Em formação

Como é criado o RNA Guia para o Crispr?


Parece que para modificar o DNA um RNA guia e Cripr são introduzidos.

Mas não consigo entender como o RNA Guia é feito ou criado.

É um método simples que pode ser feito com equipamentos de laboratório simples ou é complicado?

Qual é o equipamento necessário para criá-lo?


Novo tipo de tecnologia CRISPR para o RNA alvo, incluindo vírus de RNA como o coronavírus

Os rastreios genéticos baseados em CRISPR ajudaram os cientistas a identificar genes que são os principais intervenientes na anemia falciforme, imunoterapia do cancro, metástase do cancro do pulmão e muitas outras doenças. No entanto, essas telas genéticas são limitadas em escopo: elas podem apenas editar ou direcionar o DNA. Para muitas regiões do genoma humano, o direcionamento ao DNA pode não ser eficaz, e outros organismos, como vírus de RNA como coronavírus ou gripe, não podem ser direcionados de forma alguma com as telas CRISPR de direcionamento de DNA existentes.

Agora, em um novo recurso importante para a comunidade científica publicado hoje em Nature Biotechnology, pesquisadores do laboratório de Neville Sanjana, PhD, do New York Genome Center e da New York University, desenvolveram um novo tipo de tecnologia de tela CRISPR para direcionar o RNA.

Os pesquisadores capitalizaram em uma enzima CRISPR recentemente caracterizada, chamada Cas13, que tem como alvo o RNA em vez do DNA. Usando Cas13, eles projetaram uma plataforma otimizada para telas genéticas massivamente paralelas no nível de RNA em células humanas. Esta tecnologia de triagem pode ser usada para entender muitos aspectos da regulação do RNA e para identificar a função de RNAs não codificantes, que são moléculas de RNA que são produzidas, mas não codificam proteínas.

Visando milhares de locais diferentes em transcrições de RNA humano, os pesquisadores desenvolveram um modelo preditivo baseado em aprendizado de máquina para agilizar a identificação dos RNAs guia Cas13 mais eficazes. A nova tecnologia está disponível para pesquisadores por meio de um site interativo e uma caixa de ferramentas de código aberto para prever a eficiência do RNA guia para alvos de RNA personalizados e fornece RNAs-guia pré-projetados para todos os genes codificadores de proteínas humanas.

"Prevemos que as enzimas Cas13 direcionadas ao RNA terão um grande impacto na biologia molecular e nas aplicações médicas, mas pouco se sabe sobre o design do RNA guia para uma alta eficácia de direcionamento", disse o Dr. Sanjana, autor sênior do estudo. "Começamos a mudar isso por meio de um estudo aprofundado e sistemático para desenvolver princípios-chave e modelagem preditiva para o design de guia mais eficaz."

O Dr. Sanjana é um membro do corpo docente do New York Genome Center, um professor assistente de biologia na New York University e um professor assistente de neurociência e fisiologia na NYU School of Medicine.

As enzimas Cas13 são enzimas do tipo VI CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente intercaladas) que foram recentemente identificadas como proteínas de direcionamento de RNA programáveis ​​guiadas por RNA com atividade de nuclease que permite o knockdown do gene alvo sem alterar o genoma. Esta propriedade torna Cas13 um terapêutico potencialmente significativo para influenciar a expressão do gene sem alterar permanentemente a sequência do genoma.

"Este é o tipo de inovação tecnológica que fomentamos e desenvolvemos no New York Genome Center. Esta mais recente tecnologia CRISPR do Sanjana Lab tem implicações empolgantes para o avanço dos campos da genômica e da medicina de precisão", disse Tom Maniatis, PhD, Família Evnin Diretor científico e CEO do New York Genome Center.

O cientista pós-doutorado Hans-Hermann Wessels e o estudante de doutorado Alejandro M & eacutendez-Mancilla, que são os co-autores do estudo, desenvolveram um conjunto de novas ferramentas baseadas em Cas13 e conduziram uma tela de transcrição e permutação em células de mamíferos. No total, os pesquisadores coletaram informações para mais de 24.000 guias de segmentação de RNA.

"Nós organizamos RNAs-guia em muitos transcritos diferentes, incluindo vários genes humanos onde poderíamos medir facilmente o knock-down do transcrito por meio de coloração de anticorpos e citometria de fluxo", disse o Dr. Wessels. "Ao longo do caminho, descobrimos alguns insights biológicos interessantes que podem expandir a aplicação de enzimas Cas13 direcionadas ao RNA." Entre as descobertas da equipe, por exemplo, estão os insights sobre quais regiões do RNA guia são mais importantes para o reconhecimento de um RNA alvo. Usando milhares de RNAs guia com 1, 2 ou 3 incompatibilidades de uma única letra com seu RNA alvo, eles identificaram uma região de "semente" crítica que é extremamente sensível a incompatibilidades entre o guia CRISPR e o alvo. Esta descoberta ajudará os cientistas a projetar RNAs-guia para evitar atividade fora do alvo em RNAs-alvo não intencionais. Uma vez que uma célula humana típica expressa aproximadamente 100.000 RNAs, o direcionamento preciso de Cas13 apenas do alvo pretendido é vital para a triagem e aplicações terapêuticas.

Além de aprofundar nossa compreensão de Cas13 fora dos alvos, a região de "semente" poderia ser usada para biossensores de próxima geração que podem discriminar mais precisamente entre espécies de RNA intimamente relacionadas. No total, este estudo aumenta o número de pontos de dados de estudos Cas13 anteriores em células de mamíferos em mais de duas ordens de magnitude.

"Estamos particularmente entusiasmados em usar o sistema de triagem Cas13 otimizado para atingir RNAs não codificantes", disse o coautor M & eacutendez-Mancilla. "Isso expande muito a caixa de ferramentas CRISPR para telas genéticas e transcriptômicas futuras." No estudo, os pesquisadores notaram uma diferença marcante no knockdown de proteína ao almejar diferentes elementos codificadores e não codificantes de proteínas de RNAs mensageiros, e encontraram evidências de que Cas13 compete com outras proteínas de ligação a RNA envolvidas no processamento de transcrição e splicing.

