Em formação

Complementaridade do cDNA


A rigor, qual é a definição de cDNA? Isso me confunde, já que geralmente se diz que se refere a um DNA complementar ao mRNA. Isso está correto? É restrito ao mRNA maduro?

Também acho a direcionalidade muito confusa. Pelo que entendi, o mRNA tem uma sequência equivalente (menos íntrons, após o splicing) à chamada 'fita de codificação' do DNA. Isso significa que o cDNA feito a partir do mRNA, pelo menos antes de tratado com uma DNA polimerase, também é complementar ao DNA genômico original? Esta é a melhor definição (também vi isso ser usado, embora a primeira definição pareça muito mais comum).

Por último, pelo que entendi, cada cromossomo tem uma fita direta e outra reversa, definidas por convenção, mas que a fita "codificadora" de um determinado gene é aleatória. Isso parece contra-intuitivo ... é só porque os dois fios são equivalentes? Isso introduz complicações em termos de a célula "saber" qual fita é a fita codificadora de um gene?

A resposta mais votada a esta pergunta (http://www.biostars.org/p/3423/) me confundiu ainda mais. Eu me sinto da mesma forma que 'Onefishtwofish', nas respostas. Alguém pode esclarecer?


É uma boa pergunta e também me confundiu.

Uma definição padrão de cDNA é que ele é um produto de fita dupla (ds) de mRNA maduro. Suponho que seja possível copiar uma fita nascente de RNA em cDNA, mas nunca ouvi falar disso.

Como o cDNA é dsDNA, a fita original é feita do seu mRNA como a fita complementar, mas então você descarta o RNA e faz a segunda fita para obter uma molécula estável e reproduzível. A molécula de dsDNA total é o que chamamos de cDNA (não uma única fita deste material).

considere esta molécula de DNA simplificada:

ATG-INTRON-CTCTAG

TAC-INTRON-GAGATC

isso poderia ser transcrito no seguinte mRNA (correspondendo a Met-INTRON-Leu-Stop):

AUG-INTRON-CUCUAG

antes da exportação nuclear, o íntron é removido, tornando o mRNA maduro:

AUGCUCUAG

você faz cDNA a partir disso:

ATGCTCTAG

TACGAGATC

Portanto, você tem uma fita codificadora e uma fita complementar em seu cDNA.

Quanto à direcionalidade no cromossomo, os genes podem estar em qualquer direção (o que significa que eles podem usar qualquer fita como a fita codificadora), mas lembre-se de que as forças que contribuem para a transcrição são determinadas apenas localmente (montagem de fatores de transcrição, etc) e pagam não dê atenção à direção em que estão indo ou à cadeia em que estão em relação a qualquer outro gene. Os fios são rotulados como positivos e negativos, mas isso é apenas uma referência para orientação. Um bom lugar para navegar pelo genoma humano (ou de outras espécies) é o visualizador de mapa do NIH. Clique em um cromossomo para ver os genes mapeados para ele. Observe que a coluna rotulada 'O' é para orientação.


3.6: cDNA

  • Contribuição de Ross Hardison
  • T. Ming Chu Professor (Bioquímica e Biologia Molecular) na Universidade Estadual da Pensilvânia

Os clones de cDNA são cópias de mRNAs

A construção de clones de cDNA envolve a síntese de DNA complementar a partir de mRNA e, em seguida, a inserção de uma cópia duplex desse em um vetor de clonagem, seguido pela transformação de bactérias (Figura ( PageIndex <1> )).

