Em formação

Uso de endonucleases de restrição para analisar Repetições Tandem de Número Variável (VNTRs)


O livro que estou usando afirma que “As extremidades do VNTR têm sequências conservadas. Estes podem ser facilmente cortados por endonucleases de restrição. ”

Mas as endonucleases de restrição clivam as sequências palindrômicas. Isso significa que o DNA repetido e as sequências conservadas juntas formam uma sequência palindrômica?


A situação geral em relação ao uso de endonucleases de restrição para analisar Repetições Tandem de Número Variável pode ser explicada com (ou sem) referência à ilustração abaixo.

A região original do DNA em que ocorre a inserção será, em geral, complexa (ao invés de repetida) e conservada em uma extensão razoável entre H. sapiens. A sequência conservada complexa é representada por um gradiente de cor na parte superior do diagrama para que o ponto em que a cópia original da repetição inserida possa ser identificada em diferentes indivíduos (ou alelos), A, B e C, onde, para fins de argumentação, duas, três e quatro cópias foram geradas.

A unidade de repetição individual é relativamente curta (tipicamente 10-100 bp), então é relativamente fácil encontrar locais conservados para pelo menos uma endonuclease de restrição disponível comercialmente em qualquer lado da inserção original, mas não dentro da repetição.

A matemática desse raciocínio é bastante simples, e eu forneço exercícios no site da minha universidade. No entanto, como exemplo, considere uma sequência de 4 pares de bases que é o alvo para uma enzima de restrição. Não precisa ser palíndromo, mas como a maioria das endonucleases de restrição do Tipo I, vamos escolher o GGCC. A chance de encontrar isso em qualquer tetranucleotídeo é de 1 em 256 (4x4x4x4), ou seja, deve ocorrer em qualquer trecho de DNA de 256 bp. (Claro que esta é apenas uma média do que pode ser uma distribuição normal, e a composição geral da base afetará a frequência real.)

O resultado líquido será que será possível gerar fragmentos de um tamanho geral tal que as regiões de flanco não sejam tão grandes que tornem difícil distinguir diferenças que refletem diferentes números de repetições.

E hoje?

A reação em cadeia da polimerase (PCR) pode muito bem ser usada em vez da digestão com endonuclease de restrição, uma vez que a sequência de DNA da região foi determinada, pode-se escolher posições apropriadas nas regiões flanqueadoras para gerar fragmentos de DNA para análise. Veja, por exemplo Richie et al. (1999).


Protocolos

Gregory A. Denomme PhD,. Marion E. Reid PhD, em Molecular Protocols in Transfusion Medicine, 2000

Princípio

O número variável de repetições em tandem (VNTR) e sequências de repetição em tandem curtas (STR) são trechos de DNA repetidos herdados de centenas (VNTRs) a alguns (STRs) nucleotídeos geralmente encontrados nas regiões não codificantes do genoma humano. Esses trechos de DNA mostram heterogeneidade de tamanho entre os humanos e são herdados de forma co-dominante. No teste, os iniciadores de oligonucleotídeo, flanqueando um VNTR / STR, são estendidos usando a PCR. A eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida é usada para estimar os tamanhos dos fragmentos de PCR, respectivamente VNTR e STR.


Número de Variável em Repetições Tandem

A diferença nas sequências de nucleotídeos entre humanos está entre 0,1-0,4%. Isso significa que as pessoas são mais de 99% semelhantes. Mas quando você olha ao redor da sala para seus colegas de classe, você pode ver que essa pequena diferença representa uma grande variação dentro de nossa espécie. A maior parte dessas diferenças não está nem mesmo dentro das sequências de codificação dos genes, mas está fora das regiões regulatórias que alteram a expressão desses genes. Imagine se houvesse mutações nas sequências de codificação, isso poderia ser muito prejudicial para o bem-estar do organismo. Dizemos que as sequências de codificação de genes que, em última análise, levam às proteínas têm um pressão seletiva para permanecer o mesmo. As áreas fora das sequências de codificação têm uma pressão de seleção reduzida e às vezes inexistente. Essas áreas podem sofrer mutações em sequência e até mesmo expandir ou contrair. As áreas de mudanças ou diferenças são chamadas polimórfico (muitas formas). Se você lesse um conjunto repetitivo de sequências e contasse as repetições, cometeria erros e perderia a conta. Da mesma forma, DNA
a polimerase comete erros ou gagueja em áreas de repetitividade e produz regiões polimórficas.

Um tipo de polimorfismo ocorre devido à expansão e contração dessas repetições em regiões não codificantes. Essas regiões são chamadas de repetições tandem de número variável ( VNTRs )
ou às vezes repetições curtas em tandem ( STRs ) Qualquer região ou local em um cromossomo é referido como locus (loci para plural). Os cientistas usam loci polimórficos que são conhecidos por
contêm VNTRs / STRs para diferenciar as pessoas com base em seu DNA. Isso é frequentemente usado em ciência forense ou em casos de maternidade / paternidade. Qualquer variação de um locus é referida como um alelo . Na genética padrão, muitas vezes pensamos em um alelo como uma variação do gene que resultaria em uma diferença na manifestação física desse gene. No caso de STRs, esses alelos são simplesmente uma diferença no número de https://openlab.citytech.cuny.edu/bio1-oer/repeats. Isso significa que o comprimento do DNA dentro desse locus é mais longo ou mais curto e dá origem a muitos alelos diferentes.

O FBI e as agências locais de aplicação da lei desenvolveram um banco de dados chamado Combined DNA Index System ( CoDIS ) que reúne dados sobre vários STRs. Ao estabelecer o número de repetições de um determinado locus, os encarregados da aplicação da lei podem diferenciar os indivíduos com base no comprimento de repetição desses alelos. CoDIS usa um
conjunto de 13 loci que são testados juntos. Como você pode imaginar, as pessoas tendem a ter os mesmos alelos de certos loci, especialmente se forem parentes. O uso de 13 loci diferentes torna estatisticamente improvável que duas pessoas diferentes possam ser confundidas uma com a outra. Pense nisso em termos de características físicas. À medida que você aumenta o número de características físicas usadas para descrever alguém, é menos provável que você confunda essa pessoa com outra com base nessas combinações de características. Usar os loci CoDIS aumenta o rigor, uma vez que existem muitos alelos para cada locus. O décimo terceiro locus em CoDIS (chamado AMEL) discrimina entre masculino e feminino.

CoDIS STRs: O FBI utiliza 13 locais diferentes para discriminar as pessoas. AMEL discrimina por gênero e está localizado no X e no Y.

Este laboratório usa um locus CoDIS chamado TH01. TH01 é um locus no cromossomo 11 que tem uma sequência repetitiva de TCAT. É relatado haver entre 3-14 repetições neste local. Com exceção de X e Y em um homem, todos os cromossomos têm um parceiro homólogo. Portanto, cada indivíduo terá 2 alelos para cada locus CoDIS.

TH01 STR: Fora do STR, existem áreas de flanqueamento de sequência conhecida. Os primers que amplificam TH01 em PCR reconhecem essas sequências de flanqueamento para amplificar as repetições de TCAT.

Na cena do crime, os criminosos não costumam deixar grandes quantidades de tecido para trás. A evidência escassa na forma de algumas células encontradas em fluidos corporais ou fios de cabelo pode ser suficiente para usar como evidência de DNA. O DNA é extraído dessas poucas células e amplificado por PCR usando os primers específicos que flanqueiam os STRs usados ​​no CoDIS.

Provas de DNA de uma cena de crime: O DNA pode ser extraído de células encontradas em várias fontes na cena do crime. O PCR pode amplificar essa pequena quantidade de DNA.

