Em formação

Dependência do pH do ensaio de precipitação de sulfato de amônio


Em geral, o pH afeta a precipitação, e. um pH de 6 causaria menos precipitação do que um pH de 7,5. Ou eles não estão relacionados?


Eu acho que afetaria algumas proteínas, mas a precipitação de sulfato de amônio geralmente requer grandes quantidades de sal, que você teria que adicionar um muito de base para ajustar o pH.

Quando eu tiver feito a precipitação de sulfato de amônio, é para tirar um corte bruto de proteínas de uma célula inteira / lisado de órgão inteiro - é mais como um martelo do que um par de pinças no que diz respeito à purificação de proteínas. Eu preferiria usar uma resina plástica carregada ou uma coluna de dimensionamento se quisesse me preocupar com a purificação isoelétrica.


Precipitação de sulfato de amônio de adenovírus recombinante a partir do meio de cultura: um método fácil para aumentar o rendimento total do vírus

Na maioria dos métodos de purificação e concentração de adenovírus recombinantes (rAds), o vírus que está associado às células auxiliares é colhido, enquanto o vírus que está presente no meio de cultura celular é descartado. Durante a propagação de rotina de vetores de adenovírus tipo 5 em condições otimizadas, notamos que, em média, 47% da quantidade total de vírus está presente no meio de cultura. Para recuperar e concentrar esses rAds do meio, criamos um método, que é baseado em sulfato de amônio ((NH4)2TÃO4) precipitação. A 40% (NH4)2TÃO4 saturação, 95 ± 6% do vírus disponível precipita do meio, enquanto a maioria da proteína (85%) permanece em solução. Em contraste com a precipitação de adenovírus com polietilenoglicol, o (NH4)2TÃO4a técnica de precipitação permite a coleta de rAds precipitados por filtração. Demonstramos aqui que (NH4)2TÃO4 precipitação de rAds de meio de cultura de células é uma técnica simples e rápida que pode ser usada em combinação com métodos de isolamento de vírus padrão para aumentar os rendimentos de rAds.

Há cerca de 30 anos, Winters e Russell1 descreveram um método de purificação de adenovírus que ainda é muito utilizado. Ele emprega a ultracentrifugação com gradiente de densidade de cloreto de césio (CsCl) das partículas de adenovírus associadas às células. Embora lotes de adenovírus puros com alto título possam ser obtidos, o método é demorado e difícil de aumentar. Com o advento da terapia gênica, os procedimentos para a produção em grande escala e purificação de adenovírus recombinantes tornaram-se necessários.2 As modificações do protocolo original que levaram à redução do tempo total de preparação fazem uso de gradientes de etapas de CsCl em vez de densidade flutuante de CsCl gradientes3 ou gradientes de CsCl corrigidos para gradientes de sacarose.45 Em estudos posteriores, cromatografia em coluna com base na exclusão de tamanho, troca aniônica, interação hidrofóbica ou resinas quelantes de metal foram empregadas.67 Em vista das restrições de volume de ultracentrifugação, protocolos de purificação focados em o adenovírus associado às células hospedeiras. No entanto, uma quantidade significativa de vírus não está associada às células, mas é encontrada no meio de cultura. As análises em nossa Instalação de Vetores Virais no LUMC revelaram que quantidades significativas (25–80%) de vetores de adenovírus estão presentes no meio de cultura de células (Tabela 1), mesmo em condições ideais de produção. Embora a quantidade de vírus no meio varie, em média 47% (n = 19) do vírus é descartado se apenas a fração associada à célula for isolada. Isso sugere que, na verdade, uma parte lucrativa do rendimento geral costuma ser desperdiçada.

Para concentrar o vírus do meio, ele pode ser precipitado com polietilenoglicol 6000 (PEG-6000) .89 Nesse caso, entretanto, o precipitado do vírus precisa ser coletado por centrifugação. Portanto, buscamos um método que permitisse a recuperação do vírus do meio por filtração, para contornar a centrifugação de volumes relativamente grandes de meio. Neste relatório, avaliamos o uso de sulfato de amônio ((NH4)2TÃO4) precipitação.1011 Na primeira tentativa, um intervalo de 0-100% (NH4)2TÃO4 a saturação, com etapas de incremento de 10%, foi testada para precipitar Ad5CMVLuc, um adenovírus recombinante portador do gene da luciferase, a partir do meio de cultura. Em concentrações de até 30% de saturação o vírus permaneceu no meio, mas em 40% de saturação ou mais o vírus precipitou virtualmente completamente (dados não mostrados). Para otimizar as condições, foram testados valores de saturação em torno do ponto de 40%. O meio de cultura foi saturado em uma faixa de saturação de 30-42% com incrementos de 2%. A presença de Ad5CMVLuc intacto nas várias frações foi avaliada através do nível de expressão do gene repórter da luciferase (Figura 1). A precipitação do adenovírus começou em 36% (NH4)2TÃO4 saturação e estava completa em 40% de saturação, com uma atividade relativa de luciferase de 130%. Ao longo deste intervalo de saturação, a atividade da luciferase obtida do vírus residual no meio caiu para 11%. Notavelmente, a recuperação aparente é maior do que o máximo esperado e pode ser explicada pela purificação do estoque de vírus. Observações semelhantes foram relatadas durante o isolamento de adenovírus de lisados ​​celulares, 3 e o isolamento de retrovírus do meio.12 Nesses estudos, o aumento da atividade foi atribuído à remoção de inibidores da infecção viral. No entanto, os lotes de adenovírus que precipitaram a 40% (NH4)2TÃO4 a saturação teve uma razão OD260 / 280 de 0,6 (dados não mostrados). Em comparação com a proporção de 1,2-1,3 para lotes de adenovírus puro, 7 isso indica a presença de quantidades significativas de proteína.

Atividade de luciferase como indicador para a quantidade de Ad5CMVLuc precipitado do meio de cultura a 30-42% (NH4)2TÃO4 saturação. Uma série de 4,4-6,4 g (NH4)2TÃO4 (adquirido de JT Baker, Deventer, Holanda) foi adicionado a 25 ml de meio de cultura para atingir uma saturação de 30-42 %.11 A solução foi incubada por 4 h em temperatura ambiente e, subsequentemente, o precipitado foi sedimentado por centrifugação por 15 min a 1614 g. O sedimento foi dissolvido em 1 ml de PBS contendo 2% de soro de cavalo. A diálise durante a noite do sobrenadante e das amostras de precipitado dissolvido foi realizada em 1 × tampão TD (25 m M Tris, 137 m M NaCl, 5 m M KCl, 0,73 m M Na2HPO4, CaCl 0,9 m M2, MgCl 0,5 m M2 pH 7,45). Essas amostras foram usadas para infectar células HepG2, que foram lisadas 48 h após a infecção e analisadas quanto à atividade da luciferase, conforme descrito anteriormente.9 A atividade da luciferase foi convertida na amostra total e representada como porcentagem da atividade da luciferase encontrada em 25 ml de Ad5CMVLuc contendo cultura médium. As barras pretas representam a fração Ad5CMVLuc encontrada no precipitado, as barras cinzas a fração no sobrenadante.

Para obter mais informações sobre a capacidade de purificação deste método, determinamos as quantidades de proteína, que foram precipitadas do meio de cultura contendo 10% de FCS ao longo de uma faixa de saturação de 0 a 80% (NH4)2TÃO4. Conforme representado na Figura 2, a 40% de saturação, 15% da proteína disponível foi precipitada. Resultados essencialmente idênticos foram obtidos com meio de células infectadas por vírus. Assim, nessas condições, a maioria das proteínas presentes no meio é separada do vírus.

As frações de proteína precipitaram do meio de cultura em vários (NH4)2TÃO4 concentrações. Amostras de 25 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal de vitela (FCS) foram saturadas para as percentagens indicadas: 10%: 1,4 g, 20%: 2,9 g, 30%: 4,4 g, 38%: 5,7 g , 40%: 6,1 g, 42%: 6,4 g, 50%: 7,8 g, 60%: 9,8 g, 70%: 11,8 g, 80%: 14 g (NH4)2TÃO4.11 Após 2,5 h de incubação à temperatura ambiente, o precipitado foi sedimentado por centrifugação (15 min a 1614 g). O sedimento foi dissolvido em PBS e, subsequentemente, a quantidade isolada de proteína foi determinada através do ensaio de proteína de Bradford. A quantidade total de proteína presente em uma amostra de 25 ml é considerada 100%.

No caso de produções em grande escala, envolvendo vários litros de meio contendo vírus, a etapa de centrifugação constitui uma limitação nas configurações normais de laboratório. A filtração pode ser uma alternativa prática para o isolamento do precipitado de rAd de grandes volumes médios. Portanto, comparamos a recuperação de (NH4)2TÃO4- e adenovírus precipitado com PEG-6000 após isolamento por centrifugação ou filtração. Ad5CMVLacZ foi precipitado com 40% (NH4)2TÃO4 saturação ou PEG-6000 a 10% e o precipitado resultante foi eliminado do meio por centrifugação, por filtração em um filtro de membrana de 0,45 μm ou por filtração em um papel de filtro Whatman 3MM. Conforme representado na Figura 3a, o vírus disponível pode ser precipitado virtualmente completamente com (NH4)2TÃO4. Obteve-se uma recuperação de 90% quando o precipitado foi sedimentado por centrifugação. A recuperação do precipitado PEG-6000 por centrifugação foi apenas ligeiramente menor (84% de recuperação). No entanto, a filtração revelou uma diferença mais pronunciada entre os dois métodos de precipitação. O precipitado PEG-6000 passou pelos filtros quase desimpedido: o resíduo representou apenas 3-4% do rendimento inicial. No entanto, o (NH4)2TÃO4 o precipitado foi retido no filtro com alta eficiência. Embora o rendimento do resíduo tenha sido inferior ao obtido após a centrifugação, a recuperação ainda foi de 46% e 61% do material de partida, no caso do filtro 3MM e do filtro de 0,45 μm, respectivamente. A menor recuperação do meio por filtração em comparação com a centrifugação não é compensada por um aumento de vírus residual no filtrado. Isso sugere que a perda não pode ser atribuída a um corte insuficiente do filtro, mas sim a uma recuperação subótima de vírus do filtro.