A equipe recentemente alavancou seu modelo preditivo de RNA guia para uma análise particularmente crítica: a emergência de saúde pública do COVID-19 se deve a um coronavírus, que contém um genoma de RNA - não DNA. Usando o modelo derivado de suas telas maciçamente paralelas, os pesquisadores identificaram RNAs-guia ideais que poderiam ser usados ​​para detecção futura e aplicações terapêuticas.


RNA de guia específico de mutação para correção sem cicatrizes no alvo porfiria heterozigótica composta por CRISPR / Cas9 em células-tronco

CRISPR / Cas9 é uma tecnologia promissora para correção de genes. No entanto, a edição é freqüentemente bialélica, e pequenas inserções e deleções não controladas (indels) concomitantes à correção precisa são criadas. Os RNAs guia específicos de mutação foram recentemente testados para corrigir doenças hereditárias dominantes, poupando o alelo de tipo selvagem. Testamos uma abordagem original para corrigir mutações recessivas heterozigotas compostas. Comparamos a eficiência da edição e genotoxicidade por RNA guia bialélico versus RNA guia específico de alelo mutante em iPSCs derivadas de um paciente com porfiria eritropoiética congênita portadora de mutações heterozigotas compostas, resultando na invalidação do gene UROS. Obtivemos resgate da função UROS e correção metabólica com ambos os guias com potencial de uso para intervenção clínica de porfiria. No entanto, ao contrário do bialélico, o guia específico do alelo mutante estava livre de danos colaterais no alvo. Recomendamos este projeto para evitar genotoxicidade e para obter correção de gene sem cicatrizes no alvo para doença recessiva com casos frequentes de mutações heterozigóticas compostas.

Palavras-chave: CRISPR / Cas9 composto heterozigoto recessivo doença congênita porfiria eritropoiética terapia gênica iPSCs mutação específica edição precisa do genoma.

Copyright © 2020 os autores. Publicado pela Elsevier Inc. Todos os direitos reservados.


Sistemas CRISPR

Bactérias e arquéias possuem imunidade adaptativa contra elementos genéticos estranhos usando sistemas CRISPR-Cas. Após a infecção, novas sequências de DNA estranho são capturadas e integradas no locus CRISPR hospedeiro como novos espaçadores. O locus CRISPR é transcrito e processado para gerar RNAs CRISPR maduros, cada um codificando uma sequência espaçadora única. Cada crRNA se associa a proteínas efetoras Cas que usam crRNAs como guias para silenciar elementos genéticos estranhos que correspondem à sequência de crRNA. Estamos interessados ​​em elucidar os mecanismos subjacentes à imunidade CRISPR-Cas, especialmente na compreensão das funções das proteínas Cas e no desenvolvimento de novas ferramentas baseadas em CRISPR para aplicações de biotecnologia.

Os sistemas CRISPR – Cas são altamente diversos e foram divididos em muitos subtipos. O sistema Tipo I-E em E. coli usa o complexo Cascade para silenciamento de DNA estranho guiado por RNA. Cascade é composta de subunidades Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e e Cas6e e um crRNA, formando uma estrutura que se liga e desenrola dsDNA para formar um R-loop. Recentemente, usamos reconstruções de microscopia eletrônica de partícula única de Cascade ligado a dsDNA com e sem Cas3 para revelar que Cascade posiciona a extremidade proximal de PAM do duplex de DNA na subunidade Cse1 e perto do local de associação de Cas3. A descoberta de que o DNA alvo e Cas3 colocalizam com Cse1 implica esta subunidade em uma etapa chave de validação de alvo durante a interferência de DNA. Mostramos bioquimicamente que o emparelhamento de base da região PAM é desnecessário para a ligação ao alvo, mas crítico para a degradação mediada por Cas3. Juntos, esses dados mostram que a subunidade Cse1 de Cascade funciona como um parceiro essencial de Cas3, reconhecendo locais de DNA alvo e posicionando Cas3 adjacente ao PAM para garantir a clivagem (em colaboração com Eva Nogales, UC Berkeley, HHMI).

Os sistemas CRISPR-Cas do tipo II usam uma endonuclease de DNA guiada por RNA, Cas9, para gerar quebras de fita dupla no DNA invasivo durante uma resposta imune bacteriana adaptativa. A clivagem mediada por Cas9 é estritamente dependente da presença de um motivo adjacente de protoespaçador (PAM) no DNA alvo. A capacidade de programar Cas9 para clivagem de DNA em locais específicos definidos por RNAs guia levou à sua adoção como uma plataforma versátil para engenharia de genoma e regulação de genes. Para entender como o Cas9 usa seu RNA guia para interrogar as sequências de DNA alvo, resolvemos as estruturas moleculares de Cas9 nos estados apo, ligado ao RNA guia e ligado ao DNA alvo. Estruturas de cristal de Cas9 ligado ao RNA de guia único revelam uma conformação distinta de ambos os estados ligados a apo e DNA, em que a sequência de "semente" de RNA de 10 nucleotídeos necessária para a interrogação inicial do DNA é pré-ordenada em uma conformação de forma A. Este segmento do RNA guia é essencial para Cas9 formar uma estrutura competente de reconhecimento de DNA que está pronta para envolver sequências alvo de DNA de fita dupla. Nós interpretamos isso como uma evolução convergente de um mecanismo de "semente" que lembra aquele usado pelas proteínas Argonaute durante a interferência de RNA em eucariotos.

Os complexos de vigilância guiados por RNA CRISPR têm como alvo o DNA estranho para degradação por meio do emparelhamento de bases RNA-DNA e reconhecimento de uma sequência única adjacente ao DNA alvo, chamada de motivo adjacente do protoespaçador (PAM). Abordar como o DNA é desenrolado durante esse evento de ligação e como sequências-alvo curtas de 20-30 pares de bases são eficientemente localizadas e reconhecidas em genomas inteiros, tem sido um foco recente de nossa pesquisa. Em colaboração com o laboratório de Eric Greene na Universidade de Columbia, aplicamos uma combinação de experimentos bioquímicos de molécula única e em massa para resolver o mecanismo de interrogação de DNA para dois complexos filogeneticamente não relacionados: Cas9, a proteína de direcionamento de DNA encontrada no tipo II CRISPR-Cas (S. pyogenes) e Cascade, o complexo de direcionamento de DNA encontrado nos sistemas CRISPR-Cas do Tipo IE (E. coli). Nossos resultados revelaram que a busca do alvo é guiada por PAM, e que esses complexos distintos guiados por RNA convergiram em um mecanismo comum para o reconhecimento do DNA alvo.


