER), a atividade helicase de XPB é muito mais fraca do que a de XPD. Análises mutacionais em conjunto com ensaios bioquímicos indicaram que a helicase, mas não a ATPase, atividade de XPB é dispensável para NER [106]. Em contraste, a XPD ATPase / helicase não é essencial para a transcrição, mas é necessária para NER [107,108]. Por outro lado, CAK em TFIIH fosforila o domínio C-terminal da RNA polimerase II e, portanto, desempenha um papel crucial na iniciação da transcrição [109,110], enquanto CAK por si só está envolvido também na regulação do ciclo celular, ativando o dependente de ciclina família quinase (CDK) [111]. No NER, no entanto, a associação com CAK tem um efeito inibidor sobre a função TFIIH, e CAK é liberado do núcleo do TFIIH durante o processo de reparo [112,113].

Tabela 1 . Subunidades de TFIIH humano.

SubunidadeGeneNúmero de aminoácidos a Função da proteína
Essencial
XPB (P89)ERCC3782 (89.3)ATPase / helicase dependente de DNA (3′ – 5 ′)
Translocase de DNA de fita dupla (5′ – 3 ′)
Abertura de sítios de lesão
Interação com XPC
XPD (P80)ERCC2760 (86.9)ATPase / helicase dependente de DNA (5′ – 3 ′)
Abertura de sítios de lesão
Verificação de lesão
p62GTF2H1548 (62.0)Interação com XPC
p52GTF2H4462 (52.2)Estimulação da atividade ATPase do XPB
p44GTF2H2395 (44.4)Dedo anelar
Estimulação das atividades ATPase / helicase de XPD
p34GTF2H3308 (34.4)Dedo de zinco
TTDA (p8)GTF2H571 (8.1)Estabilização do complexo TFIIH
Quinase ativadora de CDK (CAK)
CDK7CDK7346 (39.0)Proteína quinase
Fosforilação de CDK, RNA polimerase II CTD
Cyclin HCCNH323 (37.6)Regulação da atividade da proteína quinase de CDK7
MAT1MNAT1309 (35.8)Dedo anelar
Montagem do complexo CAK

Análises de partícula única usando microscopia crioeletrônica revelaram que o núcleo TFIIH adota uma estrutura semelhante a uma ferradura na qual XPB e XPD são posicionados nas extremidades abertas e as outras cinco subunidades estão alinhadas ao longo do arco [114,115]. Na presença de CAK, XPB e XPD são conectados através da longa α-hélice de MAT1, formando assim uma conformação em forma de anel mais rígida, que pode restringir suas funções ATPase / helicase (ver abaixo). Deve-se notar que a perda total da subunidade XPB ou XPD é incompatível com a viabilidade, mesmo a nível celular, devido ao defeito transcricional resultante. Portanto, em contraste com a complementação XP do grupo C, os pacientes do grupo XP B ou D expressam um nível considerável de proteína mutante contendo a substituição de aminoácido correspondente ou alteração da própria porção C-terminal [116,117]. Das subunidades não enzimáticas do núcleo TFIIH, p52 e p44 interagem com XPB e XPD, respectivamente, e modulam suas atividades ATPase / helicase [106]. Além disso, o p62 interage diretamente com a cadeia ácida de XPC através de seu domínio de homologia de Pleckstrina [118,119] e, provavelmente em conjunto com XPB [19,38,120], participa no recrutamento de TFIIH para locais de lesão. TTDA, também chamado de p8, é único em que a associação desta pequena proteína com o núcleo TFIIH aumenta substancialmente a atividade NER, mas é dispensável para em vitro transcrição [121,122]. Como em pacientes TTD que abrigam mutações em XPB ou XPD, entretanto, variações patogênicas de TTDA desestabilizam o complexo TFIIH, diminuindo assim a capacidade transcricional geral da célula [102,123].