O DNA amplificado será separado por eletroforese em gel e analisado. Padrões de referência de tamanho e amostras da cena do crime e os possíveis suspeitos seriam analisados ​​juntos. Em um teste de paternidade, amostras da mãe, da criança e do pai suspeito seriam analisadas da mesma maneira. Um simples esfregaço de bochecha fornecerá células suficientes para
esse teste.

Locus TH01 usado em um teste de Paternidade / Maternidade: Reações PCR individuais são executadas para cada amostra (mãe, pai, filho). O par de primer TH01 amplifica especificamente o locus. Cada amostra amplificada é executada no mesmo gel para resolver os diferentes alelos de TH01 de cada indivíduo. A partir deste teste, a amostra poderia ser a descendência desses 2 pais, mas o uso de mais STRs tornaria a amostra mais definitiva. Conte os TCATs.


Aula 12 Biologia, Capítulo 6 Impressão digital de DNA

A impressão digital de DNA é uma técnica usada para identificar o indivíduo por amostra de seus respectivos perfis de DNA.
A impressão digital de DNA foi inventada em 1984 pelo geneticista britânico Sir Alec Jeffreys.
A base da identificação por perfis de DNA é o polimorfismo. Essas sequências altamente variáveis ​​de DNA são conhecidas como VNTRs (Número Variável de Repetições em Tandem) e STRs (Repetições em Tandem Curtas), freqüentemente chamadas de Minissatélites e Microssatélites. Estas são numerosas pequenas sequências de bases não codificantes, mas herdáveis, que se repetem muitas vezes.

Cada indivíduo tem um padrão único de DNA de minissatélites e microssatélites, exceto gêmeos idênticos ou gêmeos monozigóticos. Gêmeos idênticos têm o mesmo genótipo, pois se desenvolvem a partir do mesmo zigoto.

A impressão digital de DNA também é conhecida como sonda de DNA, perfil de DNA, tipagem de DNA, impressão digital genética, polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição.
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Etapas da impressão digital de DNA:

  1. Isolamento de DNA
  2. Digestão de DNA por endonucleases de restrição
  3. Separação de fragmentos de DNA por eletroforese,
  4. Transferência (mancha) de fragmentos de DNA separados para membranas sintéticas, como nitrocelulose ou náilon, & # xA0
  5. Hibridização usando sonda VNTR marcada, e
  6. Detecção de fragmentos de DNA hibridizados por autorradiografia.

Extraindo DNA de células

A coleta de uma amostra contendo material genético deve ser tratada com diferentes produtos químicos. Os tipos de amostra comuns usados ​​atualmente incluem amostras de sangue e bochechas.

Essas amostras devem ser tratadas com uma série de produtos químicos para romper as membranas celulares, expor a amostra de DNA e remover componentes indesejados & # x2013, como lipídios e proteínas & # x2013, até que surja DNA relativamente puro.

Amplificação de PCR

Se a quantidade de DNA em uma amostra for pequena, os cientistas podem desejar realizar PCR & # x2013 Polymerase Chain Reaction & # x2013 amplificação da amostra.

Tratamento com enzimas de restrição

Os melhores marcadores para uso em perfis de DNA rápidos e fáceis são aqueles que podem ser identificados de forma confiável usando enzimas de restrição comuns, mas que variam muito entre os indivíduos.
Para este propósito, os cientistas usam sequências repetidas & # x2013 porções de DNA que possuem a mesma sequência, de forma que possam ser identificadas pelas mesmas enzimas de restrição, mas que se repetem um número diferente de vezes em pessoas diferentes. Os tipos de repetições usados ​​no perfil de DNA incluem Repetições Tandem de Número Variável (VNTRs), especialmente repetições tandem curtas (STRs), que também são referidas pelos cientistas como & # x201Cmicrosatélites & # x201D ou & # x201Cminisatélites. & # X201D

Uma vez que DNA suficiente foi isolado e amplificado, se necessário, ele deve ser cortado com enzimas de restrição para isolar os VNTRs. As enzimas de restrição são enzimas que se ligam a sequências de DNA específicas e criam quebras nas fitas de DNA.
Na engenharia genética, o DNA é cortado com enzimas de restrição e, em seguida, & # x201Csewn & # x201D novamente junto por ligases para criar novas sequências de DNA recombinante. No perfil de DNA, no entanto, apenas a parte de corte é necessária. Uma vez que o DNA foi cortado para isolar os VNTRs, é hora de executar os fragmentos de DNA resultantes em um gel para ver quanto tempo eles têm.

Eletroforese em Gel

A eletroforese em gel é uma tecnologia brilhante que separa as moléculas por tamanho. O & # x201Cgel & # x201D em questão é um material pelo qual as moléculas podem passar, mas apenas a uma velocidade lenta.
Assim como a resistência do ar desacelera um caminhão grande mais do que uma motocicleta, a resistência oferecida pelo gel de eletroforese desacelera mais moléculas grandes do que pequenas. O efeito do gel é tão preciso que os cientistas podem dizer exatamente o tamanho de uma molécula ao ver o quão longe ela se move dentro de um determinado gel em um determinado período de tempo.
Nesse caso, medir o tamanho dos fragmentos de DNA da amostra que foi tratada com uma enzima de restrição dirá aos cientistas quantas cópias de cada repetição de VTNR a amostra de DNA contém.
É chamado de & # x201Celetroforese & # x201D porque, para fazer as moléculas se moverem através do gel, uma corrente elétrica é aplicada. Como a estrutura de açúcar-fosfato do DNA tem uma carga elétrica negativa, a corrente elétrica puxa o DNA junto com ele através do gel.
Observando quantos fragmentos de DNA as enzimas de restrição produziram e os tamanhos desses fragmentos, os cientistas podem & # x201Cfingerprint & # x201D o doador de DNA.

Realizando Southern Blot

Agora que os fragmentos de DNA foram separados por tamanho, eles devem ser transferidos para um meio onde os cientistas possam & # x201Cread & # x201D e registrar os resultados da eletroforese.
Para fazer isso, os cientistas tratam o gel com um ácido fraco, que quebra os fragmentos de DNA em ácidos nucléicos individuais que serão mais facilmente passados ​​para o papel. Eles então & # x201Cblot & # x201D os fragmentos de DNA em papel de nitrocelulose, que os fixa no lugar.

Tratamento com Sonda Radioativa

Agora que o DNA está fixado no papel absorvente, ele é tratado com uma sonda química especial que adere aos fragmentos de DNA desejados. Este produto químico é radioativo, o que significa que criará um registro visível quando exposto ao papel de raio-X.
Este método de blotting fragmentos de DNA em papel de nitrocelulose e, em seguida, tratá-lo com uma sonda radioativa foi descoberto por um cientista chamado Ed Southern & # x2013, daí o nome & # x201CSouth blot. & # X201D
Curiosamente, o fato de que o Southern blot recebeu o nome de um cientista e não a direção & # x201Csouth & # x201D não impediu os cientistas de nomear métodos semelhantes & # x201Cnorte & # x201D e & # x201Cwestern & # x201D em homenagem ao Southern blot.

Exposição de filme de raio-x

A última etapa do processo é transformar as informações dos fragmentos de DNA em um registro visível. Isso é feito expondo o papel mata-borrão, com suas bandas de DNA radioativo, ao filme de raios-X.
O filme de raios-X é & # x201C desenvolvido & # x201D por radiação, assim como o filme da câmera é revelado por luz visível, resultando em um registro visual do padrão produzido pela pessoa & # x2019s DNA & # x201Cfingerprint. & # X201D
Para garantir uma impressão clara, os cientistas muitas vezes deixam o filme de raios-X exposto ao papel Southern blot fracamente radioativo por um dia ou mais.
Uma vez que a imagem foi revelada e fixada para evitar que mais exposição à luz altere a imagem, esta & # x201Cfingerprint & # x201D pode ser usada para determinar se duas amostras de DNA são iguais ou semelhantes.