Explicador: Como funciona o CRISPR

Os cientistas estão usando uma ferramenta chamada CRISPR / Cas9 para editar o DNA.

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Os cientistas geralmente evitam usar a palavra milagre. A menos que eles estejam falando sobre a ferramenta de edição de genes chamada CRISPR. “Você pode fazer qualquer coisa com o CRISPR”, dizem alguns. Outros simplesmente consideram isso incrível.

Na verdade, surpreendeu tantas pessoas e tão rapidamente que, apenas oito anos depois de descobri-lo, Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier levaram para casa o Prêmio Nobel de Química de 2020.

CRISPR significa “agrupado regularmente intercalado curto palíndromo repete. ” Essas repetições são encontradas no DNA da bactéria. Na verdade, eles são cópias de pequenos pedaços de vírus. As bactérias os usam como coleções de fotos para identificar vírus nocivos. Cas9 é um enzima que pode separar o DNA. As bactérias lutam contra os vírus enviando a enzima Cas9 para cortar os vírus que têm uma foto na coleção. Cientistas descobriram recentemente como as bactérias fazem isso. Agora, no laboratório, os pesquisadores usam uma abordagem semelhante para transformar o sistema de combate a vírus do micróbio na mais nova ferramenta de laboratório.

Esta ferramenta CRISPR / Cas9 foi descrita pela primeira vez em 2012 e 2013. Laboratórios científicos em todo o mundo logo começaram a usá-la para alterar o genoma de um organismo - o conjunto completo de suas instruções de DNA.

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Essa ferramenta pode ajustar de forma rápida e eficiente quase qualquer gene em qualquer planta ou animal. Pesquisadores já o usaram para consertar doenças genéticas em animais, combater vírus e esterilizar mosquitos. Eles também o usaram para preparar órgãos de porcos para transplantes humanos e para fortalecer os músculos de beagles.

Até agora, o maior impacto do CRISPR foi sentido nos laboratórios de biologia básica. Este editor de genes de baixo custo é fácil de usar. Isso possibilitou aos pesquisadores mergulhar nos mistérios básicos da vida. E eles podem fazer isso de maneiras que costumavam ser difíceis, senão impossíveis.

Robert Reed é um biólogo do desenvolvimento na Cornell University em Ithaca, N.Y. Ele compara o CRISPR a um mouse de computador. “Você pode simplesmente apontá-lo para um local no genoma e fazer o que quiser naquele local.”

No início, isso significava qualquer coisa que envolvesse o corte de DNA. O CRISPR / Cas9 em sua forma original é um dispositivo de retorno (a parte CRISPR) que orienta a tesoura molecular (a enzima Cas9) para uma seção alvo do DNA. Juntos, eles funcionam como um míssil de cruzeiro de engenharia genética que desativa ou repara um gene, ou insere algo novo onde a tesoura Cas9 fez alguns cortes. As versões mais recentes do CRISPR são chamadas de "editores básicos". Eles podem editar o material genético uma base de cada vez, sem cortes. Eles se parecem mais com um lápis do que com uma tesoura.

É assim que funciona

Os cientistas começam com o RNA. Essa é uma molécula que pode ler a informação genética no DNA. O RNA encontra o ponto no núcleo de uma célula onde alguma atividade de edição deve ocorrer. (O núcleo é um compartimento em uma célula onde a maior parte do material genético é armazenado.) Este guia o RNA conduz Cas9 para o ponto preciso no DNA onde um corte é necessário. Cas9 então se conecta ao DNA de fita dupla e o descompacta.

Isso permite que o RNA guia se emparelhe com alguma região do DNA que tem como alvo. Cas9 corta o DNA neste local. Isso cria uma quebra em ambas as fitas da molécula de DNA. A célula, percebendo um problema, repara a quebra.

Consertar a quebra pode desativar um gene (a coisa mais fácil de fazer). Alternativamente, esse reparo pode corrigir um erro ou mesmo inserir um novo gene (um processo muito mais difícil).

As células geralmente reparam uma quebra em seu DNA colando as pontas soltas novamente. Esse é um processo desleixado. Freqüentemente, resulta em um erro que desativa alguns genes. Isso pode não parecer útil - mas às vezes é.

Os cientistas cortaram o DNA com CRISPR / Cas9 para fazer alterações genéticas, ou mutações. Ao comparar as células com e sem a mutação, os cientistas às vezes podem descobrir qual é o papel normal de uma proteína. Ou uma nova mutação pode ajudá-los a entender as doenças genéticas. CRISPR / Cas9 também pode ser útil em células humanas ao desativar certos genes - alguns, por exemplo, que desempenham um papel em doenças hereditárias.

“O Cas9 original é como um canivete suíço com apenas uma aplicação: é um canivete”, diz Gene Yeo. Ele é um biólogo de RNA na Universidade da Califórnia, San Diego. Mas Yeo e outros injetaram outras proteínas e produtos químicos nas lâminas cegas. Isso transformou aquela faca em uma ferramenta multifuncional.

CRISPR / Cas9 e ferramentas relacionadas agora podem ser usados ​​de novas maneiras, como alterar uma única base de nucleotídeo - uma única letra no código genético - ou adicionar uma proteína fluorescente para marcar um ponto no DNA que os cientistas desejam rastrear. Os cientistas também podem usar essa tecnologia genética de cortar e colar para ativar ou desativar genes.

Esta explosão de novas maneiras de usar o CRISPR não terminou. Feng Zhang é biólogo molecular do Instituto de Tecnologia de Massachusetts em Cambridge. Ele foi um dos primeiros cientistas a empunhar a tesoura Cas9. “O campo está avançando muito rapidamente”, diz ele. “Só de olhar até onde chegamos ... acho que o que veremos nos próximos anos será simplesmente incrível.”

Esta história foi atualizada em 8 de outubro de 2020 para observar a decisão do comitê Nobel & # 8217s de conceder a descoberta do CRISPR & # 8217s o prêmio 2020 em química.

