Em formação

Qual é o significado funcional da diferença na razão cardiolipina / colesterol em diferentes membranas?


Eu li em algum lugar que a membrana plasmática tem pouca cardiolipina, mas colesterol em excesso, enquanto a membrana mitocondrial interna é rica em cardiolipina e tem pouco colesterol. Eu só queria saber por que existe essa diferença.


De acordo com a wikipedia, a cardiolipina é encontrada em dois lugares, a membrana mitocondrial interna e as membranas bacterianas. Dada a origem endossimbiótica das mitocôndrias, faz sentido que elas retenham algum resquício de sua ancestralidade bacteriana. Porém, o mais importante é que a cardiolipina desempenha um papel nas funções enzimáticas das membranas mitocondriais. A cardiolipina forma uma estrutura de ressonância bicíclica que permite capturar um próton, o que ajuda a fosforilação oxidativa.

Como essa estrutura também responde ao pH e aos cátions divalentes, ela pode alterar seu comportamento de conformação e agregação conforme as condições celulares mudam.

A cardiolipina também desempenha um papel na manutenção de estruturas quaternárias complexas de enzimas juntas. O Complexo Mitocondrial III requer 1 cardiolipina, o Complexo IV requer 2 cardiolipinas e o Complexo V se liga a 4 cardiolipinas.

A cardiolipina também desempenha um papel na apoptose, onde é oxidada e sofre alterações conformacionais que fazem com que ela se mova das membranas mitocondriais internas para as externas e gerem poros pelos quais o citocromo C pode escapar e desencadear a apoptose.

O colesterol pode ser facilmente oxidado em oxisteróis, que desempenham uma variedade de funções, mas não são totalmente compreendidos. Se os níveis de colesterol nas mitocôndrias estivessem altos, acho que seria oxidado e causaria problemas. http://en.wikipedia.org/wiki/Oxysterol


Conteúdo de fosfolipídio e colesterol do tecido ventricular do hamster sírio cardiomiopático ☆

Foi investigada uma relação entre o desenvolvimento de cardiomiopatia hereditária no hamster Sírio (BIO 14.6) e alterações no fosfolipídio ventricular e no conteúdo de colesterol. Na tentativa de distinguir alterações puramente relacionadas à idade em lipídios, jovens (30 dias) e idosos (230 dias) cardiomiopáticos e hamsters normais (RB) foram examinados. Os antigos ventrículos cardiomiopáticos de hamster continham mais colesterol com base no peso seco e no nitrogênio da proteína do tecido não conectivo do que os ventrículos normais da mesma idade. O conteúdo de fósforo fosfolipídico foi menor no músculo ventricular de hamsters miopáticos jovens em relação aos normais da mesma idade, ao passo que não houve diferença significativa em animais mais velhos. Apesar da perda de função dos velhos corações miopáticos, a composição de fosfolipídios não foi alterada de forma marcante. O antigo músculo ventricular miopático continha 12% menos fosfatidiletanolamina e 14% mais fosfatidil inositol do que o tecido normal antigo. Cardiolipina, um indicador de conteúdo mitocodrial, não foi alterado.


Regulação genética do transporte e metabolismo de lipídios intestinais

Acil-coenzima A colesterol aciltransferase 2 e a regulação da absorção intestinal de colesterol

A esterificação do colesterol celular é realizada por duas enzimas: ACAT1, que é amplamente distribuída, mas expressa em níveis baixos no fígado e intestino e ACAT2, que é a enzima responsável pela esterificação do colesterol nesses tecidos (69). Para examinar o papel de ACAT2 na regulação da absorção intestinal de colesterol, Repa e colegas (221) geraram ACAT2 - / - camundongos e demonstraram absorção reduzida (mas não eliminada) de colesterol, particularmente no contexto de aumento da ingestão de colesterol na dieta. Além disso, a redução no mRNA de NPC1L1 observada em animais do tipo selvagem após a alimentação de colesterol foi amplificada em ACAT2 —- camundongos, sugerindo que o acúmulo de colesterol intestinal intracelular livre diminuiu ainda mais a expressão de NPC1L1 além dos efeitos observados em camundongos de tipo selvagem. Além disso, esses trabalhadores demonstraram um aumento na abundância de mRNA ABCG5 / G8 em alimentos alimentados com ração ACAT2 - / - camundongos, mas nenhum aumento após a suplementação de colesterol, sugerindo que a regulação da expressão de ABCG5 / G8 em resposta à suplementação de esterol envolve ACAT2. Um aumento notável foi observado na expressão do transportador de efluxo basolateral ABCA1 em alimentos alimentados com ração ACAT2 - / - camundongos, e um aumento adicional na abundância de mRNA de ABCA1 foi observado em ACAT2 - / - ratos alimentados com uma dieta rica em colesterol. Esses dados sugerem que o acúmulo de colesterol livre em enterócitos em resposta à deficiência de ACAT2 leva à regulação positiva dos mecanismos de efluxo de colesterol basolateral, embora a forma das partículas de lipoproteína associadas a essa secreção aumentada de colesterol ainda não tenha sido identificada. No entanto, com base nas informações atuais, o candidato mais provável seriam as partículas de HDL formadas pelas ações de ABCA1 e ApoA – I (ver Fig. 67-3).


The Triglyceride / HDL Cholesterol Ratio. O que é ideal?

A proporção TG / HDL-C pode ser facilmente calculada a partir do perfil lipídico padrão. Basta dividir o seu TG pelo seu HDL-C.

No entanto, ao olhar para a proporção ideal, você deve verificar se seus valores de lipídios são fornecidos em mg / dl como nos EUA ou em mmol / L como na Austrália, Canadá e na maioria dos países europeus.

Se os valores de lipídios forem expressos como mg / dl (como nos EUA)

A relação TG / HDL-C menor que 2 é ideal

A relação TG / HDL-C acima de 4 é muito alta

A relação TG / HDL-C acima de 6 é muito alta

Se você estiver usando mmol / L (a maioria dos países, exceto os EUA), você deve multiplicar essa proporção por 0.4366 para obter os valores de referência corretos. Você também pode multiplicar sua proporção por 2.3 e use os valores de referência acima.

Se os valores de lipídios forem expressos como mmol / L (como na Austrália, Canadá e Europa)

A relação TG / HDL-C inferior a 0,87 é ideal

A relação TG / HDL-C acima de 1,74 é muito alta

A relação TG / HDL-C acima de 2,62 é muito alta

Neste artigo, a razão TG / HDL-C é fornecida como nos EUA (mg / dl).


Resultados

Perfil clínico, bioquímico e histológico

Foram estudados 9 sujeitos em cada grupo (Tabela 1). Os 3 grupos eram semelhantes em relação a gênero, etnia, idade, índice de massa corporal, açúcar no sangue em jejum, hemoglobina glicosilada e funções sintéticas hepáticas. Os indivíduos com NASH apresentaram níveis mais elevados de aspartato aminotransferase e alanina aminotransferase que se aproximaram, mas não alcançaram significância. Embora o colesterol total fosse maior em indivíduos com NAFL e NASH do que nos controles (P & lt 0,05 para ambos), não houve diferenças significativas no colesterol lipídico de alta densidade ou colesterol lipídico de baixa densidade. Indivíduos com NAFL tinham esteatose isolada (nota média ± SEM: 2,1 ± 0,6) ou esteatose com inflamação leve (pontuação média de atividade da NAFLD ± SEM: 3,2 ± 0,3), enquanto aqueles com NASH tinham uma pontuação média de esteatose ± SEM de 1,8 ± 0,4 e uma pontuação de atividade NAFLD ± SEM de 5,1 ± 0,4 (P & lt 0,03 versus NAFL).

Parâmetro Controle (n = 9) NAFL (n = 9) NASH (n = 9)
Sexo F / M 7/2 6/3 6/3
Caucasiano / Afro-americano 7/2 8/1 9/0
Idade média (anos) 46.6 ± 3.8 48.5 ± 4.8 47 ± 3.2
IMC (kg / m 2) 34.5 ± 4.3 37.5 ± 5.2 34 ± 1.8
Glicose em jejum (mg / dl) 87.5 ± 4.9 119.2 ± 39.6 123.3 ± 29.3
Hemoglobina glicosilada (%) 5.2 ± 0.4 5.8 ± 0.1 5.8 ± 0.1
AST (intervalo normal: 0-65 U / l) 42 ± 16.6 36.8 ± 5 77.4 ± 14.2
ALT (faixa normal: 0-65 U / l) 55.7 ± 27.4 49 ± 10.2 119.4 ± 25.8
Fosfatase alcalina (U / l) 82.4 ± 9.1 113.4 ± 22.8 111 ± 13.9
Bilirrubina total (mg / dl) 0.6 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.5 ± 0.1
Albumina (g / dl) 4.1 ± 0.1 4 ± 0.3 4 ± 0.1
Plaquetas (1000 / mm 3) 255.5 ± 27.9 281.3 ± 40.5 233 ± 23.3
Colesterol total (mg / dl) 166.5 ± 10.5 230.6 ± 13.8* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
234 ± 11.2* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
Colesterol HDL (mg / dl) 57.5 ± 8.5 40.2 ± 6.3 50.5 ± 2.1
Colesterol LDL (mg / dl) 87 ± 4 127 ± 22.6 99 ± 3.8
Triglicerídeos (mg / dl) 220 ± 22 397.8 ± 135.2 274 ± 19.4
Grau de esteatose 0 2.1 ± 0.6 1.8 ± 0.4
Pontuação de atividade NAFLD 0 3.2 ± 0.3 5.1 ± 0.4† † P & lt 0,05 contra NAFL (t teste).
Estágio de fibrose 0 1.3 ± 0.3 1.8 ± 0.4
  • Os dados são expressos como a média ± SEM. ALT indica alanina aminotransferase AST, aspartato aminotransferase IMC, índice de massa corporal HDL, lipídio de alta densidade LDL, lipídio de baixa densidade NAFL, fígado gorduroso não alcoólico NAFLD, doença hepática gordurosa não alcoólica NASH, esteatohepatite não alcoólica.
  • * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
  • P & lt 0,05 contra NAFL (t teste).

Conteúdo total de lipídios hepáticos (Tabela 2)

O conteúdo lipídico hepático total foi acentuadamente aumentado em NAFL e NASH (P & lt 0,001) isso foi impulsionado principalmente pelo aumento do conteúdo de TAG (P & lt 0,001). Da mesma forma, o DAG também aumentou significativamente (P & lt 0,03 para NAFL e NASH). Em comparação com os controles normais, a razão TAG / DAG (produto / precursor) aumentou significativamente em NAFL e NASH (7 versus 26 versus 31, P & lt 0,001 para ambos). O teor de ácidos graxos n-6 nos lipídios totais aumentou dos controles para NAFL e NASH (média ± SEM: 4131 ± 210 contra 6424 ± 605 contra 8449 ± 1012 nmol / g, P & lt 0,03 para NASH versus os controles) e foi associado a uma proporção n-6: n-3 total significativamente maior em NAFL e NASH (P & lt 0,05 para ambos versus os controles). No entanto, o conteúdo de FFA não aumentou em NAFL ou NASH. Além disso, houve um incremento gradual na FC de normal para NAFL para NASH (P & lt 0,05 para o controle versus NASH). Isso, no entanto, não foi acompanhado por um aumento nos CEs em NAFL ou NASH.

Parâmetro Controle (n = 9) NAFL (n = 9) NASH (n = 9)
Lipídios totais 15,978 ± 1,157 49,991 ± 10,718* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
43,658 ± 6,162* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
SFA Total 7,189 ± 586 22,889 ± 5,328* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
18,756 ± 3,003* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
MUFA total 3,527 ± 258 19,616 ± 4,937 14,819 ± 2,204* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
PUFA total 5,104 ± 347 7,328 ± 606* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
9,822.62 ± 1,094* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
Total n-3 949 ± 153 862 ± 49 1,336 ± 180
Total n-6 4,131 ± 210 6,424 ± 605 8,449 ± 1,012* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
razão n-6 / n-3 4.8 ± 0.4 7.6 ± 0.8* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
6.9 ± 0.9* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
FFA 5,533 ± 1,210 5,929 ± 1,487 6,115 ± 584
DAG 1,922 ± 430 4,946 ± 1,232* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
3,304 ± 473* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
MARCAÇÃO 13,609 ± 2,300 128,585 ± 34,201* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
104,035 ± 20,451* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
Razão TAG / DAG 7 26* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
31* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
CE 7,589 ± 1,548 8,522 ± 1,846 7,774 ± 808
FC 7,538 ± 718 10,382 ± 1,079 12,862 ± 1,707* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
CL 4,447 ± 620 5,023 ± 585 6,063 ± 902
LYPC 1,936 ± 308 1,800 ± 505 2,239 ± 475* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
PC 20,321 ± 1,098 15,322 ± 1,247* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
16,874 ± 1,319
EDUCAÇAO FISICA 14,599 ± 813 11,456 ± 494* * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).
14,828 ± 1,359
PS 4,114 ± 577 5,295 ± 1,774 4,199 ± 706
SM 4,194 ± 587 3,773 ± 590 5,684 ± 685
  • Todos os valores são expressos como a média (nmol / g de tecido) ± SEM. CE indica éster de colesterol CL, cardiolipina DAG, diacilglicerol FC, colesterol livre FFA, ácido graxo livre LYPC, lisofosfatidilcolina MUFA, ácido graxo monoinsaturado NAFL, fígado graxo não alcoólico NASH, esteatohepatite não alcoólica PC, ácido graxo fosfatidilcolina poli-fosfatidil-PE, ácido graxo fosfatidilcolina poliinsatidil-PE, fosfatidilcolina PE SFA, ácido graxo saturado SM, esfingomielina TAG, triacilglicerol.
  • * P & lt 0,05 versus o controle (análise de variância).