APLICAÇÕES DE DNA DE IMPRESSÃO DIGITAL:

Este processo é freqüentemente usado nos seguintes casos:

Investigações criminais para determinar se amostras de sangue ou tecido encontradas nas cenas do crime podem pertencer a um determinado suspeito.

  • Compare os tecidos de doadores de órgãos com os de pessoas que precisam de transplantes.
  • Identifique doenças transmitidas por sua família.
  • Ajude a encontrar curas para essas doenças, chamadas condições hereditárias.

Na ciência, a impressão digital de DNA é usada na história de populações de plantas e animais para determinar quão intimamente relacionadas as espécies e populações são com outras espécies e populações. Além disso, ele pode rastrear sua propagação ao longo do tempo. Essa capacidade de olhar diretamente para os marcadores de genes de um organismo revolucionou nossa compreensão da zoologia, botânica, agricultura e até mesmo da história humana.


Semelhanças entre VNTR e STR

  • VNTR e STR são dois tipos de repetições em tandem.
  • Ambos VNTR e STR são regiões estruturais do genoma eucariótico.
  • Tanto o VNTR quanto o STR consistem em DNA não codificador.
  • Ambos VNTR e STR são herdados dos pais.
  • Tanto o VNTR quanto o STR são compostos de sequências repetitivas, dispostas adjacentes entre si em uma matriz.
  • Tanto o VNTR quanto o STR produzem polimorfismo genético.
  • Ambos VNTR e STR estão espalhados por todo o genoma.
  • Tanto o VNTR quanto o STR são usados ​​como marcadores genéticos em genética forense.
  • Mutações em VNTR e STR levam a doenças genéticas.

Conclusões

O presente estudo procurou esclarecer aspectos da transmissão de F. psychrophilum no Chile e na Noruega usando VNTRs como marcadores genéticos, ou seja. um sistema MLVA. O método deu, em grande medida, a mesma resolução encontrada em um estudo MLST anterior Apablaza et al. [36], com alta diversidade entre os isolados chilenos e menor variação entre os isolados noruegueses. O método não foi capaz de separar os isolados em relação às espécies hospedeiras, exceto para um grupo de isolados distintos de salmão selvagem do Atlântico na Noruega. Não está claro se isso é devido à resolução limitada do método ou resultado da alta pressão de infecção entre as populações infectadas de salmão do Atlântico e truta arco-íris no Chile e na Europa. O potencial da análise de VNTR como método de separação de isolados em relação à virulência deve ser testado em experimentos de desafio usando isolados com perfis diferentes. Além disso, estudos futuros devem incluir mais isolados de F. psychrophilum para um estudo mais detalhado do poder de resolução dos dois métodos, análise MLST e VNTR.


Perfil de DNA na medicina legal moderna (com diagrama)

A impressão digital de DNA é o detetive genético atual na prática da medicina legal moderna. Os princípios básicos da impressão digital de DNA são descritos resumidamente. A estrutura do genoma de cada pessoa é única. A única exceção sendo gêmeos idênticos monozigóticos (gêmeos desenvolvidos a partir de um único óvulo fertilizado).

A natureza única da estrutura do genoma oferece uma boa oportunidade para a identificação específica de um indivíduo. Pode ser lembrado aqui que na técnica tradicional de impressão digital, o indivíduo é identificado preparando uma impressão de tinta das dobras da pele na ponta do dedo da pessoa. Isso se baseia no fato de que a natureza dessas dobras cutâneas é determinada geneticamente e, portanto, a impressão digital é única para um indivíduo. Em contraste, a impressão digital do DNA é uma análise da sequência de bases nitrogenadas no DNA de um indivíduo.

História e Terminologia:

A técnica de impressão digital de DNA original foi desenvolvida por Alec Jaffrey & # 8217s em 1985. Embora a impressão digital de DNA seja comumente usada, um termo mais geral perfil de DNA é o preferido. Isso se deve ao fato de que uma ampla gama de testes pode ser realizada por sequenciamento de DNA com tecnologia aprimorada.

Aplicações da impressão digital de DNA:

A quantidade de DNA necessária para a impressão digital do DNA é notavelmente pequena. As diminutas quantidades de DNA de cepas de sangue, fluidos corporais e fibras capilares ou fragmentos de pele são suficientes. A reação em cadeia da polimerase é usada para amplificar esse DNA para uso em impressões digitais. O perfil de DNA tem uma ampla gama de aplicações - a maioria delas relacionadas à medicina legal.

Alguns importantes estão listados abaixo:

eu. Identificação de criminosos, estupradores, ladrões etc.

ii. Resolução de disputas de paternidade.

iii. Use em casos de teste de imigração e disputas.

Em geral, a técnica de impressão digital é realizada coletando o DNA de um suspeito (ou de uma pessoa em uma disputa de paternidade ou imigração) e combinando-o com o de uma amostra de referência (da vítima de um crime ou de um parente próximo em um caso civil).

Marcadores de DNA no diagnóstico de doenças e impressões digitais:

Os marcadores de DNA são muito úteis para o mapeamento genético de genomas. Existem quatro tipos de sequências de DNA que podem ser usadas como marcadores.

1. Polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLFs, pronunciados como lábios de rifle).

2. Minissatélites ou repetições tandem de número variável (VNTRs, pronunciados como vinters).

3. Microssatélites ou repetições simples em tandem (STRs).

4. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs, pronunciados como recortes).

Os aspectos gerais dos marcadores de DNA acima são descritos juntamente com sua utilidade no diagnóstico de doenças e impressões digitais de DNA.

Polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs):

Um RFLP representa um trecho de DNA que serve como um marcador para mapear um gene específico. Os RFLPs estão localizados aleatoriamente nos cromossomos de uma pessoa e não têm função aparente. Uma molécula de DNA pode ser cortada em diferentes fragmentos por um grupo de enzimas chamadas endonucleases de restrição. Esses fragmentos são chamados de polimorfismos (literalmente significa muitas formas).

Um esboço do RFLP está representado na Fig. 14.5. A molécula de DNA 1 tem três sítios de restrição (R1, R2, R3), e quando clivado por endonucleases de restrição forma 4 fragmentos. Vamos agora considerar o DNA 2 com uma mutação herdada (ou uma mudança genética) que alterou alguns pares de bases. Como resultado, o site (R2) para o reconhecimento por endonuclease de restrição é perdida. Esta molécula de DNA 2 quando cortada por endonuclease de restrição forma apenas 3 fragmentos (em vez de 4 no DNA 1).

Como é evidente a partir da descrição acima, um trecho de DNA existe em fragmentos de vários comprimentos (polimorfismos), derivados pela ação de enzimas de restrição, daí o nome polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição.

RFLPs no diagnóstico de doenças:

Se o RFLP estiver dentro ou mesmo próximo ao locus de um gene que causa uma doença específica, é possível rastrear o gene defeituoso pela análise do RFLP no DNA. O DNA celular da pessoa é isolado e tratado com enzimas de restrição. Os fragmentos de DNA assim obtidos são separados por eletroforese.

Os padrões de RFLP dos indivíduos suspeitos da doença podem ser comparados com os de pessoas normais (de preferência com parentes da mesma família). Por meio dessa abordagem, é possível determinar se o indivíduo possui o marcador RFLP e o gene da doença. Com 95% de certeza, os RFLPs podem detectar doenças baseadas em um único gene.

Métodos de pontuação RFLP:

Dois métodos são comumente usados ​​para a detecção de RFLPs (Fig. 14.5).