Palavras de Poder

aplicativo Um uso ou função particular de algo.

base (em genética) Uma versão abreviada do termo nucleobase. Essas bases são blocos de construção de moléculas de DNA e RNA.

biologia O estudo das coisas vivas. Os cientistas que os estudam são conhecidos como biólogos.

Cas9 Uma enzima que os geneticistas estão usando agora para ajudar a editar genes. Ele pode cortar o DNA, permitindo-lhe consertar genes quebrados, unir em novos ou desativar certos genes. O Cas9 é conduzido até o local onde deveria fazer os cortes pelos CRISPRs, uma espécie de guias genéticos. A enzima Cas9 veio de bactérias. Quando os vírus invadem uma bactéria, essa enzima pode fragmentar o DNA dos germes, tornando-o inofensivo.

célula A menor unidade estrutural e funcional de um organismo. Normalmente muito pequeno para ser visto a olho nu, consiste em um fluido aquoso rodeado por uma membrana ou parede. Os animais são compostos de milhares a trilhões de células, dependendo de seu tamanho. Alguns organismos, como leveduras, fungos, bactérias e algumas algas, são compostos por apenas uma célula.

químico Uma substância formada por dois ou mais átomos que se unem (tornam-se ligados) em uma proporção e estrutura fixas. Por exemplo, a água é um produto químico feito de dois átomos de hidrogênio ligados a um átomo de oxigênio. Seu símbolo químico é H2O.

CRISPR Uma abreviatura - pronunciada mais nítida - para o termo "repetições palindrômicas curtas com espaçamento regular entre espaçamentos". São pedaços de RNA, uma molécula que carrega informações. Eles são copiados do material genético de vírus que infectam bactérias. Quando uma bactéria encontra um vírus ao qual foi exposta anteriormente, ela produz uma cópia de RNA do CRISPR que contém a informação genética desse vírus. O RNA então guia uma enzima, chamada Cas9, para cortar o vírus e torná-lo inofensivo. Os cientistas estão agora construindo suas próprias versões de RNAs CRISPR. Esses RNAs feitos em laboratório guiam a enzima para cortar genes específicos em outros organismos. Os cientistas os usam, como uma tesoura genética, para editar - ou alterar - genes específicos para que possam estudar como o gene funciona, reparar danos a genes quebrados, inserir novos genes ou desativar genes prejudiciais.

desenvolvimentista (em biologia) Um adjetivo que se refere às mudanças pelas quais um organismo passa desde a concepção até a idade adulta. Essas mudanças geralmente envolvem química, tamanho e às vezes até mesmo forma.

DNA (abreviação de ácido desoxirribonucléico) Uma molécula longa, de fita dupla e em forma de espiral dentro da maioria das células vivas que carrega instruções genéticas. Ele é construído em uma espinha dorsal de átomos de fósforo, oxigênio e carbono. Em todas as coisas vivas, de plantas e animais a micróbios, essas instruções dizem às células quais moléculas fazer.

Engenharia Campo de pesquisa que usa matemática e ciências para resolver problemas práticos.

campo Uma área de estudo, como em: Seu campo de pesquisa era a biologia. Também é um termo para descrever um ambiente do mundo real no qual algumas pesquisas são conduzidas, como no mar, na floresta, no topo de uma montanha ou na rua de uma cidade. É o oposto de um ambiente artificial, como um laboratório de pesquisa.

fluorescente Capaz de absorver e reemitir luz. Essa luz reemitida é conhecida como fluorescência.

gene (adj. genético) Um segmento de DNA que codifica, ou contém instruções, para a produção de uma proteína. A prole herda genes de seus pais. Os genes influenciam a aparência e o comportamento de um organismo.

genoma O conjunto completo de genes ou material genético em uma célula ou organismo. O estudo dessa herança genética alojada nas células é conhecido como genômica.

músculo Tipo de tecido usado para produzir movimento pela contração de suas células, conhecidas como fibras musculares. O músculo é rico em uma proteína, por isso as espécies predadoras procuram presas que contenham muito desse tecido.

mutação (v. mutação) Alguma mudança que ocorre em um gene no DNA de um organismo. Algumas mutações ocorrem naturalmente. Outros podem ser desencadeados por fatores externos, como poluição, radiação, medicamentos ou algo na dieta. Um gene com essa alteração é denominado mutante.

núcleo Plural é núcleos. (em biologia) Uma estrutura densa presente em muitas células. Normalmente, uma única estrutura arredondada envolta em uma membrana, o núcleo contém a informação genética.

órgão (em biologia) Várias partes de um organismo que desempenham uma ou mais funções específicas. Por exemplo, um ovário é um órgão que produz óvulos, o cérebro é um órgão que interpreta os sinais nervosos e as raízes de uma planta são órgãos que absorvem nutrientes e umidade.

palíndromo (adj. palíndromo) Uma palavra, um nome ou uma frase que tem a mesma ordem de letras quando lida para frente ou para trás. Por exemplo, Papai e mãe são ambos palíndromos.

proteína Composto feito de uma ou mais longas cadeias de aminoácidos. As proteínas são uma parte essencial de todos os organismos vivos. Eles formam a base das células vivas, músculos e tecidos e também fazem o trabalho dentro das células. A hemoglobina no sangue e os anticorpos que tentam combater infecções estão entre as proteínas autônomas mais conhecidas. Os medicamentos freqüentemente atuam fixando-se nas proteínas.

RNA Uma molécula que ajuda a “ler” a informação genética contida no DNA. A maquinaria molecular de uma célula lê DNA para criar RNA e, em seguida, lê RNA para criar proteínas.

marcação (em biologia) Para prender alguma faixa robusta ou pacote de instrumentos em um animal. Às vezes, a etiqueta é usada para dar a cada indivíduo um número de identificação exclusivo. Uma vez preso à perna, orelha ou outra parte do corpo de uma criatura, pode efetivamente se tornar o "nome" do animal. Em alguns casos, uma etiqueta pode coletar informações do ambiente ao redor do animal também. Isso ajuda os cientistas a entender o meio ambiente e o papel do animal nele.

Citações

Jornal: S. Wang et al. Um sistema de rotulagem CRISPR de duas cores baseado em aptâmero de RNA. Relatórios Científicos. Vol. 6, 27 de maio de 2016, p. 26857. doi: 10.1038 / srep26857.