4.1.2 XPA

O humano XPA gene, que mapeia para o cromossomo 9 (9q22.33), consiste em seis exons que codificam uma proteína de 31 kDa de 273 aminoácidos [124]. Os ortólogos são onipresentes em eucariotos, desde leveduras até humanos. Embora o XPA não exista como um complexo compacto com outras proteínas na Vivo [125], ele interage com uma série de fatores NER, apesar de seu tamanho relativamente pequeno. Seus parceiros relatados incluem XPC [36], TFIIH [126,127], proteína de replicação A (RPA) [128,129], ERCC1-XPF [130] e UV-DDB [131], sugerindo que XPA coordena a montagem sequencial de fatores NER na lesão locais depositando cada componente de maneira apropriada. Ambos na Vivo e em vitro estudos suportam um modelo no qual o XPA chega aos locais das lesões após XPC e TFIIH [10,11].

A própria proteína XPA possui atividade de ligação ao DNA, mas nenhuma função enzimática óbvia. XPA tem afinidade de ligação específica para certos tipos de DNA danificado [132,133], que é aumentada na presença de RPA [128,134]. A ligação ao DNA por XPA é particularmente forte e específica quando os substratos de DNA contêm estruturas incomuns, como fitas de DNA fortemente dobradas (por exemplo, estruturas ramificadas semelhantes a junções de Holliday) [135]. A estrutura da solução do C-terminal, domínio mínimo de ligação ao DNA de XPA foi determinada [136], e se assemelha aos domínios β-hairpin em XPC (especialmente BHD1 e BHD2), sugerindo alguma similaridade funcional entre esses dois fatores NER [34] . O XPA tem um motivo de dedo de zinco em sua região mais N-terminal que pode estar envolvida nas interações proteína-proteína ao invés da ligação ao DNA.

O grupo de complementação genética A é uma forma bastante comum de XP, e as células desses pacientes geralmente têm capacidade residual de NER muito menor do que aquelas de outros grupos de XP [137]. Os pacientes sem expressão detectável da proteína XPA são viáveis, mas geralmente apresentam disfunções neurológicas graves e progressivas, além dos sintomas cutâneos típicos do XP. Esses casos ocorrem com uma frequência particularmente alta no Japão devido ao efeito fundador de uma mutação de splice específica do XPA gene (IVS3-1G & gt C) [138].


Ativação da quinase 4 dependente de ciclina (cdk4) pela quinase associada a MO15 de camundongo.

A montagem de holoenzimas funcionais compostas por ciclinas reguladoras do tipo D e quinases dependentes de ciclina (cdks) é um fator limitante da progressão através da fase G1 do ciclo celular somático de mamíferos. Os complexos entre as ciclinas do tipo D e sua subunidade catalítica principal, cdk4, são cataliticamente inativos até que o cdk4 ligado à ciclina sofra fosforilação em um único resíduo de treonil (Thr-172). Esta etapa é catalisada por uma cinase de ativação de cdk (CAK) funcionalmente análoga à enzima que fosforila cdc2 e cdk2 em Thr-161/160. Aqui, demonstramos que a subunidade catalítica de CDc2 / cdk2 CAK de camundongo (uma proteína de 39 kDa designada p39MO15) pode se reunir com uma proteína reguladora presente em células de inseto ou de mamífero para gerar uma atividade CAK capaz de fosforilar e ativar enzimaticamente tanto cdk2 quanto cdk4 em complexos com seus respectivos parceiros de ciclina. Uma proteína semelhante a ciclina de 37 kDa identificada recentemente (ciclina H [RP Fisher e DO Morgan, Cell 78: 713-724, 1994]) pode se reunir com p39MO15 para ativar tanto a ciclina A-cdk2 quanto a ciclina D-cdk4 in vitro, implicando que CAK é estruturalmente uma reminiscência dos próprios complexos ciclina-cdk. Os anti-soros produzidos para a subunidade p39MO15 podem esgotar completamente os lisados ​​de células de mamíferos da atividade CAK tanto para a ciclina A-cdk2 quanto para a ciclina D-cdk4, com recuperação da atividade nos complexos imunes resultantes. Usando um ensaio de CAK de complexo imune, a atividade de CAK para ciclina A-cdk2 e ciclina D-cdk4 foi detectada em células quiescentes e invariante ao longo do ciclo celular. Portanto, embora seja essencial para a ativação enzimática de complexos ciclina-cdk, CAK não parece ser nem limitante da taxa para a emergência de células de quiescência, nem sujeito a controle regulatório a montante por mitógenos estimuladores.


