Em formação

1.10: Avaliação da ligação de antibióticos à albumina sérica usando espectroscopia de fluorescência - Biologia


10.1 Objetivos de aprendizagem

Neste laboratório, você estudará uma das funções mais importantes das proteínas. Este laboratório concentra-se na principal proteína extracelular da corrente sanguínea, a albumina do soro humano. Para estudar a ligação, escolhemos uma medição óptica sensível, a fluorescência. Você usará a riqueza de dados dessa técnica sensível para estudar os detalhes da ligação do antibiótico à albumina.

10.2 Papel biológico da albumina sérica

A albumina é a principal proteína circulante na corrente sanguínea, compreendendo cerca de metade da proteína sérica total. Sua estrutura contém muitos bolsões hidrofóbicos que se ligam a uma variedade de moléculas biológicas. Seguem vários exemplos:

  • Quando os glóbulos vermelhos morrem e lisam, o excesso do heme é liberado. A albumina se liga a esse excesso removendo-o da corrente sanguínea.
  • Hormônios hidrofóbicos, como as tiroxinas ou esteróides, geralmente são ligados pela albumina.
  • Muitos medicamentos aniônicos hidrofóbicos se ligam à albumina. Essa ligação tem um grande impacto na eficácia dos medicamentos. Esta ligação pode retardar a distribuição do medicamento aos tecidos, reduzir a depuração do medicamento e causar uma perda geral da eficácia do medicamento. As interações entre as drogas também são mediadas pela albumina sérica. Por exemplo, um medicamento pode causar um aumento na disponibilidade de um segundo medicamento (assim, aumentando a dose efetiva do medicamento) se os medicamentos competirem pelo mesmo local de ligação da albumina sérica.

Durante este laboratório, você irá determinar a afinidade de ligação entre a albumina e um antibiótico comum, a levofloxacina (Levaquin®).

10.3 Antibióticos Fluoroquinolina

Levofloxacin (Levaquin®) é um membro da classe de antibióticos fluoroquinolina. Essas drogas são conhecidas há cerca de 50 anos, mas os derivados especialmente eficazes não estavam amplamente disponíveis até a década de 1980. Estas são fluoroquinolinas de “segunda geração” e incluem os medicamentos comuns, ciprofloxacina (Cipro®) e ofloxacina (Floxin®).

A levofloxacina (Levaquin®) é uma fluoroquinolona de “terceira geração” e é simplesmente o isômero biologicamente ativo da ofloxacina (uma mistura racêmica).

As fluoroquinolonas possuem sítio de ação único, inibindo a DNA girase bacteriana (topoisomerase tipo II) e topoisomerase IV. Essas enzimas desenrolam o DNA e são necessárias para a replicação do DNA. As fluoroquinolinas bloqueiam o desenrolamento do DNA e, portanto, bloqueiam a replicação bacteriana. Eles são mais eficazes contra bactérias Gram-negativas, embora os medicamentos de última geração também sejam eficazes contra algumas bactérias Gram-positivas e anaeróbias.

10.4 Estrutura da proteína, aminoácidos aromáticos e fluorescência

As proteínas são polímeros de aminoácidos. As cadeias laterais de aminoácidos (grupos R) são principalmente responsáveis ​​pelas propriedades únicas de cada proteína. Por exemplo, se uma proteína tem muitos aminoácidos com cadeias laterais de alquila, então a proteína é relativamente hidrofóbica. Ou, se a proteína tiver muitos aminoácidos com cadeias laterais contendo carboxilato, então a proteína tende a ser carregada negativamente.

Os aminoácidos aromáticos, fenilalanina, tirosina e triptofano, contribuem para a propriedade única das proteínas, a fluorescência. Fluorescência é um processo pelo qual uma molécula absorve luz e emite a luz novamente (normalmente em um comprimento de onda mais longo; Fig. 10.1).

Os aminoácidos aromáticos têm um pico de absorbância entre 260 nm a 290 nm. Eles emitem luz no máximo de cerca de 290 nm a cerca de 350 nm.

10.5 Medindo Fluorescência

Para medir a fluorescência, você sempre define dois comprimentos de onda, o comprimento de onda da luz que irradia a amostra (a excitação ou absorbância λ) e o comprimento de onda da luz emitida a ser medida (emissão λ). Para varrer um espectro de emissão, a absorbância / excitação λ é fixada e um monocromador varre os comprimentos de onda de emissão (Fig. 10.2).

Para varrer um espectro de excitação, a emissão λ é fixada e um monocromador varre comprimentos de onda de luz que irradiam a amostra (Fig. 10.3).