Jornal: A. C. Komor et al. Edição programável de uma base alvo no DNA genômico sem clivagem de DNA de fita dupla. Natureza. Vol. 533, 19 de maio de 2016, publicado online em 20 de abril de 2016, p. 420. doi: 10.1038 / nature17946.

Jornal: D. A. Nelles et al. Rastreamento de RNA programável em células vivas com CRISPR / Cas9. Célula. Vol. 165, 7 de abril de 2016, p. 488. doi: 10.1016 / j.cell.2016.02.054.

Sobre Tina Hesman Saey

Tina Hesman Saey é redatora sênior da equipe e faz relatórios sobre biologia molecular. Ela tem um Ph.D. em genética molecular pela Washington University em St. Louis e um mestrado em jornalismo científico pela Boston University.

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A descoberta do CRISPR abre caminho para o novo método de teste COVID-19

A nova plataforma LEOPARD tem o potencial de detectar uma variedade de biomarcadores relacionados a doenças em apenas um teste. Crédito: Sandy Westermann / HIRI

A maioria dos diagnósticos moleculares convencionais geralmente detecta apenas um único biomarcador relacionado à doença. Ótimos exemplos são os testes de PCR atualmente usados ​​para diagnosticar COVID-19 pela detecção de uma sequência específica do SARS-CoV-2. Os chamados métodos singleplex fornecem resultados confiáveis ​​porque são calibrados para um único biomarcador. No entanto, determinar se um paciente está infectado com uma nova variante do SARS-CoV-2 ou um patógeno completamente diferente requer a sondagem de muitos biomarcadores diferentes ao mesmo tempo.

Cientistas do Instituto Helmholtz para Pesquisa de Infecção baseada em RNA (HIRI) e da Universidade Julius Maximilians (JMU) em Würzburg agora abriram o caminho para uma plataforma de diagnóstico completamente nova com LEOPARD. É um método baseado em CRISPR altamente multiplexável, com potencial para detectar uma variedade de biomarcadores relacionados a doenças em apenas um teste.

LEOPARD, que significa "Leveraging Engineered tracrRNAs and On-target DNAs for PArallel RNA Detection", é baseado na descoberta de que o corte de DNA por Cas9 pode estar ligado à presença de um ácido ribonucleico (RNA) específico. Este link permite que o LEOPARD detecte muitos RNAs de uma vez, abrindo oportunidades para a detecção simultânea de RNAs de vírus e outros patógenos em uma amostra de paciente.

O estudo publicado hoje em Ciência foi iniciado por Chase Beisel, professor do JMU e líder do grupo de pesquisa do HIRI, e a professora Cynthia Sharma do Instituto de Biologia da Infecção Molecular (IMIB) do JMU. “Com o LEOPARD, conseguimos detectar fragmentos de RNA de nove vírus diferentes ', diz Beisel.“ Também fomos capazes de diferenciar o SARS-CoV-2 e uma de suas variantes em uma amostra de paciente enquanto confirmamos que cada amostra foi coletada corretamente do paciente."

CRISPR-Cas9 é conhecido principalmente como uma ferramenta biomolecular para edição de genoma. Aqui, o CRISPR-Cas9 funciona como uma tesoura molecular que corta sequências de DNA específicas. Essas mesmas tesouras são usadas naturalmente pelas bactérias para cortar o DNA associado aos vírus invasores. Seja editando genomas ou eliminando vírus, o corte de Cas9 é dirigido por RNAs guia. Os RNAs guias encontrados nas bactérias devem emparelhar com um RNA separado denominado tracrRNA. O casal de RNA pode então trabalhar com Cas9 para direcionar o corte de DNA.

Uma descoberta inesperada

O tracrRNA foi pensado para emparelhar apenas com RNAs guia provenientes do sistema antiviral. No entanto, os cientistas de Würzburg descobriram que o tracrRNA estava emparelhando com outros RNAs, transformando-os em RNAs guias. Cynthia Sharma, presidente de Biologia de Infecção Molecular II do IMIB e porta-voz do Centro de Pesquisa para Doenças de Infecção (ZINF) do JMU ficou surpresa com esta descoberta: "Quando procuramos por RNAs que se ligam a Cas9 em nosso organismo modelo Campylobacter, surpreendentemente encontramos que detectamos não apenas RNAs guia, mas também outros fragmentos de RNA na célula que se pareciam com RNAs guia. O tracrRNA estava emparelhando com esses RNAs, resultando em RNAs guia "não canônicos" que poderiam direcionar o corte de DNA por Cas9. "

A plataforma de diagnóstico LEOPARD se baseia nessa descoberta. "Nós descobrimos como reprogramar os tracrRNAs para decidir quais RNAs se tornam RNAs guias", diz Beisel. "Ao monitorar um conjunto de DNAs correspondentes, podemos determinar quais RNAs estavam presentes em uma amostra com base em quais DNAs são cortados. Como parte da pandemia em andamento, o LEOPARD pode permitir que um médico descubra se o paciente está infectado com SARS-CoV -2, se for uma variante única e se a amostra foi coletada corretamente ou precisa ser repetida - tudo em um único teste. "

No futuro, o desempenho do LEOPARD pode diminuir até mesmo os testes de PCR multiplexados e outros métodos. "A tecnologia tem o potencial de revolucionar o diagnóstico médico não apenas para doenças infecciosas e resistências a antibióticos, mas também para câncer e doenças genéticas raras", disse Oliver Kurzai, diretor do Instituto de Higiene e Microbiologia da JMU, que forneceu amostras de pacientes para o estudo.

"O trabalho destaca a excelente pesquisa colaborativa e interdisciplinar que ocorre aqui em Würzburg", disse Jörg Vogel, diretor do IMIB e HIRI, uma instalação conjunta da JMU com o Centro Helmholtz para Pesquisa de Infecções em Braunschweig. "O LEOPARD demonstra de forma impressionante que podemos cobrir todo o espectro de pesquisas complementares de ponta em Würzburg, desde os fundamentos da pesquisa de RNA até as aplicações clínicas."