1. Hibridização Southern:

O DNA é digerido com a enzima de restrição apropriada e separado por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos de DNA assim obtidos são transferidos para uma membrana de náilon. Uma sonda de DNA que abrange o local de restrição suspeita é agora adicionada e as bandas hibridizadas são detectadas por autorradiografia. Se o local de restrição estiver ausente, apenas um único fragmento de restrição será detectado. Se o local estiver presente, então dois fragmentos são detectados (Fig. 14.6A).

2. Reação em cadeia da polimerase:

RFLPs também podem ser pontuados por PCR. Para este propósito, são utilizados primers de PCR que podem anelar em qualquer um dos lados do sítio de restrição suspeito. Após a amplificação por PCR, as moléculas de DNA são tratadas com enzima de restrição e analisadas por eletroforese em gel de agarose. Se o local de restrição estiver ausente, apenas uma banda é vista, enquanto duas bandas são encontradas se o local for encontrado (Fig. 14.6B).

Aplicações de RFLPs:

A abordagem por RFLP é muito poderosa e ajudou muitos genes a serem mapeados nos cromossomos, por ex. anemia falciforme (cromossomo 11), fibrose cística (cromossomo 7), doença de Huntington & # 8217s (cromossomo 4), retinoblastoma (cromossomo 13), doença de Alzheimer & # 8217s (cromossomo 21).

Número variável de repetições em série (VNTRs):

Os VNTRs, também conhecidos como minissatélites, como os RFLPs, são fragmentos de DNA de diferentes comprimentos. A principal diferença é que os RFLPs se desenvolvem a partir de mutações aleatórias no local da atividade da enzima de restrição, enquanto os VNTRs são formados devido ao número diferente de sequências de bases entre dois pontos de uma molécula de DNA. Em geral, os VNTRs são feitos de repetições em tandem de sequências de bases curtas (10-100 pares de bases). O número de elementos em uma determinada região pode variar, portanto, eles são conhecidos como repetições em tandem de número variável.

Um genoma individual & # 8217s tem muitos VNTRs e RFLPs diferentes que são exclusivos do indivíduo. O padrão de VNTRs e RFLPs forma a base da impressão digital de DNA ou perfil de DNA. Na Fig. 14.7, duas moléculas de DNA diferentes com diferentes números de cópias (bandas) de VNTRs são mostradas. Quando essas moléculas são submetidas à ação da endonuclease de restrição (em dois locais R 1 e R2), as sequências de VNTR são liberadas e podem ser detectadas devido à variabilidade nas cópias de sequência repetidas. Eles podem ser usados ​​no mapeamento de genomas, além de sua utilidade na impressão digital de DNA.

Os VNTRs são úteis para a detecção de certas doenças genéticas associadas a alterações no grau de repetição de microssatélites, e. A coreia de Huntington & # 8217s é um distúrbio encontrado quando os VNTRs excedem 40 unidades de repetição.

A principal desvantagem dos VNTRs é que eles não são distribuídos uniformemente por todo o genoma. Os VNTRs tendem a estar localizados nas regiões teloméricas nas extremidades dos cromossomos.

Uso de RFLPs e VNTRs em impressões digitais genéticas:

RFLPs causados ​​por variações no número de VNTRs entre dois locais de restrição podem ser detectados (Fig. 14.8). Os DNAs de três indivíduos com diferentes VNTRs são cortados pela endonuclease de restrição específica. Os fragmentos de DNA são separados por eletroforese e identificados após hibridização com uma sonda complementar a uma sequência específica dos fragmentos.

Microssatélites (Repetições Tandem Simples):

Os microssatélites são unidades de repetição curtas (10-30 cópias) geralmente compostas de unidades dinucleotídicas ou tetranucleotídicas. Essas repetições simples em tandem (STRs) são mais populares do que os minissatélites (VNTRs) como marcadores de DNA por dois motivos.

1. Os microssatélites estão em todo o genoma.

2. O PCR pode ser eficaz e convenientemente usado para identificar o comprimento do polimorfismo.

Duas variantes (alelos) de moléculas de DNA com 5 e 10 unidades repetidas de um dímero de nucleotídeos (GA) são representadas na Fig. 14.9.

Por meio de PCR, a região ao redor dos microssatélites é amplificada, separada por eletroforese em gel de agarose e identificada.

Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs):

SNPs representam as posições no genoma onde alguns indivíduos têm um nucleotídeo (por exemplo, G), enquanto outros têm um nucleotídeo diferente (por exemplo, C). Há um grande número de SNPs nos genomas. Estima-se que o genoma humano contém pelo menos 3 milhões de SNPs. Alguns desses SNPs podem dar origem a RFLPs. Os SNPs são altamente úteis como marcadores de DNA, pois não há necessidade de eletroforese em gel e isso economiza muito tempo e trabalho. A detecção de SNPs é baseada na análise de hibridização de oligonucleotídeo (Fig. 14.10).

Um oligonucleotídeo é uma pequena molécula de DNA de fita simples sintetizada em laboratório com um comprimento que geralmente não excede 50 nucleotídeos. Sob condições apropriadas, esta sequência de nucleotídeos irá hibridizar com uma fita de DNA alvo se ambas tiverem estrutura emparelhada completamente. Mesmo uma única incompatibilidade no par de bases não permitirá que a hibridização ocorra. A tecnologia de chip de DNA é mais comumente usada para rastrear a hibridização SNPs com oligonucleotídeo

Tecnologia Atual de Impressão Digital de DNA:

Na análise forense de DNA, as técnicas originais baseadas em RFLPs e VNTRs agora são amplamente substituídas por microssatélites (repetições curtas em tandem). O princípio básico envolve a amplificação de microssatélites pela reação em cadeia da polimerase seguida de sua detecção. Agora é possível gerar um perfil de DNA por sistema automatizado de detecção de DNA (comparável ao equipamento de sequenciamento de DNA).


Como os VNTRs são usados ​​no perfil de DNA?

Clique aqui para saber mais sobre isso. Conseqüentemente, por que os VNTRs podem ser usados ​​na identificação pessoal?

Desta maneira, VNTRs são uma fonte de polimorfismo genético (variação), e posso ser usado como marcadores para identificação pessoal bem como no estudo de herança, diversidade genética, genética de populações e doenças genéticas.

Além disso, os VNTRs são encontrados dentro dos genes? número variável tandem repete / VNTRs VNTR. Dentro de um gene, pequenas sequências de DNA repetidas em tandem que variam muito em número entre os indivíduos, também chamados de microssatélites. Normalmente usado em impressões digitais de DNA devido à extrema variabilidade entre os humanos, abreviado como VNTRs.

Então, como os STRs são usados ​​no perfil de DNA?

O sistema de Perfil de DNA usado hoje é baseado em PCR e usa sequências simples ou repetições tandem curtas (STR). Esses loci STR (localizações em um cromossomo) são direcionados com iniciadores específicos de sequência e amplificados por PCR. o DNA os fragmentos resultantes são então separados e detectados por eletroforese.

Número variável de repetições em tandem (VNTRs) Duas categorias importantes de repetição em tandem têm sido amplamente utilizadas na genética forense: minissatélites, também chamados de repetições em tandem de número variável (VNTRs) e microssatélites, também chamados de repetições curtas em tandem (STRs).


RFLPs, VNTR, SNP - definições e uso

O que são polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs), repetição tandem de número variável (VNTRs) e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs)? Qual é a relação entre eles? Como usamos essa tecnologia para, por exemplo, identificar paternidade?

© BrainMass Inc. brainmass.com 4 de março de 2021, 23h20 ad1c9bdddf
https://brainmass.com/biology/dna-chromosomes-and-genomes/rflps-vntr-snp-definitions-413525

Antevisão da Solução

RFLP significa polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição. Essa técnica se baseia no fato de que, ao ser digerido por enzimas de restrição, um padrão de fragmentos de DNA será gerado a partir do DNA do indivíduo que é único devido à sequência única de seu DNA. Ao examinar o padrão de bandas desse DNA executado em um gel, a identidade de alelos específicos pode ser identificada pelo padrão de bandas.

