Em formação

Quando devo usar a criofixação e a fixação química?


Sabemos que a técnica utilizada na preparação de amostras TEM envolve várias etapas, uma das mais importantes delas é a fixação.

A fixação pode ser de dois tipos:

  1. Criofixação, que sugere que os espécimes são submetidos à temperatura de congelamento para preservar o material vivo da célula antes de observá-los.

  2. A fixação química envolve o uso de certos produtos químicos, como formalina, glutaraldeído, etc. para quase o mesmo propósito.

A questão é quando é obrigatório usar apenas um deles? Por exemplo, criofixação ou química? Em alguns casos, os pesquisadores já precisaram usar as duas técnicas ao mesmo tempo?


A criofixação geralmente preserva melhor as organelas dentro das células, mas é mais trabalhosa e geralmente resulta em imagens TEM com menor contraste. A fixação química é mais fácil e oferece bom contraste, mas é mais provável que destrua detalhes em amostras delicadas. A fixação química geralmente será usada a menos que seja descoberto ou esperado que não funcione bem para uma amostra particular. É possível misturar os métodos, por exemplo, incluindo glutaraldeído em soluções de substituição por congelamento. Aqui está um artigo que descreve tudo o que você perguntou em mais detalhes, se você puder acessá-lo: Uma comparação entre a fixação crio e química no solo algas verdes Jaagiella


Um único método para criofixação e luz correlativa, microscopia eletrônica e tomografia de embriões de peixe-zebra

O peixe-zebra é um poderoso sistema de vertebrados para estudos celulares e de desenvolvimento. Neste estudo, otimizamos métodos para congelamento rápido e processamento de embriões de peixe-zebra para microscopia eletrônica (EM). Mostramos que, na ausência de fixação química primária, excelente ultraestrutura, preservação da fluorescência da proteína fluorescente verde (GFP), marcação imunogold e tomografia eletrônica podem ser obtidas usando uma única técnica envolvendo congelamento de alta pressão e incorporação em resinas Lowicryl em baixa temperatura. Além de ser uma nova ferramenta importante para a pesquisa do peixe-zebra, a manutenção da fluorescência GFP após o congelamento rápido, substituição por congelamento e incorporação de resina será de uso geral para luz correlativa e EM de amostras biológicas.

O peixe-zebra é um excelente sistema modelo para a biologia celular e do desenvolvimento. Além do poder deste sistema de vertebrados para a triagem genética 1, 2, a transparência do embrião do peixe-zebra o tornou um sistema ideal para microscopia de luz que tem sido usado com todas as vantagens para estudar processos morfogenéticos durante o desenvolvimento. As triagens genéticas estão agora sendo cada vez mais complementadas por abordagens genéticas reversas, particularmente envolvendo abordagens baseadas em morfolino 3, mas mais recentemente usando uma abordagem baseada em nuclease de dedo de zinco poderosa 4, 5. Embriões de peixe-zebra também são ideais para estudos de microscopia eletrônica (EM). Uma seção transversal de um embrião de 72 h pode ser facilmente contida em uma única seção EM, mas pode conter vários tipos de células e tecidos diferentes. No entanto, os métodos convencionais de EM não fornecem preservação ideal de todos os tecidos e geralmente são incompatíveis com a imunomarcação e visualização de proteínas expressas com marcação fluorescente. Uma exceção a isso é o método de corte congelado Tokuyasu, mas a ausência de uma resina 6, embora forneça excelente detecção de antígeno, é menos adequada para a preservação de grandes estruturas cheias de fluido, como a notocorda do embrião de peixe-zebra, uma estrutura crucial e estrutura de sinalização.