Como é criado o RNA Guia para o Crispr? - Biologia

Selecione um formato abaixo para encontrar guias de nocaute para seu gene de interesse & ndash Todos com garantia de edição de seu gene alvo

SgRNA sintético

Formato de guia de uma parte - ideal para tipos de células complexas e difíceis de editar

CrRNA sintético

Edição eficiente para uso na maioria dos tipos de células - deve ser usado com tracrRNA sintético

Lentiviral sgRNA

Expressão de RNA guia estável para tipos de células não passíveis de transfecção

SgRNA lentiviral tudo-em-um

Combine a expressão de sgRNA e Cas9 em um único vetor

RNA guia personalizado

Guia de design de RNAs para uso em mais de 40 espécies ou com uma nuclease alternativa

Solicitar RNA de guia personalizado
Ferramenta de Design CRISPR
  • Visão geral
  • Guia de seleção
  • Dados de apoio
  • Produtos
  • Garantia

Os RNAs guia programam nucleases Cas9 para cortar em um local genômico específico. O projeto de um RNA guia eficaz é fundamental para alcançar um nocaute genético eficiente.

Todos os produtos de RNA guia predefinidos Edit-R são projetados com um algoritmo validado para maximizar a probabilidade de nocaute de proteína funcional, não apenas para criar uma quebra de fita dupla. Ao avaliar os fenótipos de milhares de designs e, em seguida, validar nossas regras de design em outros sistemas de ensaio, estabelecemos padrões para determinar os locais-alvo com maior probabilidade de atingir o knockout funcional com alta especificidade.

Os RNAs guia sintéticos e lentivirais também podem ser projetados para espécies adicionais, nucleases alternativas ou qualquer região específica dentro de um gene usando a ferramenta de design CRISPR. Para aqueles que projetam RNA guia que usam Staph aureus Cas9 para clivagem, a Horizon recomenda NEB EnGen & reg Sau Cas9 para sua nuclease.

RNAs guia no sistema CRISPR-Cas9

Além da expressão da nuclease Cas9, o sistema CRISPR-Cas9 requer uma molécula de RNA específica para recrutar e direcionar a atividade da nuclease para a região de interesse. Esses RNAs guia assumem uma de duas formas:

  1. Um RNA CRISPR transativador sintético (tracrRNA) mais um RNA CRISPR sintético (crRNA) projetado para clivar o local do gene alvo de interesse (Figura 1a)
  2. Um RNA guia único sintético ou expresso (sgRNA) que consiste em crRNA e tracrRNA como um único construto (Figura 1b)

Figura 1a. Ilustração da nuclease Cas9 programada pelo crRNA: complexo tracr cortando ambas as fitas do DNA genômico 5 'do PAM

Guia de seleção de RNA

A determinação do tipo mais apropriado de RNA guia para seu experimento dependerá de sua aplicação específica e do tipo de célula. Use esta tabela para começar a selecionar o formato de guia de RNA correto para suas condições experimentais específicas.

CrRNA sintético SgRNA sintético Lentiviral sgRNA Lentiviral All-in-one sgRNA
Garantido para editar o seu gene de interesse
Pode ser customizado para qualquer espécie, nuclease ou local de edição
RNP compatível para eletroporação
Transduzem em células difíceis de editar que não podem ser eletroporadas
Enriquecimento da população com marcadores de resistência a antibióticos
Disponível em vetor tudo-em-um (sgRNA + Cas9) para fluxo de trabalho simplificado

Dados de apoio

As pontuações do algoritmo Edit-R se correlacionam com a eficiência de clivagem

10 crRNAs with high functional scores for 10 genes (blue bars) and 10 crRNAs with low functional scores for the same genes (yellow bars) were tested for editing by Next Generation Sequencing. 93% of the high-scoring crRNAs and 32 % of the low scoring crRNAs showed > 40% of editing (indel formation). The Cas9-HEK293T cell line was transfected with 50 nM crRNA:tracrRNA, using 0.25 µL/well of DharmaFECT 1. Seventy-two hours post-transfection, cells were lysed and Nextera transposon-adapted amplicons spanning each crRNA site were generated for every treated sample as well as for a matched control amplicon from untransfected samples. Samples were indexed using the Nextera 96-well index kit and pooled for sequencing on a MiSeq instrument (paired end reads, 2 x 300 length). Reads that passed NGS quality filtering criteria were aligned to the reference file (Bowtie2 v2.1.0). Percent perfect reads were calculated and normalized to the control untransfected samples (Samtools v0.1.12a) the data is presented as normalized percent edited.

CrRNAs with high algorithm functional scores have also perform well in other functional assays

U2OS-Proteasome cells with integrated Cas9 (under CAG promoter) were plated in 96-well plates at 10,000 cells per well. 24h after plating, cells were transfected with 25 nM crRNA:tracrRNA using 0.2 µg/well of DharmaFECT4. Cell were analyzed for apoptosis 48 h after transfection using the ApoONE homogeneous assay (Promega). Shown is a box plot representation of the functionality of crRNAs targeting BCL2L1, PLK1 or WEE1 in ApoONE assay. To generate the box plot, the crRNAs were divided into bottom half (H1) and top half (h2) based on their functional score. The medians, distribution of data between the lower and upper quartile and the minimum and maximum values demonstrate that high-scoring crRNAs have increased functionality.

Edit-R synthetic guide RNA products

Predesigned synthetic sgRNA

Genome wide synthetic sgRNA designs guaranteed to edit your gene of interest. The design algorithm maximizes the potential for functional protein knockout while minimizing off-target editing through stringent specificity checks.

Positive synthetic sgRNA controls and detection primers

Species-specific synthetic sgRNAs targeting well-characterized genes, as well as mismatch detection assay primers, to determine the effectiveness of your gene editing conditions for maximal efficiency.

Synthetic sgRNA non-targeting controls

Non-targeting controls to evaluate cellular responses to CRISPR-Cas9 components in the absence of gene target-specific sgRNA.

Predesigned synthetic crRNA

Guaranteed to edit your target! Algorithm-optimized crRNA for genome-wide coverage of human and mouse genes. Modifications for nuclease resistance improve DNA-free editing.

Positive synthetic crRNA controls and detection primers

Species-specific synthetic crRNAs targeting well-characterized genes, as well as mismatch detection assay primers, to determine the effectiveness of your gene editing conditions for maximal efficiency.