Recuperação e rendimento de rAd precipitado do meio de cultura. (a) Eficiência de recuperação de Ad5CMVLacZ precipitado do meio de cultura por (NH4)2TÃO4 ou PEG-6000 e isolado por centrifugação ou filtração. 6,1 g (NH4)2TÃO4 foi dissolvido em 25 ml de meio de cultura. Após uma incubação de 2,5 h à temperatura ambiente, o precipitado foi sedimentado da mistura por uma etapa de centrifugação de 15 min a 1614 g ou por filtração a vácuo usando um filtro de membrana de 0,45 μm (Schleicher & amp Schuell, Dassel, Alemanha), ou um Filtro de papel 3MM (Whatman International Ltd, Maidstone, UK). A precipitação do PEG foi realizada conforme descrito anteriormente9 com pequenas modificações. Resumidamente, 25 ml de PEG-6000 a 20% (p / v) (BDH, Poole, UK) em solução de NaCl 2,5 M foram misturados com 25 ml de meio de cultura. Após uma incubação de 3 h a 4 ° C, o precipitado foi sedimentado por uma etapa de centrifugação de 15 min a 16300 g ou por filtração a vácuo usando um filtro de membrana de 0,45 μm ou um filtro de 3MM. As amostras de resíduo ou pelota foram dissolvidas em 2 ml de PBS contendo 2% de HS. Todas as amostras foram dialisadas e, subsequentemente, os seus títulos foram determinados por ensaio de placa em células 911. Para o cálculo da recuperação, os rendimentos foram relacionados à quantidade de adenovírus presente em 25 ml do meio original. As barras pretas representam a fração viral no resíduo ou as barras cinza do sedimento representam a fração viral que reside no filtrado ou sobrenadante. (b) Comparação dos rendimentos de vírus, expressos em partículas virais (vp), isoladas da fração associada à célula ou precipitadas do meio de cultura. Várias amostras mencionadas na Figura 3a foram analisadas por HPLC, basicamente conforme descrito por Shabram et al.6. A HPLC foi realizada com um módulo de separação Alliance 2690 equipado com um detector de matriz de fotodiodo (PDA 996) (Waters, Milford, MA, EUA). Os picos de vírus de todas as amostras tiveram razões de OD260 / 280 entre 1,15 e 1,34. A quantificação foi feita por integração da área do pico do vírus a 260 nm com a ajuda do Millennium 32 Software (Waters). O rendimento obtido a partir de 25 ml de meio de cultura foi extrapolado para todo o volume de produção e, como tal, comparado com o rendimento da fração associada a células.

A análise de HPLC foi usada para determinar as concentrações de partículas das amostras acima mencionadas e os rendimentos foram comparados com o rendimento total de partículas de vírus (vp) do lisado celular (Figura 3b). O rendimento do lisado celular foi aproximadamente o mesmo que o rendimento obtido do meio após a filtração com filtro de 0,45 μm, 52% contra 48%. Deve-se notar, entretanto, que apenas 61% do vírus foi recuperado do meio. O rendimento após a centrifugação foi até duas vezes o rendimento obtido a partir do lisado celular: para (NH4)2TÃO4 e precipitação PEG-6000, respectivamente, 67% contra 33% e 68% contra 32%. Nos isolamentos estudados o vp a p.f.u. a proporção foi de 6–17 para 1.

Dependendo do tipo de rAd e das condições exatas de produção, a quantidade de vírus que está presente no meio de cultura pode variar consideravelmente. Mesmo que as condições de produção sejam otimizadas, pequenas diferenças, por exemplo, no status celular ou no inóculo, podem causar variações que podem levar à perda de uma parte lucrativa da produção do vírus, se o meio for descartado (Tabela 1). No caso de produções rAd em grande escala (NH4)2TÃO4 precipitação seguida de filtração em um filtro de membrana de 0,45 μm parece um método rápido e fácil para recuperar o vírus do meio, especialmente se o método puder ser combinado com protocolos de purificação padrão. Portanto, propomos um protocolo de colheita de rAd (Figura 4) em que o vírus é isolado das células, bem como do meio de cultura. Primeiro, a colheita é dividida em duas frações: um meio e uma fração de células. Durante o período de incubação do meio de cultura com (NH4)2TÃO4, as células podem ser rompidas e gradientes de etapa de CsCl preparados. Pelo menos 2 h após o início da incubação, o precipitado pode ser isolado por filtração e pode ser carregado em um gradiente de CsCl, em paralelo ao lisado celular. A seguir, o segundo gradiente de CsCl e a diálise terminarão a purificação. Para ilustrar a viabilidade do procedimento proposto, Ad5CMVLacZ foi cultivado em células PER.C6 e purificado de acordo com o protocolo sugerido. Os rendimentos obtidos em vários pontos ao longo da purificação são mostrados na Tabela 2. Como pode ser deduzido desses dados, a fração média (A) abrange 30% do rendimento bruto do vírus (o total das frações A e C). Após a precipitação, 67% puderam ser recuperados do meio com uma redução de volume de 33 vezes (B). Para avaliar a carga direta indicada do precipitado no gradiente de CsCl, a purificação de 50% do precipitado recuperado (B) foi comparada com 50% do lisado celular bruto (C). A recuperação do vírus foi para o meio (D) pelo menos duas vezes maior (68%) do que para o lisado celular (E) (30%). Consequentemente, a contribuição da fração média para o rendimento geral subiu para 40%. O rendimento cumulativo das frações purificadas separadamente (D e E) é semelhante aos rendimentos da purificação combinada de meio e lisado celular (F). Uma vez que a purificação combinada é tão eficaz quanto a purificação das frações separadas, é mais conveniente combinar o lisado celular e o precipitado. No geral, esses dados ilustram bem a aplicabilidade do protocolo representado na Figura 4. O precipitado dissolvido também pode ser purificado por meio de cromatografia em coluna AE sem etapas intermediárias de purificação. Isto foi demonstrado por análise de HPLC de precipitados dialisados ​​e não dialisados, que revelou picos de vírus claros sem qualquer perturbação como consequência da presença de (NH4)2TÃO4 (dados não mostrados).

Protocolo de isolamento de adenovírus recombinante das células auxiliares e seu meio de cultura no caso de produções em média a grande escala. A purificação da fração do vírus associado à célula é conforme descrito anteriormente.14 As várias frações são indicadas pelos caracteres A – F e correspondem às amostras mencionadas na Tabela 2. RT, temperatura ambiente.


Purificação e caracterização da enzima tirosinase melanogênica do cogumelo-botão

A melanogênese é uma via biossintética para a formação do pigmento melanina na pele humana. Uma enzima chave, a tirosinase, catalisa as primeiras e únicas etapas limitantes da taxa na melanogênese. Desde a descoberta de suas propriedades melanogênicas, a tirosinase tem estado em foco e fontes microbianas da enzima são procuradas. Agaricus bisporus amplamente conhecido como o cogumelo comestível comum, ocorre em grandes quantidades de proteínas, enzimas, carboidratos, fibras e baixo teor de gordura são frequentemente citados na literatura em relação ao seu valor nutricional. No presente estudo, a tirosinase de Agaricus bisporus foi purificado por precipitação com sulfato de amônio, diálise seguida por cromatografia de filtração em gel em Sephadex G-100 e cromatografia de troca iônica em DEAE-Celulose, a enzima foi purificada, 16,36 vezes para dar 26,6% de rendimento na atividade total no extrato bruto e específico final atividade de 52,19 U / mg. A eletroforese SDS-PAGE mostrou um peso molecular de banda de proteína migratória de 95 kDa. A tirosinase purificada foi otimizada e os resultados revelaram que os valores ótimos são pH 7,0 e temperatura 35 ° C. A atividade mais elevada foi relatada em relação ao seu substrato natural, L-DOPA, com um valor de Km aparente de 0,933 mM. Isso indicou que a tirosinase purificada de Agaricus bisporus é uma fonte potencial para aplicações médicas.

1. Introdução

A tirosinase (E.C. 1.14.18.1) é uma enzima ubíqua envolvida na pigmentação. Catalisa a hidroxilação de monofenóis (atividade da cresolase) e a oxidação de difenóis (atividade da catecolase) na presença de oxigênio molecular. A conversão de fenóis em o-difenóis por tirosinase é uma capacidade catalítica potencialmente atrativa e, portanto, a tirosinase tem atraído muita atenção com relação à sua aplicação biotecnológica, uma vez que os produtos catecol são úteis como drogas ou síntese de drogas, por exemplo, L-DOPA [1]. Também desempenha um papel importante na formação do pigmento melanínico durante a melanogênese em melanócitos que estão localizados na junção epidérmica e está presente nessas células que se originam da crista neural embrionária e é responsável pela síntese de melanina. [2] Foi caracterizado pela primeira vez em mamíferos por seu papel no desenvolvimento de melanomas e por sua implicação em problemas de pigmentação, como albinismo e vitiligo [3]. O papel fisiológico das tirosinases está relacionado à biossíntese da melanina e foi extraído de diferentes fontes, como fungos, frutas e tumores de melanoma de mamíferos [4, 5]. Em fungos, as melaninas estão envolvidas em mecanismos de defesa contra fatores de estresse como radiação UV ou gama, radicais livres, desidratação e temperaturas extremas [6, 7]. A estabilidade dos esporos de fungos também se beneficia do papel protetor da melanina [8]. Além disso, as tirosinases estão associadas à cicatrização de feridas, com a resposta imune em plantas [9, 10].Em humanos, a tirosinase está envolvida na pigmentação em melanócitos [11–13], como um marcador em pacientes com melanoma [14] e como um alvo para a ativação de pró-drogas [15]. No presente trabalho, como etapa inicial na avaliação do potencial farmacêutico da tirosinase do cogumelo. Agaricus bisporus, realizamos uma caracterização preliminar da enzima. A tirosinase caracterizada mostrou semelhanças muito altas em comparação com a tirosinase humana, o que indica que o cogumelo purificado e caracterizado pode ser uma fonte próspera de tirosinase para uso terapêutico na melanogênese.

2. Materiais e métodos

2.1. Preparação de tirosinase

A extração da tirosinase do cogumelo foi realizada pelo método de Kamahldin et al. [16], com poucas modificações. Os cogumelos fatiados foram homogeneizados no liquidificador. A extração da enzima foi preparada com 500 mL de tampão fosfato 100 mM frio (pH 5,8) para 300 g de cogumelo. O homogenato foi centrifugado a 5000 rpm durante 30 min e o sobrenadante foi recolhido. Os sedimentos foram misturados com tampão fosfato frio e foram deixados em condição fria com agitação ocasional. Em seguida, o tampão contendo sedimento foi submetido a centrifugação mais uma vez para coletar o sobrenadante. O sobrenadante foi usado como fonte de enzima.