Exame de Biologia Celular 4 Aula 16

Indiretamente promove a degradação de uma proteína conhecida como coesina, que mantém as cromátides irmãs juntas durante a metáfase.

A degradação indireta da coesina faz com que as cromátides irmãs se separem, tendo como alvo um inibidor chamado securina, que promove a separação das cromátides irmãs

Alvos Ciclina Mitótica para destruição

A célula permaneceria em suas fases mitóticas e nunca se dividiria.

Os cromossomos permaneceriam condensados

Ausência de fatores de crescimento Rb (Retinoblastoma) bloqueia a transcrição de genes que a célula precisa para entrar na fase S

Uma dessas ciclinas é a ciclina G1 / S.

Com a ciclina G1 / S presente, os complexos CDK começam a adicionar grupos fosfato à proteína Rb.

O complexo de proteínas Mad e Rub inibirá o CDC20 (subunidade do complexo promotor da anáfase) de se ligar ao complexo promotor da anáfase, evitando que a célula entre na anáfase.

Eles promovem a expressão de inibidores de CDK.

- Induzir as necessidades de que a célula precisa para se mover através das fases do ciclo celular.

- Ativará a transcrição de genes como E2F (move células de G1 para S) e Cyclin e CDKS.

Se eles forem desativados ou deletados, isso aumentará a proliferação celular levando ao crescimento de órgãos e maior risco de tumores.

- Transição de metáfase para anáfase

- Influenciado por fatores ambientais

Verifique se há danos no DNA

Verifique se os cromossomos estão ligados às fibras do fuso

Fatores - fatores de crescimento, nutrientes, tamanho da célula e danos ao DNA

Garante que a replicação do DNA esteja completa antes que a célula prossiga de G2 para M


Resumo

Fator de crescimento transformador & # x003b2 (TGF - & # x003b2) G mediado1 a parada anteriormente demonstrou ter como alvo específico a inativação de complexos ciclina D: quinase dependente de ciclina (Cdk) 4 & # x0002f6. Nós relatamos aqui que células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 tratadas com TGF - & # x003b2 param em G1, mas retém a atividade contínua de ciclina D: Cdk4 & # x0002f6 e proteína supressora de tumor de retinoblastoma hipofosforilada e ativa. Consistente com esta observação, as células tratadas com TGF - & # x003b2 não conseguiram induzir p15 INK4b, regular negativamente CDC25A ou aumentar os níveis de p21 CIP1, p27 KIP1 e p57 KIP2. No entanto, o tratamento com TGF - & # x003b2 resultou na inativação específica de complexos ciclina E: Cdk2 causada pela ausência da fosforilação de Thr 160 de ativação em Cdk2. Os lisados ​​de células inteiras de células tratadas com TGF - & # x003b2 mostraram inibição da atividade da quinase ativadora de Cdk2 Thr 160 Cdk (CAK), no entanto, a atividade da ciclina H: Cdk7, um CAK de mamífero previamente assumido, não foi alterada. Saccharomyces cerevisiae contém um gene CAK geneticamente e bioquimicamente comprovado, CAK1, que codifica uma proteína Cak1p monomérica de 44 kDa não relacionada a Cdk7. Os anticorpos anti-Cak1p reagiram de forma cruzada com uma proteína humana de 45 kDa com atividade CAK que foi especificamente regulada negativamente em resposta ao tratamento com TGF - & # x003b2. Tomadas em conjunto, essas observações demonstram que a sinalização TGF - & # x003b2 medeia um G1 parada em células HepG2 por direcionamento de Cdk2 CAK e sugere a presença de pelo menos dois CAKs de mamíferos: um específico para Cdk2 e um para Cdk4 & # x0002f6.