Até recentemente, a maioria das análises EM do peixe-zebra foi realizada usando técnicas padrão que envolvem fixação química. Neste estudo, objetivamos desenvolver uma técnica que evitasse a fixação química, o que nos permitiu usar o poder da proteína fluorescente verde (GFP) como um marcador fluorescente para microscopia de luz, ao mesmo tempo que nos permitiu correlacionar observações microscópicas de luz com imunogold EM em as mesmas seções. Idealmente, essa técnica também nos permitiria realizar tomografia eletrônica tridimensional (3D) nas mesmas seções. Nós agora descrevemos um método para o congelamento de alta pressão do embrião de peixe-zebra que preenche esses critérios. O método descrito fornece uma ultraestrutura melhorada em relação aos métodos convencionais. Mais importante ainda, com este método, mostramos que a fluorescência de GFP ainda é mantida após a substituição por congelamento (FS) e a incorporação de Lowicryl de embriões congelados de alta pressão (HPF). Bem como a detecção de proteínas marcadas com GFP, os antígenos endógenos podem ser rotulados 'na seção' para detecção de microscopia de luz e imunogold rotulados para detecção de EM nas mesmas seções. Além disso, essas seções podem ser usadas para tomografia eletrônica.


Preparação de amostra TEM

Para microscopia eletrônica de transmissão de rotina (TEM), é geralmente aceito que as amostras devem ser finas, secas e conter moléculas que difratam elétrons. As amostras biológicas, que são grandes e consistem em grandes quantidades de água, também não descompactam elétrons e, portanto, são difíceis de ver no TEM. Preparar espécimes biológicos para o TEM, mantendo a morfologia estrutural do material, é um desafio. No entanto, os pesquisadores examinam o material biológico há muitos anos e existem muitos protocolos que nos permitem examinar o material biológico de muitas maneiras diferentes. Abaixo está um breve esboço de algumas das maneiras mais comuns de olhar para amostras biológicas no TEM.

Montagens inteiras

Objetos pequenos ou muito finos podem ser examinados diretamente montando-os em um filme de suporte e introduzindo-os diretamente no feixe de elétrons. O contraste é fornecido pela precipitação de metais pesados ​​de uma das três maneiras.

  1. Coloração positiva: o objeto é quimicamente tingido com uma solução de sal metálico e aparece escuro em um fundo claro.
  2. Coloração negativa: o objeto permanece sem coloração, mas está embutido em uma película seca do sal de metal pesado. A amostra parece clara em um fundo escuro. Este método de visualização foi usado extensivamente no estudo de partículas de vírus, mas também é útil para frações celulares (por exemplo, vesículas revestidas). Mais detalhes podem ser encontrados aqui.
  3. Sombreamento: Uma fina camada de átomos de metal pesado é depositada na amostra por evaporação em uma câmara de vácuo. O sombreamento de uma direção produz apenas uma imagem pseudo-tridimensional. O sombreamento rotativo, onde o espécime é uniformemente revestido com metal pesado, é usado para visualizar ácidos nucléicos e proteínas.

Corte ultrafino

A técnica mais popular para examinar materiais biológicos é embutir o material em estudo em plástico e cortar seções ultrafinas que podem ser examinadas em um TEM. O material é estabilizado por fixação química (geralmente com aldeídos como formaldeído ou gluteraldeído), contrastado com soluções de sais de metais pesados ​​(tetróxido de ósmio e acetato de uranila), desidratado em etanol ou acetona e embutido em plástico (resina epóxi). Seções ultrafinas (60 nm) cortadas com facas de vidro ou diamante usando um ultramicrótomo são flutuadas na água, transferidas para grades de suporte de amostra e examinadas no TEM. Freqüentemente, as seções são contrastadas com acetato de uranila e citrato de chumbo antes do exame ao microscópio.

Em alguns casos, as macromoléculas podem ser especificamente rotuladas antes da incorporação e do seccionamento. Por exemplo, a localização de algumas enzimas pode ser visualizada incubando o tecido com um substrato cuja reação com a enzima leva à deposição local de material opaco de elétrons. Alternativamente, os anticorpos podem ser acoplados a tais enzimas, e o produto da reação opaca do elétron é usado para localizar os antígenos reconhecidos pelos anticorpos. Algumas resinas de incorporação (por exemplo, resinas Lowicryl e resina LR White) foram projetadas para permitir que anticorpos e marcadores opacos de elétrons (como partículas de ouro coloidal) sejam aplicados às seções ultrafinas. Desta forma, os antígenos subcelulares reconhecidos pelos anticorpos podem ser localizados com o TEM.