As moléculas fluorescentes, como os aminoácidos aromáticos, têm espectros de emissão e excitação característicos - esses espectros podem servir para identificar moléculas. Por exemplo, as formas dos picos, bem como os comprimentos de onda dos picos, são características de moléculas específicas. O triptofano tem um pico de emissão amplo em cerca de 350 nm, enquanto a tirosina tem um pico de emissão estreito em cerca de 305 nm. A diferença de comprimento de onda entre excitação e emissão também é característica. Dependendo dos níveis de energia eletrônica de uma molécula, a diferença entre a excitação e a emissão pode ser grande (muita energia é perdida antes que a luz seja emitida) ou pequena (pouca energia é perdida antes que a luz seja emitida). Por exemplo, o triptofano tem cerca de 60 nm de diferença entre a excitação e o comprimento de onda de emissão, enquanto a tirosina tem apenas cerca de 15 nm de diferença (Fig. 10.4) O triptofano perde mais energia antes da emissão, enquanto a tirosina perde menos.

10.6 Espectroscopia Síncrona

A espectroscopia síncrona seleciona fluoróforos com uma diferença de energia especificada entre a excitação e a emissão. Esta técnica depende da manutenção de uma diferença constante entre o comprimento de onda de excitação e o comprimento de onda de emissão. O monocromador de excitação faz a varredura dos comprimentos de onda simultaneamente e na mesma velocidade do monocromador de emissão. Uma vez que os monocromadores são sincronizados entre si (espectroscopia síncrona), um Δλ constante é mantido. Usar um Δλ = 15 nm significa que o espectrofluorômetro é sensível a grupos que fluorescem luz após uma pequena mudança no comprimento de onda, ou seja, tirosina. Definir um Δλ = 60 nm permite que o espectrofluorômetro "veja" grupos que fluorescem a luz após uma grande mudança no comprimento de onda, ou seja, triptofano. Ao definir um determinado Δλ, o espectrofluorômetro é capaz de monitorar aminoácidos específicos selecionados.

10.7 Análise de dados

O objetivo deste laboratório é monitorar a ligação da levofloxacina à albumina.

A ligação da levofloxacina é proporcional à alteração da fluorescência. Como a fluorescência diminui, a mudança é chamada de extinção de fluorescência. Para medir a ligação de levofloxacina pela albumina em função da concentração de levofloxacina, precisamos traçar a extinção de fluorescência versus a concentração de levofloxacina na cubeta. Em geral, a ligação entre uma proteína (P) e um ligante (L) se encaixa na seguinte equação:

P + L PL

Onde

Na maioria dos experimentos, [L] (o independente variável) é variada e [PL], o dependente variável, é medido. A Equação 1 é reorganizada algebricamente para colocar a variável dependente à esquerda e a variável independente à direita. Observe que a Equação 2 tem a mesma forma que a equação de Michaelis-Menten (Fig. 10.5).

e

É importante reconhecer que a constante de dissociação, KD, é numericamente igual ao [L] que produz Então, o KD pode ser determinado a partir de ambos os gráficos. Desde a extinção de fluorescência é igual a ,

Esta equação é análoga à Equação 3 e leva a um gráfico como mostrado em Fig. 10.6.

Este gráfico é semelhante aos dois gráficos que você criou para suas titulações. No entanto, não é o mesmo. Este gráfico representa o gráfico gratuitamente [levafloxacina], que é a [levafloxacina] total na cuvete menos a [levafloxacina] ligada à albumina. Seus dois gráficos representaram o total [levafloxacina] na cubeta. Suas concentrações devem ser corrigidas antes que uma constante de equilíbrio possa ser calculada. Após o rearranjo e substituição da Equação 4, a Equação 5 é derivada:

A Equação 6 permite o cálculo de KD. Além disso, esta equação é definida de forma linear usando a equação declive-interceptação, y = m x + b. Observe que esta equação usa Flinicial, ΔFl e Fl. A espectroscopia de fluorescência pode fornecer informações sobre as mudanças na conformação da proteína. Tanto a fluorescência da tirosina quanto do triptofano são deslocadas para o azul, se os aminoácidos se movem para um ambiente mais hidrofóbico (não polar) e deslocadas para o vermelho se os aminoácidos se movem para um ambiente mais hidrofílico (polar) (Fig. 10.7).

Observe a mudança no pico λ quando mais levofloxacina é adicionada para a Titulação # 1 e a Titulação # 2. O que você pode concluir sobre as mudanças no ambiente em torno dos fluoróforos?

PROCEDIMENTOS

As necessidades de reagentes e equipamentos são calculadas por seis equipes de alunos. Há uma franquia de ~ 20% incluída.

Equipamento / vidraria necessários:

  1. Três conjuntos de micropipetas 20-100 μl, 2-20 μl e 1-10 μl
  2. cubeta padrão para um espectrofluorômetro

Reagentes necessários:

  1. 10 ml de levofloxacina 0,014 M em tris 0,05 M, pH = 7,0
  2. 100 ml de 1 × 10-5 Albumina sérica M em tris 0,05 M, pH = 7,0

Procedimento experimental:

Titulação # 1:

  1. Defina o espectrofluorômetro para Δλ = 15 nm.
  2. Pipetar 2,0 ml de albumina de soro bovino (1 × 10-5 M; 0,05 M tris, pH = 7,0) na cuvete de fluorescência. Medir espectros síncronos de 250 nm a 450 nm.
  3. Adicionar 1 μl de levofloxacina 0,014 M (tris 0,05 M, pH = 7,0). Medir espectros síncronos de 250 nm a 450 nm.
  4. Repita as adições de levofloxacina seguidas por medições fluorescentes síncronas mais duas vezes.
  5. Adicionar 2 μl de levofloxacina 0,014 M. Medir espectros síncronos de 250 nm a 450 nm.
  6. Repita as adições de levofloxacina seguidas por medições fluorescentes síncronas mais quatro vezes.
  7. Você deve ter oito espectros diferentes neste ponto. Plote os dados da seguinte forma:
    1. Crie uma sobreposição de todos os espectros.
    2. Registre a fluorescência em uma excitação λ = 287 nm para cada espectro.
    3. Imprimir espectros de sobreposição.
  8. Enxágüe a cubeta cuidadosamente com água destilada. A solução de albumina pode ser descartada na pia.

Titulação # 2:

  1. Repita o mesmo procedimento, mas defina o espectrofluorômetro para Δλ = 60 nm.
  2. Enxágue a cubeta cuidadosamente com água destilada. A solução de albumina pode ser descartada na pia.

Análise de dados:

1. Calcule a extinção de fluorescência:

Observe que a extinção de fluorescência varia de 0 a 1.

2. Calcule a concentração de levofloxacina na cubeta; [levofloxacina]cuvete para cada adição. Lembre-se de que a levofloxacina é diluído quando adicionado à cubeta. Você precisa usar a equação de diluição, M1V1 = M2V2, onde M1 = concentração de estoque de levofloxacina, V1 = volume total de levofloxacina adicionado à cubeta, M2 = a concentração de levofloxacina na cubeta, e V2 = o volume total na cubeta.

3. Plote a extinção de fluorescência versus [levofloxacina]cuvete para Titulação # 1 e Titulação # 2.

4. Determine KD valores para Titulação # 1 e Titulação # 2 como segue.

uma. Enredo contra [Levofloxacino]curveta para Titulação # 1 e Titulação # 2. Observe que estamos usando a forma linear do KD equação (ver Equação 5).

b. KD = deste gráfico.

Notas para o instrutor

O experimento do Capítulo 10 usa a versatilidade de um espectrofluorômetro de nível de pesquisa. O espectrofluorômetro fornece uma visão completa das mudanças espectrais observadas. Os alunos medem espectros completos e, em seguida, analisam a fluorescência em comprimentos de onda específicos. A espectroscopia síncrona é possível com esse espectrofluorômetro. Um fluorômetro mais básico com filtros em vez de monocromadores também pode ser usado. Neste caso, o aluno deve receber os espectros pertinentes.

Esboço do relatório de laboratório e distribuição de pontos

Introdução

  1. Várias frases definindo o objetivo / propósito deste experimento. (2 pontos)

Dados

  1. Uma tabela relatando a fluorescência como uma função do volume total de solução de levofloxacina adicionada para a titulação # 1. (2 pontos)
  2. Uma tabela relatando os mesmos dados da Titulação # 2. (2 pontos)

Resultados

  1. Um exemplo do cálculo que você usou para encontrar as concentrações de levofloxacina na cubeta. (2 pontos)
  2. Quatro parcelas:
    1. Têmpera fluorescente vs. [levofloxacina]cuvete para titulação nº 1 e nº 2. (4 pontos cada)
    2. vs. [levofloxacina]cuvete para titulação nº 1 e nº 2. Determine o KD de cada parcela. (5 pontos cada)

Análise

  1. Acesse os espectros de excitação e emissão de fluorescência para fenilalanina, tirosina e triptofano usando a Internet. Responda às quatro perguntas a seguir. (8 pontos)
    1. Estime os comprimentos de onda de pico para absorção (em λ> 230 nm) e emissão (em λ> 250 nm) para cada aminoácido.
    2. Como os comprimentos de onda de absorção de pico estão relacionados aos comprimentos de onda de emissão de pico? Por exemplo, a luz emitida está com energia mais baixa ou mais alta do que a luz absorvida? Explique brevemente.
    3. Qual aminoácido mostra a maior mudança de energia da absorção à emissão? Explique seu raciocínio.
    4. Classifique esses três aminoácidos do mais fluorescente ao menos fluorescente. Explique resumidamente seu raciocínio.
  2. Identifique a titulação (Δλ = 15 nm ou Δλ = 60 nm) que monitora a fluorescência da tirosina e a titulação que monitora a fluorescência do triptofano. Qual aminoácido é responsável pela maior parte da fluorescência da albumina? Explique brevemente. Qual aminoácido é mais neutralizado pela ligação da levofloxacina? Explique brevemente. (6 pontos)
  3. Há evidências de uma alteração na conformação da albumina causada pela ligação da levofloxacina? Se houver evidência de uma mudança de conformação, as tirosinas estão mudando seu ambiente (tornando-se mais expostas ao solvente ou mais enterradas no interior da proteína)? Responda a mesma pergunta para os triptofanos. Explique resumidamente sendo o mais específico possível. (10 pontos)


Assista o vídeo: RESISTENCIA BACTERIANA (Dezembro 2021).