2.2. Purificação da enzima do extrato bruto

A purificação da tirosinase foi realizada pelo método de Kamahldin et al. [16], com pequenas modificações. O extrato enzimático bruto purificado por precipitação com sal, diálise, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, e assim por diante, tem sido empregado em série de modo a obter a enzima em sua forma mais pura. A enzima pura assim produzida pode ser usada para análises posteriores.

2.3. Precipitação de sulfato de amônio e diálise

A precipitação do sulfato de amônio foi feita em banho de gelo usando o sulfato de amônio finamente moído. O pó foi pesado e adicionado lentamente ao extrato por agitação constante para assegurar a solubilidade completa, e a solução foi centrifugada a 5000 rpm por 30 min a 4 ° C. Diferentes etapas de precipitação foram realizadas para a precipitação da enzima tirosinase (45-80%) e os precipitados foram coletados. O precipitado foi dialisado contra tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,0) durante 24 h, mudando o tampão três vezes. A fração dialisada foi usada para a atividade da tirosinase e conteúdo de proteína.

2.4. Ensaio de atividade de tirosinase

O ensaio de atividade da tirosinase foi realizado conforme relatado por Sung e Cho [17] espectrofotometricamente, medindo a conversão de L-DOPA em dopacromo de produto de oxidação de cor vermelha. A taxa inicial de reação é proporcional à concentração da enzima. Uma alíquota contendo tirosinase foi incubada por 5 min a 35 ° C no tempo zero, 1 mL de solução de L-DOPA (4 mg / mL) para medição a 475 nm. Após incubação durante 5 minutos adicionais, a mistura foi agitada novamente e uma segunda leitura foi determinada e medida durante 3 minutos. A mudança na absorbância foi proporcional à concentração da enzima. Uma unidade de enzima correspondeu à quantidade que catalisou a transformação de 1 µmol de substrato para produto por minuto nas condições acima e produziu 1,35 mudanças na absorvância. A atividade específica foi expressa como unidade de enzima por miligrama de proteína. O teor de proteína da enzima foi determinado pelo método de Lowry [18], com albumina de soro bovino como padrão.

2,5. Filtração em Gel Sephadex G-100

A fração de sulfato de amônio dialisada foi aplicada a uma coluna Sephadex G-100 que foi pré-calibrada com um tampão de fosfato 100 mM de pH 7,0. A eluição da proteína foi feita com o mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 5 mL / min. As frações foram recolhidas a 4 ° C. Foi testado para proteína a 280 nm, bem como para atividade enzimática. As frações ativas foram reunidas, dialisadas contra tampão fosfato 100 mM de pH 7,0 e concentradas.

2.6. Cromatografia em coluna de DEAE-celulose

A preparação da enzima dialisada obtida após precipitação com sulfato de amônio e coluna Sephadex G-100 foi submetida a cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-Celulose (20 × 1 cm). A preparação de enzima dialisada foi carregada numa coluna DEAE-Celulose que foi pré-calibrada com tampão de fosfato de potássio (100 mM, pH 7,0). A coluna foi lavada primeiro com tampão equilibrado e, em seguida, as proteínas ligadas foram eluídas usando gradiente linear de NaCl 0-100 mM e tampão de fosfato de potássio 0-100 mM a uma taxa de fluxo de 1 mL por min. As frações (2,5 mL cada) foram coletadas e testadas quanto à atividade da tirosinase e aquelas que mostraram alta atividade foram agrupadas e usadas para análise de SDS-PAGE.

2.7. Gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) Eletroforese de tirosinase purificada

O SDS-PAGE foi realizado usando um gel de separação a 12% e um gel de empilhamento a 4%. As amostras foram aquecidas por 5 min a 100 ° C em frascos tampados com 1% (p / v) SDS na presença de β-mercaptoetanol. A eletroforese foi realizada a 125 V por 4 h em tampão Tris-HCl de pH 8,3. Após a eletroforese, as proteínas no gel de separação foram tornadas visíveis por coloração com Coomassie Brilliant Blue R-250. Os padrões usados ​​para fazer um gráfico do log do peso molecular versus a mobilidade da banda da proteína foram lisozima (20 kDa), mioglobina (26 kDa), anidrase carbônica (38 kDa), ovalbumina (46 kDa), glutamato (62 kDa), bovino albumina sérica (91 kDa), β-galactosidase (120 kDa) e miosina (200 kDa).

2.8. Efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática

A atividade da tirosinase foi avaliada em diferentes valores de pH na faixa entre pH 3 e 10 sob condições de ensaio e a quantidade de dopacromo foi determinada. Os tampões usados ​​foram citrato fosfato (pH 3,0-5,0), fosfato de potássio (pH 6,0-7,0), Tris-HCl (pH 8,0-9,0) e glicina-NaOH (pH 9,0-10). A temperatura ótima para a atividade enzimática foi determinada incubando a mistura de reação padrão em temperaturas variando de 35 a 65 ° C.

2.9. Análise Cinética

A cinética da enzima medida pela constante de Michaelis (Km) é definida como a concentração de substrato na metade da velocidade máxima, a taxa de reações enzimáticas, relacionando a taxa de reação à concentração de um substrato. O valor da constante de Michaelis (Km) da enzima purificada foi estimado em uma faixa de concentrações de tirosinase. O valor de Km aparente da tirosinase purificada foi calculado a partir dos gráficos de Lineweaver-Burk relacionando 1 / V a 1 / [S].

3 Resultados e discussão

3.1. Purificação Parcial de Tirosinase

O cogumelo contém uma quantidade considerável de vários compostos fenólicos, que são facilmente oxidados durante o processo de homogeneização. Após oxidação e polimerização sucessiva do conteúdo fenólico do extrato de cogumelo, macromoléculas de melaninas são formadas. A purificação da tirosinase do cogumelo é moderadamente mais difícil devido à menor quantidade de tecido disponível por corpo de frutificação do cogumelo e à maior quantidade de melanina nesses tecidos. As melaninas que as acompanham, que geralmente são acumuladas durante a preparação do extrato homogeneizado, podem ser extensivamente removidas da mistura de proteínas usando material de troca iônica. Inicialmente, tentamos trocadores de ânions adsorventes, bem como métodos de precipitação precipitação de sulfato de amônio para remover material colorido ou para concentrar tirosinase. Nenhum desses métodos teve sucesso sem causar uma diminuição na recuperação da atividade enzimática ou não ser capaz de remover uma quantidade substancial de material colorido.

Resumidamente, os extratos brutos foram preparados por homogeneização em tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 5,8) contendo EDTA 1 mM. Após centrifugação, o sobrenadante foi aplicado para precipitação de sulfato de amônio. A purificação parcial da tirosinase por precipitação com sulfato de amônio mostrou que a melhor fração foi de 70% em relação à enzima bruta e outras frações. Deu os valores máximos de atividade total, atividade específica e rendimento da enzima tirosinase que atingiram 11,09 U / mg, 83,5%, respetivamente. A purificação dobrada da enzima purificada foi de 3,47 quando sulfato de amônio a 70% foi usado. Os achados anteriores foram idênticos aos relatados por Lee et al. [19], que descobriram que sulfato de amônio 70% foi a melhor fração que deu o maior rendimento da atividade da tirosinase de Solanum melongena. O precipitado de sulfato de amônio dialisado que foi aplicado à cromatografia em coluna de filtração em gel Sephadex G-100 mostrou picos principais de atividade da tirosinase que foram observados nas frações ativas e resultou em purificação de 9,22 vezes com uma atividade específica final de 29,42 U / mg. A recuperação geral da purificação foi de 35,7% (Tabela 1). Esta fração ativa foi aplicada a uma coluna de DEAE-Celulose e eluída com um gradiente de NaCl crescente em etapas. A enzima foi eluída em NaCl 0-100 mM (Figura 1). As frações ativas eluídas recromatografadas na mesma coluna com um gradiente linear de tampão de fosfato de potássio (0-100 mM) foram passadas pela coluna (Figura 2). Este esquema de purificação de duas etapas, cromatografia de troca iônica, resultou em uma preparação de tirosinase parcialmente purificada, obtida pela combinação das frações 25, 26, 27 e 28 e a enzima foi purificada por purificação de cerca de 16,36 vezes com uma atividade específica final de 52,19 U / mg. A recuperação geral da purificação foi de 26,6%. Horowitz et al. [20] relataram que a tirosinase produzida no corpo da frutificação pode ser recuperada e purificada por homogeneização em um liquidificador e, em seguida, passada por uma prensa francesa seguida de precipitação com acetona ou sulfato de amônio [21]. O precipitado ressuspenso foi ainda purificado por uma ou mais colunas de cromatografia. As colunas mais comumente usadas são hidroxilapatita [22], DEAE-Celulose [23] ou DEAE Sepharose [24], várias outras resinas de imunoafinidade [25] e gel de exclusão de tamanho Sephadex [21].


RESULTADOS

Identificação de proteínas que interagem com GRASP65 no citosol de interfase

Em nossos estudos anteriores, usamos um ensaio de agregação de grânulos semiquantitativo para visualizar a oligomerização GRASP65. Nós revestimos esferas magnéticas Dynal M-500 com GRASP65 purificado e examinamos o grau de agregação de esferas em diferentes condições (Wang et al., 2003, 2005 Tang et al., 2010b). Quando grânulos revestidos com GRASP65 foram incubados em um tampão fisiológico a 37ºC, os grânulos formaram agregados até certo ponto, sugerindo que GRASP65 se forma trans-oligômeros que são suficientes para ligar as superfícies vizinhas (Wang et al., 2003). De interesse, quando os grânulos foram incubados com citosol de células HeLa em interfase, a agregação foi fortemente aumentada em comparação com um tampão contendo a mesma concentração de albumina sérica bovina (BSA 92,7 ± 3,5% vs. 34,2 ± 2,8% grânulos em agregados Figura 1 , A e B), sugerindo que o citosol de interfase contém componentes ativos que aumentam a oligomerização GRASP65.