Figura ( PageIndex <1> ): Fazendo clones de cDNA

uma. Síntese da primeira fita: Em primeiro lugar, um hibrida um oligo dT primer na cauda poliA 3 'de uma população de mRNAs. Então transcriptase reversa começará a síntese de DNA no primer, usando dNTPs fornecidos na reação, e copiará o mRNA em DNA complementar, abreviado cDNA. O mRNA é degradado pela atividade de RNase H associada à transcriptase reversa e pelo tratamento subsequente com álcali.

b. Síntese da segunda fita: Para que o primer faça a segunda fita de DNA (equivalente em sequência ao mRNA original), pode-se utilizar um grampo de cabelo transitório no final do cDNA. (A base para sua formação não é certa.) Em outros esquemas, gera-se um sítio de ligação do primer e usa-se um primer direcionado a esse sítio, uma forma de fazer isso é por cauda de homopolímero do cDNA seguido pelo uso de um primer complementar. Iniciadores aleatórios também podem ser usados ​​para a síntese da segunda fita, embora isso impeça a geração de um cDNA de comprimento total (isto é, uma cópia de todo o mRNA). No entanto, é raro gerar cópias duplex de todo o mRNA por qualquer meio.

A polimerase de DNA (por exemplo, polimerase de Klenow) é usada para sintetizar a segunda fita, complementar ao cDNA. O produto é cDNA duplex.

Se o grampo de cabelo foi usado para iniciar a síntese da segunda fita, ele deve ser aberto por uma única nuclease específica de fita & # 8209, como S1.

c. Inserção do cDNA duplex em um vetor de clonagem:

Um método é usar desoxinucleotidil transferase terminal para adicionar um homopolímero, como poli-dC, às extremidades do cDNA duplex e um homopolímero complementar, como poli-dG, ao vetor.

Uma abordagem alternativa é usar ligantes estes podem ser empregues de modo que um ligante transportando um local de clivagem para uma endonuclease de restrição esteja na extremidade 5 'do cDNA duplex e um ligante transportando um local de clivagem para uma endonuclease de restrição diferente esteja na extremidade 3'. (Neste contexto, 5 & rsquo e 3 & rsquo referem-se ao nontemplate, ou cadeia & quottop & quot.) Isso permite a clonagem & quot forçada & quot no vetor, e um tem informações iniciais sobre a orientação, com base na proximidade de um local de clivagem ou outro.

O cDNA e o vetor são unidos nas extremidades, usando DNA ligase, para formar plasmídeos de cDNA recombinante (ou fago).

d. Os plasmídeos de cDNA ligados são então transformado em E. coli. O conjunto resultante de transformantes é um biblioteca de clones de cDNA.


DNA recombinante e biotecnologia

DNA complementar

O DNA complementar (cDNA) é sintetizado em laboratório a partir do RNA mensageiro (Fig. 18-3). O cDNA não é DNA genômico, porque o transcrito do RNA genômico foi processado (isto é, falta promotores e íntrons). A enzima transcriptase reversa (ver Capítulo 15) é usada para sintetizar DNA de fita dupla que é uma cópia complementar do mRNA. A adição de sequências ligantes ao final deste DNA, que contém o local de restrição, seguido por tratamento com uma enzima de restrição, produz uma preparação de cDNA com extremidades coesivas prontas para inserção em um vetor. Uma preparação de cDNA representa os genes que estavam ativamente sendo expressos em uma célula, um órgão ou um organismo inteiro no momento da coleta e é chamada de biblioteca de cDNA.


Bibliotecas de DNA genômico

Tamanho de alguns genomas e cromossomos:

  • O genoma humano contém aproximadamente 50.000 genes únicos dentro de 3-4 bilhões de pares de bases de DNA, espalhados em 23 pares de cromossomos.

Fragmentação de DNA genômico para construção de biblioteca

Digestão com endonuclease de restrição

  • Um cortador de seis (por exemplo, Eco RI) cortará em média a cada 4,1 Kb. A digestão completa do DNA humano com este tipo de enzima resultará em aproximadamente 1 x 10 6 fragmentos únicos.
  • Qual é a probabilidade de encontrar um clone em uma determinada biblioteca?

A probabilidade exata de ter qualquer sequência de DNA dada na biblioteca pode ser calculada a partir da equação

N = ln (1 -P)/ ln (1 - f) P é a probabilidade desejada f é a proporção fracionária do genoma em um único recombinante N é o número necessário de recombinantes

Por exemplo, qual o tamanho de uma biblioteca (ou seja, quantos clones) você precisaria para ter uma probabilidade de 99% de encontrar uma sequência desejada representada em uma biblioteca criada por digestão com um cortador de 6?