Outra técnica de corte que está ganhando popularidade é o criossecionamento (o corte de material vitrificado e congelado). Após a fixação química, o tecido é imerso em crio-protetor (geralmente sacarose) e então rapidamente congelado em nitrogênio líquido. O crioprotetor permite que o material biológico seja congelado sem a formação de cristais de gelo, o que danificaria a ultraestrutura. Este tipo de congelamento, ou vitrificação, é possível na ausência de crio-protetores, mas é tecnicamente exigente. As seções cortadas do bloco vitrificado podem ser descongeladas e incubadas com anticorpos específicos para antígenos subcelulares. Os marcadores opacos de elétrons permitem que os anticorpos sejam vistos no TEM.

O ouro coloidal acoplado à proteína A (uma proteína das paredes das células bacterianas que se liga à porção Fc de algumas imunoglobulinas) tem sido amplamente utilizado nos últimos anos para localizar anticorpos na resina e em seções congeladas de materiais biológicos. A capacidade de produzir populações homogêneas de ouro coloidal com diferentes tamanhos de partículas permitiu aos pesquisadores usar essas sondas para colocar diferentes estruturas na mesma seção.

Criofixação

É possível congelar material biológico rápido o suficiente para vitrificar a água presente no interior das células. A vitrificação da água ocorre quando o congelamento ocorre tão rápido que os cristais de gelo não têm tempo para se formar. O material biológico vitrificado pode ser seccionado a baixas temperaturas. Filmes finos de água vitrificada e seções de material vitrificado podem ser examinados em microscópios eletrônicos de transmissão equipados com estágios de amostra que podem ser mantidos frios.

Métodos de congelamento rápido

Existem sete métodos principais de congelamento rápido atualmente disponíveis. Eles são:

  1. congelamento por imersão - a amostra é mergulhada no criogênio.
  2. Congelamento de batida (ou espelho de metal) - a amostra é impactada em uma superfície de metal polida resfriada com nitrogênio líquido ou hélio.
  3. congelamento de bloco a frio - dois blocos de metal polido e frio presos às mandíbulas de um alicate para congelar o espécime.
  4. congelamento por spray - um spray fino de amostra em suspensão líquida é injetado no criogênio (geralmente propano líquido).
  5. congelamento por jato - um jato de criogênio líquido é pulverizado sobre a amostra. - congelar a amostra em alta pressão para sub-resfriar a água.
  6. congelamento por excisão - uma agulha fria é mergulhada na amostra, simultaneamente congelando e dissecando a amostra.

Fratura por congelamento seguida de corrosão por congelamento e replicação

Se, por algum motivo, o objeto a ser estudado não puder ser examinado no TEM, então uma réplica fina pode ser feita. Isso geralmente é feito evaporando uma fina camada de um metal pesado (geralmente platina) sobre a amostra e, em seguida, revestindo-a com uma fina camada de carbono. O objeto e a réplica são separados flutuando na réplica ou digerindo o objeto. Existem quatro etapas básicas a seguir

  1. A amostra é congelada (geralmente sem levar em conta a vitrificação).
  2. A amostra está fraturada, enquanto ainda congelada, sob vácuo.
  3. A amostra fraturada pode então ser gravada, deixando-a congelada e sob vácuo. Dependendo do tempo de exposição, mais ou menos água sublima da amostra (liofilização).
  4. É feita uma réplica da superfície fraturada que é então examinada ao microscópio eletrônico.

Uma modificação recente deste método emprega o congelamento rápido obtido por células de choque contra um bloco de cobre resfriado a -269 ° C com hélio líquido. Se essas células congeladas forem então expostas a extensa liofilização (ataque profundo), imagens muito impressionantes das estruturas internas das células são descobertas.