FIGURA 1: Mena localiza-se no cis-Golgi através da interação com GRASP65. (A) Grânulos Dynal M-500 acoplados a GRASP65 foram incubados com tampão contendo BSA ou citosol de interfase HeLa (IC). Após a incubação, os grânulos foram colocados em lâminas de vidro e os campos aleatórios foram fotografados. Barra de escala, 100 μm. (B) Quantificação de A para a porcentagem de grânulos em agregados. Os resultados são expressos como média ± SEM. A significância estatística foi avaliada por comparação com esferas tratadas com BSA. o p valor foi determinado por Student's t teste ***p & lt 0,001. (C) Purificação por afinidade de proteínas que interagem com GRAS65. Citosol em interfase fracionado por precipitação de sulfato de amônio de 15-30% foi incubado com BSA ou esferas CNBr acopladas a His-GRASP65, e as proteínas ligadas foram analisadas por SDS-PAGE e coloração com azul de Coomassie. As setas indicam as bandas de Mena e β / γ-actina que foram excisadas e identificadas por espectrometria de massa. (D) Grânulos revestidos com BSA ou GRASP65 foram incubados com 15-30% de proteínas precipitadas com sulfato de amônio do citosol de interfase (I, entrada), lavados e analisados ​​por Western blot para Mena. (E) Imunoprecipitação (IP) por IgG inespecífico (ctrl) ou anticorpos anti-Mena de lisado de células transfectadas com controle (ctrl) ou siRNA direcionado a Mena. (F) Células WT HeLa foram imunocoradas com anticorpos indicados para mostrar a localização de Golgi de Mena endógena. (G) As células HeLa que expressam GFP-Mena foram imunocoradas para GRASP65. (H) As células transfectadas com siRNA de GRASP65 ou de controle foram imunocoradas para as proteínas indicadas. A depleção de GRASP65 aboliu a localização Golgi de Mena. (I) As células transfectadas com GFP, GFP-Mena ou GFP-VASP foram lisadas e imunoprecipitadas por anticorpos GFP. (J) Quantificação da quantidade de GFP-Mena ou GFP-VASP que foi coimmunoprecipitado com GRASP65, com o nível de GFP-Mena normalizado para 100%. ***p & lt 0,001. (K) As células que expressam GFP-Mena ou GFP-VASP foram imunocoradas para GRASP65. Mena, mas não VASP, está concentrada no Golgi. Bar, 20 μm (F – H, J). (L) Membranas de Golgi de fígado de rato purificado (RLG) foram incubadas com interfase (IC) ou citosol mitótico (MC) ou sequencialmente incubadas com MC e, em seguida, IC (MC → IC), reisoladas e transferidas para as proteínas indicadas.

Para confirmar ainda mais a existência de componentes ativos no citosol de interfase, primeiro agregamos grânulos revestidos com GRASP65 por citosol de interfase e, em seguida, os desagregamos por tratamento com quinases mitóticas quinase dependente de ciclina 1 (Cdk1) e quinase semelhante a Polo 1 (Plk1), que são conhecidos por fosforilar GRASP65 e interromper sua oligomerização (Wang et al., 2003 2005), e posteriormente tratou as esferas únicas resultantes com citosol de interfase ou proteína fosfatase 2A purificada (PP2A), que desfosforila GRASP65 (Tang et al., 2008). Conforme mostrado na Figura Suplementar S1A, ambos os tratamentos causaram reagregação de grânulos, mas o tratamento com citosol em interfase resultou em uma agregação muito maior do que com PP2A, sugerindo fortemente que o citosol em interfase contém componentes ativos para oligomerização GRASP65. Para caracterizar as propriedades bioquímicas desses fatores, tratamos o citosol de interfase com alto teor de sal, calor ou proteases. Todos esses tratamentos aboliram a atividade, sugerindo que os fatores citosólicos são proteínas por natureza (Figura Suplementar S1B). Experimentos adicionais usando uma variedade de nucleotídeos ou seus análogos mostraram que esta atividade requer ATP, mas não a hidrólise de ATP, porque a adição de análogos de ATP não hidrolisáveis, como ATPγS, aumentou significativamente a agregação semelhante ao ATP (Figura Suplementar S1C).

Em seguida, tentamos enriquecer essa atividade por métodos bioquímicos clássicos. Usando a precipitação sequencial de sulfato de amônio, descobrimos que a atividade foi enriquecida em 10-30% de precipitado de sulfato de amônio (Figura Suplementar S2A). Em seguida, fracionamos o precipitante de sulfato de amônio 15-30% do citosol por um gradiente de glicerol de 10-35% e descobrimos que a fração 9, entre um total de 12 frações, continha a maior parte da atividade (Figura Suplementar S2B). A comparação com os padrões de peso molecular mostrou que as proteínas na fração 9 eram ∼1000 kDa, sugerindo que se trata de um grande complexo de proteínas.

Para purificar por afinidade os componentes ativos, dissolvemos o precipitado de sulfato de amônio 15-30%, dialisamos em um tampão fisiológico e o passamos por uma coluna que continha GRASP65 ou BSA reticulado a grânulos ativados por CNBr, que têm maior capacidade do que contas Dynal. Após extensa lavagem, as proteínas ligadas foram analisadas por SDS – PAGE e coloração com azul de Coomassie. As proteínas que se ligam especificamente a GRASP65, mas não a esferas de BSA, foram excisadas e identificadas por espectrometria de massa. Mena, o homólogo mamífero de Drosófila Ena conhecido por aumentar o alongamento do filamento de actina (Gertler et al., 1996), e β- e γ-actina foram identificados neste processo (Figura 1C e Tabela Suplementar S1).

Mena é recrutada para as membranas de Golgi por meio da interação com GRASP65

Para confirmar a interação entre GRASP65 e Mena, incubamos o corte de sulfato de amônio 15-30% do citosol de interfase com esferas ativadas por CNBr revestidas com BSA ou GRASP65 e analisamos as proteínas ligadas por Western blot. Conforme mostrado na Figura 1D, GRASP65 puxou para baixo Mena do citosol, mas BSA não. Para confirmar essa interação nas células, imunoprecipitamos Mena do lisado de células HeLa e descobrimos que GRASP65, mas não sua contraparte GRASP55, coprecipitou com Mena (Figura 1E). Para garantir a especificidade dessa interação, derrubamos Mena com um pequeno RNA de interferência (siRNA). Como resultado, GRASP65 era indetectável no precipitado com anticorpos Mena quando Mena estava esgotado (Figura 1E).

Em seguida, determinamos se Mena foi recrutada para o Golgi por GRASP65. Imagens de imunofluorescência em relatórios anteriores sugerem um enriquecimento proeminente de Mena em aderências focais, lamelipódios e filopódios. No entanto, a maioria das imagens também mostra uma localização perinuclear de Mena nas células (Bear et al., 2002 Loureiro et al., 2002 Joshi e Wang, 2015). De forma consistente, filamentos de Ena e actina recentemente mostraram localizar-se no cis-Golgi para regular a fusão e fissão da membrana de Golgi no desenvolvimento de células fotorreceptoras em Drosófila (Kannan et al., 2014). Por microscopia de imunofluorescência, descobrimos que Mena endógena é enriquecida no Golgi e co-localizada com GRASP65 (Figura 1F). Da mesma forma, a proteína fluorescente verde expressa exogenamente (GFP) –Mena também se concentrou no Golgi (Figura 1G). A localização Golgi de Mena é GRASP65 dependente, porque a depleção de GRASP65 por interferência de RNA (RNAi) dispersou Mena do Golgi para o citosol (Figura 1H). Para determinar se a interação entre Mena e GRASP65 é específica, também examinamos VASP, outro membro da família de proteínas Ena / VASP. GFP-Mena coimmunoprecipitou com GRASP65 endógeno, mas GFP-VASP tinha afinidade muito menor para GRASP65 (8,2 ± 3,3% em relação a GFP-Mena Figura 1, I e J). Além disso, ao contrário de Mena, GFP-VASP não foi enriquecido no Golgi (Figura 1K), indicando que a interação com GRASP65 e localização de Golgi são específicas para Mena. Quando as membranas de Golgi purificadas foram incubadas com interfase ou citosol de células mitóticas HeLa e reisoladas, Mena citosólica foi copurificada com as membranas de Golgi em ambas as condições de interfase e mitóticas (Figura 1L), demonstrando que a interação entre GRASP65 e Mena é independente do ciclo celular.

Mena é necessário para a formação da fita de Golgi de uma maneira dependente de actina

Para investigar a função de Mena na organização de Golgi, derrubamos Mena em células HeLa (Figura 2). A transfecção com siRNA inespecífico de controle não teve efeito significativo na morfologia de Golgi na célula, conforme indicado pela coloração GRASP65, enquanto a depleção de Mena causou a fragmentação de Golgi, com elementos de Golgi separados uns dos outros e dispersos no citoplasma (Figura 2, A – C )A quantificação dessas células mostrou que o Golgi foi fragmentado em 78,2 ± 1,5% das células depletadas de Mena, significativamente maior do que nas células de controle tratadas com siRNA (9,0 ± 0,2% Figura 2C). Em seguida, examinamos a estrutura de Golgi mais de perto por EM. Em células transfectadas com siRNA de controle, as pilhas de Golgi foram bem organizadas e conectadas lateralmente em uma fita (Figura 2D). Em contraste, em células depletadas de Mena, as pilhas de Golgi foram desconectadas, dispersas por todo o citoplasma e significativamente mais curtas do que nas células de controle (Figura 2E). O comprimento médio das pilhas de Golgi foi reduzido de 1,23 ± 0,08 μm em células de controle para 0,72 ± 0,05 μm em células depletadas de Mena (Figura 2E), enquanto o empilhamento de Golgi não foi afetado (Figura 2F). Além disso, as cisternas de Golgi em células depletadas de Mena estavam ligeiramente dilatadas, semelhante ao efeito da interrupção da actina, conforme relatado anteriormente (Lazaro-Dieguez et al., 2006). Esses resultados sugerem que o esgotamento de Mena reduz a conectividade entre as pilhas de Golgi na fita.