A maquinaria básica de controle do ciclo celular é composta por subunidades de ciclina reguladoras complexadas com subunidades catalíticas da serina e # x0002ftreonina quinase dependente da ciclina (Cdk) que fosforilam substratos de uma forma específica do ciclo celular (1 & # x020134). Ativação de Cdk2 pela ciclina E no final de G1 em & # x0002 perto do G1 ponto de restrição e pela ciclina A no G1Transição de fase -S e ativação da ciclina B de CDC2 no G2A transição de fase & # x0002fM sugere o envolvimento desses complexos ciclina: Cdk em pontos de controle regulatórios do ciclo celular específico (3, 4). Em contraste, a ativação dependente da ciclina D de Cdk4 e Cdk6 (Cdk4 & # x0002f6) em células em ciclo é constitutiva ao longo do ciclo celular (5 & # x0201310) e indica um papel distinto dos complexos de ciclina D: Cdk4 & # x0002f6 daquele da ciclina E: Cdk2. Na verdade, mostramos anteriormente que os complexos de ciclina D: Cdk4 & # x0002f6 ativam a proteína supressora de tumor de retinoblastoma (pRB) por hipo-fosforilação no início de G1 (8 & # x0201310), enquanto os complexos ciclina E: Cdk2 realizam a inativação inicial, hiperfosforilação de pRB no final de G1 ponto de restrição (8 e # x0201313).

Os complexos ciclina: Cdk são altamente regulados em vários níveis. Após a síntese de ciclina, as proteínas ciclina e Cdk são montadas em complexos heterodiméricos inativos que são posteriormente modificados por fosforilação da subunidade Cdk (4). Cdk2 contém dois locais de fosforilação inibitórios em Thr 14 e Tyr 15 e um local de fosforilação de ativação em Thr 160. Wee1 fosforila Tyr 15 em Cdk2 (21), enquanto a Cdk2 Thr 14 quinase permanece desconhecida. Thr 14 e # x0002fTyr 15 são desfosforilados pela família da fosfatase CDC25 de especificidade dupla (A, B, C) (4). No entanto, a ativação de complexos ciclina E: Cdk2 requer fosforilação do resíduo Thr 160 em Cdk2 pela cinase ativadora de Cdk (CAK) (14).

A identidade do mamífero CAK permaneceu controversa na literatura. No entanto, com base principalmente em em vitro ensaios bioquímicos, relatórios iniciais identificaram um complexo CAK putativo de mamífero que é membro da família Cdk, a saber, ciclina H: Cdk7: Mat1 (15, 16). Surpreendentemente, por meios genéticos e bioquímicos, os complexos de ciclina H: Cdk7 subsequentemente foram identificados como um componente necessário do TFIIH envolvido na fosforilação do domínio C terminal da grande subunidade da RNA polimerase II (17 & # x0201320). Consistente com essas observações, a inativação do Saccharomyces cerevisiae Homólogo Cdk7, KIN28, resulta na perda da atividade de TFIIH com atividade CAK continuada (21). Significativamente, Larochelle et al. (22) recentemente demonstraram em Drosófila que a inativação de Cdk7 leva apenas a uma perda de atividade de CDC2 com a atividade contínua de ciclina E: Cdk2. Além disso, vários grupos identificaram o verdadeiro S. cerevisiae CAK (CAK1 e # x0002fCIV1) gene que codifica uma proteína CAK monomérica de 44 kDa (Cak1p) distinta da família Cdk dependente de prolina (23 & # x0201325). Juntas, essas observações desafiam a noção inicial percebida com base em em vitro experimentos que os complexos de ciclina H: Cdk7 funcionam como um Cdk2 CAK em células de mamíferos na Vivo.

Os complexos de ciclina D: Cdk4 & # x0002f6 anteriormente demonstraram ser especificamente direcionados pelo fator de crescimento transformador & # x003b2 (TGF - & # x003b2) sinalizando na mediação de um G1 parada por indução de p15 INK4b, um regulador negativo de Cdk4 & # x0002f6, regulação negativa de CDC25A ou regulação negativa dos níveis de proteína Cdk4 (26 e # x0201328). Na busca por uma linha celular responsiva a TGF - & # x003b2 que para o crescimento com atividade contínua de ciclina D: Cdk4 & # x0002f6, descobrimos a capacidade das células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 de sofrer uma G mediada por TGF - & # x003b21 parada independente de p15 INK4b e CDC25A, que tem como alvo a inativação de complexos ciclina E: Cdk2. Relatamos aqui a regulação biológica da atividade Cdk2 CAK, independente da atividade Cdk7, por sinalização TGF - & # x003b2, enquanto a atividade Cdk4 & # x0002f6 CAK permanece inalterada.