Agentes de fixação

Existem vários reagentes que podem ser usados ​​para fixar tecidos. O formaldeído, de longe o agente mais popular usado para histopatologia, e o glutaraldeído, amplamente usado para estudos ultraestruturais que requerem microscopia eletrônica, são descritos aqui. Outros reagentes são discutidos na Parte 3.

Formaldeído: Formaldeído (CH2O) é o único aldeído gasoso e é dissolvido em água até a saturação a 37% - 40% p / v. Esta solução é geralmente referida como “formalina” ou “solução concentrada de formaldeído”. Para a fixação, uma parte de formalina é geralmente diluída com nove partes de água ou tampão. Isso produz uma solução de formalina a 10% que contém cerca de 4% de formaldeído p / v, uma concentração ideal para fixação. Em soluções concentradas, o formaldeído existe como seu monohidrato de metileno glicol e como hidratos poliméricos de baixo peso molecular. Na sua forma diluída, o monohidrato predomina. O paraformaldeído, uma forma altamente polimerizada de formaldeído, pode ser depositado como um precipitado branco em soluções concentradas de formaldeído. Para evitar isso, pequenas quantidades de metanol (até 15%) são comumente adicionadas às soluções patenteadas. O paraformaldeído pode ser adquirido como um pó seco e usado para preparar soluções de formaldeído altamente puras, como as necessárias para a microscopia eletrônica. 2, 3

A formalina sem tamponamento oxidará lentamente em ácido fórmico, resultando em uma queda no pH. Sob essas condições, o ácido fórmico irá reagir com a hemoglobina formando hematina de formaldeído ácido, um pigmento granular marrom-escuro que é depositado em tecidos ricos em sangue. Este pigmento é um incômodo, pois pode ser confundido com microorganismos ou outros pigmentos patológicos. 4 Embora o pigmento possa ser removido das seções com ácido pícrico aquoso saturado antes da coloração, é preferível evitar sua formação em primeiro lugar. Por esta razão e porque o formaldeído reage mais eficazmente a um pH neutro, as soluções de formalina a 10% são normalmente tamponadas a pH 6,8 - 7,2.

Figura 2: Uma seção de rim em parafina fixada em formalina mostrando a deposição típica de hematina ácida de formaldeído (pigmento de formalina) associada a glóbulos vermelhos. O pigmento varia de marrom a preto e é birrefringente sob luz polarizada. Neste caso, a amostra permaneceu no fixador por um longo período antes do processamento.

O formaldeído reage com as cadeias laterais das proteínas para formar grupos hidroximetil reativos. Pode penetrar nas proteínas nucleares e nos ácidos nucléicos, estabilizando o invólucro ácido nucléico-proteína e modificando os nucleotídeos ao reagir com grupos amino livres. O formaldeído pode reagir com alguns grupos em lipídios insaturados, particularmente se os íons de cálcio estiverem presentes, mas tende a não reagir com carboidratos. 5 O formaldeído pode reagir com grupos de lisina, arginina, cisteína, tirosina, treonina, serina e glutamina formando complexos reativos que podem se combinar formando pontes de metileno (ligações cruzadas) ou com grupos de hidrogênio. 5 É amplamente aceito que a lavagem de tecidos após a fixação com formalina pode reverter algumas dessas reações, mas ligações cruzadas importantes permanecem. 6 É a capacidade do formaldeído de preservar os peptídeos de proteínas celulares que o tornaram tão útil como um fixador de uso geral.