FIGURA 2: Mena regula a integridade de Golgi por meio da polimerização de actina. (A) Células HeLa tratadas com siRNA indicado foram coradas para Mena e GRASP65. (B) Imunoblot de células HeLa de A. (C) Quantificação de A para a porcentagem de células com Golgi fragmentado. (D) Imagens EM representativas das células descritas em A. Arrows, pilhas de Golgi. Bar, 500 nm. (E) Quantificação de D para o comprimento cisternal médio das pilhas de Golgi. (F) Quantificação de D para o número médio de cisternas por pilha de Golgi. (G) Células HeLa depletadas de Mena foram transfectadas com um cDNA para GFP ou marcado com GFP, Mena WT resistente a RNAi ou mutantes e coradas para GRASP65. Bar, 20 μm (A, G). (H) As células foram transfectadas primeiro com siRNA não específico (faixa 1) ou específico de Mena (faixas 2–5) e, em seguida, com plasmídeo de GFP (faixa 2), marcado com GFP, Mena WT resistente a RNAi (faixa 3), ΔFAB (faixa 4) e mutantes ΔGAB (faixa 5) e analisados ​​por Western blot. endo. Mena, Mena endógena. (I) Quantificação da porcentagem de células GFP-positivas com Golgi fragmentado em G. ***p & lt 0,001.

Para garantir que o fenótipo de fragmentação de Golgi era específico para a depleção de Mena, expressamos uma forma resistente a RNAi de GFP-Mena, ou GFP como controle, em células nas quais Mena endógeno foi derrubado. Conforme mostrado na Figura 2, G – I, a expressão de GFP não teve efeito no Golgi fragmentado, enquanto nas células que expressam GFP-Mena, o Golgi tornou-se intacto e compacto. Em seguida, perguntamos se a função de Mena na integridade de Golgi é através da formação de filamentos de actina. Expressamos os mutantes Mena ΔFAB ou ΔGAB, que não podem se ligar a F-actina ou G-actina, respectivamente (Loureiro et al., 2002 Breitsprecher et al., 2011), em células depletadas de Mena. Ambos os mutantes, embora localizados no Golgi, não conseguiram resgatar a fita de Golgi da fragmentação (Figura 2, G – I). Esses resultados indicam que o Mena é necessário para a manutenção da integridade do Golgi e sua atividade depende da actina.

Além disso, mapeamos os domínios de interação em ambas as proteínas com ensaios pull-down. Como outros membros da família de proteínas Ena / VASP, Mena contém um domínio de homologia 1 de Ena / VASP N-terminal (EVH1), que se liga ao motivo rico em prolina de uma série de proteínas para o direcionamento subcelular, um domínio rico em prolina médio, e um domínio EVH2 C-terminal que interage com a G-actina e F-actina e, assim, aumenta o alongamento da F-actina. O domínio EVH2 também possui um domínio coiled-coil C-terminal que medeia a tetramerização de Mena (Bear e Gertler, 2009 Breitsprecher et al., 2011). GRASP65, por outro lado, contém um domínio GRASP N-terminal e um domínio C-terminal rico em serina / prolina (SPR) (Wang et al., 2005). Para determinar se Mena interage com o domínio rico em prolina de GRASP65 por meio de seu domínio EVH1, realizamos um ensaio suspenso usando Mena EVH1 humano recombinante purificado e fragmentos GRASP65 de rato. O domínio EVH1 de Mena copurificou com GRASP65 de comprimento total (Figura 3A), bem como com seu domínio C-terminal SPR, mas não o domínio N-terminal GRASP (Figura 3B), demonstrando que a interação é mediada diretamente pelo EVH1 domínio de Mena e o domínio SPR de GRASP65 e é independente da actina.

FIGURA 3: A interação Mena – GRASP65 é necessária para a integridade do Golgi. (A) Pérolas revestidas com BSA ou GRASP65 foram incubadas com GST-Mena EVH1 purificado, lavadas e analisadas por Western blot para GST. (B) Grânulos acoplados com BSA ou GRASP65 purificado aa 1-201 (p65N) ou fragmento 202-446 (p65C) foram incubados com His-Mena EVH1 purificado, lavados e analisados ​​por Western blot para His tag. (C) Pérolas acopladas com GST ou fragmentos GRASP65 marcados com GST purificados foram incubadas com lisado de células HeLa, lavadas e analisadas por Western blot para Mena. (D) Mutações pontuais GRASP65, com os aminoácidos indicados mutados. (E) Alinhamento de sequências de aminoácidos GRASP65 de rato, camundongo e humano na região indicada. As linhas em negrito indicam os locais onde as prolinas conservadas foram mutadas nos mutantes (M1-M6) como em D. (F) Células transfectadas com GFP, GRASP65 WT marcado com GFP ou mutantes indicados foram imunoprecipitados com anticorpos anti-GFP e analisados ​​por Western borrão. (G – J) Células empobrecidas em GRASP65 foram transfectadas com WT GRASP65 ou seu mutante M2 e analisadas por Western blot (G) e microscopia (H, I). Bar, 20 μm. (J) Quantificação de células em I com Golgi fragmentado. ***p & lt 0,001.

Usando glutationa S-transferase (GST) - fragmentos GRASP65 de rato marcados para puxar Mena do lisado de células HeLa, encontramos os aminoácidos (aa) 202–320 como o fragmento mínimo de GRASP65 para ligação a Mena (Figura 3C). Existem quatro trechos ricos em prolina nesta região conservados entre as espécies. Portanto, transformamos as prolinas conservadas em glicinas (Breitsprecher et al., 2011 Figura 3, D e E), expressou-os em células e testou suas interações com Mena por coimmunoprecipitação. Como mostrado na Figura 3F, a mutação de P236 / P237 / P239 / P241 em glicinas (M2 mutante) em GRASP65 de rato aboliu a interação com Mena, enquanto a mutação de outras prolinas não teve efeito. Esta sequência de ligação de Mena EVH1 em GRASP65, L (humano) / P (rato e camundongo) PPxPxP, embora perto da sequência comum F / LPPXP compartilhada por vários Drosófila Ena e proteínas de interação com mena de mamíferos (Ball et al., 2002), é não tradicional, semelhante a outro motivo de ligação Mena EVH1 em Abi humano (Breitsprecher et al., 2011).

Para determinar se a interação GRASP65-Mena é necessária para a localização de Mena Golgi e integridade da fita de Golgi, transfectamos GRASP65 de rato de tipo selvagem (WT) marcado com GFP ou o mutante deficiente de interação Mena M2 em células HeLa empobrecidas em GRASP65 (Figura 3, G e J). Ao contrário de WT GRASP65, o mutante M2 falhou em recrutar Mena para o Golgi (Figura 3H) ou resgatar o Golgi fragmentado (Figura 3, I e J).

Como Mena regula a estrutura de Golgi ao interagir com os filamentos de actina, perguntamos se a perturbação dos filamentos de actina por tratamento farmacológico afetaria a estrutura de Golgi. A citocalasina B é conhecida por cobrir o filamento de actina e, portanto, inibe o alongamento do filamento de actina, antagonizando Mena na prevenção do capeamento do filamento de actina (Braet et al., 1996). Latrunculin B se liga ao monômero de actina e, assim, despolimeriza os filamentos de actina (Wakatsuki et al., 2001). Nestes experimentos, não observamos um Golgi condensado óbvio como relatado anteriormente (Lazaro-Dieguez et al., 2006) em vez disso, descobrimos que as células tratadas com citocalasina B ou latrunculina B exibiram um fenótipo de Golgi solto e não ligado em comparação com um Golgi intacto em células tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO) (Figura 4A). Além disso, a depleção de β- ou γ-actina celular por siRNA resultou na fragmentação de Golgi (Figura 4B), semelhante à depleção de Mena. Por EM, descobrimos que a ruptura dos filamentos de actina por tratamentos com drogas (Figura 4C) e depleção de β- ou γ-actina (Figura 4D) resultaram em ministacks dispersos, aparentemente causados ​​pelo desligamento da fita de Golgi. Tomados em conjunto, esses resultados revelaram que os filamentos de mena e actina regulam a integridade da fita de Golgi.

FIGURA 4: Os filamentos de actina são necessários para a integridade do Golgi. (A) Células HeLa tratadas com DMSO, citocalasina B (CytB, 40 μM) ou latrunculina B (LatB, 0,5 μM) por 2 h foram coradas para α-manosidase II (ManII) e faloidina marcada com rodamina. (B) As células transfectadas com siRNA indicado foram coradas para ManII e rodamina-faloidina. Bar, 20 μm (A, B). (C) As células tratadas com DMSO, citocalasina B ou latrunculina B por 2 h foram processadas para EM e imagens. As setas indicam as pilhas de Golgi. O comprimento cisternal médio das pilhas de Golgi foi quantificado. A significância estatística foi avaliada por comparação com células tratadas com DMSO. (D) As células transfectadas com siRNA de controle, β-actina ou γ-actina por 48 h foram processadas para EM e analisadas como em C. A significância estatística foi avaliada por comparação com as células de controle tratadas com siRNA. Bar, 500 nm (C, D). ***p & lt 0,001.

Os filamentos de actina têm sido implicados no tráfico intracelular (Campellone et al., 2008 Miserey-Lenkei et al., 2010 Egea et al., 2013 Gurel et al., 2014) e, portanto, determinamos se Mena como um regulador do filamento de actina também afeta o tráfego de proteínas, usando a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) como carga. As células primeiro transfectadas com siRNA de controle ou Mena foram infectadas por adenovírus que foram pré-embalados com plasmídeos VSV-G-ts045-GFP (Xiang et al., 2013). As células foram mantidas em temperatura não permissiva (40,5ºC) durante a noite para capturar VSV-G-ts045 no retículo endoplasmático (ER) e, em seguida, movidas para a temperatura permissiva (32ºC) para permitir a exportação de VSV-G do ER através do Golgi para a membrana plasmática (Presley et al., 1997 Hirschberg et al., 1998). Conforme mostrado na Figura Suplementar S3, a depleção de Mena não afetou significativamente o tráfego de VSV-G. Assim, Mena desempenha um papel crítico na formação da fita de Golgi, mas não no tráfego de proteínas.