N = ln (1 - 0,99) / ln (1 - (4096 / 3x10 9)) N = 3,37 x 10 6 clones

Assim, a partir deste tipo de análise, podemos ver que precisamos de uma tecnologia que nos permita alcançar o seguinte:

  1. Inserção estável de fragmentos de DNA relativamente grandes em nosso vetor de clonagem
  2. Alta eficiência de inserção e capacidade de lidar com um grande número de clones
  • Por exemplo, ao galvanizar E. coli colônias em uma placa de petri 3 ”, a densidade prática máxima para permitir o isolamento de colônias individuais é de cerca de 100-200 colônias por placa.
  • Se tivéssemos que tentar placas nossa biblioteca de 3,37 x 10 6 de tal forma, seriam necessárias cerca de 22.500 placas.
  • Não só isso, mas esses fragmentos grandes de DNA não são bem tolerados em E. coli vetores de clonagem, tais como pBR322.

Os vetores do bacteriófago lambda são comumente usados ​​para a construção de bibliotecas genômicas

Bacteriófago l é um E. coli fago com um tipo de partícula fágica icosaédrica que contém o genoma viral:

Figura 3.6.6: Bacteriofase eu

  • Durante a replicação, o DNA do fago é produzido em uma forma concatamérica, que é clivada por endonucleases apropriadas para permitir o empacotamento de um único genoma dentro do capsídeo do fago.
  • Verificou-se que as regiões internas do genoma do fago, que não eram essenciais para a replicação do fago, podiam ser removidas e substituídas por DNA de interesse.
  • Este DNA híbrido pode ser eficientemente empacotado e formar um fago infectivo.

Figura 3.6.7:Criação de fago ineficaz

As vantagens deste tipo de sistema versus plasmídeos como pBR322 são:

  1. O genoma do fago é capaz de empacotar de forma eficiente com inserções de DNA tão grandes quanto 20 Kb.
  2. Além disso, os fagos empacotados são altamente infecciosos e infectam E. coli com uma eficiência muito maior do que os métodos de transformação de plasmídeo.

A digestão incompleta do DNA genômico permitirá a identificação de sobreposições de sequência

A digestão completa com uma endonuclease resultará em uma biblioteca contendo sem fragmentos sobrepostos:

Contudo, digestão incompleta resultará em uma biblioteca contendo fragmentos sobrepostos:

  • Assim, as informações de sequência obtidas a partir de um clone irá permitir o isolamento de clones contendo informações de sequência vizinha (sobreposta).
  • Isto pode permitir que grandes extensões contíguas de informação de sequência sejam obtidas ("Chromosome Walking").

Bibliotecas de sondagem

Uma vez que uma biblioteca (cDNA ou genômica) tenha sido construída, queremos ser capazes de identificar clones que contenham DNA de interesse.

  • Por exemplo, a partir das informações da sequência de proteínas, podemos deduzir possíveis extensões da sequência de DNA correspondente (no entanto, haverá ambigüidade devido à degenerescência dos códons).
  • Se pudermos sintetizar um oligonucleotídeo complementar à nossa sequência de DNA de interesse, podemos usá-lo para hibridizar especificamente para o clone apropriado em nosso bibliotecário (ou seja, para sonda nossa biblioteca).

Em metodologias padrão, o oligonucleotídeo é fosforilado na extremidade 5 'com radiomarcado g 32 P-ATP e T4 polinucleotídeo quinase.

  • A sonda é então incubada com placas fágicas individuais que foram fixadas em nitrocelulose e o seu DNA desnaturado por tratamento com base.
  • Se a placa contém DNA complementar à sequência da sonda, a sonda hibridizará.
  • Se a nitrocelulose (contendo muitas placas individuais) for exposta ao filme de raios-x, apenas as placas com a sonda hibridizada irão aparecer (como uma mancha escura):

Figura 3.6.8:Placa radiomarcada

Observe que é importante acompanhar a orientação da nitrocelulose em relação ao filme de raios-X (geralmente tinta radioativa é usada para identificar a orientação da nitrocelulose).