O conteúdo de PL hepático total não foi significativamente diferente entre os 3 grupos (média ± SEM: controles = 49.889 ± 3220 nmol / g de tecido, NAFL = 42.671 ± 3714 nmol / g de tecido e NASH = 49.614 ± 2599 nmol / g de tecido, P = não significativo). No entanto, apesar de um aumento significativo nos lipídios totais e FC, o conteúdo total de PC diminuiu (P & lt 0,03 para NAFL versus o controle). Isso foi acompanhado por um aumento na lisofosfatidilcolina (LYPC, ou seja, lisolecitina) em indivíduos com NASH (P & lt 0,05). Houve também uma tendência para diminuição de PE que foi significativa apenas para NAFL (P & lt 0,05) em contraste, os níveis de fosfatidilserina (PS) permaneceram inalterados. Embora o conteúdo hepático de esfingomielina (SM) e CLs tenha aumentado, eles não atingiram níveis de significância.

Composição de ácidos graxos de FFAs hepáticos (FFA Tabela 3)

Houve uma tendência de diminuição progressiva dos controles para NAFL e, em seguida, NASH para ácidos graxos poliinsaturados n-6 e n-3 (PUFAs) dentro de FFA hepático. O conteúdo de ácido linoléico (18: 2n-6), ponto de partida para o processamento de ácidos graxos essenciais n-6 (EFAs), 18 não foi alterado tanto no NAFL quanto no NASH. No entanto, houve uma tendência de depleção progressiva de ácido γ-linolênico (18: 3n-6), que está imediatamente a jusante do ácido linoléico, 18, 19 do controle para NAFL para NASH (P & lt 0,01 versus NASH). Isso também foi observado com o ácido araquidônico (20: 4-n6), que está mais abaixo do ácido γ-linolênico, com uma diminuição significativa na NASH (P & lt 0,05 versus os controles). A razão produto / precursor para a via n-6 (20: 4n-6: 18: 2n-6) tendeu para baixo, atingindo significância para NASH (P & lt 0,03 versus os controles). Os níveis de ácido hidromel (20: 3n-9), que são tipicamente aumentados na deficiência de EFA, 20 permaneceram inalterados no NAFL e NASH.

Ácido graxo Controle (n = 9) NAFL (n = 9) NASH (n = 9)
14:0 6.6 ± 1.5 5.4 ± 0.9 5.9 ± 0.7
15:0 1.6 ± 0.3 1.2 ± 0.2 1.6 ± 0.1
16:0 30 ± 0.7 31.5 ± 1.6 32.3 ± 1.2
18:0 19.6 ± 0.9 16.8 ± 2.6 19 ± 1.8
16: 1n-7 1.6 ± 0.2 2.4 ± 0.3 2 ± 0.3
18: 1n-7 1.8 ± 0.3 1.8 ± 0.3 1.8 ± 0.3
18: 1n-9 15.8 ± 0.8 19.2 ± 1.9 17.5 ± 1.4
24: 1n-9 1.2 ± 0.3 1 ± 0.3 1.1 ± 0.1
18: 2n-6 7.5 ± 0.8 8.2 ± 1.4 8.3 ± 0.8
18: 3n-6 1.1 ± 0.4 0.5 ± 0.2 0.2 ± 0.1* * P & lt 0,05 contra o controle.
20: 4n-6 4.9 ± 0.8 4 ± 1.1 3.1 ± 0.4* * P & lt 0,05 contra o controle.
20: 5n-3 0.4 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.2 ± 0.1
22: 6n-3 1.3 ± 0.3 1.1 ± 0.3 0.8 ± 0.2
SFA 59.3 ± 1.9 56.4 ± 2.4 60.4 ± 1.9
MUFA 22.2 ± 1.1 26.2 ± 1.7 24.2 ± 1.8
PUFA 18.4 ± 1.8 17.4 ± 1.7 15.3 ± 1.1
LCPUFA 6.6 ± 1.1 5.4 ± 1.4 4.1 ± 0.6* * P & lt 0,05 contra o controle.
n-3 PUFA 3.2 ± 0.5 2.9 ± 0.3 2.2 ± 0.4
n-6 PUFA 15.1 ± 1.5 14.3 ± 1.5 12.9 ± 0.8
razão n-6 / n-3 5.3 ± 0.8 5.1 ± 0.4 6.7 ± 0.8* * P & lt 0,05 contra o controle.
† † P & lt 0,05 contra NAFL (análise de variância).
Proporção 20: 4n-6/18: 2n-6 0.7 ± 0.1 0.6 ± 0.2 0.4 ± 0.1* * P & lt 0,05 contra o controle.
Proporção 20: 5n-3/18: 3n-3 0.6 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.3 ± 0.1
  • Todos os valores são a média (mol%) ± SEM. FFA indica LCPUFA de ácido graxo livre, ácido graxo poliinsaturado de cadeia longa (soma de 20: 4n-6, 20: 5n-3 e 22: 6n-3) MUFA, ácido graxo monoinsaturado NAFL, fígado gordo não alcoólico NASH, esteatohepatite não alcoólica PUFA , ácido graxo poliinsaturado SFA, ácido graxo saturado.
  • * P & lt 0,05 contra o controle.
  • P & lt 0,05 contra NAFL (análise de variância).

O ácido α-linolênico (18: 3n-3), o ponto de partida para o processamento de n-3 EFA, 18 não foi alterado. Houve uma tendência de diminuição progressiva dos controles para NAFL para NASH para ácido eicosapentanóico (20: 5n-3) e ácido docosahexanóico (22: 6n-3), os produtos a jusante do ácido α-linolênico (18: 3n-3 ), que se aproximou, mas não atingiu significância na NASH. A razão produto / precursor para a via n-3 (20: 5n-3: 18: 3n-3) também tendeu para baixo, se aproximando da significância para NASH.

Composição de ácidos graxos de DAG e TAG hepáticos

Ambos DAG e TAG foram significativamente aumentados em indivíduos com NAFL e NASH (Fig. 1A). Houve uma tendência de aumento de ácidos graxos saturados (SFAs) em DAG e TAG, isso foi impulsionado pelo aumento de palmitato (16: 0), mas compensado pela diminuição do ácido esteárico (18: 0). Houve também uma tendência de aumento de ácidos graxos monoinsaturados (MUFAs Fig. 1B), especificamente ácido oleico (18: 1-n9), em DAG e TAG para NAFL e NASH.

Composição lipídica hepática em indivíduos com síndrome metabólica e histologia hepática normal (controles, n = 9), fígado gorduroso não alcoólico (NAFL, n = 9) e esteatohepatite não alcoólica (NASH, n = 9). (A) Distribuição das classes de lipídios dentro dos lipídios hepáticos. o x o eixo representa as classes de ácido graxo livre (FFA), diacilglicerol (DAG) e triacilglicerol (TAG). o y os eixos representam o conteúdo de lipídios nos 3 grupos de estudo (nmol / g de tecido), com FFA e DAG exibidos à esquerda y eixo e TAG à direita y eixo. NAFL e NASH aumentaram significativamente o DAG hepático (P & lt 0,05) e TAG (P & lt 0,002). O conteúdo FFA não mudou em nenhum dos grupos. (B) Houve uma tendência de aumento na porcentagem molar de ácidos graxos saturados (SFAs) e ácidos graxos monoinsaturados (MUFAs) dentro de TAG em ambos NAFL e NASH. O conteúdo de ácido graxo poliinsaturado (PUFA) de TAG, no entanto, foi significativamente depletado em NAFL e NASH (P & lt 0,01). (C) Ambos n-3 (esquerdo y eixo) e n-6 (direita y eixo) PUFAs foram significativamente reduzidos em NAFL e NASH (P & lt 0,02). (D) A razão n-6: n-3 foi significativamente maior em NAFL e NASH (P & lt 0,01 para ambos). (E, F) Mudanças relativas do controle (mostrado como 100%) são plotadas. O ácido araquidônico (20: 4n-6), o ácido eicosapentanóico (20: 5n-3) e o ácido docosahexanóico (22: 6n-3) foram significativamente reduzidos em NAFL e NASH. (B-F) Os dados mostrados são dados de porcentagem molar (porcentagem de cada ácido graxo do total de ácidos graxos em cada classe de lipídios) dentro da classe TAG. Todos os valores são expressos como a média ± SEM. *P & lt 0,05 em relação aos controles. As barras vazias representam os controles, as barras sólidas representam NAFL e as barras cortadas representam NASH.

Em contraste, houve uma diminuição significativa nos PUFA associados com DAG e TAG em NAFL e NASH (Fig. 1B). As porcentagens molares de ácidos graxos n-3 e n-6 em TAG foram diminuídas em NAFL e NASH (Fig. 1C), no entanto, a diminuição em n-6 foi menor do que nos ácidos graxos n-3, resultando em um aumento líquido significativo nas proporções de ácidos graxos n-6: n-3 no TAG (Fig. 1D). Houve uma depleção significativa de ácido araquidônico (20: 4n-6), um ácido graxo n-6 chave (Fig. 1E). Além disso, o ácido eicosapentanóico (20: 5n-3) e o ácido docosahexanóico (22: 6n-3), os 2 produtos a jusante do ácido α-linolênico (18: 3n-3) na via n-3, foram significativamente esgotados (Fig . 1F). Essas mudanças foram qualitativamente semelhantes às mudanças vistas nos pools de FFA e DAG.

Composição de ácido graxo CE hepático

O conteúdo de FC hepática aumentou progressivamente de controles com histologia normal para NAFL para NASH (P & lt 0,05 para NASH versus o controle (Fig. 2A). O conteúdo total de CE não foi, entretanto, significativamente alterado em NAFL ou NASH. Houve um enriquecimento de SFA e um aumento leve e insignificante em MUFA, especificamente ácido oleico. Houve um enriquecimento significativo dos CEs com PUFA (Fig. 2B, C). Ambos os PUFAs n-6 e n-3 aumentaram em NAFL e NASH, mas os resultados foram significativos apenas para ácidos graxos n-6 (Fig. 2C). A relação n-6: n-3 geral não mudou significativamente (Fig. 2D). Embora o ácido linoléico (18: 2n-6) tenha sido particularmente enriquecido dentro dos CEs em NAFL e NASH, os níveis de ácido araquidônico não foram alterados significativamente (Fig. 2E).Embora tenha havido uma tendência de aumento do ácido docosahexanóico (22: 6n-3) na NASH, isso não atingiu significância (Fig. 2F).

Composição do colesterol hepático em controles (n = 9), fígado gorduroso não alcoólico (NAFL n = 9) e esteatohepatite não alcoólica (NASH n = 9). As partes B-F refletem mudanças dentro da classe de ésteres de colesterol (CE) e são de dados de porcentagem molar (porcentagem de cada ácido graxo do total de ácidos graxos dentro de cada classe de lipídio). (A) Distribuição de CE e colesterol livre (FC) nos lipídios hepáticos. Houve um aumento gradual no conteúdo de FC hepática dos controles para NAFL para NASH (P & lt 0,05, NASH versus o controle). O conteúdo de CE foi comparável nos 3 grupos. (B) O CE hepático foi significativamente depletado em ácidos graxos saturados (SFAs P & lt 0,02) e enriquecido com ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs P & lt 0,01) em NAFL e NASH. (C) Embora ambos n-3 (esquerdo y eixo) e n-6 (direita y eixo) PUFAs foram aumentados em NAFL e NASH, foi significativo apenas para n-6 (P & lt 0,02). (D) A razão n-6: n-3 não foi significativamente diferente entre os 3 grupos. (E, F) As mudanças relativas do controle (mostrado como 100%) são plotadas. O conteúdo de ácido linoléico (18: 2n-6) foi significativamente maior (P & lt 0,01), com uma tendência de diminuição no ácido araquidônico (20: 4n-6) e uma tendência de aumento no ácido docosahexanóico (22: 6n-3) em NAFL e NASH. Todos os valores são expressos como a média ± SEM. *P & lt 0,05 em relação aos controles. As barras vazias representam os controles, as barras sólidas representam NAFL e as barras cortadas representam NASH.

Composição de ácidos graxos de LPs hepáticos

O conteúdo total de PC no fígado diminuiu em NAFL e NASH, mas nenhuma alteração significativa foi observada em PS ou CL (Fig. 3A, B). Houve um aumento concomitante no LYPC (P & lt 0,05 para NASH versus o controle Fig. 3A). As porcentagens molares de SFA, MUFA e PUFA não foram alteradas em PC (Fig. 3C). Também não houve mudanças significativas nos ácidos graxos n-6 ou n-3 totais em PC (Fig. 3D). Embora o conteúdo de ácido linoléico de n-6 EFA (18: 2n-6) não tenha sido alterado, houve uma diminuição gradativa progressiva do ácido araquidônico (20: 4n-6) que foi significativa para NASH (P & lt 0,05 versus os controles (Fig. 3E). A diminuição resultante na razão produto / precursor para a via n-6 (20: 4n-6: 18: 2n-6) atingiu significância para NASH (P & lt 0,01 versus os controles).

Composição de fosfolipídios hepáticos em controles (n = 9), fígado gorduroso não alcoólico (NAFL n = 9) e esteatohepatite não alcoólica (NASH n = 9). As partes C-F mostram mudanças na fosfatidilcolina (PC) com base em dados de porcentagem molar (porcentagem de cada ácido graxo do total de ácidos graxos dentro de cada classe de lipídios). (A) O conteúdo de PC no fígado foi diminuído em NAFL e NASH. Isso foi associado a um aumento significativo na lisofosfatidilcolina (LYPC P & lt 0,05) e uma tendência de um aumento na esfingomielina hepática (SM à direita y eixo) apenas em NASH. (B) Nenhuma mudança significativa foi observada na fosfatidilserina (PS) e cardiolipinas (CLs), com diminuição da fosfatidiletanolamina (PE) no NAFL. (C) Nenhuma alteração foi encontrada nos conteúdos de ácidos graxos saturados (SFA), ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) e ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) do PC hepático. (D) O n-3 (esquerda y eixo) e n-6 (direita y eixo) PUFAs permaneceram inalterados em NAFL e NASH. (E, F) As mudanças relativas dos controles (mostradas como 100%) são plotadas. O ácido araquidônico (20: 4n-6) em PC hepático foi significativamente depletado em NASH (P & lt 0,01). Houve também uma tendência de diminuição do ácido eicosapentanóico (20: 5n-3) e do ácido docosahexanóico (22: 6n-3) tanto no NAFL quanto no NASH. Todos os valores são expressos como a média ± SEM. *P & lt 0,05 em relação aos controles. As barras vazias representam os controles, as barras sólidas representam NAFL e as barras cortadas representam NASH.