Filamentos de mena e actina facilitam a formação da fita de Golgi após lavagem com nocodazol

Em células de mamíferos, a formação da fita de Golgi requer uma rede de microtúbulos intacta. A despolimerização de microtúbulos com nocodazol resulta em ministacks de Golgi dispersos no citoplasma (Minin, 1997 Thyberg e Moskalewski, 1999). Em seguida, lavamos o nocodazol para permitir a reforma da fita de Golgi para imitar a montagem de Golgi pós-mitótica na presença ou ausência de Mena. Conforme mostrado na Figura 5, a reforma da fita de Golgi foi significativamente atrasada em células depletadas de Mena em comparação com as células de controle (Figura 5A). Em cada ponto de tempo, havia mais elementos de Golgi livres não fundidos com o núcleo de Golgi em células depletadas de Mena. Aos 120 minutos após a remoção do nocodazol, todos os elementos de Golgi estavam concentrados no centro da célula, e a fita de Golgi ficou intacta em todas as células de controle, no entanto, em células depletadas de Mena, embora os elementos de Golgi tenham sido transportados para o centro da célula, a maioria das eles permaneceram desconectados. Os resultados de imagem confocal e quantificação mostraram que a depleção de Mena aumentou o número de elementos de Golgi por célula, indicando um defeito na fusão dos elementos de Golgi (Figura 5B). Semelhante à depleção de Mena, a inibição do alongamento da actina pelo tratamento com citocalasina B também atrasou a reforma da fita de Golgi após a remoção do nocodazol (Figura 5C e Figura Suplementar S4). Assim, o alongamento do filamento de Mena e actina são essenciais para ligar as pilhas de Golgi à fita.

FIGURA 5: Depleção de mena prejudica a remontagem de Golgi após lavagem com nocodazol. (A) Células HeLa transfectadas com controle ou siRNA de Mena foram incubadas com nocodazol por 2 h. Após a remoção do nocodazol pelos tempos indicados (minutos), as células foram fixadas e coradas pelos anticorpos faloidina e GRASP65. Bar, 10 μm. (B) Os experimentos em A foram analisados ​​por microscopia confocal, e o número de partículas de Golgi nas células indicadas foi quantificado (média ± SEM). *p & lt 0,05 ***p & lt 0,001. (C) As células foram incubadas primeiro com nocodazol por 2 h e, em seguida, com a adição de DMSO ou citocalasina B por mais 30 min. As células foram lavadas e posteriormente incubadas em meio de crescimento contendo DMSO ou citocalasina B, mas sem nocodazol, pelos tempos indicados. As células foram coradas para GRASP65 e por faloidina (imagens mostradas nas Figuras Suplementares S4 e S5) e analisadas por microscopia confocal e quantificadas como em B. Resultados de quantificação.

Como sugerido por Kondylis et al. (2007), quando dispersos por tratamento com nocodazol, as pilhas de Golgi existem como pares em células de mamíferos, semelhantes às observadas em Drosófila As células S2 e os filamentos de actina são necessários para a formação dos pares de Golgi. Portanto, a despolimerização dos filamentos de actina pela latrunculina B em células tratadas com nocodazol deve levar à cisão dos pares de Golgi e à duplicação dos elementos de Golgi. Para testar essa possibilidade, incubamos células com nocodazol na presença de DMSO, citocalasina B ou latrunculina B. A análise de microscopia confocal mostrou que o tratamento com nocodazol dispersou a fita de Golgi em ministacks; no entanto, o tratamento adicional com citocalasina B não aumentou ainda mais o número de Elementos de Golgi. Da mesma forma, a depleção de Mena por siRNA não afetou o número de elementos de Golgi em células tratadas com nocodazol (Figura Suplementar S5A). Sob EM, as pilhas de Golgi em células tratadas com nocodazol eram mais curtas do que em células de interfase normais e estavam sempre localizadas adjacentes às membranas de ER, presumivelmente locais de saída de ER. Nem a depleção de Mena nem o tratamento com citocalasina B e latrunculina B afetaram ainda mais o comprimento e a localização das mini-pilhas de Golgi (Figura Suplementar S5B). Estes resultados indicaram que o emparelhamento de Golgi é improvável que seja o mecanismo de ligação da fita mediada por Mena e actina.

Mena e filamento de actina são necessários para a fusão de Golgi

Durante a reforma da fita de Golgi após a remoção do nocodazol, muitas vezes observamos manchas de actina localizadas ao redor e entre os elementos de Golgi nas células de controle (Figura 6A), possivelmente facilitando a ligação das pilhas de Golgi umas com as outras, enquanto que nas células depletadas de Mena, essas manchas de actina foram raramente detectáveis ​​(Figura 6B). Como a ligação da fita de Golgi requer atividade de fusão de membrana, determinamos se o alongamento de actina mediado por Mena facilita a fusão de membrana de Golgi, usando um ensaio de remontagem de Golgi in vitro bem estabelecido (Tang et al., 2010a). Primeiro tratamos membranas de Golgi purificadas com citossol de células mitóticas HeLa para induzir a fragmentação de Golgi. Nós reisolamos os fragmentos de Golgi mitóticos (MGFs) resultantes e os tratamos posteriormente com citosol de interfase para permitir que as vesículas se fundissem. Em seguida, medimos a atividade de fusão da membrana de Golgi quantificando as membranas cisternal longas geradas a partir das vesículas. Para determinar se o Mena é necessário para a fusão da membrana de Golgi, imunodepletamos o Mena do citosol em interfase. Quando incubados com citosol tratado com imunoglobulina G (IgG) de controle, os fragmentos de Golgi mitóticos (Figura 6C) remontam em cisternas de Golgi longas e empilhadas (Figura 6D). No entanto, quando Mena estava esgotado, o que removeu 85,5% de Mena do citosol, a atividade de fusão da membrana foi reduzida para 35,1 ± 7,7% do citosol de controle (Figura 6, E – G). Da mesma forma, a despolimerização da actina pela adição de citocalasina B na reação de remontagem reduziu a eficiência de fusão da membrana para 29,7 ± 7,1% em relação ao controle de DMSO (Figura 6H). Assim, Mena e actina são essenciais para a fusão da membrana de Golgi.

FIGURA 6: Mena regula a fusão da membrana de Golgi por meio do alongamento da F-actina. (A, B) As células HeLa foram transfectadas com siRNA de controle (A) ou Mena (B) e incubadas com nocodazol por 2 h. Aos 15 minutos após a remoção do nocodazol, as células foram coradas para actina (vermelho) e GRASP65 (branco) e analisadas por microscopia confocal. São mostradas varreduras únicas, partes das imagens são ampliadas para mostrar as manchas de actina entre as membranas de Golgi. Barras, 10 μm. (C) Mena foi eficientemente esgotado do citosol de interfase, como mostrado por Western blot. (D – F) Ensaio de remontagem de Golgi in vitro. As membranas RLG purificadas foram desmontadas por tratamento com citosol mitótico, reisoladas (D) e posteriormente incubadas com citosol de interfase imunodepletado por IgG de controle (E) ou por anticorpos anti-Mena (F). As membranas foram processadas para EM e geradas por imagem. Barras, 500 nm. (G) Quantificação da eficiência relativa de fusão da membrana de Golgi em E e F. ***p & lt 0,001. (H) Membranas de Golgi purificadas que foram primeiro desmontadas por tratamento com citosol mitótico e depois incubadas com citosol de interfase na presença de DMSO ou 40 μM de citocalasina B (CytB). As membranas foram processadas para EM e quantificadas como em G.

Mena e filamento de actina alongado aumentam a oligomerização GRASP65

Como Mena interage diretamente com GRASP65 e Mena promove o alongamento de actina para ligar as pilhas de Golgi em uma fita, perguntamos se GRASP65 funciona apenas como âncora de membrana para Mena ou Mena e os filamentos de actina também regulam a oligomerização GRASP65. Esta questão foi abordada usando o ensaio de agregação de grânulos, no qual a oligomerização GRASP65 pode ser visualizada diretamente (Wang et al., 2003 2005). Como mostrado na Figura 7, A e B, grânulos revestidos com GRASP65 formaram grandes agregados quando tratados com citosol de interfase, enquanto a depleção de Mena do citosol reduziu significativamente essa atividade, sugerindo que Mena é pelo menos um dos principais componentes do citosol de interfase que aumentam a oligomerização GRASP65 (Figura 7, A e B). A hiperpolimerização de GRASP65 requer polimerização de actina, porque a adição de citocalasina B na reação reduziu significativamente a agregação de grânulos GRASP65 em comparação com o controle DMSO (Figura 7, C e D).

FIGURA 7: Mena e F-actinas aumentam a oligomerização GRASP65. (A, B) Grânulos revestidos com GRASP65 foram incubados com citosol de interfase (IC) imunodepletado por IgG não específico ou anti-Mena. Grânulos foram fotografados por microscopia (A), e a porcentagem de grânulos em agregados foi quantificada (B). (C, D) Grânulos revestidos com GRASP65 foram incubados com IC na presença de DMSO ou 40 μM de citocalasina B e os resultados quantificados. (E, F) Grânulos revestidos com GRASP65 incubados com proteínas purificadas indicadas ou IC foram fotografados e quantificados. (G, H) Grânulos revestidos com GRASP65 incubados com citosol de interfase ou citosol de interfase que foi pré-incubado com BSA, Mena EVH1, domínio ou domínio Mena EVH2 foram fotografados e quantificados. Barras, 50 μm. ***p & lt 0,001.

Talvez a melhor maneira de testar como Mena e actina regulam a oligomerização GRASP65 seja incubar grânulos revestidos com GRASP65 com Mena purificada e actina; no entanto, os esforços para expressar e purificar Mena de comprimento total falharam e fomos capazes de purificar apenas os fragmentos de Mena. Portanto, primeiro determinamos se os fragmentos de Mena poderiam aumentar a oligomerização GRASP65.Como mostrado na Figura 7, E e F, o domínio EVH1, que interage com GRASP65 (Figura 3A), mas não promove a polimerização de actina devido à falta do domínio de polimerização de actina, não aumentou a agregação de grânulos GRASP65. Da mesma forma, o domínio EVH2, que promove a polimerização da actina, mas não se liga a GRASP65, também não aumentou a oligomerização de GRASP65. Em seguida, testamos se a adição de fragmentos de Mena no citosol de interfase poderia inibir a oligomerização GRASP65 promovida por Mena. Na verdade, a adição do domínio EVH1 purificado à reação, que compete com Mena no citosol pela ligação de GRASP65, reduziu significativamente a atividade no citosol de interfase na promoção da agregação de grânulos revestidos com GRASP65. O domínio EVH2, conhecido por competir pela ligação da actina, teve um efeito semelhante. Como controle negativo, BSA não teve efeito na oligomerização GRASP65 (Figura 7, G e H). Estes resultados demonstram que a interação GRASP65 e a atividade de alongamento de actina são necessárias para que Mena intensifique a oligomerização GRASP65 e a ligação da fita de Golgi.