VNTR significa número variável de repetições em tandem. A análise de VNTRs se baseia no fato de que existem regiões em muitos cromossomos onde eles estão.

Resumo da Solução

Esta solução explica o que se entende por polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), repetição em tandem de número variável (VNTR) e análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). Também detalha as relações entre eles e como são usados.


Uso de endonucleases de restrição para analisar Repetições Tandem de Número Variável (VNTRs) - Biologia

PARTE III. BIOLOGIA MOLECULAR, DIVISÃO CELULAR E GENÉTICA

11. Aplicações da Biotecnologia

11,2. Comparando DNA

É útil distinguir entre organismos individuais com base em seu DNA. As comparações de DNA podem ser realizadas de duas maneiras gerais. Ambos se baseiam no fato de que organismos geneticamente diferentes terão sequências de nucleotídeos diferentes em seu DNA. Os dois métodos são impressão digital de DNA e sequenciamento de DNA. A impressão digital de DNA analisa padrões em porções específicas do DNA de um organismo. O sequenciamento de DNA olha diretamente para a sequência de nucleotídeos.

Como essas duas abordagens têm vantagens e desvantagens, os cientistas escolhem entre elas dependendo de suas necessidades. A impressão digital de DNA permite uma visão relativamente rápida em áreas maiores de informações genéticas do organismo. É útil distinguir entre organismos - como possíveis suspeitos em um julgamento. O sequenciamento de DNA cria uma visão muito detalhada de uma região relativamente pequena da informação genética do organismo. O sequenciamento de DNA é a visão mais detalhada que podemos ter das informações genéticas do organismo.

A impressão digital de DNA é uma técnica que identifica indivíduos de maneira única com base em pequenos pedaços de DNA. Como duas pessoas não têm as mesmas sequências de nucleotídeos, elas não geram os mesmos comprimentos de fragmentos de DNA quando seu DNA é cortado com enzimas. Até mesmo olhar para os muitos pedaços de DNA que são produzidos dessa maneira é muito complexo. Therefore, scientists don’t look at all the possible fragments but, rather, focus on differences found in pieces of DNA that form repeating patterns in the DNA. By focusing on these regions with repeating nucleotide sequences, it is possible to determine whether samples from two individuals have the same number of repeating segments (Outlooks 11.1).

The First Use of a DNA Fingerprint in a Criminal Case

In 1988, a baker in England was the first person in the world to be convicted of a crime on the basis of DNA evidence. Colin Pitchfork's crime was the rape and murder of two girls. The first murder occurred in 1983. The initial evidence in this case consisted of the culprit's body fluids, which contained his proteins and DNA. On the basis of the proteins, the police were able to create a molecular description of the culprit. The problem was that this description matched 10% of the males in the local population, and the police were unable to identify just one person. In 1986, there was another murder that closely matched the details of the 1983 killing. Another male, Richard Buckland, was the prime suspect for the second murder. In fact, while being questioned, Buckland admitted to the most recent killing but had no knowledge of the first killing. The clues still did not point consistently to a single person.

Meanwhile, the scientists at a nearby university had been working on a new forensic technique—DNA fingerprinting.

To track down the killer, police asked local men to donate blood or saliva samples. Between 4,000 and 5,000 local men participated in the dragnet. None of the volunteers matched the culprit's DNA. Interestingly, Buckland's DNA did not match the culprit's DNA, either. He was later released because his confession was false. It wasn't until after someone reported that Colin Pitchfork had asked a friend to donate a sample for him and offered to pay several others to do the same that police arrested Pitchfork. Pitchfork's DNA matched that of the killer's.

This is a good example of how biotechnology helps the search for truth within the justice system. The additional evidence from DNA was able to provide key information to identify the culprit.

DNA Fingerprinting Techniques

In the scenario presented in Outlooks 11.1, a crime was committed and the scientists had evidence in the form of body fluids from the criminal. These body fluids contained cells with the criminal’s DNA. The DNA in these cells was used as a template to produce enough DNA for analysis. The polymerase chain reaction (PCR) is a technique used to generate large quantities of DNA from small amounts (How Science Works 11.1).

Using PCR and the suspect’s DNA, scientists were able to replicate regions of human DNA that are known to vary from individual to individual. This created large quantities of DNA so that DNA fingerprinting could be performed. Scientists target areas of the suspect’s DNA that contains variable number tandem repeats. Variable number tandem repeats (VNTRs) are sequences of DNA that are repeated a variable number of times from one individual to another. For example, in a given region of DNA, one person may have a DNA sequence repeated 4 times, whereas another may have the same sequence repeated 20 times (figure 11.1).

FIGURE 11.1. Variable Number Tandem Repeats

Variable number tandem repeats (VNTRs) are short sequences of DNA that are repeated often. The repeated sequences are attached end-to-end. This illustration shows the VNTRs for three individuals. The individual in I has 8 repeats on 1 chromosome and 12 on the homologous chromosome. They are heterozygous. The individual in II is homozygous for 12 repeats. The individual in III is heterozygous for a different number of repeats—18 and 20.

Once enough DNA was generated through PCR, the DNA needed to be treated so that the VNTRs would be detectable. To detect the varying number of VNTRs, the replicated DNA sample is cut into smaller pieces with restriction enzymes. Restriction sites are DNA nucleotide sequences that attract restriction enzymes. When the restriction enzymes bind to a restriction site, the enzyme cuts the DNA molecule into two molecules. Restriction fragments are the smaller DNA fragments that are generated after the restriction enzyme has cut the selected DNA into smaller pieces. Some of the fragments of DNA that are generated by restriction enzymes will contain the regions with VNTRs. The fragments with VNTRs will vary in size from person to person because some individuals have more repeats than others. Restriction enzymes are used to create fragments of DNA that might be different from one individual to the next.

In DNA fingerprinting, scientists look for different lengths of restriction fragments as an indicator of differences in VNTRs.

Electrophoresis is a technique that separates DNA fragments on the basis of size (How Science Works 11.2). The shorter DNA molecules migrate more quickly than the long molecules. As differently sized molecules are separated, a banding pattern is generated. Each band is a differently sized restriction fragment. Each person’s unique DNA banding pattern is called a DNA fingerprint (figure 11.2). The process of DNA fingerprinting includes the following basic stages:

1. DNA is obtained from a source, which may be as small as one cell.

2. PCR is used to make many copies of portions of the DNA that contain VNTRs.

3. Restriction enzymes are used to cut the VNTR DNA into pieces so that the VNTRs can be detected.

4. To detect the differences in the VNTRs, the pieces are separated by electrophoresis.

5. Comparisons between patterns can be made.

FIGURE 11.2. DNA Fingerprints

(a) Because every person’s DNA is unique, (b) when samples of an individual’s DNA are collected and subjected to restriction enzymes, the cuts occur in different places and DNA fragments of different sizes result. (c) Restriction enzymes can cut DNA at places where specific sequences of nucleotides occur. (d) When the cut DNA fragments are separated by electrophoresis, (e) the smaller fragments migrate more quickly than the larger fragments. This produces a pattern, called a DNA fingerprint, that is unique and identifies the person who provided the DNA. (f) The victim’s DNA is on the left. The rapist’s DNA is in the middle. The suspect’s DNA is on the right. The match in banding patterns between the suspect and the rapist indicates that they are the same.

DNA Fingerprinting Applications

With DNA fingerprinting, the more similar the banding patterns are from two different samples, the more likely the two samples are from the same person. The less similar the patterns, the less likely the two samples are from the same person. In criminal cases, DNA samples from the crime site can be compared with those taken from suspects. If 100% of the banding pattern matches, it is highly probable that the suspect was at the scene of the crime and is the guilty party. The same procedure can be used to confirm a person’s identity, as in cases of amnesia, murder, or accidental death.