Existem perigos bem conhecidos associados ao uso de formaldeído como fixador através do contato com a pele ou com os olhos ou via respiratória. É irritante, corrosivo e pode causar sensibilização alérgica. A partir de 1981, o formaldeído foi listado como “razoavelmente antecipado para ser um cancerígeno humano” e em 2011 a lista foi atualizada para “sabidamente um cancerígeno humano”. 7, 8 Estudos mostraram que o formaldeído causa câncer nasofarangeano, câncer nasossinusal e leucemia mieloide. Por essas razões, na maioria dos países, existem diretrizes rígidas para limitar a exposição dos trabalhadores ao formaldeído no local de trabalho. Por exemplo, nos EUA, o limite de exposição permissível OSHA (PEL) é de 0,75 ppm (8 horas TWA) e um limite de exposição de curto prazo (STEL) de 2 ppm (exposição de 15 minutos) e essas recomendações são apoiadas por um programa de monitoramento regular. Em um laboratório bem equipado com equipamento moderno de extração de fumaça, esses níveis-alvo não devem ser excedidos. 9, 10

Apesar dos riscos do uso de formaldeído, a maioria dos morfologistas construiu seu conhecimento sobre tecidos normais e doentes observando espécimes fixados em formalina. Como agora estamos cientes dos riscos tóxicos desse reagente, muitos laboratórios buscaram e continuam buscando uma alternativa mais segura. No entanto, as alternativas à formalina são geralmente julgadas por sua capacidade de produzir uma imagem morfológica semelhante, senão melhor do que a produzida pela formalina e permitir uma gama completa de métodos de coloração, incluindo métodos moleculares, e ser igualmente baratos. A maioria dos laboratórios continua a usar formalina porque não consegue encontrar um substituto completamente satisfatório, por isso é importante que a equipe esteja ciente dos riscos envolvidos. Algumas alternativas ao formaldeído são discutidas na Parte 3.

Glutaraldeído: Glutaraldeído ou dialdeído glutárico (CHO (CH2)3CHO) É considerado um aldeído bifuncional, possuindo grupos aldeído em cada extremidade da molécula que têm o potencial de reagir com os mesmos grupos químicos que o formaldeído. Eles formarão compostos de adição e pontes de metileno, mas também uma única molécula de glutaraldeído pode formar ligações cruzadas diretas se o arranjo estérico de peptídeos adjacentes permitir. Os grupos amino da lisina são particularmente importantes a este respeito. O tecido fixado em glutaraldeído será mais extensivamente reticulado do que o tecido fixado em formalina e também possuirá alguns grupos aldeído não reagidos que, a menos que quimicamente bloqueados, podem causar coloração de fundo em métodos como o PAS. A extensa reticulação afeta adversamente a coloração imuno-histoquímica, mas fornece excelente preservação ultraestrutural, o que explica seu amplo uso como fixador primário para microscopia eletrônica. As reações de reticulação do glutaraldeído são amplamente irreversíveis. O glutaraldeído penetra muito lentamente e é recomendado que o tecido tenha menos de 1 mm de espessura em pelo menos uma dimensão. 5, 11

O glutaraldeído se decompõe lentamente para formar ácido glutárico e também se polimeriza para formar compostos cíclicos e oligoméricos. O glutaraldeído é, portanto, melhor obtido em ampolas seladas em uma forma conveniente "estabilizada para microscopia eletrônica" e isso pode ser adicionado a um tampão adequado em pH 7,2 - 7,4 (geralmente cacodilato, fosfato ou maleato) para produzir uma concentração de glutaraldeído de 3% para uso. Para microscopia eletrônica, a fixação primária de glutaraldeído é comumente seguida pela fixação secundária em tetróxido de ósmio. O glutaraldeído não é normalmente usado para histopatologia de rotina. 11


Esfregaço ou células: preparação e fixação

Antes da coloração, fixe o material a ser observado sobre a lâmina. Se a preparação não for fixada ou colada na lâmina, as células são lavadas durante o procedimento de coloração.

Preparação do esfregaço:

Coloque uma pequena gota de cultura líquida com uma alça de inoculação em uma lâmina limpa. Se a cultura for retirada de um meio sólido. Coloque uma pequena gota de água na lâmina e misture bem um pouco de cultura. Espalhe a gota na lâmina uniformemente para formar uma fina película de células. Essa fina película de células é chamada de esfregaço, que deve ser o mais uniforme possível.