Pegando os resultados juntos, identificamos Mena como um novo parceiro de ligação GRASP65 que desempenha um papel essencial na formação da fita de Golgi. Isso explica como GRASP65 desempenha um papel duplo na formação da estrutura de Golgi. Quando localizados entre as cisternas de Golgi, os oligômeros GRASP65 amarram diretamente as cisternas adjacentes em pilhas. Quando localizado nas bordas das pilhas de Golgi, GRASP65 recruta Mena para o Golgi por meio de uma interação direta e dispara o crescimento local do filamento de actina. Posteriormente, as fibras de actina reticulam GRASP65 e promovem a oligomerização GRASP65. Tanto os filamentos de actina quanto os oligômeros GRASP65 geram forças para ligar as pilhas de Golgi vizinhas em uma fita (Figura 8).

FIGURA 8: Modelo de interação Mena – GRASP65 na ligação da fita de Golgi. As miniestacas de Golgi são transportadas para o centro da célula ao longo dos microtúbulos (1). Os oligômeros GRASP65 prendem as cisternas de Golgi em pilhas (2) e prendem as pilhas de Golgi próximas em uma fita (3). A formação da fita requer inicialmente que Mena GRASP65 recrute Mena para o Golgi, que promove o alongamento do filamento de actina (4). As fibras de actina então ligam pilhas de Golgi espalhadas e puxam-nas uma em direção à outra para formar uma fita (5). Em ambos os cis e a trans faces da pilha, os filamentos de actina associados a Golgi podem facilitar a deformação da membrana para a formação de vesículas, fissão e fusão, e movimentos de curto alcance (6).


Dependência do pH do ensaio de precipitação com sulfato de amônio - Biologia

A sensibilidade do procedimento de Lowry é moderadamente constante de proteína a proteína, e tem sido tão amplamente usada que as estimativas de proteína de Lowry são uma alternativa completamente aceitável para uma determinação absoluta rigorosa em quase todas as circunstâncias onde misturas de proteínas ou extratos brutos estão envolvidos.

O método é baseado na reação de Biureto, onde as ligações peptídicas das proteínas reagem com cobre em condições alcalinas produzindo Cu +, que reage com o reagente de Folin, e na reação de Folin-Ciocalteau, que é mal compreendida, mas em essência o fosfomolibdotungstato é reduzido a azul de heteropolimolibdênio pela oxidação catalisada por cobre de aminoácidos aromáticos. As reações resultam em uma cor azul forte, que depende em parte do conteúdo de tirosina e triptofano. O método é sensível até cerca de 0,01 mg de proteína / mL e é melhor usado em soluções com concentrações na faixa de 0,01-1,0 mg / mL de proteína.

1. Reagente formador de complexo : Prepare imediatamente antes de usar, misturando as seguintes três soluções estoque A, B e C na proporção 100: 1: 1 (v: v: v), respectivamente.
Solução A: 2% (w / v) Na2CO3 em água destilada.
Solução B: 1% (w / v) CuSO4& middot5H2O em água destilada.
Solução C: tartarato de sódio e potássio a 2% (p / v) em água destilada.
2. NaOH 2N .
3. Reagente de folin (comercialmente disponível). Diluir 1: 2 em H2O antes de usar.
4. Padrões : Use uma solução estoque de proteína padrão (por exemplo, fração de albumina de soro bovino V) contendo 4 mg / mL de proteína em água destilada armazenada congelada a -20 e degC. Prepare os padrões diluindo a solução estoque com água destilada da seguinte forma:

solução de estoque, ul 0 1,25 2,5 6,25 12,5 25 62,5 125 250
água, ul 500 499 498 494 488 475 438 375 250
Prot.conc., Ug / ml 0 10 20 50 100 200 500 1000 2000

1. A 0,2 mL de amostra ou padrão, adicione 1 mL de reagente formador de complexo recém-misturado. Deixe a solução em temperatura ambiente por 10 min

2. Adicione 0,1mL de reagente de Folin diluído, usando um misturador de vórtice e deixe a mistura em temperatura ambiente por 30-60 min (não exceda 60 min)

3. Leia a absorbância a 750 nm se a concentração de proteína estiver abaixo de 500 µg / mL ou a 550 nm se a concentração de proteína estiver entre 100 e 2.000 µg / mL.

4. Trace uma curva padrão de absorbância em função da concentração inicial de proteína e use-a para determinar as concentrações desconhecidas de proteína.

1. Se a amostra estiver disponível como um precipitado, dissolva o precipitado em NaOH 2N.

2. Peterson descreveu uma etapa de precipitação que permite a separação da amostra de proteína de substâncias interferentes e também consequentemente concentra a amostra de proteína, permitindo a determinação de proteínas em solução diluída. A etapa de precipitação de Peterson é a seguinte:
uma. Adicione 0,1 mL de desoxicolato 0,15% a 1,0 mL da amostra de proteína.
b. Vortex e deixe em temperatura ambiente por 10 min.
c. Adicionar 0,1 mL de 72% TCA, vortex e centrifugar a 10.000 rpm por 30 min.
d. Decante o sobrenadante e, em seguida, dissolva o sedimento em NaOH 2N.

3. A reação é muito dependente do pH e, portanto, é importante manter o pH entre 10 e 10,5. Portanto, tome cuidado ao analisar amostras que estão em um buffer forte fora dessa faixa.

4. O período de incubação não é crítico e pode variar de 10 min a várias horas sem afetar a absorbância final.

5. A etapa Vortex é crítica para a obtenção de resultados reproduzíveis. O reagente de Folin é reativo apenas por um curto período de tempo sob essas condições alcalinas, sendo instável em álcali, e deve-se tomar muito cuidado para garantir uma mistura completa.

6. O ensaio não é linear em concentrações mais altas. Portanto, certifique-se de que está analisando sua amostra na parte linear da curva de calibração.

7. É necessário um conjunto de padrões com cada grupo de ensaios, de preferência em duplicado. Desconhecidos duplicados ou triplicados são recomendados.

8. Uma desvantagem do método de Lowry é o fato de que várias substâncias interferem neste ensaio, incluindo tampões, drogas, ácidos nucléicos e açúcares. Em muitos casos, os efeitos desses agentes podem ser minimizados diluindo-os, assumindo que a concentração de proteína é suficientemente alta para ainda ser detectada após a diluição. Quando compostos interferentes estão envolvidos, é, obviamente, importante executar um branco apropriado. A interferência causada por detergentes, sacarose e EDTA pode ser eliminada pela adição de SDS. A melhor alternativa neste caso é fazer Lowry-TCA (consulte Protocolos de precipitação de proteínas) ou Peterson.

9. Foram relatadas modificações neste ensaio básico que aumentam a sensibilidade da reação. Se o reagente de Folin for adicionado em duas porções, agitando em vórtex entre cada adição, um aumento de 20% na sensibilidade é obtido. A adição de ditiotreitol 3 min após a adição do reagente de Folin aumenta a sensibilidade em 50%.

10. A quantidade de cor produzida neste ensaio por qualquer proteína (ou mistura de proteínas) depende da composição de aminoácidos da (s) proteína (s) (ver Introdução). Portanto, duas proteínas diferentes, cada uma, por exemplo, em concentrações de 1 mg / mL, podem dar rendimentos de cores diferentes neste ensaio. Deve ser apreciado, portanto, que usar BSA (ou qualquer outra proteína para esse assunto) como um padrão dá apenas uma medida aproximada da concentração de proteína. O único momento em que este método fornece um valor absoluto para a concentração de proteína é quando a proteína que está sendo analisada também é usada para construir a curva padrão. A maneira mais precisa de determinar a concentração de qualquer solução de proteína é a análise de aminoácidos.

Reagentes de interferência para Lowry

Muitos detergentes, ureia, guanidina HCl, sacarose elevada, sulfato de amônio, & gt0.1M TrisHCl, & gt1MNa acetato ou fosfato de Na, EDTA, agentes redutores, etc.


Problema com a precipitação de sulfato de amônio - O que devo fazer? (17 / abr / 2004)

Talvez tente uma simples filtração em gel (tamanho) para purificar sua proteína.

estou trabalhando com uma proteína de múltiplos domínios. não se liga a nenhuma coluna de afinidade, troca iônica ou hidrofóbica. então eu tentei sulfato de amônio pptn. após a precipitação, a proteína torna-se insolúvel e não consigo ressuspendê-la em nenhum tampão e torná-la solúvel. este foi o caso mesmo com um sulfato de amônio de 10-15%.
então mudei para sulfato de zinco em vez de sulfato de amônio. agora eu recebo essa proteína na fração solúvel somente quando diluo muito. quando tento concentrar isso, ele precipita novamente.
agora, quando coloco a proteína em uma coluna de filtração em gel, ela sai muito perto do volume vazio. e além disso, esta fração não é pura de forma alguma.
Alguém pode gentilmente sugerir como purificar essa proteína?

O sulfato de amônio deve se dissolver até 4,1M, portanto, uma solução 4M em água destilada não deve ser problema. Mas normalmente você usa uma solução saturada para misturar com sua solução de proteína, para obter uma porcentagem de sulfato de amônio desejada (ou seja, 1 volume de sulfato de amônio saturado + 1 volume de sua solução de proteína - & gt 50% de precipitação de sulfato de amônio)

Eu estava tentando preparar uma solução de sulfato de amônio 4M para minha precipitação. Estou adicionando água, mas não se dissolve completamente após longas horas de agitação. Alguém pode ajudar fornecendo alguns detalhes sobre como preparar a solução de sulfato de amônio 4M?

caros
Eu produzi a enzima alfa amilase com Bacillus licheniformis
em um volume de 2 litros. O ensaio sobre a atividade da alfa amilase foi feito e estou certo de que ela tem atividade da amilase.
Agora quero concentrar minha enzima com precipitação de sulfato de amônio e compará-la com ultrafiltração, mas em três ensaios que foram feitos até agora não obtive precipitado a 85% de saturação e também nenhum pelete.
como eu acho que deveria ter pelo menos 1 mililitro de precipitante em meus 10-2o ml de minha amostra, mas infelizmente não tenho nenhum precipitante.
estou muito nervosa porque devo terminar meu trabalho prático até dois meses depois. o que devo fazer para este problema. o que você sugere ?
desde já, obrigado

O que você sabe sobre sua proteína? Por exemplo, você conhece o pI? Você pode colocar seu lisado em uma coluna de troca iônica? Isso deve permitir que você se livre de muitas outras proteínas e concentre sua proteína.