DNA fingerprinting can be used in paternity cases that determine the biological father of a child. A child’s DNA is a unique combination of both the mother’s DNA and the father’s DNA. The child’s DNA fingerprint is unique, but all the bands in the child’s DNA fingerprint should be found in either the mother’s or the father’s fingerprint. To determine paternity, the child’s DNA, the mother’s DNA, and DNA from the man who is alleged to be the father are collected.

The DNA from all three is subjected to PCR, restriction enzymes, and electrophoresis. During analysis of the banding patterns, scientists account for the child’s banding pattern by linking each DNA band to a DNA band of the mother and the presumed father. Bands that are common to both the biological mother and the child are identified and eliminated from further consideration. If all the remaining bands can be matched to the presumed father, it is extremely likely that he is the father (figure 11.3). If there are bands that do not match the presumed father’s, then there are one of two conclusions: (1) The presumed father is not the child’s biological father, or (2) the child has a new mutation that accounts for the unique band. This last possibility can usually be ruled out by considering multiple regions of DNA, because it is extremely unlikely that the child will have multiple new mutations.

FIGURE 11.3. Paternity Determination

(a) This illustration shows the VNTRs for four different individuals—a child, the mother, one possible father, and a second possible father. (b) Using PCR, electrophoresis, and DNA fingerprinting analysis, it is possible to identify the child’s father. The mother possesses the “12” band and has passed that to her child. The mother did not give the child the child’s “8” band because the mother does not have an “8” band herself. The child’s “8” band must have come from the father. Of the two men under consideration, only man IV has the “8” band, so man IV is the father. Now stop for a moment and think about the principles of genetics. If man IV is the father, why doesn’t the child have an “18” band?

Polymerase Chain Reaction

Polymerase chain reaction (PCR) is a laboratory procedure for copying selected segments of DNA from larger DNA molecules. With PCR, a single cell can provide enough DNA for analysis and identification. Scientists start with a sample of DNA that contains the desired DNA region. The types of samples that can be used include semen, hair, blood, bacteria, protozoa, viruses, mummified tissues, and frozen cells. Targeting specific portions of DNA for replication enables biochemists to manipulate DNA more easily. When many copies of this DNA have been produced it is easy to find, recognize, and manipulate.

PCR is a test-tube version of the cellular DNA replication process and requires similar components. The DNA from the sample specimen serves as the template for replication. Free DNA nucleotides are used to assemble new strands of DNA. DNA polymerase, which has been purified from bacteria cells, is used to catalyze the PCR reaction.

DNA primers are short stretches of single-stranded DNA, which are used to direct the DNA polymerase to replicate only certain regions of the template DNA. These primer molecules are specifically designed to flank the ends of the target region's DNA sequence and point the DNA polymerase to the region between the primers. The PCR reaction is carried out by heating the target DNA, so that the two strands of DNA fall away from each other. This process is called denaturation. Once the nitrogenous bases on the target sequence are exposed and the reaction cools, the primers are able to attach to the template molecule. The primers anneal to the template. The primers anneal (that is, stick or attach) to the template. The primers are able to target a particular area of DNA because the primer nucleotide sequence pairs with the template DNA sequence using the base-pairing rules.

Purified DNA polymerase is the enzyme that drives the DNA replication process. The presence of the primer, attached to the DNA template and added nucleotides, serves as the substrate for the DNA polymerase. Once added, the polymerase extends the DNA molecule from the primer down the length of the DNA. Extension continues until the polymerase falls off of the template DNA. The enzyme incorporates the new DNA nucleotides in the growing DNA strand. It stops when it reaches the other end, having produced a new copy of the target sequence.

The elegance of PCR is that it allows the exponential replication of DNA. Exponential, or logarithmic, growth is a doubling in number with each round of PCR. With just one copy of template DNA, there will be a total of two copies at the end of one replication cycle. During the second round, both copies are used as a template. At the end of the second round, there is a total of 4 copies. The number of copies of the target DNA increases very quickly. With each round of replication, the number doubles—8, 16, 32, 64. Each round of replication takes only minutes. Thirty rounds of replication in PCR can be performed within 2.5 hours. Starting with just one copy of DNA and 30 rounds of replication, it is possible to produce over half a billion copies of the desired DNA segment.

Because this technique can create useful amounts of DNA from very limited amounts, it is a very sensitive test for the presence of specific DNA sequences. Frequently, the presence of a DNA sequence indicates the presence of an infectious agent or a disease-causing condition.

During cycle one of PCR, the template DNA is denatured, so that the two strands of DNA separate. This allows the primers to attach (anneal) to the template DNA. DNA polymerase and DNA nucleotides, which are present for the reaction, create DNA by extending from the primers. During cycle 2, the same process occurs again, but the previous round of replication has made more template available for further replication. Each subsequent cycle essentially doubles the amount of DNA.

Electrophoresis is a technique used to separate molecules, such as nucleic acids, proteins, or carbohydrates. Electrophoresis separates nucleic acids on the basis of size. DNA is too long for scientists to work with when taken directly from the cell. To make the DNA more manageable, scientists cut the DNA into smaller pieces. Restriction enzymes are frequently used to cut large DNA molecules into smaller pieces. After the DNA is broken into smaller pieces, electrophoresis is used to separate differently sized DNA fragments.

Electrophoresis uses an electric current to move DNA through a gel matrix. DNA has a negative charge because of the phosphates that link the nucleotides. In an electrical field, DNA migrates toward the positive pole. The speed at which DNA moves through the gel depends on the length of the DNA molecule. Longer DNA molecules move more slowly through the gel matrix than do shorter DNA molecules.

When scientists work with small areas of DNA, electrophoresis allows them to isolate specific stretches of DNA for other applications.

DNA sequencing uses electrophoresis to separate DNA fragments of different lengths. A DNA synthesis reaction is set up that includes DNA from the region being investigated. The reaction also includes (1) DNA polymerase, (2) a specific DNA primer, (3) all DNA nucleotides (G, A, T, and C), and (4) a small amount of 4 kinds of chemically altered DNA nucleotides. DNA polymerase is the enzyme that synthesizes DNA in cells by using DNA nucleotides as a substrate. The DNA primer gives the DNA polymerase a single place to start the DNA synthesis reaction. All of these components work together to allow DNA synthesis in a manner very similar to cellular DNA replication.

The DNA sequencing process also adds nucleotides that have been chemically altered in two ways: (1) The altered nucleotides are called dideoxyribonucleosides because they contain a dideoxyribose sugar rather than the normal deoxyribose. Dideoxyribose has one less oxygen in its structure than deoxyribose. (2) The four kinds of dideoxyribonucleotides (A, T, G, C) are each labeled with a different flourescent dye so that each of the four nucleotides is colored differently. During DNA sequencing, the DNA polymerase randomly incorporates either a normal DNA nucleotide or a dideoxyribonucleotide. When the dideoxyribonucleoside is used, two things happen: (1) No more nucleotides can be added to the DNA strand, and (2) the DNA strand is now tagged with the fluorescent label of the dideoxynucleotide that was just incorporated.

As a group, the DNA molecules that are created by this technique have the following properties:

1. They all start at the same point, because they all started with the same primer.

2. There are copies of DNA molecules that had their replication halted at each nucleotide in the sequence of the sample DNA when a dideoxyribose nucleotide was incorporated.

3. DNA molecules of the same length (number of nucleotides) are labeled with the same color of fluorescent dye.

Electrophoresis separates this collection of molecules by size, because the shortest DNA molecules move fastest. The DNA sequence is determined by reading the color sequence from the shortest DNA molecules to the longest DNA molecules. The pattern of colors matches the order of the nucleotides in the DNA. The color pattern that is generated by the sequencing gel is the order of the nucleotides. Automated sequencing is done by using a laser beam to read the colored bands. A printout is provided as peaks of color to show the order of the nucleotides.