O conteúdo de ácido α-linolênico (18: 3n-3) de PC não foi alterado em NAFL e NASH (Fig. 3F). Houve, no entanto, uma tendência para diminuição dos produtos de ácido graxo n-3 a jusante, especificamente ácido eicosapentanóico (20: 5n-3) e ácido docosahexanóico (22: 6n-3). Essa tendência estava de acordo com o perfil visto em TAG e DAG e no pool de FFA no fígado. Além disso, de acordo com o perfil visto nessas classes de lipídios, houve uma tendência progressiva, mas não significativa, de um aumento na relação n-6: n-3 total em PC de 6,7 em controles normais para 7,6 em NAFL e 8,5 em NASH.

Alterações nos ácidos graxos essenciais n-6 e n-3

A porcentagem molar de ácido graxo n-6 foi reduzida em FFA, DAG e TAG, mas atingiu significância apenas para TAG em NAFL e NASH (Tabela 4). O ácido araquidônico (20: 4n-6) foi relativamente esgotado da maioria das classes de lipídios. Especificamente, houve diminuições de 31% e 36% no conteúdo de ácido araquidônico (20: 4n-6) de PC (P & lt 0,03) e DAG (P = não significativo) em NASH, respectivamente, as principais fontes de sua liberação para a síntese inflamatória de prostaglandinas. 21 Essa diminuição foi observada apesar de não haver mudanças significativas em seu precursor ácido linoléico (18: 2n-6) em nenhuma dessas classes.

Classe Lipídica n-3 PUFA n-6 PUFA Razão n-6: n-3
Ao controle NAFL NASH Ao controle NAFL NASH Ao controle NAFL NASH
FFA 3.1 ± 0.5 2.8 ± 0.3 2.2 ± 0.4 15.1 ± 1.5 14.3 ± 1.5 12.9 ± 0.8 5.2 ± 0.8 5.1 ± 0.4 6.7 ± 0.8* * P & lt 0,05 contra o controle.
† † P & lt 0,05 contra NAFL (análise de variância).
DAG 4.0 ± 1.3 2.1 ± 0.4 2.1 ± 0.4 17.5 ± 1.9 11.8 ± 1.2* * P & lt 0,05 contra o controle.
16.1 ± 0.6 6 ± 0.9 6.4 ± 1.2 10.3 ± 2.5
MARCAÇÃO 1.9 ± 0.3 0.6 ± 0.1* * P & lt 0,05 contra o controle.
1.2 ± 0.1* * P & lt 0,05 contra o controle.
18.8 ± 0.7 10.8 ± 1.7* * P & lt 0,05 contra o controle.
15.5 ± 1.1* * P & lt 0,05 contra o controle.
10.2 ± 0.9 16.1 ± 1.4* * P & lt 0,05 contra o controle.
13.2 ± 0.8* * P & lt 0,05 contra o controle.
CE 1.5 ± 0.4 2.2 ± 0.2 2.7 ± 0.5 17.4 ± 1.9 28.2 ± 4.1* * P & lt 0,05 contra o controle.
26.3 ± 2.8* * P & lt 0,05 contra o controle.
16 ± 3.1 13.5 ± 2.4 12.8 ± 2.6
CL 6.4 ± 0.7 5.6 ± 0.5 8 ± 2.1 32.8 ± 3.5 29.3 ± 3.4 29.9 ± 1.8 5.4 ± 0.7 5.4 ± 0.5 5.6 ± 1.3
LYPC 2.5 ± 0.5 2.8 ± 0.3 2.8 ± 0.3 10.8 ± 1.2 12.9 ± 0.9 12.4 ± 0.9 5.5 ± 1 4.7 ± 0.4 4.85 ± 0.6
PC 5.6 ± 0.8 4.5 ± 0.4 4.8 ± 0.6 34.5 ± 0.8 32.5 ± 1.7 33.9 ± 0.9 6.7 ± 0.7 7.6 ± 0.8 8.5 ± 1.6
EDUCAÇAO FISICA 12.9 ± 1.4 11 ± 1.1 12 ± 1.2 32.8 ± 1.3 33.3 ± 1.5 31.3 ± 1.3 2.8 ± 0.4 3.2 ± 0.3 2.9 ± 0.4
PS 8.6 ± 1.9 8.7 ± 1.5 8.6 ± 1.1 18.3 ± 2.3 20.1 ± 2.8 16.6 ± 1.5 3.5 ± 1.2 2.4 ± 0.2 2 ± 0.1
SM 3.2 ± 0.3 2.3 ± 0.6 2.8 ± 0.6 11.1 ± 0.8 10.6 ± 1.4 10.2 ± 1.3 3.5 ± 0.1 5.8 ± 1.3 4.8 ± 0.9
Ácido araquidônico (20: 4n-6) Ácido eicosapentanóico (20: 5n-3) Ácido docosahexanóico (22: 6n-3)
FFA 4.8 ± 0.8 4 ± 1.1 3.1 ± 0.3* * P & lt 0,05 contra o controle.
0.41 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.2 ± 0.1 1.3 ± 0.3 1.1 ± 0.3 0.8 ± 0.2
DAG 4.8 ± 1 2.2 ± 0.5 3.1 ± 0.5 0.22 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.2 ± 0.1 1.1 ± 0.3 0.6 ± 0.2 0.7 ± 0.2
MARCAÇÃO 1.3 ± 0.2 0.3 ± 0.1* * P & lt 0,05 contra o controle.
0.3 ± 0.1* * P & lt 0,05 contra o controle.
0.14 ± 0.04 0.02 ± 0.01* * P & lt 0,05 contra o controle.
0.05 ± 0.02* * P & lt 0,05 contra o controle.
0.5 ± 0.1 0.06 ± 0.01* * P & lt 0,05 contra o controle.
0.2 ± 0.05* * P & lt 0,05 contra o controle.
CE 4.2 ± 0.4 3.9 ± 0.7 3.2 ± 0.4 0.24 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.6 ± 0.2 1.0 ± 0.4
CL 7.6 ± 0.5 7.4 ± 1.0 6.3 ± 0.4 0.17 ± 0.03 0.3 ± 0.1 0.3 ± 0.1 5 ± 0.7 4.1 ± 0.4 5.5 ± 1.9
LYPC 4.6 ± 0.9 5.7 ± 0.8 4.5 ± 0.7 0.21 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.1 1.3 ± 0.3 1.4 ± 0.3 1.6 ± 0.3
PC 12.3 ± 1.2 9.5 ± 1.1 8.5 ± 0.6* * P & lt 0,05 contra o controle.
1.0 ± 0.3 0.9 ± 0.2 0.8 ± 0.1 3.5 ± 0.5 2.5 ± 0.2 2.9 ± 0.5
EDUCAÇAO FISICA 22.4 ± 1.1 21.0 ± 1.4 18.8 ± 0.8 0.6 ± 0.2 0.8 ± 0.2 0.9 ± 0.3 10.8 ± 1.4 8.5 ± 0.9 9.5 ± 1.3
PS 10.3 ± 2.2 11.2 ± 2.4 8.8 ± 1 0.4 ± 0.1 0.6 ± 0.1 0.4 ± 0.1 6.3 ± 1.5 6.2 ± 1.5 6.6 ± 1.0
SM 3.6 ± 0.4 3.2 ± 0.7 2.7 ± 0.6 0.2 ± 0.1 0.1 ± 0.1 0.2 ± 0.1 1.5 ± 0.5 1.4 ± 0.4 1.5 ± 0.5
  • Todos os valores são a média (mol%) ± SEM. CE indica colesterol éster CL, cardiolipina DAG, diacilglicerol AGL, ácido gordo livre LYPC, lisofosfatidilcolina Nafl, fígado gordo não alcoólica NASH, PC esteatohepatite não alcoólica, fosfatidilcolina PE, fosfatidiletanolamina PUFA, poliinsaturados PS ácido gordo, SM fosfatidilserina, esfingomielina TAG, triacilglicerol.
  • * P & lt 0,05 contra o controle.
  • P & lt 0,05 contra NAFL (análise de variância).

A porcentagem molar de ácidos graxos n-3 diminuiu em FFA, DAG, TAG e PC em NASH, mas foi significativa apenas para TAG (Tabela 4). O ácido eicosapentanóico (20: 5n-3) e o ácido docosahexanóico (22: 6n-3) foram significativamente depletados em TAG, e uma tendência de depleção foi observada em FFA, DAG e, em menor grau, PC. Essas mudanças ocorreram apesar do conteúdo inalterado do precursor ácido n-3 EFA α-linolênico (18: 3n-3). Houve uma tendência de aumento na razão n-6: n-3 em várias classes de lipídios, mas atingiu significância apenas para FFA (28% NASH contra ambos os grupos, P & lt 0,05) e TAG (57% NAFL e 29% NASH, contra o controle, P & lt 0,05). PUFAs de cadeia longa (soma de 20: 4n-6, 20: 5n-3 e 22: 6n-3) foram significativamente esgotados em NASH (P & lt 0,05 versus o controle) dentro de FFA.


3. RESULTADOS

3.1 As diferenças de perfil de proteoma entre tecidos tumorais HCC impulsionados por NAFLD e tecidos não tumorais adjacentes

No total, 1965 proteínas foram identificadas e quantificadas (Tabela S5). Para evitar o potencial viés de identificação incorreta, nos concentramos em 238 proteínas que foram identificadas em todas as amostras. Um gráfico de vulcão foi gerado para mostrar a distribuição de expressão diferencial (Figura 1A). Entre as 238 proteínas, 100 proteínas apresentaram expressão diferencial significativa entre os tecidos HCC e tecidos não tumorais adjacentes (P & lt .05) (Tabela S6). Aqui, 65 proteínas foram reguladas positivamente e 35 proteínas foram reguladas negativamente no HCC. A análise da via indicou que as principais vias enriquecidas incluíram cetogênese, via do mevalonato I e degradação da isoleucina I (Figura 1B e Tabela S7). As proteínas alteradas significativas foram analisadas usando o sistema de classificação PANTHER (http://pantherdb.org/). 22 A maioria das proteínas pertencia a componentes celulares (58,68%), possuía atividade catalítica (45,33%) e estava envolvida em processos metabólicos (31,77%) (Figura S1). A análise da via foi consistente com os achados em um relatório anterior de um aumento do processo de glicólise e diminuição do processo de beta-oxidação de ácidos graxos. Além disso, nossos resultados proteômicos foram comparáveis ​​aos de um estudo anterior, indicando que existia uma diferença potencial de mecanismo entre o CHC associado à NAFLD e outros tipos de CHC. 23-25 ​​Os resultados da proteômica do carcinoma hepatocelular em estágio inicial mostraram que o carcinoma hepatocelular estava relacionado à infecção pelo vírus da hepatite B (HBV-HCC) e estava associado à interrupção da homeostase do colesterol, acompanhada por alta expressão de esterol O-aciltransferase 1 (SOAT1). 23 No entanto, nosso estudo sugeriu que as diferenças na expressão de proteínas entre os tecidos de HCC impulsionados pela NAFLD e os tecidos adjacentes não tumorais estavam focadas principalmente na cetogênese. Essa diferença sugere que diferentes diagnósticos e estratégias terapêuticas devem ser aplicados a diferentes tipos de CHC.

3.2 VDAC1 é desregulado em HCC impulsionado por NAFLD e associado com NAFLD

Para priorizar os genes associados com NAFLD, uma análise de associação de todo o transcriptoma foi realizada em cepas de camundongos BXD. Foi calculada a correlação entre a porcentagem de massa gorda corporal e os transcritos de 100 proteínas candidatas. Entre todos os candidatos, VDAC1 apresentou uma correlação significativa com o percentual de massa de gordura corporal (R = 0.469, P = 0,008) (Figura 1C e Tabela S1). Para confirmar ainda mais a associação entre VDAC1 e NAFLD, a correlação entre VDAC1 e uma série de fenótipos de doença hepática gordurosa foi avaliada em ambos os níveis de transcrição e peptídeo. Os fenótipos incluíram massa de gordura corporal, peso corporal, massa hepática, massa adiposa branca, colesterol no plasma, glicose basal no plasma em jejum e área sob a curva de glicose em um teste de tolerância à glicose oral (AUC de glicose em OGTT) (Figura 1E e Tabela S2). Os resultados sugeriram que os níveis de expressão gênica e proteica de VDAC1 estavam correlacionados com as características da NAFLD.

A desregulação de VDAC1 em HCC foi posteriormente validada. Nossos resultados proteômicos sugeriram um aumento de 3,3 vezes em VDAC1 em tecidos de CHC. Este resultado foi validado usando um western blot (Figuras 1D e S2), e posteriormente confirmado em uma coorte clínica externa. Na coorte LIHC do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA), os níveis de expressão de Vdac1 foram regulados positivamente em tecidos de HCC em comparação com tecidos não tumorais (Normal N = 50, Tumor N = 371, P & lt .0001) (Figura 2A) e aumentou com o aumento do grau do tumor (Figura 2B). Além disso, a expressão de VDAC1 de alto nível foi correlacionada com resultados clínicos ruins (alta, n = 91 baixo, n = 91 P = 0,013) (Figura 2C). Coletivamente, esses resultados indicaram que o VDAC1 estava associado à NAFLD e ao CHC desregulado causado pela NAFLD.