Caminho de sinalização CDK

A transição entre os diferentes estados do ciclo celular eucariótico é controlada principalmente por pontos de verificação, que consistem em duas famílias de proteínas: proteína quinase dependente de ciclina (CDK) e ciclagem. O primeiro monômero não tem atividade enzimática e só pode ser ativado quando forma um complexo CDK-ciclina com o último. Uma série de eventos associados a transições de estado celular no ciclo celular são então iniciados por fosforilação específica de resíduos de serina e treonina específicos na proteína alvo. Esta última é uma classe de proteínas que se agregam e se degradam no ciclo celular conforme as células mudam e regulam sua atividade formando complexos com CDK, que são essenciais para a atividade de expressão de CDK. A agregação, ativação e despolimerização do complexo CDK-ciclina periódica são eventos críticos que impulsionam a renovação celular do ciclo celular. A regulação da ativação e inativação da proteína quinase dependente da ciclina é central para o controle do ciclo celular.

CDK é uma classe de proteínas quinases dependentes de ciclina e o substrato é uma família heterodimérica de seda / treonina quinase. Até agora, a família CDKS nomeada tem 13 membros: CDK1

CDK13. O CDK é ativado pela ligação a ciclinas, que catalisam a fosforilação de substratos e conduzem a fase do ciclo celular para completar a síntese de DNA e mitose, levando ao crescimento e proliferação celular. Ao mesmo tempo, os CDKs também podem desempenhar um papel regulador negativo em combinação com o fator inibidor de CDKs (CKI), inibir a progressão do ciclo celular e prevenir a divisão celular. Nas diferentes fases do ciclo celular, a fase G1 de controle principal é CDK2, 4 e 6, e a fase S e a fase G2 são dependentes de CDK2, enquanto a fase M é principalmente regulada por CDK1. Em vista do importante papel da anormalidade da atividade de CDK2 na tumorigênese e no desenvolvimento, os inibidores de CDK2 se tornaram uma nova direção na pesquisa de tratamento de tumores. Estudos demonstraram que a inibição direta da atividade de CDK2 quinase ou inibição de CDK2 pelo aumento de p27 e p21 pode causar a inibição do crescimento de células de câncer de ovário. A ciclina é uma família de proteínas reguladoras positivas e é um fator ativo de CDK. Existem atualmente 8 tipos de Ciclina que foram encontrados, que são classificados em A, B, C, D, E, F, G e H. A ciclina forma principalmente um complexo Ciclina-CDK com CDK na regulação do ciclo celular, ativando assim o CDK atividade. Por exemplo, células de controle do complexo Ciclina D e CDK 4/6 cruzam a fase G0 / G1, células de controle do complexo Ciclina E e CDK2 de G0 / G1 entrando na fase S, células de controle do complexo Ciclina A e CDK2 passando pela síntese de DNA na fase S, e A ciclina B forma um complexo com CDK1 para controlar as células na fase G2 / M. Dentre as ciclinas, a ciclina D e a ciclina E são as mais estudadas. A ciclina inclui principalmente os subtipos CyclinD1, D2 e ​​D33, dos quais a ciclinD1 é o subtipo principal, também conhecido como gene-1 do adenoma da paratireóide, que é uma proteína chave que regula a fase G1, composta principalmente de CDK4 / CDK6 sintase. A célula passa pela fase G1 e o substrato a jusante de CyclinD1-CDK4 / CDK6 é a proteína de blastoma da membrana retinal (Rb) e o fator de transcrição E2F. Yang et al descobriram que a Cyclin D1 é altamente expressa no câncer de mama e é expressa junto com a progressão do câncer de mama. A expressão aumentada da ciclina D1 está relacionada à formação e metástase do câncer de mama. Achados semelhantes foram encontrados no câncer cervical, câncer endometrial, mieloma múltiplo, etc. E alguns estudos encontraram ciclina no câncer de fígado e câncer de pulmão de células não pequenas. Os resultados de superexpressão da ciclina D1 são consistentes.