Gene Sequencing and the Human Genome Project

The Human Genome Project (HGP) was a 13-year effort to determine the human DNA sequence. Work began in 1990. It was first proposed in 1986 by the U.S. Department of Energy (DOE) and was cosponsored soon after by the National Institutes of Health (NIH). These agencies were the main research agencies within the U.S. government responsible for developing and planning the project. Estimates are that the United States spent over $3 billion on the Human Genome Project.

Many countries contributed both funds and labor resources to the Human Genome Project. At least 17 countries other than the United States participated, including Australia, Brazil, Canada, China, Denmark, France, Germany, Israel, Italy, Japan, Korea, Mexico, the Netherlands, Russia, Sweden, and the United Kingdom. The Human Genome Project was one of the most ambitious projects ever undertaken in the biological sciences.

The data that these countries produced are stored in powerful computers, so that the information can be shared. To get an idea of the size of this project, consider that a human Y chromosome (one of the smallest of the human chromosomes) is composed of nearly 60 million paired nucleotides. The larger X chromosome may be composed of 150 million paired nucleotides. The entire human genome consists of 3.12 billion paired nucleotides. That is roughly the same number as all the letter characters found in about 2,000 copies of this textbook.

Human Genome Project Techniques

Two kinds of work progressed simultaneously to determine the sequence of the human genome. First, physical maps were constructed by determining the location of specific “markers” and the proximity of these markers to genes. The markers were known sequences of DNA that could be located on the chromosome. This physical map was used to organize the vast amount of data produced by the second technique, which was for the labs to determine the exact order of nitrogenous bases of the DNA for each chromosome. Techniques exist for determining base sequences (How Science Works 11.3). The challenge is storing and organizing the information from these experiments, so that the data can be used.

A slightly different approach was adopted by Celera Genomics, a private U.S. corporation. Although Celera Genomics started later than the labs funded by the Department of Energy and National Institute of Health it was able to catch up and completed its sequencing at almost the same time as the government-sponsored programs by developing new techniques. Celera jumped directly to determining the DNA sequence of small pieces of DNA without the physical map. It then used computers to compare and contrast the short sequences, so that it could put them together and assemble the longer sequence. The benefit of having these two organizations as competitors was that, when they finished their research, they could compare and contrast results. Amazingly, the discrepancies between their findings were declared insignificant.

Human Genome Project Applications

The first draft of the human genome was completed early in 2003, when the complete nucleotide sequence of all 23 pairs of human chromosomes was determined. By sequencing the human genome, it is as if we have now identified all the words in the human gene “dictionary.” Continued analysis will provide the definitions for these words—what these words tell the cell to do.

The information provided by the human genome project is extremely useful in diagnosing diseases and providing genetic counseling to those considering having children. This information can identify human genes and proteins that can be targets for drugs and new gene therapies. Once it is known where an abnormal gene is located and how it differs in base sequence from the normal DNA sequence, steps could be taken to correct the abnormality. Further defining the human genome will also result in the discovery of new families of proteins and will help explain basic physiological and cell biological processes common to many organisms. All this information will increase the breadth and depth of the understanding of basic biology.

It was originally estimated that there were between 100,000 and 140,000 genes in the human genome, because scientists were able to detect so many different proteins. DNA sequencing data indicate that there are only about 20,000 protein-coding genes—only about twice as many as in a worm or a fly. Our genes are able to generate several different proteins per gene because of alternative splicing (figure 11.4). Alternative splicing occurs much more frequently than previously expected. Knowing this information provides insights into the evolution of humans and will make future efforts to work with the genome through bioengineering much easier.

FIGURE 11.4. Different Proteins—One Gene

This illustration shows a stretch of DNA that contains a gene. Proteincoding regions (exons) of this gene are shown in different colors. Introns that do not code for protein and are not transcribed into RNA are shown in a single color—rust. Alternative splicing allows different tissue to use the same gene but make slightly different proteins. The gray bands show how some exons are used to form both proteins, whereas other exons are used on only one protein.

There is a concern that, as our genetic makeup becomes easier to determine, some people may attempt to use this information for profit or political power. Consider that some health insurance companies refuse to insure people with “preexisting conditions” or those at “genetic risk” for certain abnormalities. Refusing to provide coverage would save these companies the expense of future medical bills incurred by “less than perfect” people. While this might be good for insurance companies, it raises major social questions about fair and equal treatment and discrimination.

Another fear is that attempts may be made to “breed out” certain genes and people from the human population to create a “perfect race.” Intentions such as these superficially appear to have good intentions, but historically they have been used by many groups to justify discrimination against groups of individuals or even to commit genocide.

While some scientists refine our understanding of the human genome, others are sequencing the genomes of other organisms. Representatives of each major grouping of organisms have been investigated, and the DNA sequence data have been made available to the general public through a centralized government website. This centralized database has made the exchange and analysis of scientific information easier than ever (table 11.1). The information gained from these studies

TABLE 11.1. Completed and Current Genome Projects

The Human Genome Project has sparked major interest in nonhuman genomes. The investigation of some genomes has been very organized. Other investigations have been less directed, whereby only sequences of certain regions of interest have been reported. Regardless, information on many genomes is available at the National Center for Biotechnology Information website.

Number of Different Genomes Represented

Viruses and retroviruses and bacteriphages

Herpes virus, human papillomavirus, HIV

Anthrax species, Chlamydia species, Escherichia coli, Pseudomonas species, Salmonella species

Halobacterium species, Methanococcus species, Pyrococcus species, Thermococcus species

Cryptosporidium species, Entamoeba histolytica, Plasmodium species

Yeast, Aspergillus, Candida

Thale cress (Arabidopsis thaliana), tomato, lotus, rice

Bee, cat, chicken, chimp, cow, dog, frog, fruit fly, mosquito, nematode, pig, rat, sea urchin, sheep, zebra fish

Patterns in Protein-Coding Sequences

As scientists sequenced the human genome and compared it with other genomes, certain patterns became apparent.

Tandem clusters are grouped copies of the same gene that are found on the same chromosome (figure 11.5). For example, the DNA that codes for ribosomal RNA is present in many copies in the human genome. From an evolutionary perspective, the advantage to the cell is the ability to create large amounts of gene product quickly from the genes found in tandem clusters.

FIGURE 11.5. Patterns in Protein Coding Sequences

(a) Tandem clusters are identical or nearly identical repeats of one gene. (b) Segmental duplications are duplications of sets of genes. These may occur on the same chromosome or different chromosomes. (c) Multigene families are repeats of similar genes. The genes are similar because regions are conserved from gene to gene, but many regions have changed significantly.

Segmental duplications are groups of genes that are copied from 1 chromosome and moved as a set to another chromosome. These types of gene duplications allow for genetic backups of information. If either copy is mutated, the remaining copy can still provide the necessary gene product sufficient for the organism to live. Because the function of the mutated copy of the gene is being carried out by the normal gene, the mutated copy may take on new function if it accumulates additional mutations. This can allow evolution to occur more quickly (figure 11.5b).

Multigene families are groups of different genes that are closely related. When members of multigene families are closely inspected, it is clear that certain regions of the genes carry similar nucleotide sequences. Hemoglobin is a member of the globin gene family. There are several different hemoglobin genes in the human genome. Evolutionary patterns can be tracked at the molecular level by examining gene families across species. The portions of genes that show very little change across many species represent portions of the protein that are important for function. Scientists reason that regions that are important for function will be intolerant of change and stay unaltered over time. Again, using hemoglobin as an example, it is possible to compare the hemoglobin genes of different organisms to identify specific changes in the gene. Such comparisons can lead to a better understanding of how organisms are related to each other evolutionarily (figure 11.5c).