Falso-positivo

Se estivermos projetando sondas de DNA a partir de informações da sequência de proteínas, teremos possível ambigüidade em nossa sequência de DNA deduzida usada para o projeto da sonda.

  • Normalmente, os oligonucleotídeos 14-24mer são usados ​​como sondas, uma sonda 14-24mer significa que precisamos de um trecho de 5-8 aminoácidos no polipeptídeo.
  • Dada a escolha, as melhores sequências de aminoácidos para procurar em um polipeptídeo são aquelas com degenerescência de códon baixa (Veja acima).
  • Assim, procuraríamos um pequeno trecho da sequência polipeptídica contendo esperançosamente Met ou Trp , e com os aminoácidos restantes compreendendo Phe, Tyr, His, Gln, Asn, Lys, Asp, Glu ou Cys .
  • Regiões incluindo Leu, Arg ou Ser devem ser evitado (6 códons cada).

Durante a síntese de oligonucleotídeos, múltiplas bases serão incorporadas em posições ambíguas.

  • Assim, nossa sonda será realmente um mistura de oligonucleotídeos.
  • Quanto mais elevada for a degenerescência, maior será a possibilidade de "falsos positivos", i.e. clones que hibridizam mas não estão relacionados com a sequência real que queremos.
  • Os clones positivos são sequenciados e a sequência de aminoácidos deduzida é comparada com a informação da nossa sequência polipeptídica para identificar os clones corretos.

Anticorpos (imunoglobulinas)

Se o vetor específico, ou fago, usado para construir uma biblioteca de cDNA contém um promotor região a montante do local de inserção, podemos ser capazes de rastrear os clones desejados, procurando por expressão da proteína de interesse .

  • Neste caso, precisamos de um ensaio que seja ao mesmo tempo confidencial (não estaremos produzindo muitas proteínas) e específico (queremos minimizar quaisquer falsos positivos).
  • Um dos melhores ensaios, que é sensível e específico, faz uso de anticorpos.

Antígeno, anticorpo, epítopo

Um dos mecanismos de defesa dos vertebrados é a capacidade de distinguir entre auto e não-eu moléculas.

  • Assim, se uma molécula estranha (de outra espécie ou às vezes de outro indivíduo dentro de uma espécie) invade um organismo vertebrado, o sistema imunológico funciona para aprender a identificar essa molécula.
  • Em futuras invasões pela mesma molécula, o organismo monta uma defesa contra ela, produzindo anticorpos que reconhecem e se ligam ao estrangeiro antígeno.
  • Quando os anticorpos se ligam ao antígeno, certos glóbulos brancos (macrófagos e monócitos) reconhecem o corpo invasor como estranho e respondem destruindo-o.

Os anticorpos são moléculas em forma de 'Y' que contêm duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas.

  • O radical do 'Y' compreende o Domínio Fc (constante) , e os 'braços' do 'Y' compreendem o Domínios Fab (variáveis) .
  • Antígenos se ligam ao regiões determinantes de complementaridade (CDR's) localizado nas extremidades dos domínios Fab.

Figura 3.6.9:Estrutura de anticorpos

Os anticorpos são sintetizados por linfócitos B. Cada linfócito B é capaz de produzir um único tipo de anticorpo dirigido contra um determinante estrutural específico, ou epítopo, em um antígeno.

  • Assim, uma resposta imune a um antígeno de proteína pode resultar em uma população de linfócitos B, cada um produzindo anticorpos que reconhecem um determinante estrutural diferente da proteína estranha.
  • Um epítopo pode ser um região contígua de 5 ou 6 aminoácidos no polipeptídeo estranho, ou o epítopo pode compreender meia dúzia ou mais de aminoácidos colocados em justaposição na proteína nativa, ainda amplamente espaçados na sequência polipeptídica.
  • Assim, alguns anticorpos reconhecerão nativos e formas desnaturadas de uma proteína estranha igualmente bem, enquanto outros anticorpos podem reconhecer apenas uma ou outra.