Via de sinalização CDK

    Cascata da via de sinalização CDK

A condução da via de sinalização de CDK começa com a ligação de CDK e ciclina. O substrato E2F a jusante de cyclinD1-CDK4 / CDK6 promove a transcrição do gene de ciclina E. A ciclina E se liga ao CDK2 e ativa o CDK2 para formar um complexo ciclina E-CDK2, que fosforila pRb e P107. O substrato a jusante regula as células para entrar na fase S. A expressão da Ciclina E também é regulada pela ubiquitinação do complexo SCF (SKP1-CUL1F box-proteína). O Instituto Chinês de Microbiologia encontrou uma nova interação entre Ciclinas / CDKs, a proteína e Ankrd17, substrato da Ciclina E / CDK2, uma proteína reguladora positiva na transição de fase G1 / S. A superexpressão de Ankrd17 promove a entrada da célula na fase S, enquanto a diminuição da expressão de Ankrd17 inibirá a replicação do DNA, impedirá a progressão do ciclo celular e regulará positivamente a expressão de p53 e p21. Du et al descobriram que a ocorrência de tumores de mama em camundongos transgênicos Myc foi associada à superexpressão de Ciclina E. Em células de câncer de mama humano, pacientes com câncer de mama com alta expressão de Ciclina E também apresentaram uma maior malignidade em câncer de pulmão de células não pequenas e trato gastrointestinal. Alta expressão de Cyclin E também foi encontrada no câncer. Esses achados sugerem que a ciclina E está intimamente relacionada à tumorigênese.

A regulação da via de sinalização CDK pode ser dividida principalmente em regulação positiva e regulação negativa. Regulação positiva da fosforilação de CDK: na sequência de aminoácidos de CDK, existem resíduos de treonina conservados (posição 161 do CDC2 CDK2 somático de 160 bits). Este resíduo está escondido no T loop. Após a fosforilação, a estrutura do anel T muda, aumentando assim a afinidade da ciclina para CDK e tornando o complexo de CDK altamente ativo. O CDK7 liga-se à ciclina H e a outra subunidade pequena e é fosforilado no 170º resíduo de treonina, tendo assim a capacidade de fosforilar outro CDK. Regulação negativa da fosforilação de CDK: A inibição da atividade do complexo de CDK pode ser realizada interrompendo a ligação à ciclina e desfosforilação do local da treonina. Experimentos mostraram que, além de CDK 4, a fosforilação simultânea no 14º resíduo de treonina e no 15º resíduo de tirosina também pode inibir a atividade do complexo de CDK. Ambos os resíduos estão localizados perto do local de junção ATP. Sua fosforilação afeta a ligação do ácido fosfórico ao ATP. Na levedura de fissão, Weel e Mik1 são provavelmente quinases de resíduos de tirosina, e os fosforilatos de Nim1 / Cdr1 Weel inibe sua atividade. To de-phosphorize the negative effects, CDC25 is required to dephosphorylate the two sites. CDC2, MAP, MAM 2 kinase phosphorylation of CDC25 N-terminal increases CDC25 activity. At the same time, PP1, PP2A can dephosphorylate CDCD25. It is not difficult to see that this is a network of phosphatase and kinase. In addition, some CDK inhibitors can effectively inhibit the conduction of CDK signaling pathway. In recent years, a batch of eggs that can be combined with CDK for one week has been isolated. The white complexes specifically bind to and inhibit the activity of the protein called the weekly protein-dependent enzyme to inhibit the protein. The confirmed proteins are FARI, p40 (slel / s DB25) and PHOsl, which are inhibited separately. Kinase activity of CDC28-CLN, CDC28-CLB and PHO 85-PHO8 complexes p21(CIPI / WAF / CAPZO / SDI), P27(KIP in mammals), p16 , NK , and p15NK4β, which inhibit the activity of CDKZ-cyclin, CDK4 -cyclin, CDK4-cyclin and CDK6-cyclin complex, respectively. The mechanism by which CKI regulates C D K is unclear. However, there is evidence that they may directly affect the activity of the enzyme by affecting the binding of the enzyme to the substrate. For example, FARI p4. P21 can be phosphorylated by its target CDK-period protein complex, and p40 reduces the Vmax and Km of its target CDC 28 - CLB complex combined with the substrate. Although most CKIs are more susceptible to recognizing the CDK-cyclin complex and are less likely to recognize monomeric CDK, p16IN4K binds to CDK 4 monomers na Vivo, so by blocking CDK 4 the binding of the protein is inhibited. The inhibition of c D K activity by CKI may be an important factor in cell cycle regulation. Because the regulation of CKI level is complex and related to the tumor suppressor gene p53, the second messenger cAMP and the transforming growth factor TGF, the activity regulation of CDK and the response of the cell response environment are changed. Linkages align cell transitions in the cell cycle with environmental changes. Some of the regulation of CKI is carried out at the transcriptional level. For example, when DNA is damaged or cell ages, p53 induces transcription of p21 and blocks the cell cycle. As in human keratinocytes, the conversion growth factor TGFβ enhances the expression of the p15NK4β gene. The regulation of CKI can also be carried out at the post-translational level. For example, the total 2P7 content in the epidermal cells of the leech is unchanged in the cell cycle and is not affected by the TGF. However, when the TGF is treated, the p27 is a CDK-cyclin. The inhibitory effect of the complex is increased, and the treatment of TGF may cause 2P7 to be released from a bound state.