Synthetic crRNA non-targeting controls

Non-targeting controls to evaluate cellular responses to CRISPR-Cas9 components in the absence of gene target-specific crRNA.

TracrRNA

Trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) is synthetic, HPLC-purified, long RNA required for use with Edit-R synthetic crRNA to form the complex that programs Cas9 nuclease. It is modified for nuclease resistance and can be used with modified or unmodified Edit-R crRNA.

CrRNA libraries

Plated pre-defined collections of popular gene families for arrayed knockout screening

Cherry-pick libraries

Have a favorite gene list? Customize and order plates of predesigned guide RNAs for knockout studies in your targets of interest

Edit-R all-in-one lentiviral sgRNA products

All-in-one lentiviral sgRNA

Genome-wide combined Cas9 and sgRNAs for efficient gene knockout & unparalleled specificity available as glycerol stocks and high-titer purified particles.

All-in-one lentiviral sgRNA positive controls and kits

All-in-one lentiviral sgRNA controls to verify DNA double-strand breaks and gene editing efficiencies.

All-in-one lentiviral sgRNA non-targeting controls

All-in-one lentiviral sgRNA constructs bioinformatically designed to not target any gene in human or mouse genomes.

Edit-R Lentiviral sgRNA products

Predesigned lentiviral sgRNA

Guaranteed to edit your target, algorithm-optimized sgRNA for genome-wide coverage of human or mouse genes. Provided as high-titer lentiviral particles or glycerol stocks.

Lentiviral sgRNA positive controls

Species-specific sgRNAs targeting well-characterized genes to determine the effectiveness of your gene editing conditions for maximum efficiency.

Lentiviral sgRNA non-targeting controls

Non-targeting controls to evaluate cellular responses to CRISPR-Cas9 components in the absence of gene-specific sgRNA.

Pooled lentiviral sgRNA libraries

High-titer pooled screening libraries for pre-defined gene sets in human and mouse.

Arrayed lentiviral sgRNA libraries

Arrayed collections of lentiviral sgRNA libraries for high-throughput knockout screening across entire human gene families.

Custom guide RNA design & ordering tools

CRISPR Design Tool

Place a custom guide RNA order, or design and order your own synthetic sgRNA, crRNA, or lentiviral sgRNA with our easy-to-use interface.

Edit-R HDR donor template design, ordering tools & kits

HDR Donor Designer - oligo

Design and order a single-strand DNA donor (&le 150 nt) for insertion, deletion, or other alteration.

HDR Donor Designer - plasmid

Design and order a plasmid DNA donor kit for insertion of a mKate2 or EGFP fluorescent marker, or other a custom insert.

HDR plasmid donor kits

Rapidly and easily assemble a plasmid donor for HDR

HDR plasmid donor components

Quickly and efficiently build a HDR donor plasmid

HDR plasmid donor primers

PCR components for Edit-R Plasmid Donor Kits

The Edit-R predesigned guide RNA guarantee

We guarantee that EVERY predesigned guide RNA will provide successful editing at the target site when delivered as described in the Edit-R technical manuals.

The Edit-R guide RNA guarantee is valid when used with any wild type S. pyogenes Cas9 nuclease, including mRNA, expression plasmid, protein, or stable Cas9 expression, and Edit-R crRNAs must be used with Edit-R tracrRNA for the guarantee to apply.

Analysis of editing of the treated cell population must be shown using a T7EI or Surveyor mismatch detection assay. If successful editing is not observed for a predesigned Edit-R guide RNA while an appropriate side-by-side Edit-R positive control is successful, a one-time replacement of a different predesigned Edit-R guide RNA of the same format and quantity will be provided at no cost.

A replacement will only be approved upon discussion with our Technical Support team.

Successful editing at the DNA level does not always lead to functional gene knockout it is recommended to test multiple guide RNAs to determine the most effective guide RNA for knockout of your target gene.

This guarantee does not extend to any accompanying experimental costs, does not apply to guide RNAs ordered via the CRISPR Design Tool, and will not be extended to the replacement guide RNA.


Apresentou

Destaques

CRISPR is an incredibly useful tool for geneticists and microbiologists. Short for clustered regularly interspaced short palindromic repeats, it sounds intimidating on the basis of name alone. Yet it’s a tool that Annie Taylor—a senior applied and engineering physics major at Cornell University—uses extensively in her research. What she does with CRISPR showcases some of its powers.

“I can write out a nucleotide sequence on my computer, buy a custom-made DNA fragment for that sequence, and use it to program the CRISPR system to target practically any DNA sequence I want with high specificity.” She explains. Hearing how she uses it, it’s easy to imagine that CRISPR has had a tremendous impact in biological research, with applications in countless subdisciplines.

Creating Genetic Circuits to Operate Like Computer Circuits

Taylor conducts her research in Guillaume Lambert’s lab, Applied and Engineering Physics, which focuses on creating genetic circuits in cells—an application of CRISPR in synthetic biology. Genetic circuits are analogous to logic circuits in electrical engineering. Logic circuits are comprised of many logic gates they alter the voltage and current of a system as it passes through them. Similarly to how computers function, genetic circuits may eventually be used to perform complex logic functions in a cell.

Many types of logic gates perform a variety of functions. Taylor is working on a particular type of logic gate known as a NOT gate, or an inverter. The input of the gate is at a high voltage, while the output of the gate is at a low voltage (or vice versa). In electrical engineering, high voltage is represented by one, while low voltage is zero. A one at the input of a NOT gate would produce a zero at the output. The same is true the other way around.

In biological systems, there is no high voltage or low voltage. Instead, one and zero would correspond to high and low protein expression. A one would mean that a certain protein is expressed, while a zero would mean the protein is inactive.

“While the systems and the techniques are biological, a lot of the underlying theories of our work revolve around physics.”

In a cell, protein expression can be easily examined. One can insert marker genes such as the green fluorescent protein (GFP) gene. A cell that is expressing GFP will glow green in ultraviolet light or blue light, so one can tell whether or not GFP is being expressed by simply shining a blue light over the colonies. Taylor inserts these marker genes into a cell by inserting them into a plasmid, a structure that carries genetic information, which is then absorbed and incorporated into bacterial cells. The end result is a colony of cells that glows green in blue light. Taylor then uses the CRISPR system to target this inserted GFP gene.