3.3 Análise genética do sistema de Vdac1 em cepas de camundongos BXD

A análise genética do sistema foi então realizada para revelar a regulação da expressão de VDAC1. Níveis de expressão gênica de VDAC1 no tecido hepático 39 cepas de camundongos BXD e suas cepas parentais correspondentes foram examinadas. Havia apenas 1 conjunto de sonda (10 375 941) que teve como alvo o primeiro exon do Vdac1 gene na matriz Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST. A expressão de Vdac1 variou amplamente entre as cepas de BXD com uma alteração de 1,41 (Figura 3A). A expressão média de Vdac1 em todas as cepas BXD foi de 12,12 ± 0,02 (log2 escala, média ± erro padrão da média (SEM)). A cepa com maior nível de expressão foi BXD45, enquanto a cepa com menor expressão foi BXD61. Para identificar as variantes de sequência que afetaram a expressão de Vdac1 no fígado de camundongo, realizamos mapeamento de intervalo simples para Vdac1 em todo o genoma do camundongo. Uma expressão significativa QTL (eQTL) foi identificada no cromossomo 11 em 52,01 Mb com um LRS de 18,3 e que estava perto da localização física de Vdac1 no cromossomo 11 em 52,36 Mb (Figura 3B e Tabela S8). Além disso, também identificamos 4 eQTLs sugestivos localizados em outros cromossomos (Figura 3B e Tabela 2). Esses resultados indicaram que o Vdac1 o nível de mRNA era ambos cis- e trans-regulado, simultaneamente. Para os outros 4 trans-eQTLs, recuperamos um total de 361 genes codificadores de proteínas de seu intervalo de confiança de 1,5 LOD (Tabela 2). Entre eles, 18 genes estão significativamente correlacionados com o nível de expressão de Vdac1 (Tabela 2). A partir dos dados do proteoma do fígado, havia 20 proteínas VDAC1 direcionadas ao peptídeo. Para avaliar a correlação entre os transcritos de Vdac1 e os peptídeos, foi realizada uma análise de correlação. Entre os 20 peptídeos, os 5 principais peptídeos mais altamente correlacionados com o transcrito VDAC1 foram listados, Peptídeo 3 (R = 0,458, P = 0,005), Peptídeo 10 (R = 0.472, P = 0,004), Péptido 14 (R = 0.493, P = 0,002), Peptídeo 15 (R = 0.437, P = 0,008), e Peptídeo 19 (R = 0.496, P = 0,002) (Figura S3 e Tabela S4). Portanto, os Peptídeos 3, 10, 14, 15, 19 foram escolhidos para representar a proteína VDAC1 para análise posterior.

Chr Começar Fim LRS Marcador # de gene Genes correlacionados com Vdac1
2 98 107 16.263 rs33188980 87 Tcp11l1 Apip Cd59a Cd59b Lmo2 Ldlrad3 Eif3m Qser1
5 132 136 14.215 rs36653585 66 Lat2 Limk1 Mdh2
14 73 100 12.941 151 Klf5 Rcbtb2 Tpt1 Mzt1 Sucla2 Esd
X 64 72 16.188 rs33876026 57 Prrg3

3.4 Rede de co-expressão gênica e análise de enriquecimento de função indicaram que VDAC1 está associado à disfunção mitocondrial

Para explorar o mecanismo potencial de VDAC1 envolvido em HCC orientado por NAFLD, o Vdac1 rede de co-expressão gênica e análise de enriquecimento funcional foram implementadas. Com o objetivo de identificar Vdac1 genes envolvidos em módulos gênicos, as sondas filtradas foram submetidas ao pacote WGCNA 18 para construção de redes de co-expressão gênica. A potência de limiar suave β (8) foi escolhida com base em critérios de topologia sem escala (Figura 4A, B). Usando esse poder de limiar suave, identificamos 35 módulos de co-expressão distintos que foram atribuídos a cores diferentes Vdac1 foi localizado no módulo verde contendo 589 genes (Figura 4C e Tabela S9). Para verificar o envolvimento do módulo verde nos processos biológicos, realizamos análises de enriquecimento GO e KEGG usando o kit de ferramentas online WebGestalt. Descobrimos que este módulo foi significativamente enriquecido em processos biológicos, como o processo de redução de oxidação, morte celular e via de sinalização apoptótica (Tabela 3). Este módulo verde também foi enriquecido em várias vias KEGG, incluindo fosforilação oxidativa, NAFLD e o ciclo do ácido tricarboxílico (ciclo TCA) (Tabela 3). A análise revelou que Vdac1 e seus genes co-expressos presentes no mesmo módulo estavam envolvidos em funções biológicas, como metabolismo energético e doenças hepáticas (NAFLD). Além disso, a análise da via usando IPA mostrou que a via de disfunção mitocondrial era a via enriquecida de topo (Figura 5A e Tabela S10) e que 20 proteínas da membrana interna mitocondrial estavam envolvidas nesta via, que mostrou correlação com Vdac1 (Figura 5B e Tabela S11).

Prazo Descrição No. de Genes P-valor FDR
GO: processo biológico
GO: 0055114 Processo de redução de oxidação 54 4,89E-10 4.08E-06
GO: 0045333 Respiração celular 18 4.17E-09 1.74E-05
GO: 0006091 Geração de metabólitos precursores e energia 24 6,68E-08 1.85E-04
GO: 0015980 Derivação de energia por oxidação de compostos orgânicos 20 2.06E-07 2.86E-04
GO: 0007005 Organização mitocôndria 29 4.36E-06 2.45E-03
GO: 0008219 Morte celular 67 4,42E-06 2.45E-03
GO: 0097190 Via de sinalização apoptótica 30 5,72E-06 2.75E-03
GO: 0006915 Processo apoptótico 62 1.04E-05 3.61E-03
GO: 0012501 Morte celular programada 62 1.63E-05 4,84E-03
GO: 0006099 Ciclo do ácido tricarboxílico 6 3.27E-05 7,79E-03
Vias KEGG
mmu00190 Fosforilação oxidativa 22 2.17E-12 6,49E-10
mmu05012 doença de Parkinson 21 7.31E-11 1.09E-08
mmu05010 Doença de Alzheimer 21 2,91E-09 2,90E-07
mmu05016 doença de Huntington 21 1.88E-08 1.40E-06
mmu01100 Vias metabólicas 61 8.03E-07 4,80E-05
mmu04932 Doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) 16 1.60E-06 7,98E-05
mmu01200 Metabolismo de carbono 13 8,85E-06 3,78E-04
mmu00020 Ciclo de citrato (ciclo TCA) 6 1.34E-04 5.02E-03
mmu04142 Lisossoma 10 1.23E-03 4.09E-02
mmu00010 Glicólise / Gluconeogênese 7 1.39E-03 4.16E-02

3,5 VDAC1 está correlacionado com mudança de perfil de cardiolipina (CL)

Para entender melhor como o VDAC1 estava associado à disfunção mitocondrial, investigamos a associação entre o VDAC1 e os lipídios da membrana mitocondrial. CL era o fosfolipídio assinatura do IMM, que desempenha um papel importante na manutenção da estrutura e função das mitocôndrias. 26, 27 Uma análise de associação gene-lipidoma foi realizada entre VDAC1 e 22 espécies de lipídeos da classe CL. Os níveis de expressão do transcrito VDAC1 e dos peptídeos tiveram uma correlação negativa com os CLs maduros, CL (LLLL) e seu precursor MLCL (LLL) (Figura 5C e Tabela S3). Por outro lado, o VDAC1 teve uma correlação positiva com o painel dos CLs nascentes (Figura 5C e Tabela S3), portanto, hipotetizamos que o VDAC1 estava associado ao comprometimento da remodelação do CL. Portanto, calculamos a razão CLs nascentes / CL de espécies CL maduras (LLLL) para cada espécie CL nascente que é a marca registrada da remodelação CL. O VDAC1 foi positivamente correlacionado com 17 das 18 razões nascentes / maduras (Tabela S12). Além disso, a correlação significativa entre VDAC1 e cardiolipina sintetase PTPMT1 e TAZ foi confirmada na coorte de camundongos BXD com (R = 0.452, P = .003 R = 0.334, P = 0,033) (Figura 5D e Tabela S13). O VDAC1 foi correlacionado com a síntese de CLs e remodelamento de CL, o que pode prejudicar a estabilidade da estrutura da membrana interna mitocondrial ao alterar os componentes do CL e, eventualmente, causar disfunção mitocondrial.

3.6 Análise da função mitocondrial com ou sem expressão de VDAC1 em Hep3B e HepG2

Para identificar melhor se a superexpressão de VDAC1 atenua a função mitocondrial ou não, realizamos experimentos patológicos e biológicos. Os resultados da análise imuno-histoquímica sugeriram que a expressão de VDAC1 elevada em tecidos de HCC dirigidos por NAFLD em comparação com os tecidos não tumorais adjacentes (Figura 6E). Para ilustrar os efeitos de VDAC1 na função mitocondrial, células HCC (HepG2 e Hep3B) foram aplicadas para knockdown ou superexpressão de VDAC1. Enquanto isso, também aplicamos um inibidor para reduzir a função VDAC1. A redução e a superexpressão de VDAC1 foram determinadas por western blot (Figura 6A). Após o esgotamento de VDAC1 em células HCC, a função respiratória mitocondrial aumentou significativamente em comparação com o grupo de superexpressão VDAC1 (Figura 6D). Além disso, a superexpressão de VDAC1 afetou significativamente a respiração mitocondrial, com inibição das taxas de consumo de oxigênio (OCRs) na respiração basal (Figura 6D). O IMM com enzimas respiratórias abundantes desempenhou um papel importante na respiração mitocondrial. Além disso, a membrana interna é rica em um fosfolipídeo incomum, a cardiolipina. Posteriormente, as cardiolipinas foram quantificadas por kit de sonda fluorométrica e coloração com NAO. O conteúdo de cardiolipina foi diminuído pela superexpressão de VDAC1 em ambas as linhas de células HepG2 e Hep3B. Em contraste, a diminuição de VDAC1 causou um aumento no conteúdo de cardiolipina (Figura 6B, C). Esses dados revelaram um papel importante da superexpressão de VDAC1 no declínio da função mitocondrial.

3.7 Rede de correlação de transcrição-lipídios-fenótipos centralizada VDAC1

Para ilustrar melhor a associação de VDAC1 a fenótipos NAFLD por meio de perfil CL, uma rede de correlação de fenótipos transcritos-lipídios centralizada VDAC1 foi gerada para fornecer uma referência para estudos futuros (Figura 7A e Tabelas S2-S4). Em resumo, nosso estudo indicou que VADC1 estava associado com NAFLD e a desregulação de VDAC1 em HCC dirigido por NAFLD por meio da disfunção mitocondrial e pela regulação das proteínas da membrana mitocondrial e a mudança da composição da cadeia de acila CL (Figura 7B).


INTRODUÇÃO

As GTPases da superfamília da dinamina catalisam vários eventos de remodelação da membrana na célula eucariótica, incluindo aqueles de divisão e fusão organelar (Praefcke e McMahon, 2004 Heymann e Hinshaw, 2009). A proteína 1 relacionada à dinamina (Drp1), um membro citosólico desta extensa superfamília, estabelece o equilíbrio crítico da divisão e fusão mitocondrial catalisando a fissão da membrana mitocondrial (Chan, 2012). Em resposta a uma variedade de pistas fisiológicas, o Drp1 se transloca para a superfície da membrana externa mitocondrial (MOM) para iniciar os eventos de remodelação da membrana que culminam na divisão mitocondrial. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a esses processos estão apenas começando a ser compreendidos.

Ao contrário da dinamina prototípica, Drp1 carece de um domínio de ligação de lipídios aparente e requer proteínas adaptadoras integradas à membrana, como Fis1, Mff e MiD49 / 51 para seu recrutamento para o MOM (Bui e Shaw, 2013 Labbe et al., 2014 Richter et al., 2015). No entanto, nós e outros identificamos recentemente a cardiolipina lipídica específica da mitocôndria (CL) como um parceiro de ligação específico para Drp1 (Bustillo-Zabalbeitia et al., 2014 Macdonald et al., 2014 Ugarte-Uribe et al., 2014). CL facilita a automontagem de Drp1 em polímeros helicoidais que tubulam membranas e também estimula fortemente a atividade de GTPase Drp1, duas características consideradas marcas funcionais dessas GTPases atípicas (Heymann e Hinshaw, 2009). No entanto, a natureza das interações Drp1-CL e o papel do CL, se houver, no processo de remodelação da membrana mitocondrial permanecem obscuros.

CL é um fosfolipídeo dimérico incomum com propriedades bioquímicas e biofísicas únicas (Schlame et al., 2005 Huang e Ramamurthi, 2010). Contendo quatro cadeias de acil predominantemente linoleoil (C18: 2) em eucariotos superiores, o CL nativo tem uma pequena área de seção transversal do grupo de cabeça e volume em relação às suas cadeias de acil, tornando-o efetivamente em forma de cone. Consequentemente, CL exibe um comportamento de fase complexo nas membranas, com uma propensão para estabilizar a curvatura negativa da membrana após o sequestro e para a transição de uma fase lamelar em bicamada para uma fase hexagonal invertida não lamelar (HII) configuração após enriquecimento adicional (de Kruijff e Cullis, 1980 Seddon, 1990 Tarahovsky et al., 2000 Trusova et al., 2010 Renner e Weibel, 2011). Esta propriedade do CL pode ser relevante para eventos de rearranjo lipídico que precipitam a fissão ou fusão da membrana, especialmente quando considerada no contexto da dinâmica da membrana mitocondrial (Chernomordik e Kozlov, 2008 Doan et al., 2013 Pan et al., 2014). Na verdade, a GTPase OPA1 relacionada com a dinamina da membrana mitocondrial interna (MIM) depende criticamente do CL para promover a fusão da membrana mitocondrial (DeVay et al., Ban 2009 et al., 2010). Além disso, defeitos na remodelação da cadeia acila do CL e as variações resultantes na composição da cadeia acila do CL levam à síndrome de Barth da miopatia cardioesquelética, destacando a importância desse lipídio atípico para a função mitocondrial adequada (Schlame e Ren, 2006). Ainda não se sabe como Drp1 e CL funcionam cooperativamente para efetuar a remodelação e fissão da membrana mitocondrial.