Studies have shown that although the total phosphorylation level of CDK2 is unchanged in senescent cells, the phosphorylation levels in cyclin D, E, and CDK are decreased, resulting in cell arrest in the G1 phase. Furthermore, senescent cells do not have mRNA and products of cyclin A, cyclin B, CDK4, and CDC 2. In addition, there may be no mature mRNA and products of PCN A due to the lack of post-transcriptional regulation. At the same time, the expression of P21 in senescent cells is 20 times higher than that of normal proliferating young cells, which may be the cause of cell senescence and cell cycle delay.

Studies have pointed out that CDK5 expression is an independent factor in the evaluation of prognosis in patients with gastric cancer. The 5-year survival rate of patients increases with the increase in CDK5 expression in cancer tissues. In the diagnosis and treatment of gastric cancer, CDK5 protein is expected to become a target.


Resumo

K cyclin encoded by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus confers resistance to the cyclin-dependent kinase (cdk) inhibitors p16 Ink4A , p21 Cip1 , and p27 Kip1 on the associated cdk6. We have previously shown that K cyclin expression enforces S-phase entry on cells overexpressing p27 Kip1 by promoting phosphorylation of p27 Kip1 on threonine 187, triggering p27 Kip1 down-regulation. Since p21 Cip1 acts in a manner similar to that of p27 Kip1 , we have investigated the subversion of a p21 Cip1 -induced G1 arrest by K cyclin. Here, we show that p21 Cip1 is associated with K cyclin both in overexpression models and in primary effusion lymphoma cells and is a substrate of the K cyclin/cdk6 complex, resulting in phosphorylation of p21 Cip1 on serine 130. This phosphoform of p21 Cip1 appeared unable to associate with cdk2 in vivo. We further demonstrate that phosphorylation on serine 130 is essential for K cyclin-mediated release of a p21 Cip1 -imposed G1 arrest. Moreover, we show that under physiological conditions of cell cycle arrest due to elevated levels of p21 Cip1 resulting from oxidative stress, K cyclin expression enabled S-phase entry and was associated with p21 Cip1 phosphorylation and partial restoration of cdk2 kinase activity. Thus, expression of the viral cyclin enables cells to subvert the cell cycle inhibitory function of p21 Cip1 by promoting cdk6-dependent phosphorylation of this antiproliferative protein.

Progression through the mammalian cell cycle is primarily regulated during the G1 phase. D-type cyclins complexed with either cyclin-dependent kinase 4 (cdk4) or cdk6 collaborate with cyclin E/cdk2 to phosphorylate the retinoblastoma protein, pRb. This multisite phosphorylation inactivates pRb, hence removing its restraining influence on S-phase entry (1). However, to prevent unscheduled progression through the cell cycle, the G1-specific cyclin/cdk holoenzymes are held in check by p21 Cip1 and p27 Kip1 (34). These inhibitory proteins stoichiometrically bind to both the cyclin and cdk subunits and inhibit their enzyme activity through steric hindrance within the catalytic cleft (10, 15, 30, 32). p21 Cip1 and p27 Kip1 can also prevent the activating phosphorylation of the cdk subunit (2, 17). In addition to their inhibitory roles, p21 Cip1 and p27 Kip1 can promote D-type cyclin/cdk complex formation these heterotrimeric complexes retain substantial kinase activity (20, 36). Such trimeric complexes are believed to promote cell cycle progression through the sequestration of p21 Cip1 and p27 Kip1 , releasing cyclin/cdk2 complexes from inhibitory interactions (28).