How CRISPR Works

“The CRISPR system, in nature, is a bacterial immune system. Bacteria are trying to protect themselves from viruses, which are basically sequences of foreign DNA. They have to be able to recognize what genetic information is foreign and what genetic information is their own.”

To do this, bacterial cells produce Cas proteins, which bind to a guide RNA sequence. Then the Cas protein inspects any DNA it encounters. If any sequences on the DNA match with the guide RNA sequence, the Cas protein recognizes it as being foreign DNA and destroys it.

The most commonly used Cas protein for gene editing, Cas9, natively acts to cut DNA at the place where it is identical to the guide RNA sequence, but Cas9 can be modified in many ways. For instance, the Lambert lab often uses dead Cas9—known as dCas9)—which has been modified so that it is catalytically inactive. When it recognizes a DNA sequence, instead of cutting the DNA, dCas9 binds to that sequence and inhibits transcription. The target DNA sequence is not cleaved but becomes unable to express the protein for which it codes.

The power of the CRISPR system lies in the fact that one can modify the 20-base pair guide RNA sequence that the Cas9 protein binds to. If one knows a critical sequence of DNA on a gene of interest, they can create a corresponding guide RNA sequence that will cause the Cas9 protein to target that area of DNA. If it is dCas9 protein, then it will bind to that sequence of DNA and inhibit transcription, the expression of a protein at that site.

Taylor can design a guide RNA sequence that she knows will correspond to a sequence on one of the marker genes she inserts. For example, she can create a sequence of RNA that corresponds to a critical part of the GFP gene. Before she inserts the guide RNA sequence, the bacterial cells will express the GFP gene. Afterward when the dCas9 has bound to the RNA sequence, recognized the corresponding sequence on the DNA, and deactivated it, the colonies will no longer produce GFP and will no longer glow under ultraviolet light.

“There are a variety of Cas proteins,” Taylor explains. “Each Cas protein may have a different guide RNA structures or may deactivate genes in different ways. And while dead Cas9 inhibits transcriptions, there are other ways to modify Cas proteins to activate genes. It gives us control over which genes are expressed in a cell and which are inhibited.”

Creating Genetics Circuits

One of the aims of the Lambert lab is to use this control over gene expression in order to generate a genetic circuit. They want to develop a system in which they can submit certain inputs, and knowing how the logic gates in the cell will interact with the inputs, be able to obtain a predictable result.

Living systems are incredibly complex, however. Having multiple logic gates might cause them to interfere with each other’s function. The Lambert lab is working to understand the limitations of the system. How many logic gates can be inserted until their behavior is no longer predictable and stable? What are the off-target effects of the CRISPR system?

“If you have a genome that is millions or billions of base pairs long, there might be several locations that the Cas protein will unintendedly target, because they match the 20-base pair guide RNA sequence simply by chance,” Taylor says. “This might be disastrous for the cell, or the cell might appear to be unaffected. It just depends on where those off-target sequences are and what they code for.”

The Fusion of Physics and Biology

Taylor appreciates the intersection between sciences, which is the focus of the Lambert lab. She entered Cornell interested in aerospace engineering, yet in her senior year she has found a passion for combining physics and biology. Minoring in biological sciences, Taylor has been able to apply her coursework to her lab work.

“While the systems and the techniques are biological, a lot of the underlying theories of our work revolve around physics,” she says. She hopes to use the gene editing and manipulation tools that she has learned through her work with the Lambert lab in her future research.

CRISPR is both a scary name and a powerful tool, and as Taylor has learned through her work with the Lambert lab, its applications to scientific research are widespread. It has the potential to turn genetic loci into logic gates and cells into circuits, to turn proteins on or off at will, and to inform our growing knowledge of how cells—and life—function.


Our Role in Developing CRISPR/Cas9

We are proud to offer our newest line of CRISPR genome editing tools to the global research community. As the first company to commercially offer targeted genome editing technology nearly ten years ago, no one has more expertise in this field than us. This experience is especially important when it comes to crafting genome editing tools that possess the critical requirements of having specific targeting and robust cutting activity. We provide both in our new CRISPR product line, and now we put our skill into your hands with a quick and simple web-based design platform. Our CRISPR products can be ordered directly through the link below or browse the CRISPR content on this page to learn more about the technology.


Mitosis and Meiosis Part A

Kara L. McKinley , in Methods in Cell Biology , 2018

3.3 Generation of sgRNA-Expressing Plasmids

3.3.1 Considerations for selection of targeting sequences

The sgRNA should target within 100 bp of the insertion site. It can be in either a coding sequence, or in an untranslated region. For an N-terminal tag, either the 5′ UTR can be targeted, or the first coding exon can be targeted if it is desirable to knock out the other allele as described in Section 3.2 . For a C-terminal tag, the 3′ UTR should be targeted. The targeting sequence should be selected to be (1) feasible (i.e., directly upstream of a PAM sequence) and (2) specific (i.e., with maximal number of mismatches to other sequences) as outlined in Section 2.2.2 .

3.3.2 Cloning targeting sequences into transient vectors

To introduce sequences at specified sites, the Cas9, sgRNA, and repair template only need to be temporarily present within the cells to be targeted. Therefore, for this application we will introduce them by transient transfection. We will transfect two plasmids ( Fig. 7 ): one that constitutively expresses both Cas9 and the sgRNA, and one that carries the repair sequence.

For transient expression of Cas9 and the sgRNA, we use the plasmid pX330 from Feng Zhang's laboratory (Addgene #42230). The cloning for pX330 uses the same overhangs as the pLenti-sgRNA/pKM808 plasmids used in Section 2.2.3 . Therefore, the protocol for cloning is the same as in Section 2.2.3 with one important exception: in this case, the plasmid is cut with BbsI, also marketed as Fast Digest BpiI (Thermo Fisher 10569110). We recommend use of the Fast Digest BpiI, as traditional formulations of BbsI are poorly stable at − 20°C.

As described in Section 2.2.2 , the cleavage efficiency of sgRNAs is variable. Therefore, we recommend designing two sgRNAs per target. If tag insertion fails, cleavage efficiency can be validated using T7 endonuclease I or Surveyor assays.


Assista o vídeo: How CRISPR lets you edit DNA - Andrea M. Henle (Novembro 2021).