Neste estudo, demonstramos que Drp1 se associa de forma estável com CL localizado em uma alta densidade espacial na bicamada lipídica alvo. Mostramos ainda que Drp1 preferencialmente reorganiza CL de fase fluida sem restrições (isto é, não associado a jangada) para gerar plataformas de membrana condensada para a remodelação de membrana subsequente. A hidrólise de GTP estimulada após automontagem helicoidal induz um rearranjo adicional de CL, que parece aumentar a propensão do lipídeo a sofrer uma transição de fase lamelar para não lamelar localizada. Esses rearranjos CL, dependentes das interações Drp1 B-inserção-membrana, criam regiões de membrana estreitamente contraídas que são predispostas à fissão. Assim, Drp1 e CL funcionam cooperativamente para facilitar a remodelação e fissão da membrana durante a divisão mitocondrial.


Formação e regulação das membranas mitocondriais

Os fosfolipídios da membrana mitocondrial são essenciais para a arquitetura mitocondrial, a atividade das proteínas respiratórias e o transporte de proteínas para a mitocôndria. O acúmulo de fosfolipídios dentro das mitocôndrias depende de uma síntese coordenada, degradação e tráfico de fosfolipídios entre o retículo endoplasmático (RE) e mitocôndrias, bem como do tráfico de lipídios intramitocondrial. Vários estudos destacam a contribuição dos ácidos graxos da dieta para a remodelação dos fosfolipídios e homeostase da membrana mitocondrial. Compreender o papel dos fosfolipídios na membrana mitocondrial e seu metabolismo vai lançar luz sobre os mecanismos moleculares envolvidos na regulação da função mitocondrial e nas doenças relacionadas com mitocondrial.

1. Introdução

As mitocôndrias estão envolvidas em uma ampla gama de processos celulares importantes para a sobrevivência celular. A membrana mitocondrial interna é o local ativo para a cadeia de transporte de elétrons e produção de ATP. Sua integridade é fundamental para a função mitocondrial e depende do fornecimento de proteínas e fosfolipídios. Como uma das principais classes de lipídios na bicamada lipídica das membranas celulares e organelas, os fosfolipídios são responsáveis ​​por manter a integridade estrutural de uma célula e a separação espacial dos compartimentos subcelulares. As principais classes de fosfolipídios encontrados na membrana mitocondrial são semelhantes a outras membranas, como a fosfatidilcolina (PC) e a fosfatidiletanolamina (PE), e alguns são exclusivamente componentes da membrana mitocondrial, como a cardiolipina (CL) [1].

A interação entre fosfolipídios e proteínas é importante principalmente na membrana mitocondrial interna. Uma proporção significativa de proteínas associadas à membrana interna é composta por proteínas envolvidas na fosforilação oxidativa e sua atividade depende da composição fosfolipídica da membrana. Mudanças na composição fosfolipídica podem afetar a respiração mitocondrial [2], que tem sido associada a uma variedade de doenças humanas, como síndrome de Barth, isquemia e insuficiência cardíaca [3, 4]. A diversidade de fosfolipídios na membrana mitocondrial também é influenciada pela variação no comprimento e grau de insaturação da cadeia de acil graxo presente em cada classe de fosfolipídios [5]. No entanto, o papel da composição da cadeia de acila dos fosfolipídios na função mitocondrial ainda é pouco compreendido.

A manutenção da composição fosfolipídica nas membranas mitocondriais é essencial para a função, estrutura e biogênese mitocondrial e depende do metabolismo dos fosfolipídeos, transporte para as mitocôndrias e fornecimento de lipídeos da dieta. Nesta revisão, enfocamos a biossíntese, o tráfego e a degradação de fosfolipídios e sua regulação / remodelação por lipídios da dieta, bem como seu papel na integridade e função da membrana mitocondrial interna.

2. Composição lipídica das membranas mitocondriais

As mitocôndrias têm uma estrutura distinta das outras organelas, pois contêm duas membranas: a membrana mitocondrial externa (OMM) e a membrana mitocondrial interna (IMM), que separa o espaço intermembranar (IMS) da matriz. A composição das membranas mitocondriais é semelhante à de outras membranas, no entanto. Os principais fosfolipídios nas membranas mitocondriais são fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS) e ácido fosfatídico (PA), quanto à membrana plasmática e fosfatidilglicerol (CL) e cardiol são exclusivamente componentes da membrana mitocondrial (Figura 1). PC e PE são os fosfolipídios mais abundantes, compreendendo 40 e 30% do total de fosfolipídios mitocondriais, respectivamente. PA e PS constituem 5% do total de fosfolipídios mitocondriais [6, 7]. Ao contrário da membrana plasmática, as membranas mitocondriais contêm altos níveis de cardiolipina (

15% do total de fosfolipídios) e baixos níveis de esfingolipídios e colesterol [8, 9].


(uma)
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(d)
(e)
(uma)
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(e) Fórmulas estruturais dos principais fosfolipídios mitocondriais. (a) Fosfatidilcolina - PC (b) fosfatidiletanolamina - PE (c) ácido fosfatídico - PA (d) fosfatidilserina - PS (e) cardiolipina - CL.

O fosfolipídeo CL não só tem um papel na manutenção do potencial de membrana e da arquitetura da membrana mitocondrial interna, mas também fornece suporte estrutural e funcional essencial para várias proteínas envolvidas na respiração mitocondrial. A estrutura única do CL (Figura 1), que contém três backbones de glicerol e quatro cadeias de acil graxo, torna-o altamente importante para o funcionamento ideal da mitocôndria [10]. A incorporação de quatro cadeias laterais do ácido linoléico na mesma molécula de CL torna-o o principal alvo do ataque dos radicais livres, causando sua peroxidação. A peroxidação mitocondrial do CL parece ser um evento precoce que precede a morte celular apoptótica intrínseca [11]. Devido ao seu papel na apoptose e função mitocondrial, os níveis de CL e a peroxidação de CL têm sido implicados em várias doenças humanas, como aterosclerose [12], câncer [13], síndrome de Barth [14] e doenças neurodegenerativas, incluindo Alzheimer [15] e doença de Parkinson [16].

Outra peculiaridade do IMM é que a quantidade de proteínas associadas à membrana é alta. Alguns estudos estimam que a proporção proteína-lipídio da membrana interna seja tão alta quanto 3: 1 [17]. Entre as proteínas IMM, uma porção significativa das proteínas compreende o sistema de fosforilação oxidativa, que contém cinco complexos multiproteicos. A importância desse sistema reside em seu papel em fornecer as moléculas de ATP celulares necessárias para a sobrevivência celular. A atividade e estabilidade das proteínas de fosforilação oxidativa são afetadas por sua interação com os fosfolipídios no IMM. Por exemplo, a falta de cardiolipina em IMM foi encontrada para desestabilizar os complexos III e IV do sistema de fosforilação oxidativa [18, 19], ilustrando a importância do CL para a respiração mitocondrial. Além disso, CL também está envolvido na importação e montagem de proteínas. A maioria das proteínas mitocondriais são codificadas nuclearmente e requerem translocases de proteínas nas membranas mitocondriais para serem importadas [20]. Vários estudos têm mostrado que o CL é essencial para a montagem e função das translocases, permitindo a integridade da maquinaria de importação mitocondrial [21–23].

Além de ter um papel na regulação da importação e atividade de proteínas, CL, bem como PE, é importante para a morfologia mitocondrial tubular e fusão de membrana [24-28]. A morfologia mitocondrial depende de um equilíbrio entre os eventos de fusão e fissão. A fusão mitocondrial requer um lipídio fusogênico PA que é gerado pela hidrólise do CL pela fosfolipase D [26]. PE é outro fosfolipídeo necessário para a fusão mitocondrial. A interrupção da síntese de PE através da via de descarboxilação de PS causa defeitos de fusão das mitocôndrias [25]. O acúmulo de CL e PE dentro das mitocôndrias é regulado pelas proteínas Ups1 e Ups2, respectivamente, que estão envolvidas no tráfego intramitocondrial de fosfolipídios (ver Seção 6). Ups1 e Ups2 afetam o processamento de OPA1 (ou Mgm1 na levedura), uma GTPase semelhante à dinamina da membrana interna que regula a fusão da membrana [8]. Foi sugerido que o processamento deficiente de Mgm1 poderia explicar os defeitos na morfologia mitocondrial com uma composição de fosfolipídios de membrana alterada [8]. Uma diminuição no conteúdo mitocondrial de PE foi encontrada para alterar a morfologia mitocondrial em leveduras [27] e células de mamíferos [25]. Joshi e colegas demonstraram que CL e PE têm funções sobrepostas na fusão mitocondrial e que a ruptura de ambos PE e CL causa perda do potencial de membrana mitocondrial e fragmentação de mitocôndrias de levedura [27]. Mitocôndrias fragmentadas estão associadas a cardiomiopatia e síndrome de Barth, mostrando a relevância do papel de CL e PE na fusão mitocondrial. Nesta linha, um fermento crd1 mutante que não sintetiza CL exibe múltiplos defeitos mitocondriais e celulares, incluindo perda de DNA mitocondrial, diminuição da função respiratória e potencial de membrana e redução da viabilidade celular em temperaturas elevadas como consequência da falta de CL [29]. Fenótipos semelhantes foram encontrados em psd1 mutante de levedura, que reduziu PE mitocondrial [30]. Tomados em conjunto, os fosfolipídios mitocondriais CL e PE regulam a fusão / fissão mitocondrial e a biogênese, que por sua vez estão ligadas à homeostase celular.

O fosfolipídio PA tem funções importantes como âncora lipídica para recrutar proteínas envolvidas no tráfego [31], sinalização lipídica [32] e fusão [33] às superfícies da membrana. A regulação da fusão e fissão das mitocôndrias por PA foi encontrada para permitir que as mitocôndrias alterem sua morfologia, para aumentar a eficiência da produção de energia e para marcar mitocôndrias prejudiciais para autofagia [34]. Além disso, o PA pode servir como substrato para a produção dos lipídeos de sinalização diacilglicerol (DAG) e ácido lisofosfatídico. Mutações no gene Lipin-1, a PA fosfatase que gera DAG do PA, têm sido associadas a doenças metabólicas e neurológicas [35].

Essas evidências demonstram a importância dos fosfolipídios da membrana mitocondrial para a arquitetura IMM, a apoptose, a atividade de proteínas respiratórias e o transporte de proteínas para a mitocôndria. Devido ao seu amplo papel na função mitocondrial, as alterações dos fosfolipídios têm sido associadas a várias doenças [36]. Por exemplo, as células cancerosas, que são caracterizadas por alterações na bioenergética e apoptose, alteraram a composição fosfolipídica mitocondrial [37]. As patologias cardíacas resultam em redução do tetralinoleil-CL, com conseqüente aumento do peróxido de hidrogênio pela cadeia respiratória e apoptose [38, 39]. Doenças metabólicas, como diabetes e doença gordurosa não-alcoólica, também foram associadas à diminuição do CL mitocondrial e à alteração da remodelação da cadeia de acila do CL [40, 41]. Outro aspecto importante relacionado à composição dos fosfolipídios é sua alteração com o envelhecimento. Estudos relataram que o envelhecimento está inversamente relacionado ao conteúdo de fosfolipídios insaturados [42]. A perda de fluidez da membrana resultante da peroxidação lipídica, bem como a diminuição do conteúdo de CL mitocondrial e a atividade alterada da cadeia respiratória também são características do envelhecimento [43]. Portanto, a regulação da homeostase dos fosfolipídios nas membranas mitocondriais por meio de sua síntese / degradação e transporte para dentro e para fora da membrana mitocondrial desempenha um papel crucial na manutenção da viabilidade celular e da saúde.

3. A biossíntese dos principais fosfolipídios da membrana ocorre no ER

Dois principais fosfolipídios de bicamada de membrana PC e PE são produzidos a partir de colina e etanolamina e o intermediário lipídico comum diacilglicerol no processo conhecido como de novo Via de Kennedy de CDP-colina e CDP-etanolamina [44, 45] (Figura 2). Ambos os brunches da via dependem da disponibilidade dos substratos extracelulares, colina e etanolamina, e de sua entrada nas células. Esses substratos são moléculas polares e precisam ser ativamente transportados para as células. O sistema de transporte da etanolamina não foi amplamente estudado e permanece pouco compreendido. O transporte de colina para a síntese de PC é conhecido por ser mediado por um grupo de transportadores de soluto ubíquos da família SLC44A, principalmente pelo membro A1, também conhecido como proteína 1 semelhante ao transportador de colina (CTL1) e como o antígeno de superfície celular CDw92 [46 ] Imediatamente após entrar nas células, a colina e a etanolamina são fosforiladas por colina e etanolamina quinases, das quais

e - foram identificados e totalmente caracterizados em sistemas de mamíferos [47]. Os produtos quinase, fosfocolina e fosfoetanolamina, são então acoplados com CTP pelas enzimas regulatórias específicas e da via CDP-fosfocolina e CDP fosfoetanolamina citidililtransferases (CCT / Pcyt1 e ECT / Pcyt2) para produzir CDP-colina e CDP-etanolamina, respectivamente, e para liberar pirofosfato inorgânico. Nas etapas finais, a CDP-colina e os derivados CDP-etanolamina são condensados ​​com diacilglicerol, catalisada por múltiplas DAG-colina e DAG-etanolamina fosfotransferases (CPT, EPT, CEPT), para liberar CDP e produzir a bicamada formadora de fosfolipídeos PC e PE no retículo endoplasmático (RE).


Vias de síntese de fosfolipídios e sua interconexão. Os dois ramos do caminho Kennedy estão representados em cinza. Os principais metabólitos e enzimas que catalisam as respectivas reações são indicados. As abreviaturas são as indicadas no texto principal.