Our understanding of the roles of endogenous cell cycle regulatory proteins has been greatly increased through the analysis of the functions of a variety of viral proteins that promote proliferation. The cyclin encoded by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) (K cyclin) is the viral homologue of the mammalian D-type cyclins, and it preferentially interacts with endogenous cdk6 (7, 13). K cyclin/cdk6 complexes have unusual properties, preeminent being their ability to maintain kinase activity in the presence of p21 Cip1 and p27 Kip1 (37). We have previously shown that K cyclin is able to circumvent the G1 blockades imposed by p21 Cip1 and p27 Kip1 (37). To overcome the arrest imposed by p27 Kip1 , K cyclin promotes the cdk6-dependent phosphorylation of p27 Kip1 on threonine 187, thereby stimulating p27 Kip1 degradation (11, 22). The phosphorylation-resistant T187A mutant of p27 Kip1 is able to restrict cell cycle progression even in the presence of K cyclin (22, 37). These data indicate that K cyclin expression provides conditions that are permissive for cyclin/cdk2 activation by eliminating p27 Kip1 and that the viral cyclin must facilitate the activation of endogenous cyclin/cdk complexes to enable cell cycle progression (21, 34).

To further dissect the properties of the viral cyclin and shed additional light on the control of cdk inhibitors in vivo, we addressed the mechanism by which K cyclin can bypass the G1 arrest imposed by p21 Cip1 , given that this cdk inhibitor, like p27 Kip1 , can inhibit the G1-specific cyclin/cdk holoenzymes. Our results demonstrate that K cyclin/cdk6 can phosphorylate p21 Cip1 on serine 130 (S130) in vitro and in vivo and that this phosphorylation is essential for K cyclin-mediated release of a p21 Cip1 -imposed G1 arrest. Also, we show that K cyclin expression enabled S-phase entry under oxidative stress-induced cell cycle arrest resulting from elevated levels of p21 Cip1 . This was associated with p21 Cip1 phosphorylation and partial restoration of cdk2 kinase activity.


Activation of cyclin-dependent kinases CDC2 and CDK2 in hepatocellular carcinoma

*Randy Y.C. Poon, Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong, Tel: 85223588703. Fax: 85223581552. e-mail: [email protected] Search for more papers by this author

Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong,

Department of Pathology, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, Hong Kong,

Department of Surgery, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, Hong Kong,

Department of Medicine, Hennepin County Medical Center, Minneapolis, Minnesota 55415, USA,

Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Kanazawa University, 13-1, Takara-machi, Kanazawa 920-0934, Japan

Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong,

*Randy Y.C. Poon, Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong, Tel: 85223588703. Fax: 85223581552. e-mail: [email protected] Search for more papers by this author

Resumo

Resumo: Fundo: The cyclin-dependent kinases (CDKs) CDC2 and CDK2 are key regulators of the cell cycle. The expression of the CDK alone does not necessary reflect their true activities because they are highly regulated by post-translational mechanisms. Human hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers in the world, but the kinase activities of CDKs in HCC have not been examined.

Métodos: Here we examined the protein expression and kinase activities associated with CDC2 and CDK2 in HCC and the corresponding non-tumorous liver tissues.

Resultados: CDC2 and CDK2 are activated in HCC in over 70% and 80% of the cases, respectively, but have little correlation with clinical parameters and PCNA expression. Interestingly, PCNA was readily detectable in extracts from non-tumorous liver, but more than 60% of samples contain higher concentration of PCNA in HCC than the corresponding non-tumorous tissues. CDC2 and CDK2 are generally activated in the same HCC samples, but the extent of their activation varied significantly, suggesting that the pathways leading to the activation of CDC2 and CDK2 can be regulated independently. Both positive regulators of CDK activity like cyclins and CDKs, and negative regulators of CDK activity like p21 CIP1/WAF1 and Thr14/Tyr15 phosphorylation were up-regulated in HCC. Conclusão: CDC2 and CDK2 are activated in HCC, and this may be due to a complex interplay between the level of the cyclin, CDK, CDK inhibitors, and inhibitory phosphorylation.


Assista o vídeo: Controle do Ciclo Celular HD Animation Legendado (Dezembro 2021).