Se a proteína de interesse foi purificada, ela pode ser usada para induzir uma resposta imune em um animal hospedeiro .

  • Animais hospedeiros típicos incluem camundongo, galinha, coelho, cabra, ovelha, cavalo e, ocasionalmente, humano.
  • Após uma imunização inicial, seguida por uma ou mais injeções de reforço, os linfócitos B do animal hospedeiro podem produzir anticorpos direcionados contra o antígeno.
  • Os anticorpos podem ser purificados a partir de amostras de sangue retiradas do animal. Tais preparações de anticorpos são consideradas policlonal.
  • Isso se refere ao fato de que os anticorpos presentes são de uma coleção de diferentes linfócitos B e, portanto, reconhecerão um variedade de epítopos diferentes na proteína do antígeno.
  • A capacidade de isolar anticorpos de amostras de sangue significa que o animal hospedeiro não precisa ser destruído.
  • Obviamente, o tamanho do animal determina a quantidade de anticorpos que se pode obter. Por exemplo, um coelho pode fornecer 5 ml de sangue a cada duas semanas, um rato fornece significativamente menos, enquanto um cavalo pode fornecer um pouco mais.

Um anticorpo isolado de um população única de células de linfócitos B é denominado monoclonal.

  • Reconhece um epítopo único na proteína antigênica.
  • Os linfócitos B produtores de anticorpos podem ser isolados do baço ou dos nódulos linfáticos. No entanto, eles têm um vida finitaperíodoem cultura, isto é, sofrerão um certo número de divisões celulares e depois morrerão.
  • Essas células podem, no entanto, ser fundidas com linfócitos imortais (mieloma canceroso) para produzir um hibridoma célula.
  • Essa célula é imortal como o mieloma, e produz um anticorpo específico do linfócito B. A capacidade de crescer indefinidamente em cultura permite o isolamento de quantidades úteis de anticorpos monoclonais.

Às vezes, a imunização com a proteína de interesse é problemática: quantidades apropriadas de material purificado não podem ser produzidas ou a própria proteína é tóxica no nível de dosagem necessário para produzir uma resposta imune.

  • Se a informação da sequência parcial for conhecida, então grandes quantidades de polipeptídeos representando pequenos fragmentos da proteína, podem ser sintetizados e usados ​​para imunizar o animal.
  • Freqüentemente, esses polipeptídeos são covalentemente ligados a uma proteína transportadora (tipicamente albumina sérica) para aumentar a resposta antigênica.
  • Os anticorpos produzidos contra tais peptídeos reconhecerão apenas epítopos dentro do polipeptídeo. Assim, mesmo os anticorpos policlonais seriam bastante limitados no seu reconhecimento de epítopo.

Tal como acontece com os oligonucleotídeos radiomarcados, os anticorpos podem ser usados ​​para identificar os clones da biblioteca que contêm um cDNA de interesse. Este método seria, obviamente, baseado em um vetor hospedeiro ou fago que contém um promotor a montante do local de inserção do DNA genômico.


DNA complementar (cDNA)

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Em seguida, devemos converter o RNA em DNA. Usamos uma enzima chamada & # 8220transcriptase reversa & # 8221 para criar uma sequência de DNA complementar (cDNA) a partir do fragmento de RNA. Isso cria moléculas híbridas que são uma combinação de RNA e cDNA.

cDNA. O mRNA é isolado de um organismo de interesse. A porção de fita simples & # 8211 da alça é cortada com uma nuclease S1, e o resultado é uma cópia de cDNA de fita dupla do mRNA. Observe que esse cDNA incluirá apenas as porções de exon do gene, e não os íntrons, que foram separados do molde de mRNA.


Compre a maior seleção de cDNA de tecido do mercado

As amostras de cDNA da BioChain são sintetizadas usando isolamento total de RNA nas instalações com técnicas modificadas para garantir a consistência. O cDNA é submetido a inspeção visual, detectando bandas intactas de DNA ribossômico, e testado quanto à pureza com um espectrofotômetro. A primeira fita é sintetizada usando a transcriptase reversa MMLV com baixa atividade de RNase H, com um iniciador oligo dT para garantir a presença de todo o cDNA.