Os principais pontos regulatórios para a síntese de PC e PE através da via de Kennedy são as reações mais lentas (limitantes da taxa) governadas por Pcyt1 e Pcyt2, respectivamente. Além disso, como em outras vias metabólicas, a via de Kennedy é regulada pelas disponibilidades do substrato (colina / etanolamina e DAG). A regulação de Pcyt1 e Pcyt2 é amplamente estudada e historicamente considerada semelhante, mas estão surgindo evidências de que são completamente distintos e regulados de forma diferente [48-53].

A taxa de síntese de PC é predominantemente regulada pela atividade Pcyt1 [54]. Pcyt1 é ativado por associação com membranas e regulado para baixo por fosforilação [55]. A translocação de Pcyt1 para as membranas celulares é estimulada por ácidos graxos e também por fosfolipídios aniônicos [56-59]. Eles induzem a ligação do Pcyt1 às membranas, por causa de seus grupos de cabeça carregados negativamente [59].Assim, mudanças na composição lipídica das membranas podem modificar a atividade do Pcyt1, o que normalmente leva à estimulação da síntese de PC.

Ainda outra etapa regulatória para a síntese de PC é a disponibilidade de colina, que é regulada pelo transporte mediado por proteínas ao nível da membrana plasmática. O transportador universal CTL1 transporta colina em vários tecidos [60–62] e é considerado o transportador de colina predominante em células não neuronais [46, 60, 62, 63]. Recentemente, foi descoberto que a expressão de CTL1, a captação de colina e a síntese de PC podem ser diretamente reguladas pela deficiência de colina [64] e ácidos graxos saturados e insaturados (AFs) nas células do músculo esquelético [65]. A disponibilidade de colina e o tipo de AFs regulam a síntese de PC juntamente com a modificação diferente do transporte de colina, síntese de PC e homeostase de DAG / TAG. Em células com deficiência de colina, a síntese de PC a partir da colina foi atenuada, o que levou a um aumento da disponibilidade de DAG e FA para a síntese de TAG [64]. Semelhante à deficiência de colina, a exposição crônica de células musculares ao ácido palmítico reduziu CTL1, captação de colina e síntese de PC e aumentou DAG e TAG [65]. Em contraste, o ácido oleico não mostrou nenhum efeito no CTL1 e na captação de colina, no entanto, aumentou a síntese de PC no nível de Pcyt1 e aumentou o conteúdo de TAG [65]. O ácido oleico é um estimulador bem conhecido da ligação e atividade da membrana Pcyt1 [56-59].

o de novo a síntese de PE pode ser limitada pela disponibilidade de substratos etanolamina [66, 67] e DAG [68] ou das enzimas EK [69] e Pcyt2 [53]. Com base nos numerosos estudos de radiomarcação e modelos animais, Pcyt2 é a principal enzima reguladora na via CDP-etanolamina. Camundongos heterozigotos para o gene Pcyt2 (

) têm formação reduzida de CDP-etanolamina, o que limita a síntese de PE e aumenta a disponibilidade de DAG para a síntese de TAG [70]. Por outro lado, a superexpressão de Pcyt2 não pode acelerar a síntese de PE quando a disponibilidade de DAG para a última etapa da via estava limitando a formação de PE [68], enquanto a superexpressão de EK acelerou a síntese de PE em células Cos-7 [69]. Em baixos níveis de etanolamina, Pcyt2 limita a taxa de reação, enquanto em altos níveis de etanolamina, EK limita a taxa [71]. Em meios deficientes em etanolamina, as células adaptam a via de descarboxilação de PS mitocondrial para produzir PE adicional a partir da serina (ver Seção 4) [72]. No entanto, este não é o caso no metabolismo normal. Estudos em animais indicam que a via CDP-etanolamina é a via de contribuição principal para a síntese de PE [53].

No fígado, uma via alternativa utiliza PE para produzir mais PC e colina em uma metilação de três etapas de PE por S-adenosilmetionina (SAM) catalisada por fosfatidiletanolamina-N-metiltransferase (PEMT). A via PEMT é responsável por

30% da síntese hepática de PC e é co-regulada com a via de Kennedy CDP-colina [73]. Não se sabe como a via de Kennedy CDP-etanolamina, que só faz PE de novo, está relacionado com o PE usado na via PEMT para a formação de PC. No entanto, nos camundongos knockout para PEMT, a via CDP-colina é regulada positivamente, enquanto durante a superexpressão de PEMT em células de hepatoma, ela é regulada para baixo, mostrando uma forte ligação da via PEMT com o metabolismo PC do fígado [74, 75]. Como via de backup, o PEMT fornece PC para a montagem da lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL) e para a produção de bile e é uma fonte de colina para a síntese de betaína na mitocôndria [76]. A metilação hepática de PE também fornece PC para a síntese de PS pela reação de troca de base catalisada pela PS sintase 1 (PSS1). O PS recém-formado poderia então ser transformado em PE mitocondrial pela PS descarboxilase (PSD), formando um ciclo de PE específico do fígado [77] (Figura 2). O ciclo hepático PE-PC-PS pode estar envolvido na manutenção dos níveis de fosfolipídios quando de novo As vias de CDP-colina e CDP-etanolamina estão prejudicadas.

Em mamíferos, o PS poderia ser feito apenas a partir dos fosfolipídios preexistentes (PC e PE) e L-serina, catalisados ​​pelas PS sintases 1 e 2 (PSS1 e PSS2) nas membranas associadas às mitocôndrias (MAM), uma subfração do ER. MAM foi proposto para ser um domínio distinto do ER que entra em contato próximo com OMM e, assim, medeia a importação de PS recentemente sintetizado em mitocôndrias para ser descarboxilado em PE. A descarboxilação de PS por PSD para formar PE mitocondrial é uma função chave de PS na mitocôndria (ver Seção 4).

A síntese de PS é regulada pela fosforilação da PS sintase em células de levedura e mamíferos [78, 79]. O principal mecanismo para regular a síntese de PS em células de mamíferos é um mecanismo de feedback, pelo qual a atividade das PS sintases 1 e 2 é regulada pelo produto final, PS [77, 80, 81]. Além disso, PSS1 e PSS2 modulam diferencialmente o metabolismo de fosfolipídios. A superexpressão de PSS1 em células de hepatoma diminui a taxa de síntese de PE por meio da via CDP-etanolamina [82], enquanto a superexpressão de PSS2 não [83].

4. A Biossíntese de Fosfolipídios Mitocondriais

A manutenção da bicamada mitocondrial e de uma composição definida de fosfolipídios mitocondriais depende da capacidade da organela de sintetizar CL, PE, PG e PA no local e no fornecimento externo de PC e PS, que são sintetizados exclusivamente no ER e MAM e devem ser importados para as mitocôndrias [8].

PE é feito nas mitocôndrias por descarboxilação de PS. Esta reação é catalisada pela enzima mitocondrial interna fosfatidilserina descarboxilase (PSD). Embora o PE produzido pela via CDP-etanolamina possa ser importado para IMM, a descarboxilação do PS fornece a maior parte do PE mitocondrial [84]. Camundongos knockout para PSD têm disfunção mitocondrial e morrem na fase embrionária [25]. Além disso, a deficiência de PE mitocondrial resultante do silenciamento de PSD por siRNA em células CHO altera a morfologia mitocondrial e afeta a produção de ATP, o consumo de oxigênio e a atividade dos componentes de transporte de elétrons [85].

A cardiolipina, um fosfolipídeo importante nas membranas mitocondriais, é sintetizada via condensação de fosfatidilglicerol (PG) e CDP-diacilglicerol catalisada pela cardiolipina sintase (CLS) no lado da matriz da membrana mitocondrial interna (Figura 2). PG é produzido por uma reação de duas etapas: glicerol-3-fosfato e CDP-diacilglicerol condensam em fosfato de fosfatidilglicerol, que é então desfosforilado em PG. A falta de CLS reduz a atividade do sistema de fosforilação oxidativa e a importação de proteínas para as mitocôndrias em leveduras [86], mas, curiosamente, as funções fundamentais das mitocôndrias permanecem intactas [87]. A regulação da síntese do CL envolve vários mecanismos, como fatores que afetam a biogênese mitocondrial, a HP da matriz e a respiração [88]. Recentemente, Tam41 (translocador e proteína de manutenção 41), um componente do sistema translocador mitocondrial, foi encontrado para regular a síntese de CL [23]. Tam41 as células mutantes mostram uma ausência quase completa de CL e PG, sugerindo que a regulação pode ocorrer ao nível da CDP-diacilglicerol (CDP-DAG) sintase. Este estudo demonstra que Tam41 é principalmente necessário para a biossíntese de PG e CL e que defeitos na importação de proteínas em células deficientes em Tam41 são uma consequência da perda de PG e CL [23].

Finalmente, o fosfolipídio ácido fosfatídico (PA) representa um ponto de ramificação para a síntese de todos os fosfolipídios [89] (Figura 2). O PA pode ser convertido em CDP-DAG pela CDP-DAG sintase para a síntese de PG, PS e CL em uma reação catalisada por CTP: PA citidililtransferase [90]. Alternativamente, o PA pode ser convertido em DAG, que é um substrato para a síntese de PE e PC, em uma reação catalisada por PA fosfatases, como Lipin-1 [35, 91]. As PA fosfatases são uma das enzimas mais reguladas no metabolismo lipídico. Sua atividade é governada pela fosforilação, associação com membranas e modulação por componentes do metabolismo lipídico, como CL e CDP-DAG [92, 93].

A síntese do PA ocorre por duas etapas de acilação, primeiro o glicerol-3-fosfato é convertido em 1-acilglicerol-3-fosfato (ácido lisofosfatídico) pela glicerol-3-fosfato aciltransferase. O produto 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato é então acilado a 1,2-diacil-sn-glicerol-3-fosfato (ácido fosfatídico) por 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato aciltransferase [94] . Estudos indicaram que tanto o ácido lisofosfatídico quanto o ácido fosfatídico são sintetizados na superfície externa da membrana mitocondrial externa e, em seguida, o ácido fosfatídico se move para a membrana mitocondrial interna, onde serve como um precursor para a biossíntese de cardiolipina [95]. O PA também pode ser gerado por meio da fosforilação de DAG por meio da ação de uma grande família de quinases DAG (DAGK) ou por hidrólise dos fosfolipídeos PC e CL pela fosfolipase D (ver Seção 8). Por sua vez, o PA pode ser metabolizado em ácido lisofosfatídico pela fosfolipase A2 ou desfosforilado em DAG pela Lipina-1.

5. Tráfico de Fosfolipídios para dentro e para fora da Mitocôndria

O tráfego intracelular de fosfolipídios desempenha um papel crucial na homeostase de fosfolipídios e fornece fosfolipídios para membranas celulares e organelas, incluindo OMM e IMM. Como a maioria dos fosfolipídios, como PE, PS e PC, são sintetizados no ER, eles precisam ser importados para a mitocôndria. A importação de PE produzida pela via CDP-etanolamina em IMM foi considerada eficaz em células CHO, células HeLa e levedura [96-98]. No entanto, a maior parte do PE na mitocôndria deriva da descarboxilação do PS [85]. A síntese de PE a partir de PS no IMM requer a translocação de PS de seus locais de síntese no ER. Além disso, vários estudos mostraram que o PE formado a partir de PS na mitocôndria pode ser exportado para fora desta organela [85, 97]. O transporte de PE derivado de PS para fora da mitocôndria foi encontrado para ser afetado pela taxa de síntese de PE através da via CDP-etanolamina e ser conduzido por um gradiente de concentração [97].

Foi proposto que o mecanismo de transporte de fosfolipídios para dentro e para fora das membranas mitocondriais envolva locais de contato transiente com a membrana. Esses locais de contato ocorrem em várias organelas, incluindo o ER e as mitocôndrias e podem estar envolvidos no tráfico de PS para e PE fora das mitocôndrias [99, 100]. Estudos recentes descobriram que a membrana ER está fisicamente presa ao OMM pela estrutura de encontro ER-mitocôndria (ERMES) [101]. O ERMES é composto por um complexo de cinco proteínas residente do ER e das mitocôndrias [101]. A principal função do ERMES é atuar como um elo mecânico entre o ER e as mitocôndrias e fornecer troca de fosfolipídios entre essas organelas [102, 103]. Um complexo ERMES defeituoso altera os níveis de fosfolipídios nas membranas mitocondriais e causa defeitos morfológicos mitocondriais [103, 104]. No entanto, o fluxo de fosfolipídios entre ER e mitocôndrias não é completamente abolido em células deficientes em ERMES, sugerindo que também devem existir vias adicionais independentes de ERMES para o transporte de fosfolipídios [102].

As proteínas de transferência de lipídios, como a proteína de transferência de PC e a proteína de transferência de lipídios inespecífica, mostraram transferir fosfolipídios para a membrana plasmática e também podem estar envolvidas na troca de fosfolipídios entre as membranas de organela [105]. No entanto, nenhuma proteína de transferência que medeia o tráfego de PC, PS e PE para dentro / fora das mitocôndrias foi estabelecida até o momento.

A taxa de importação de PS e exportação de PE da mitocôndria é regulada pela composição da cadeia de acila e pela taxa metabólica [97]. Estudos de rotulagem mostraram que espécies de PS poliinsaturadas são preferencialmente descarboxiladas, ou seja, importadas para IMM [97]. Por sua vez, PE derivado da descarboxilação de PS contém as principais espécies poliinsaturadas, bem como monoinsaturadas 36: 1, enquanto PE produzido através da via CDP-etanolamina contém várias espécies mono e di-insaturadas. A composição de espécies de PE do IMM e ER mostra que a maior parte do PE no IMM deriva de PS importado, enquanto a maior parte do PE no ER é sintetizada através da via CDP-etanolamina [97]. Além disso, Kainu e colegas descobriram que aumentar a síntese de PE pela via CDP-etanolamina reduz a exportação de PE derivado de PS de IMM. Da mesma forma, a translocação de PS para mitocôndrias é acoplada à sua síntese no ER. No entanto, a taxa de transporte de PS sintetizado recentemente para as mitocôndrias não se correlaciona diretamente com sua taxa de síntese, mas depende de sua hidrofobicidade [97].