Fixação de células (esfregaço) nas lâminas:

Após a preparação de um esfregaço uniforme, ele deve ser fixado ou colado sobre a lâmina. Fixação é o processo pelo qual as estruturas internas e externas das células e microrganismos são preservadas e fixadas em posição. Ele inativa enzimas naquela noite, interrompendo a morfologia celular e a resistência das estruturas celulares para que não mudem durante a coloração e observação.

Uma célula geralmente é morta e colocada em lâmina durante a observação microscópica.

A fixação da célula microbiana é feita de duas maneiras:

Fixação por calor ou fixação química. A fixação por calor é rotineiramente usada para observar procariotos. Um filme de célula é suavemente aquecido quando uma lâmina passa por uma chama. A fixação de calor preserva toda a morfologia, mas não as estruturas dentro da célula. A fixação química é usada para proteger a subestrutura celular fina e a morfologia de microorganismos grandes e delicados.

Os fixadores químicos penetram na célula e reagem com os componentes celulares, geralmente proteínas e lipídios, para torná-los inativos. A mistura fixadora comum contém etanol, ácido acético, cloreto mercúrico, formaldeído e glutaraldeído.


Referências

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Resumo

A espectrometria de massa de íons secundários de tempo de voo (TOF-SIMS) é uma ferramenta promissora para a análise química subcelular de células biológicas. No entanto, para obter informações relevantes, o método utilizado para a preparação da amostra é fundamental. Neste trabalho, utilizamos TOF-SIMS, microscopia eletrônica de varredura (SEM) e microscopia de reflexão de interferência (IRM) para estudar os efeitos de diferentes métodos de fixação e secagem na morfologia e estrutura química de células de fibroblastos humanos (hTERT) aderidas. uma superfície de silicone. Especificamente, duas técnicas de fixação (fixação química com glutaraldeído e criofixação por imersão de congelamento) e duas técnicas de secagem (liofilização e secagem por substituição de álcool) foram investigadas. A criofixação seguida por liofilização foi determinada para produzir células secas com morfologia celular preservada, membranas celulares intactas e gradientes de concentração de íons sódio / potássio retidos através da membrana plasmática. Ao lavar as amostras em uma solução aquosa de formato de amônio (AF) antes da criofixação, o acúmulo de sais na superfície da amostra durante a secagem pode ser suprimido. As medições de IRM mostraram que a morfologia celular foi preservada durante a lavagem com formato de amônio, embora tenha ocorrido algum inchaço. Em comparação com a criofixação, as células fixadas com glutaraldeído mostraram estruturas mais finas na superfície celular em MEV e distribuições de lipídios semelhantes em TOF-SIMS, mas os gradientes de íon sódio / potássio não foram retidos. A secagem com álcool foi determinada para remover os fosfolipídios da membrana celular significativamente, embora o uso de tetróxido de ósmio como um pós-fixador tenha mostrado diminuir esse efeito.


Resumo

A espectrometria de massa de íons secundários de tempo de voo (TOF-SIMS) é uma ferramenta promissora para a análise química subcelular de células biológicas. No entanto, para obter informações relevantes, o método utilizado para a preparação da amostra é fundamental. Neste trabalho, usamos TOF-SIMS, microscopia eletrônica de varredura (SEM) e microscopia de reflexão de interferência (IRM) para estudar os efeitos de diferentes métodos de fixação e secagem na morfologia e estrutura química de células de fibroblastos humanos (hTERT) aderidas. uma superfície de silicone. Especificamente, duas técnicas de fixação (fixação química com glutaraldeído e criofixação por imersão de congelamento) e duas técnicas de secagem (liofilização e secagem por substituição de álcool) foram investigadas. A criofixação seguida por liofilização foi determinada para produzir células secas com morfologia celular preservada, membranas celulares intactas e gradientes de concentração de íons sódio / potássio retidos através da membrana plasmática. Ao lavar as amostras em uma solução aquosa de formato de amônio (AF) antes da criofixação, o acúmulo de sais na superfície da amostra durante a secagem pode ser suprimido. As medições de IRM mostraram que a morfologia celular foi preservada durante a lavagem com formato de amônio, embora tenha ocorrido algum inchaço. Em comparação com a criofixação, as células fixadas com glutaraldeído mostraram estruturas mais finas na superfície celular em MEV e distribuições lipídicas semelhantes em TOF-SIMS, mas os gradientes de íon sódio / potássio não foram retidos. A secagem com álcool foi determinada para remover os fosfolipídios da membrana celular significativamente, embora o uso de tetróxido de ósmio como um pós-fixador tenha mostrado diminuir esse efeito.