As fontes se originam de uma variedade de tecidos animais, vegetais e humanos / fetais (incluindo órgãos saudáveis ​​e doentes). A documentação sobre a história clínica dos tecidos está disponível. O cDNA pode ser usado para PCR, descoberta de genes, análise ou mRNA e clonagem, entre outros.


Etapa 1. Prepare a amostra

O RNA serve como molde na síntese de cDNA. O RNA total é rotineiramente usado na síntese de cDNA para aplicações downstream, como RT- (q) PCR, enquanto tipos específicos de RNAs (por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) e pequenos RNAs como miRNA) podem ser enriquecidos para certas aplicações como construção de biblioteca de cDNA e perfilamento de miRNA.

Manter a integridade do RNA é fundamental e requer precauções especiais durante a extração, processamento, armazenamento e uso experimental. As melhores práticas para prevenir a degradação do RNA incluem o uso de luvas, pipetagem com pontas de barreira de aerossol, uso de material de laboratório e reagentes sem nuclease e descontaminação das áreas de trabalho.

Para isolar e purificar o RNA, uma variedade de estratégias estão disponíveis, dependendo do tipo de materiais de origem (por exemplo, sangue, tecidos, células, plantas) e objetivos dos experimentos. Os principais objetivos dos fluxos de trabalho de isolamento são estabilizar as moléculas de RNA, inibir RNases e maximizar o rendimento com métodos adequados de armazenamento e extração. Métodos de purificação ideais removem compostos endógenos, como polissacarídeos complexos e ácido húmico de tecidos vegetais que interferem com a atividade enzimática e inibidores comuns de transcriptases reversas, como sais, íons metálicos, etanol e fenol. Uma vez purificado, o RNA deve ser armazenado a –80 ° C com ciclos mínimos de congelamento-descongelamento.

Destaques do produto

Dicas de soluções de problemas

  1. Minimize o número de ciclos de congelamento-descongelamento de amostras de RNA para evitar a degradação.
  2. Armazene o RNA em uma solução tamponada com EDTA para minimizar a clivagem inespecífica por nucleases que possuem cofatores de íons metálicos.
  3. Use água certificada como livre de nuclease ou tratada com DEPC (dietilpirocarbonato) para garantir a ausência de RNase.
  4. Avalie a integridade do RNA por eletroforese em gel ou microfluídica.

Prevalência

As transcriptases reversas foram identificadas em muitos organismos, incluindo vírus, bactérias, animais e plantas. Nesses organismos, o papel geral da transcriptase reversa é converter sequências de RNA em sequências de cDNA que são capazes de se inserir em diferentes áreas do genoma. Desta forma, a transcrição reversa contribui para (Figura 2):

  • Propagação de retrovírus - por exemplo, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da leucemia murina Moloney (M-MuLV) e vírus da mieloblastose aviária (AMV) [1,2]
  • Diversidade genética em eucariotos via elementos móveis transponíveis chamados retrotransposons [4]
  • Replicação de extremidades cromossômicas chamadas telômeros [5,6]
  • Síntese de elementos quiméricos extracromossômicos de DNA / RNA chamados de DNA de fita simples multicópia (msDNA) em bactérias [7,8]

Figura 2. Funções da transcriptase reversa em sistemas biológicos. (UMA) O RNA viral é transcrito reversamente para integração no genoma do hospedeiro. (B) Na retrotransposição, um intermediário de RNA é transcrito reversamente para inserir cópias de DNA em outras áreas do genoma. (C) A transcriptase reversa da telomerase (TERT) usa o RNA como um modelo para alongar e manter as extremidades dos cromossomos eucarióticos. (D) A transcrição reversa é uma etapa intermediária na formação de DNA de fita simples multicópia (msDNA) em bactérias.