6. Tráfico Intramitocondrial de Fosfolipídios

Os movimentos transbicamadas entre os folhetos mitocondriais devem existir para permitir o tráfego e o acúmulo de fosfolipídios, quando importados do ER ou quando sintetizados no IMM. Vários estudos mostraram que a importação de PS na mitocôndria é mediada pelo contato da membrana entre MAM, uma subfração do ER e OMM [84, 85, 97, 106, 107]. O PS deve, então, translocar através do OMM e, subsequentemente, ser entregue a partir do folheto interno do OMM, através do espaço intermembranar, para o folheto externo do IMM, que é o local ativo para a descarboxilação de PS para PE [108]. Os mecanismos subjacentes ao movimento lipídico intramitocondrial também foram sugeridos como ocorrendo através dos locais de contato da membrana [99, 109]. O modelo que melhor descreve o transporte intramitocondrial de PS envolve poros no OMM que levam ao seu movimento do folheto externo do OMM para o folheto interno do OMM. O PS então se difunde ainda mais para o IMM ao longo das pontes lipídicas, que são análogas aos locais de contato da membrana, unindo as duas membranas [110]. Uma vez no IMM, o PS pode ser convertido em PE. O PE produzido no IMM pode então se difundir de volta para a monocamada externa do OMM ao longo de uma rota reversa.

Os fosfolipídios scramblases (PLS), membros da família dos transportadores transmembranares de lipídios conhecidos como flippases, são enzimas responsáveis ​​pelo movimento bidirecional dos fosfolipídios entre dois compartimentos. Desta família, o PLS3 foi identificado na mitocôndria e modula a translocação do CL do IMM para o OMM, afetando a estrutura mitocondrial, a respiração e a apoptose [111]. Não se sabe se PLS3 regula o transporte de outros fosfolipídios. As proteínas do espaço intermembrana Ups1 e Ups2 são responsáveis ​​pelo tráfego de CL e PE entre as membranas mitocondrial externa e interna [112]. A perda do tráfego intramitocondrial de CL em células deficientes em Ups1 altera a composição e morfologia dos fosfolipídios mitocondriais, semelhante às células deficientes em ERMES [112]. Mdm35, um parceiro de ligação comum de Ups1 e Ups2 no espaço intermembranar, também fornece uma regulação coordenada do tráfego de PE e CL por essas proteínas reguladoras conservadas [113].

Portanto, o tráfego de fosfolipídios na mitocôndria e no espaço intramitocondrial fornece a esta organela fosfolipídios recentemente sintetizados, que são essenciais para a composição da membrana mitocondrial ou precursores para a síntese de fosfolipídios mitocondriais específicos. O equilíbrio no tráfego de fosfolipídios, junto com sua síntese e degradação, é essencial para a manutenção da homeostase de fosfolipídios. No entanto, não apenas a classe de fosfolipídios acumulados na membrana mitocondrial, mas também a cadeia de acila gordurosa presente nos fosfolipídios é importante para a estrutura e função mitocondrial, que serão descritas na próxima seção.

7. Remodelação de Fosfolipídios Mitocondriais e o Papel dos Lipídios na Dieta

Depois de de novo síntese de fosfolipídios, muitos deles sofrem remodelação da cadeia de acila, conhecida como ciclo de Terras. A variação no comprimento da cadeia e grau de insaturação dos ácidos graxos presentes nos fosfolipídios contribui para a diversidade dos fosfolipídios da membrana mitocondrial, que é importante para as propriedades biofísicas da membrana [114, 115]. Além disso, a ativação de enzimas na membrana mitocondrial interna requer a remodelação da cadeia de acila. Por exemplo, o comprometimento da remodelação CL pode interferir na montagem e estabilidade das proteínas da cadeia respiratória [115]. Convencionalmente, a remodelação da cadeia acila envolve a família das fosfolipases A (PLAs), que catalisam a remoção de uma cadeia acila da porção glicerol, e transacilases, que medeiam a reacilação com diferentes FAs [114, 116].

A remodelação da cardiolipina tem sido amplamente estudada devido ao seu papel na funcionalidade da mitocôndria. A remodelação CL envolve tafazzin, uma transacilase que gera padrões específicos de espécies CL [117]. A deficiência de tafazzin altera a composição do CL e está relacionada a mudanças dramáticas na morfologia mitocondrial e à síndrome de Barth [118]. A síndrome de Barth é uma doença recessiva ligada ao X caracterizada por níveis diminuídos de CL devido à mutação no gene tafazzin [119]. Em pacientes de Barth, uma única espécie molecular, a saber, tetralinoleoil-cardiolipina, está ausente, enquanto outras cardiolipinas não são afetadas ou mesmo aumentadas. Isso é causado por uma incorporação reduzida de ácido linoléico (C18: 2) no CL por causa da remodelação prejudicada de FA pelo tafazzin [118, 120]. Mudanças na composição de cardiolipina FA na síndrome de Barth também podem interferir na montagem e estabilidade dos complexos de fosforilação oxidativos.

Outra enzima envolvida na remodelação da cardiolipina é a acil coenzima A tioesterase (Them5). Camundongos sem Them5 têm uma morfologia mitocondrial alterada e função nos hepatócitos [121]. Da mesma forma, a deficiência de lipocalina-2, uma proteína de transferência de lipídios, altera a composição de ácidos graxos do PE, PC e PS, bem como a quantidade de cardiolipina mitocondrial no coração do camundongo [122]. A lipocalina reduziu o conteúdo de ácido linoléico (C18: 2) nos fosfolipídios e afetou adversamente a função mitocondrial e a produção de energia [122]. Na verdade, a cardiolipina enriquecida com ácido linoléico simétrico permite o funcionamento ideal da mitocôndria [123].

A composição de ácidos graxos da dieta pode, adicionalmente, modificar a remodelação da cadeia acila de fosfolipídios e a função mitocondrial. Em um estudo, a exposição de camundongos à dieta rica em óleo de colza mostrou composição alterada de fosfolipídios da membrana mitocondrial em termos do tipo de cadeias de acila dentro dos fosfolipídios e das proporções das classes de fosfolipídios. Como resultado da composição alterada da membrana mitocondrial, esses camundongos apresentaram bioenergética mitocondrial hepática alterada [124]. Guderley e colaboradores mostraram que nas mitocôndrias de truta as mudanças nas características dos fosfolipídios da membrana, incluindo a composição da cadeia acila, seguem os padrões dos ácidos graxos presentes na dieta. Nesse mesmo estudo, a capacidade respiratória da mitocôndria do músculo vermelho foi alterada pelas diferentes dietas e foi considerada maior na dieta rica em lipídios poliinsaturados [125]. Vários outros estudos em mamíferos também demonstraram que as mudanças na dieta modificam a composição de AF dos principais fosfolipídios mitocondriais [126-128] e, em particular, as espécies moleculares associadas ao CL mitocondrial [57]. Seguindo uma dieta deficiente em ácido linoléico (C18: 2), um ácido graxo essencial, o coração de rato mostrou uma diminuição significativa no CL de tetralinoleoil, que afetou o consumo de oxigênio mitocondrial [127, 129]. Por outro lado, a suplementação dietética com ácido linoléico restaurou tetralinoleoil CL em cultura de fibroblastos de pacientes com síndrome de Barth e níveis elevados de CL [130].

A composição do CL mitocondrial foi encontrada alterada tanto pela quantidade quanto pela qualidade da gordura dietética [131]. Nos hepatócitos, a composição do CL mitocondrial foi alterada em ratos alimentados com dietas com 30% de gordura em comparação com ratos alimentados com dietas com 5% de gordura. Além disso, o conteúdo de ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) e ácidos graxos poliinsaturados n-3 (PUFA) foi aumentado com a dieta rica em óleo de peixe em comparação com a dieta basal, tanto a 5% como a 30% de gordura na dieta. Tanto o conteúdo total de CL quanto seu conteúdo C18: 2 aumentaram com a esteatose hepática e se correlacionaram com a atividade da ATP sintase [131]. Recentemente, uma análise lipidômica mitocondrial mostrou que a composição de FA do pool de CL não está diretamente relacionada à presença de um determinado FA na dieta, mas há uma seleção de cadeias de FA individuais a serem incorporadas ao pool de CL [132]. Por exemplo, a incorporação de 18: 2 foi considerada semelhante, apesar das dietas variadas

4 vezes neste FA essencial.

O conteúdo de PUFA n-3 da membrana plasmática em diferentes tecidos de camundongos teve a maior sensibilidade às mudanças nos ácidos graxos da dieta [133]. O fato de que as classes n-6 e n-3 de PUFA não podem ser sintetizadas de novo por mamíferos sugere que a composição dos fosfolipídios da membrana pode ser fortemente influenciada pela proporção e abundância de PUFAs n-6 e n-3 na dieta. Vários estudos mostraram que o aumento do conteúdo de PUFA da dieta aumenta a taxa metabólica [134–136]. Por exemplo, o tratamento de ratos com n-3 PUFA diminuiu o vazamento de prótons da cadeia respiratória e isso foi relacionado à incorporação de PUFAs em PC mitocondrial, PE e CL [137]. O tratamento com ácido docosahexaenóico (DHA), mas não com ácido eicosapentaenóico (EPA), altera profundamente a composição de ácidos graxos dos fosfolipídios mitocondriais no coração do rato, diminuindo o ácido araquidônico e aumentando o conteúdo de DHA. O conteúdo aumentado de DHA atrasou a abertura do poro de transição da permeabilidade mitocondrial (MPTP), que está associada à apoptose e dano miocárdico durante a isquemia [127]. A incorporação de DHA em CL também foi encontrada para regular o agrupamento mitocondrial de proteína-lipídio, o que altera vários aspectos da função mitocondrial [17]. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que o aumento do nível de PUFA na dieta altera a composição dos fosfolipídios da membrana mitocondrial e, consequentemente, pode alterar a capacidade e função mitocondrial.

A resposta aos ácidos graxos da dieta também varia de acordo com a classe de fosfolipídios. O PC foi mais responsivo à variação no conteúdo de MUFA da dieta do que as outras classes de fosfolipídios, ao passo que o PE foi mais responsivo do que o PC aos PUFA n-6 e n-3 da dieta [133]. Curiosamente, camundongos deficientes em Pcyt2, que têm uma taxa diminuída de síntese de PE, são deficientes em PUFA e modificaram especificamente a composição de AF em PE e em TAG [70]. Portanto, a mudança na composição da cadeia de acil graxo de fosfolipídios depende não apenas do perfil de ácidos graxos da dieta, mas também das classes de fosfolipídios afetados.

Tomados em conjunto, esses estudos demonstraram que a perturbação das enzimas envolvidas na remodelação dos fosfolipídios, bem como as mudanças nos ácidos graxos da dieta, podem alterar a composição dos fosfolipídios da membrana mitocondrial. As intervenções dietéticas que são capazes de influenciar os fosfolipídios da membrana mitocondrial, modificando assim suas propriedades físicas, respiração e outros processos como o MPTP, estão emergindo como novas estratégias terapêuticas [124]. As terapias direcionadas aos fosfolipídios mitocondriais têm sido sugeridas como potencialmente úteis para tratar patologias, como câncer, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, obesidade e distúrbios metabólicos [124].

8. Degradação de Fosfolipídios Mitocondriais

Muitos fosfolipídios têm uma renovação rápida, indicando que sua degradação desempenha um papel importante na homeostase da membrana. A degradação dos fosfolipídios é principalmente catalisada por fosfolipases não lisossômicas. Essas fosfolipases são divididas em três classes com base na ligação que clivam: fosfolipases A (PLAs), fosfolipases C (PLCs) e fosfolipases D (PLD).

PLAs liberam o ácido graxo no sn-1 e sn-2 posição da porção glicerol gerando lisofosfolipídeo e AF livre. O lisofosfolipídeo é reacilado para gerar um novo fosfolipídeo, o mecanismo conhecido como remodelação de AF, ou é degradado por uma lisofosfolipase. Vários estudos sugerem que os PLAs medeiam grande parte da renovação dos fosfolipídios [138, 139]. A família PLA2, que hidrolisa o FA ligado ao snA posição -2 do fosfolipídeo tem sido relacionada à renovação e remodelação dos fosfolipídeos, bem como à homeostase da membrana [140, 141]. iPLA2

independente da família PLA2, é preferencialmente distribuída nas mitocôndrias. Devido à associação do iPLA2 com as membranas mitocondriais, essa enzima pode estar envolvida na integração do fosfolipídio e do metabolismo energético. Camundongos nulos para iPLA2 exibem função mitocondrial anormal com uma redução dramática no consumo de oxigênio [142]. Assim, o iPLA2 é essencial para manter a função mitocondrial bioenergética por meio da regulação da homeostase dos fosfolipídios da membrana mitocondrial. Devido ao seu papel na remodelação da cardiolipina, o hipocampo de camundongos nulos para iPLA2 mostra um conteúdo elevado de cardiolipina mitocondrial com uma composição alterada do comprimento da cadeia [142].

As fosfolipases C (PLCs) hidrolisam a ligação entre a estrutura do glicerol e o fosfato para produzir DAG e o grupo principal fosforilado. Os PLCs estão geralmente envolvidos na geração de segundos mensageiros para eventos de sinalização [143], mas também desempenham um papel no turnover do PC e PE [144, 145].

As fosfolipases D hidrolisam a ligação entre o fosfato e o grupo principal para produzir PA e o grupo principal livre. Tanto os membros clássicos da família da fosfolipase D (PLD) encontrados em muitas superfícies da membrana citoplasmática quanto o MitoPLD, o membro da família PLD encontrado na superfície mitocondrial, podem gerar PA por meio da hidrólise dos fosfolipídios PC e CL [26]. O PA gerado pelo MitoPLD regula a forma mitocondrial por meio da facilitação da fusão mitocondrial [146]. A fusão e fissão mitocondrial são muito importantes na manutenção da função mitocondrial e celular, e as alterações morfológicas das mitocôndrias estão ligadas à apoptose celular e doença neurodegenerativa [146]. Por exemplo, em cérebros de pacientes com doença de Alzheimer, o PLD1 é regulado positivamente na membrana mitocondrial, o que afeta a composição dos fosfolipídios da membrana mitocondrial [147].