The following are a few more interesting facts obtained by comparing genomes:

• Eukaryotic genomes are more complex than prokaryotic genomes. Eukaryotic genomes are, on average, nearly twice the size of prokaryotic genomes. Eukaryotic genomes devote more DNA to regulating gene expression. Only 1% of human DNA actually codes for protein.

• The number of genes in a genome is not a reflection of the size or complexity of an organism. Humans possess roughly 21,000 genes. Roundworms have about 26,000 genes, and rice plants possess 32,000 to 55,000 genes.

• Eukaryotes create multiple proteins from their genes because of alternative splicing. Prokaryotes do not. Nearly 25% of human DNA consists of intron sequences, which are removed during splicing. On average, each human gene makes between 4.5 and 5 different proteins because of alternative splicing.

• There are numerous, virtually identical genes found in very distantly related organisms—for example, mice, humans, and yeasts.

• Hundreds of genes found in humans and other eukaryotic organisms appear to have resulted from the transfer of genes from bacteria to eukaryotes at some point in eukaryotic evolution.

• Chimpanzees have 98-99% of the same DNA sequence as humans. All the human “races” are about 99.9% identical at the DNA level. In fact, there is virtually no scientific reason for the concept of “race,” because the amount of variation within a race is as great as the amount of variation between races.

• Genes are unequally distributed between chromosomes and unequally distributed along the length of a chromosome.

Patterns in Non-Coding Sequence

Protein-coding DNA is not the only reason for examining DNA sequences. The regions of DNA that do not code for protein are more important than once thought. Many noncoding sequences are involved with the regulation of gene expression.

A recent and more accurate map of the human genome from Britain focuses on copy number variations, or CNVs. These are segments in the genetic code that can be deleted or copied most are deletions and a small number are duplications. The new map has also revealed that humans have:

1. 75 “jumping genes,” or transposable elements (regions of the genetic code that can move from one place to another in the genome of an individual).

2. more than 250 genes that can lose one of the two copies in chromosomes and not causing any obvious consequences, and

3. 56 genes that can join together, potentially forming new genes.

The ability to make comparisons of the DNA of organisms has led to the development of three new fields in biology— genomics, transcriptomics, and proteomics. Genomics is the comparison of the genomes of different organisms to identify similarities and differences. Species relatedness and gene similarities can be determined from these studies. When the DNA sequence of a gene is known, transcriptomics looks at when, where, and how much mRNA is expressed from a gene. Finally, proteomics examines the proteins that are predicted from the DNA sequence. From these types of studies, scientists are able to identify gene families that can be used to determine how humans have evolved at a molecular level. They can also examine how genes are used in an organism throughout its body and over its life span. They can also better understand how a protein works by identifying common themes from one protein to the next.

3. What types of questions can be answered by comparing the DNA of two different organisms?

4. What techniques do scientists use to compare DNA?

5. What benefits does the Human Genome Project offer?

6. What is the purpose of the PCR?

7. What role does electrophoresis play in DNA comparisons?

8. What are tandem clusters, segmental duplications and multigene families?

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DISCUSSÃO

In this study we analyzed the temporal MIRU VNTR genotype stability in M. tuberculosis by using serial isolates from patients chronically infected over long periods (up to 6 years) within a defined high-incidence geographic area. The 12 MIRU VNTR loci were identical within groups of serial isolates in 55 out of 56 cases (98.2%). The total set of 123 isolates included both drug-sensitive and drug-resistant strains from a range of 20 distinct genotype families as previously defined by IS6110 RFLP fingerprints (33). The strains contained 2 to 24 IS6110 bands. The 12 MIRU VNTR loci thus appear to be highly stable over a period as long as 6 years, within a large range of strain lineages and genetic backgrounds.

Even the 11 paired isolates with slightly different IS6110 RFLPs all displayed conserved MIRU VNTR genotypes. However, in one case serial isolates with an unchanged IS6110 RFLP pattern showed a change in the MIRU VNTR genotype, which was limited to 1 out of the 12 loci. Interestingly, this locus (locus 26) is one of the most polymorphic MIRU VNTR loci in M. tuberculosis strains, suggesting that its molecular clock is faster than those of the other loci (16, 26). The change in this locus consisted of a single repeat difference. Such a change is consistent with a stepwise VNTR mutation mechanism (sequential additions or deletions of repeat units), supported by a previous analysis of MIRU VNTR changes in locus 4 in the Mycobacterium bovis BCG genealogy (28). It should be noted that these isolates were separated by 309 days, which is far less than the time spans between many other first and last isolates (up to 2,185 days) during which MIRU VNTR genotypes were stable. Thus, this change is best interpreted by stochastic occurrence of a VNTR mutation event concomitant to emergence of a corresponding clonal variant in the bacterial population in the second isolation.

In agreement with previous studies (16, 26, 28), these results provide additional evidence that the mechanisms driving MIRU VNTR and IS6110 RFLP pattern polymorphisms are essentially independent from one another and that the combined evolution rate of the 12 MIRU VNTR loci is slightly lower than that of IS6110 RFLP. Therefore, the MIRU VNTRs appear suitable for reliable follow-up of patients chronically infected with M. tuberculosis over long periods. On the basis of the stability of MIRUs, the detection of changes in MIRU VNTR genotypes will help to clarify the definition of exogenous reinfection, which is currently based on observation of changes of at least three or four bands in IS6110 RFLP patterns (24, 35). This issue is particularly important for accurate estimation of success rates of tuberculosis control programs and for evaluation of clinical trials of new therapies.

Extrapolation of the rates of IS6110 RFLP changes within serial isolates (3, 4, 18, 35, 36) has led to proposal of the use of IS6110 RFLP primarily as an inclusion tool for tracking ongoing transmission. Two strains with identical fingerprints are considered to be included in the same epidemiologically linked cluster (7, 36), while the status of strains differing by one or more bands remains undefined. In previous studies, IS6110 RFLP changes were observed in 4 to 29% of serial isolates (3, 4, 18, 35, 36) and in an estimated 18% of isolates within chains of transmission in a period covering 6.5 years (34). Exceptionally, no changes were observed in IS6110 RFLP patterns obtained from isolates collected sequentially from patients in Texas, but most of these organisms were obtained within 60 days of one another, which may be a period too short for variation to be observed (22). Therefore, if one considers only absolutely identical IS6110 RFLPs as the sole criterion for inclusion of isolates in the same cluster, a significant proportion of isolates would be erroneously excluded (36).

The results presented here support MIRU VNTR genotyping as an efficient alternative to IS6110 RFLP as an exclusion/inclusion method for tracking ongoing transmission. Based on the stability of the 12 MIRU VNTR loci observed here, less than 2% of the isolates could be extrapolated to be erroneously excluded from a cluster if one considered absolute identity of all 12 MIRU loci as the sole criterion. Given the advantages of MIRU VNTR genotyping with respect to speed and ease of analysis, reproducibility, and discriminatory power (16, 26), we suggest the use of MIRU VNTR typing as a first-line analysis to identify clusters during ongoing transmission. Optionally, this first-line analysis could be complemented by spoligotyping (9). This simple PCR-based method targets a single locus and has lower discriminatory power but can nevertheless help distinguish between some MIRU VNTR or other VNTR genotypes with no apparent epidemiological links (12, 16, 23, 25). In cases where MIRU VNTR (and possibly spoligotype) profiles are identical, IS6110 RFLP could be used as a second-line analysis to confirm potential epidemiological links between isolates. This two-step strategy would be expected to increase the accuracy of outbreak investigations and to considerably accelerate epidemiological studies of M. tuberculosis.


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