Complementaridade do cDNA - Biologia

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Quase todas as células do corpo têm o mesmo DNA, mas diferentes tipos de células, como neurônios e células musculares, expressam genes diferentes porque apenas alguns genes são transcritos em RNA mensageiro, ou mRNA, em cada célula. No laboratório, os mRNAs podem ser usados ​​como um modelo para sintetizar DNA complementar, cDNA, para estudar a expressão gênica. Um método comum é extrair o RNA das células e, em seguida, isolar o mRNA de outros tipos de RNA, como RNA ribossômico ou RNA de transferência, executando a amostra em uma coluna de contas com trechos de nucleotídeos de timina anexados.

Estes se ligam à cauda poli-A, uma cadeia de nucleotídeos de adenina especificamente presente nas extremidades 3 do mRNA eucariótico. Os outros tipos de RNA não se ligam e são lavados.

Após o mRNA ser isolado, um primer poli-T é ligado à cauda poli-A, fornecendo um ponto de partida para as enzimas de transcriptase reversa transcreverem um cDNA de fita simples a partir do mRNA. Produtos químicos, como enzimas RNase, são então adicionados para degradar o RNA.

As enzimas da polimerase de DNA são então usadas para sintetizar uma fita complementar ao cDNA, resultando em cDNA de fita dupla, que pode ser inserida em um vetor bacteriano ou viral e usada em pesquisas de biologia molecular.

15.13: DNA complementar

Visão geral

Apenas os genes que são transcritos em RNA mensageiro (mRNA) são ativos ou expressos. Os cientistas podem, portanto, extrair o mRNA das células para estudar a expressão gênica em diferentes células e tecidos. O cientista converte o mRNA em DNA complementar (cDNA) por meio da transcrição reversa. Como o mRNA não contém íntrons (regiões não codificantes) e outras sequências regulatórias, cDNA e DNA genômico mdashunlike também permite que os pesquisadores determinem diretamente a sequência de aminoácidos do peptídeo codificado pelo gene.

Síntese de cDNA

O cDNA pode ser gerado por vários métodos, mas uma maneira comum é primeiro extrair o RNA total das células e, em seguida, isolar o mRNA dos tipos mais predominantes e RNA de transferência de mdash (tRNA) e ribossomal (rRNA). O mRNA de eucariotos maduros tem uma cauda poli (A) e uma cadeia de nucleotídeos de adenina ramificada em sua extremidade 3 e rsquo, enquanto outros tipos de RNA não. Portanto, uma cadeia de nucleotídeos de timina (oligo-dTs) pode ser ligada a um substrato, como uma coluna ou esferas magnéticas, para parear especificamente com as caudas poli (A) do mRNA. Enquanto o mRNA com uma cauda poli (A) é capturado, os outros tipos de RNA são lavados.

Em seguida, a transcriptase reversa e a enzima mdasha DNA polimerase de retrovírus e mdashis são usadas para gerar cDNA a partir do mRNA. Uma vez que, como a maioria das polimerases de DNA, a transcriptase reversa pode adicionar nucleotídeos apenas à extremidade 3 & rsquo de uma cadeia, um primer poli (T) é adicionado para se ligar à cauda poli (A) para fornecer um ponto de partida para a síntese de cDNA. A fita de cDNA termina em uma alça em gancho. O RNA é então degradado & mdash comumente com tratamento alcalino ou enzimas RNase & mdashleaving o cDNA de fita simples intacto.

Uma segunda fita de DNA complementar ao cDNA é então sintetizada pela DNA polimerase e mdashoften usando a alça em gancho da primeira fita de cDNA ou um pedaço cortado do mRNA como um iniciador.

O cDNA de cadeia dupla resultante pode ser inserido em vetores bacterianos ou virais e clonado usando técnicas de biologia molecular padrão. Uma biblioteca de cDNA & mdashrepresentando todos os mRNAs nas células ou tecido de interesse & mdashpode também ser construída para pesquisas adicionais.

Ore, Leslie A. & ldquoA revolução da biotecnologia: PCR e o uso da transcriptase reversa para clonar genes expressos. & Rdquo Educação da Natureza 1, não. 1 (2008): 94. [Fonte]


Assista o vídeo: cDNA methods (Janeiro 2022).