O envolvimento de fosfolipases na homeostase de fosfolipídios também é demonstrado por enzimas semelhantes a PLD que catalisam a síntese de PS por reações de troca de base. PS sintases 1 e 2 (PSS1 / 2), as enzimas semelhantes a PLD, catalisam principalmente a troca do grupo principal de PE ou PC por serina em vez da troca do grupo principal de serina de PS por colina ou etanolamina. Assim, PLD e enzimas semelhantes a PLD podem desempenhar um papel importante na homeostase de fosfolipídios diferentes [84].

9. Conclusão

A identificação de uma ligação entre fosfolipídios e proteínas na membrana mitocondrial tem melhorado nossa compreensão da morfologia e função mitocondrial. A regulação da síntese, tráfego e degradação de fosfolipídios é essencial para manter a homeostase de fosfolipídios na mitocôndria. A remodelação do fosfolipídio na mitocôndria pode ser modificada pelos ácidos graxos da dieta, que contribuem para a integridade da membrana mitocondrial. No entanto, o mecanismo molecular para a coordenação da síntese, degradação, tráfico e remodelação de fosfolipídios ainda é uma área ativa de pesquisa. Por exemplo, como a síntese e a degradação estão interligadas? Quais são os sinais para o transporte de fosfolipídios para dentro e para fora das mitocôndrias? Como a dieta pode ser usada para modular a homeostase dos fosfolipídios em estados de saúde e doença? Sem dúvida, muitas descobertas serão realizadas em poucos anos.

Conflito de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses quanto à publicação deste artigo.

Agradecimentos

Este trabalho no laboratório de Marica Bakovic foi apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde e pelo Conselho Nacional de Ciências e Pesquisa em Engenharia do Canadá.

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Direito autoral

Copyright & # xA9 2014 Laila Cigana Schenkel e Marica Bakovic. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.


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Discussão

A caspase-8 interage com as mitocôndrias em células saudáveis ​​[52] e apoptóticas [53], [54]. No entanto, não ficou claro como a caspase-8 interage com o CL nas mitocôndrias. Foi sugerido que esta enzima é translocada para a mitocôndria junto com seu substrato conhecido, Bid [25]. No entanto, a translocação da caspase-8 para a mitocôndria após a ativação do Fas não é afetada nas células knock-down de Bid. A interação da caspase-8 com a mitocôndria pode ser mediada por outras proteínas [54] ou, conforme descrito para tBid, a caspase-8 pode interagir não apenas com outras proteínas, mas também diretamente com o lipídeo CL na membrana mitocondrial. O modelo & # x0201cembedded together & # x0201d para a associação dos membros da família Bcl-2 com o domínio lipídico das membranas assume que a inserção dessas proteínas na membrana mitocondrial externa durante a apoptose afeta as afinidades das várias proteínas Bcl-2, criando novos superfícies de interação [30], [55]. Foi conjecturado que os microdomínios da membrana mitocondrial enriquecidos em CL desempenham um papel importante na apoptose e no controle do fluxo enzimático [56].

Nós investigamos o papel do CL na formação de tal plataforma de reação de ativação de apoptose, gerando um mínimo em vitro sistema de reconstituição com membranas biomiméticas (LUVs e GUVs). Western blotting e citometria de fluxo ( Figura 1 ) foram usados ​​para distinguir entre a ligação específica e não específica de Bid e caspase-8. De fato, enquanto Bid não interagiu nem com DOPC nem com lipossomas CL +, a caspase-8 foi encontrada para interagir com LUVs contendo CL, dando origem à forma ativada por CL p43 kDa ( Fig. 1b, c ).

Em seguida, usamos Laurdan como um marcador de fluidez, para estudar os efeitos da caspase-8, Bid e do complexo caspase-8 + Bid em um modelo de membrana relevante. As diferenças nos espectros de excitação e emissão de fluorescência de Laurdan na fase de gel e líquido-cristalino tornam possível usar o parâmetro de polarização geral (GP) para relatar as mudanças locais no conteúdo de água da membrana relacionadas às mudanças na fluidez da membrana devido à ligação às proteínas . O lance sozinho não se ligou aos lipossomas ( Fig. 4 ) Em contraste, a caspase-8 e a caspase-8 mais Bid diminuíram a fluidez das membranas contendo CL ( Figura 2 ), como, em menor medida, tBid. Este resultado é consistente com dados anteriores que indicam que a presença de tBid pode promover a formação de fases não lamelares altamente curvas [57]. Uma descoberta surpreendente foi o efeito marcante da própria procaspase-8 na membrana e subsequente ligação de Bid. O efeito aditivo de procaspase-8 e Bid pode resultar da aquisição de atividade funcional completa após a ligação ao CL. A interação do CL com a caspase-8 na membrana é importante para a progressão da apoptose, com a formação de uma plataforma de reação local da proteína CL evidente a partir da mudança no valor de GP. Esses resultados lançam luz sobre o papel das membranas mitocondriais na regulação da atividade da família de proteínas Bcl-2 [33].

Os resultados dos experimentos de tensão de ruptura e os da fluorescência de Laurdan são complementares. A abordagem de tensão de ruptura, originalmente desenvolvida por Evans e colaboradores [ver [43] e citações nele], pode ser usada para quantificar as propriedades micro-mecânicas de um filme fino, como uma membrana lipídica, estudando sua deformação. Aqui, o módulo de expansão (Ks) e a tensão de ruptura (& # x003c4r) foram avaliados por meio da expansão de grandes vesículas unilamelares (GUVs), cujas membranas constituíram um sistema modelo que mimetiza locais de contato mitocondrial. Descobrimos que a adição de CL resultou em uma diminuição acentuada nos módulos elásticos de bicamadas lipídicas DOPC, com ambos Ks e & # x003c4r fortemente afetado ( Fig. 3b e 3c ) A diminuição em Ks após a adição de CL indica que a membrana se torna mais fácil de expandir na presença deste lipídeo ( Fig. 3b ) A molécula de CL possui uma forma cônica inerente em um sistema de fase pura, portanto, seria preferencialmente encontrada na fase hexagonal invertida. No sistema de modelo usado aqui (CL / DOPC & # x0200a = & # x0200a5 / 95 mol / mol), evitamos intencionalmente estabelecer tal condição: Cada molécula de CL estava cercada por moléculas de DOPC. Em teoria, o sistema apresentou mistura quase ideal, pois as cadeias dos dois lipídios (oleoil-CL e DOPC) eram idênticas. O predomínio das espécies com preferência pela fase lamelar garantiu a manutenção do estado lamelar. O CL foi, portanto, estruturalmente frustrado, pois foi incorporado como um componente secundário em sua membrana hospedeira. No entanto, sua presença modifica localmente a curvatura espontânea. Devido às suas quatro cadeias de hidrocarbonetos, as moléculas CL submetidas à força externa agem como molas integradas que podem ser expandidas mais facilmente do que as moléculas DOPC, resultando em um K menors. Porém, não é possível para o sistema assumir uma fase hexagonal e os limites de expansão da fase lamelar são logo atingidos. A tensão de ruptura é, portanto, menor do que para o sistema puro. Os dados para o sistema de controle puro são consistentes com os dados publicados para vesículas DOPC [58], dando um Ks valor de cerca de 200 mN / m.

Em seguida, avaliamos as consequências mecânicas das proteínas no sistema de controle puro e no modelo de local de contato PC / CL ( Fig. 3 ) Nenhuma das proteínas testadas interagiu prontamente com a membrana de controle DOPC pura. As propriedades de GUVs contendo CL não foram alteradas pela ligação de Bid, enquanto a ligação de caspase-8, tBid e caspase-8 mais Bid modificou claramente as propriedades mecânicas dessas vesículas ( Fig. 3b e 3c ) A ligação da caspase-8 sozinha reverteu parcialmente os efeitos do CL, indicando um papel do CL na ligação. A frustração estrutural observada quando CL sozinho é adicionado foi reduzida, de modo que o valor do módulo de expansão ficou entre aqueles para o controle e o sistema do modelo DOPC / CL. A resistência à tração na ruptura foi essencialmente a mesma do sistema puro, sendo limitada apenas pela própria membrana lipídica. Muito provavelmente, a caspase-8 detecta a frustração da curvatura perto dos locais CL dentro da membrana e sua inserção compensa parcialmente isso. tBid sozinho também se ligou às vesículas modelo (DOPC / CL). Neste caso, a resposta elástica expansiva da membrana, avaliada pelo cálculo do módulo Ks, foi totalmente restaurado ao sistema de controle DOPC puro: A adsorção dessa proteína liberou totalmente a frustração estrutural causada pela presença de CL. É provável que todos os sites de interação estivessem saturados. No entanto, a presença da proteína claramente causava defeitos que enfraqueciam a membrana ao estresse mecânico. Isso é evidente pelo valor muito baixo da tensão de ruptura. Embora a membrana inicialmente respondesse a uma força de deformação com um aumento na área semelhante ao do sistema puro, a faixa total de expansibilidade foi muito menor, e a membrana quebrou quando a tensão aumentou em & # x0223c 4,2 mN / m, correspondente para uma mudança de & # x0223c 70% em relação aos sistemas de controle (DOPC puro ou DOPC / caspase-8). Evidentemente, dois domínios com propriedades elásticas diferentes foram formados. A maior parte da membrana consiste em DOPC essencialmente puro e não participa da interação ou do estabelecimento de uma plataforma de reação. Suas propriedades elásticas, portanto, não são modificadas, de modo que o K observados era & # x0223c200 mN / m. A outra parte da membrana, que contém CL como iniciador de uma plataforma de reação, é mais rígida. Não contribui visivelmente para a expansibilidade da membrana, mas limita a resistência geral, conforme mostrado pelo baixo valor de & # x003c4r. Comportamento semelhante foi observado para caspase-8 mais Bid, dentro dos limites da resolução experimental, e em linha com os resultados de GP obtidos com LUVs. Todas essas descobertas são consistentes com as interações recentemente descritas entre Bcl-XL [59] e tBid. Confirmamos que CL desempenha um papel essencial na associação entre caspase-8 e membranas biomiméticas ( Fig. 6 ), e muito provavelmente também membranas biológicas [25]. Sugerimos que CL é um componente da plataforma de reação formada posteriormente (que também contém caspase-8 e Bid), na qual atua como um co-fator para a ativação da caspase-8. À medida que a plataforma é formada, ela adquire imediatamente sua função enzimática, mas apenas se CL estiver presente ( Fig. 4 e Fig. 5 ) A produção de tBid na presença da caspase-8, ao interagir com esse CL, promove a quebra da vesícula, esse efeito é inibido se inibidores da caspase-8 forem adicionados ao sistema [41]. Esses resultados indicam que a presença da caspase-8 ligada ao CL é essencial para a formação do chamado & # x0201cmitossoma & # x0201d [25], [41]. Além das interações entre CL e caspase-8, também pode haver interações proteína-proteína na Vivo. Ainda não está claro se outras proteínas, como Rab5 [60], [61], que requer ativação da caspase-8, ou BAR [54] e FLASH, que medeiam a translocação da caspase-8 para a mitocôndria [62], [63], [ 64], desempenham um papel auxiliar na relação funcional entre caspase-8 e CL. Possivelmente, MTCH2 / MIMP [65] e seu papel no recrutamento de tBid pode atuar em sinergia com a formação de mitossoma induzida por CL para facilitar MOMP. O trabalho que relatamos aqui expande nosso conhecimento da sinalização pró-apoptótica induzida por Bid e fornece uma descrição do papel do CL no recrutamento e ativação da capsase-8 na superfície da membrana mitocondrial externa. No entanto, estamos longe de compreender todas as intrincadas e complexas alterações e interações moleculares que levam à ativação de Bid, permeabilização da membrana mitocondrial e apoptose pela via mitocondrial após estimulação dos receptores de morte.

(a) O diagrama mostra a sequência de eventos em células do tipo II de acordo com Gonzalvez et al. [25]. A plataforma CL (red heads) / caspase-8 nos locais de contato entre as membranas mitocondriais interna e externa (enriquecida em CL) se liga a BID, resultando na produção da parte C-termimal truncada ativa de BID (tcBID). Isso, por sua vez, causa perturbações induzidas por CL da curvatura da membrana, oligomerização BAK / BAX e citocromo c liberar. (b) Representação esquemática da plataforma funcional reconstituída em vesículas unilamelares gigantes contendo CL com o p18/ p10. DD, domínio de morte DED, domínio efetor de morte p10 e p18 formam o núcleo catalítico da caspase. A isoforma p43 / p10 caspase-8 compreende dois DEDs, um domínio p10 e um domínio p18. IMM, membrana mitocondrial interna IMS, espaço intermembrana OM, membrana mitocondrial externa. Pontos vermelhos no espaço intermembranar, citocromo c e a cabeça violeta corresponde à cardiolipina nos locais de contato entre as membranas externa e interna.

Os resultados que apresentamos demonstram e descrevem os papéis essenciais desempenhados pelos lipídios nos processos biológicos. Em particular, eles fornecem novos insights sobre como os lipídios específicos das mitocôndrias, como o CL, podem ter funções ativas que vão muito além de simplesmente constituir uma matriz para as atividades das proteínas. Na verdade, os lipídios funcionais parecem contribuir não apenas para modular as interações entre os membros da família Bcl-2, mas também como atores-chave nos processos de reconhecimento, conforme demonstrado pelo exemplo de cardiolipina que desencadeia a ativação da caspase-8 no processo apoptótico.


Assista o vídeo: Biologia Celular: Colesterol en la Membrana Celular (Dezembro 2021).