A importância da fixação

O objetivo amplo da fixação de tecidos é preservar as células e os componentes do tecido em um “estado semelhante à vida” e fazer isso de forma a permitir a preparação de cortes finos e corados. 1 É claro que, durante a fixação e as etapas que se seguem, ocorrem mudanças substanciais na composição e na aparência dos componentes celulares e teciduais, que estão muito distantes do “estado semelhante à vida” ideal. No entanto, com cuidado, podemos produzir características químicas e físicas consistentes nas seções de tecido que permitem a observação de padrões, a observação de alterações morfológicas e químicas e a realização de comparações. Essas observações nos permitem ter uma visão de um ambiente dinâmico em constante mudança “fixo” em um determinado momento 2, e podem possibilitar um diagnóstico histopatológico.

Para fins práticos, a fixação visa prevenir ou interromper os processos degenerativos que começam assim que um tecido é privado de seu suprimento sanguíneo. A autólise, que resulta na digestão do tecido por enzimas intracelulares liberadas quando as membranas das organelas se rompem, e a decomposição ou putrefação bacteriana causada por microrganismos que podem já estar presentes na amostra, são processos que devem ser evitados. A perda e a difusão de substâncias solúveis devem ser evitadas, tanto quanto possível, por precipitação ou coagulação desses componentes ou por sua reticulação com outros componentes estruturais insolúveis. Os tecidos devem ser amplamente protegidos contra os efeitos deletérios do processamento do tecido, incluindo infiltração com cera quente, mas, o que é mais importante, os tecidos devem reter a reatividade a manchas e outros reagentes, incluindo anticorpos e sondas de ácido nucleico. 1, 2

É importante perceber que um fixador irá inicialmente produzir uma série de alterações nos tecidos no que geralmente é um ambiente aquoso. Isso incluirá encolhimento, dilatação e endurecimento de vários componentes. Apesar desses efeitos iniciais, os tecidos sofrerão mudanças adicionais durante o processamento quando forem colocados em um ambiente não aquoso. 2 Por exemplo, a fixação em formalina tamponada a 10% causa inicialmente um leve inchaço nas amostras de tecido. Durante o processamento, entretanto, a amostra pode encolher de 20% a 30% de seu volume. 3 O fixador particular empregado também influenciará o grau em que os elementos individuais serão corados com vários reagentes histoquímicos e imuno-histoquímicos. 4 Portanto, o efeito total sobre os tecidos de um determinado fixador deve ser avaliado após o tecido ter sido processado, seccionado e tingido para demonstrar os elementos necessários.

Figura 1: Uma seção de parafina de rim que foi fixada com formalina tamponada neutra. Este é um exemplo de tecido bem fixado apresentando boa morfologia nuclear e citoplasmática com encolhimento mínimo mostrando membranas basais e margens celulares claramente definidas.
Figura 2: Uma seção de parafina de rim que foi fixada com formalina tamponada neutra. Este é um exemplo de tecido mal fixado mostrando morfologia nuclear e citoplasmática inferior com encolhimento excessivo e margens celulares mal definidas. Observe a vacuolização e a fragmentação do núcleo e do citoplasma das células do túbulo distal e a retração do glomérulo devido ao encolhimento.

Referências

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