Quanto a Aparna, você já tentou a troca iônica no pH & quotwrong & quot? Lembre-se de que o pI calculado é apenas teórico. Sua proteína pode ter patches carregados, o que significa que ela agirá de forma contra-intuitiva com o que os & citados textos & quot; dizem. Você também pode tentar a cromatografia de fase reversa suave.

estou trabalhando com uma proteína de múltiplos domínios. não se liga a nenhuma coluna de afinidade, troca iônica ou hidrofóbica. então eu tentei sulfato de amônio pptn. após a precipitação, a proteína torna-se insolúvel e não consigo ressuspendê-la em nenhum tampão e torná-la solúvel. este foi o caso mesmo com um sulfato de amônio de 10-15%.
então mudei para sulfato de zinco em vez de sulfato de amônio. agora eu recebo essa proteína na fração solúvel somente quando diluo muito. quando tento concentrar isso, ele precipita novamente.
agora, quando coloco a proteína em uma coluna de filtração em gel, ela sai muito perto do volume vazio. e além disso, esta fração não é pura de forma alguma.
Alguém pode gentilmente sugerir como purificar essa proteína?

Você já tentou precipitação com acetona? Funcionou bem para mim.

1. Adicione 4 volumes de acetona gelada
2. Incube por 30 min no gelo ou a -20 ° C
3. Centrifugue por 10 min à velocidade máxima em uma centrífuga de bancada. Descarte o sobrenadante e seque o pellet ao ar.
4. Opcional: Lave o pellet com etanol 100 mikrol gelado e seque ao ar o pellet
5. Ressuspenda o pellet no buffer para aplicação posterior.

kylvalda qual buffer devemos usar no final, para ressuspender o pellet final para a aplicação downstream? (por precipitação de acetona como você sugeriu), obrigado.

Eu só queria perguntar a você, como você sabe que a precipitação de sulfato de amônio funcionará para proteínas com MW acima de 20 kDa?
você tem a literatura sobre isso?
isso me ajudaria, pois trabalho com enzimas que tem MW 5-10 kDa.


Pergunta: Com base nos dados da tabela para purificação de LDH por precipitação de sulfato de amônio Pergunta de resposta Atividade Concentração de extrato não diluído (umol / min * mL) Atividade total (umol / min) Heart Crude 36 5600 40% Pellet 120 2900 40% Sobrenadante 13 1700 70% Pellet 97 1500 70% Sobrenadante 1,5 200 Espera-se que o LDH saia em pastilhas de sulfato de amônio 70%. .

Espera-se que o LDH saia em pellet de sulfato de amônio 70%. Todas as frações (sobrenadante e pellets) serão analisadas. • O ponto real onde o LDH precipita pode variar dependendo da concentração de proteína e da temperatura. Algumas alíquotas serão congeladas, mas não congele as amostras para o ensaio enzimático: armazene-as a 4 ° C. As frações com grande quantidade de atividade de LDH serão combinadas e colocadas em um saco de diálise após completar a precipitação do sulfato de amônio.

Você recuperou a maior parte de sua atividade de LDH no corte de sal esperado (pellet de 70%)?

Em caso afirmativo, chegue a uma conclusão lógica sobre um erro que você poderia ter cometido se sua proteína permanecesse no sobrenadante de 70%.

Se não, onde você encontrou a maior parte do seu LDH e chegou a uma conclusão lógica sobre um erro que você pode ter cometido durante o curso do experimento.


Discussão

A atividade GAD em extratos livres de células de maçã foi regulada por pH e Ca 2+ / CaM

As enzimas GAD são onipresentes em todos os reinos, e nas plantas tanto o acúmulo de transcritos quanto a atividade podem ser induzidos durante o desenvolvimento e em resposta a perturbações de estresse abiótico e biótico [2, 4]. Em plantas submetidas a estresse de temperatura, seca, salinidade ou manuseio mecânico, ocorre um aumento na concentração intracelular de Ca 2+ [19], o que promoveria a estimulação do GAD por Ca 2+ / CaM, enquanto a exposição a elevado CO2, O2 a deficiência e o ferimento influenciam a atividade GAD pela acidificação citosólica em vários tecidos e espécies vegetais [19, 20]. Como foi demonstrado que o GABA se acumula na maçã durante o armazenamento em atmosfera controlada, e este nível é maior durante o tratamento prolongado com CO elevado2[12-14], formulamos a hipótese de que a atividade GAD da maçã é estimulada pela acidificação citosólica e / ou Ca 2+ / CaM. A atividade GAD de extratos livres de células de maçã apresentou atividade ótima em pH 5,5 na presença de PLP e glutamato saturante (Tabela 1), a atividade específica final é comparável a em vitro atividades de tecidos vegetativos de petúnia, soja, Arabidopsis e Mudas de pinheiro-bravo [1]. A atividade GAD da maçã foi mais dramaticamente estimulada por Ca 2+ / CaM em pH próximo ao fisiológico do que em pH ácido (Tabela 1), indicando que pode ser regulada in planta por Ca 2+ / CaM e pH. Como não houve efeito do anatagonista CaM, TFP, sobre em vitro Atividade GAD, sugere-se que GAD não foi ligado com CaM endógeno e a ligação de Ca 2+ / CaM a GAD é rigidamente controlada por parâmetros específicos de estresse de atmosfera controlada. No geral, as propriedades bioquímicas da atividade GAD em extratos livres de células de maçã fornecem suporte para a existência de um GAD regulado por Ca 2+ / CaM, como é típico da maioria das plantas [1]. Notavelmente, três homólogos GAD genes (arquivo adicional 1: Figura S1), designados como MdGAD1, MdGAD2 e MdGAD3, estavam presentes na planta da maçã (Figura 2). MdGAD1, gostar AtGAD2, era abundante e onipresente, enquanto MdGAD2 e MdGAD3, gostar AtGAD3 e AtGAD4, foram expressos em níveis muito mais baixos e podem ser candidatos para indução em frutas pelos estresses (ou seja, resfriamento, O2 deficiência e CO elevado2) imposto durante o armazenamento em atmosfera controlada (Figura 2) [2, 3].

GADs recombinantes de maçã eram dependentes de CaM e independentes de CaM

Com nossas estratégias de marcação / purificação, pudemos confirmar que o recombinante NoGAD1 é ativado em pH fisiológico por Ca 2+ / CaM quer a etiqueta 6-His tenha sido retida ou não durante o ensaio de atividade e propriedades espectrais (Figuras 3 e 4). No entanto, o grau de ativação parece ser maior com a forma recombinante da proteína nativa, o que pode ser atribuído à atividade muito baixa encontrada na ausência de Ca 2+ / CaM. Embora essa interpretação seja um pouco complicada pela quantidade variável de uma proteína contaminante menor, provavelmente um produto de degradação, na preparação final da proteína, essas descobertas sugerem que a interpretação do impacto de Ca 2+ / CaM na conformação e atividade biológica de GADs de plantas recombinantes devem ser feitos com cautela [11].

Aqui, as versões com ou sem marca de His dos três GADs da maçã foram expressas em Escherichia coli e purificado até a homogeneidade ou quase homogeneidade (arquivo adicional 2: Figura S2). A subunidade prevista M r das três proteínas recombinantes da maçã (56,6-57 kDa) é semelhante à maioria dos GADs vegetais, que existem como hexâmeros de subunidades de 43-62 kDa [1]. Os GADs de maçã recombinantes exibiram um perfil de pH semelhante ao mostrado para a atividade de GAD nos extratos livres de células de maçã (Tabela 1, Figura 3), bem como um pH ótimo semelhante com a maioria dos GADs de plantas e atividades com Ca 2 + / CaM em pH fisiológico tão ou mais alto que suas atividades máximas na literatura [1]. Ao contrário da maioria dos GADs de planta, MdGAD3 não foi ativado por Ca 2+ / CaM em pHs próximos aos fisiológicos, embora a técnica / ensaio usado neste estudo foi claramente capaz de demonstrar tal relação (Tabela 1, Figuras 3 e 4). Historicamente, a ligação de CaM ao domínio C-terminal conservado foi considerada necessária para aliviar a autoinibição de GAD em pH fisiológico [1]. Contudo, OsVerificou-se que GAD2 (Figura 1) é independente de CaM e possui uma região C-terminal que é autoinibitória [5]. MdGAD3 é apenas o segundo GAD de planta relatado que não pode ser purificado por cromatografia de afinidade com CaM e cuja atividade e propriedades espectrais não são afetadas por Ca 2+ / CaM. Notavelmente, MdGAD3 é a primeira planta GAD que possui uma região C-terminal que não é autoinibitória (Figura 3).

Alinhamento da região C-terminal de MdGAD1 e MdGAD2 com GADs vegetais caracterizados bioquimicamente demonstraram que os principais resíduos de CaMBD são conservados nas enzimas da maçã, e que estes estão ausentes em OsGAD2 (Figura 1). O triptofano bem conservado e um par de resíduos de lisina na extremidade C-terminal são cruciais para as interações com CaM e a formação de oligômeros de alto peso molecular em PhGAD e NoGAD1 [9, 16, 21, 22]. Em comparação com GADs de plantas conhecidos por serem estimulados por Ca 2+ / CaM, MdGAD3 está faltando duas regiões flanqueadoras carregadas positivamente (Lys474-Lys475 e Lys496-Lys497) e o motivo Trp488-Lys489-Lys490-Phe491-Tyr492 (Figura 1). A sua substituição por resíduos não conservados pode explicar a falta de estimulação de Ca 2+ / CaM do recombinante MdGAD3. Curiosamente, quase todos os resíduos de ligação de CaM em GADs vegetais são conservados em MdGAD1 e MdGAD2, as principais exceções em que a carga não é conservada são as substituições em Lys474 e Lys 490 em MdGAD1 e Lys497 em MdGAD2 (Figura 1).


J64419 Sulfato de amônio, ultrapuro, 99 +%

O sulfato de amônio é um reagente amplamente utilizado em biologia molecular e cromatografia. É útil no isolamento e purificação de enzimas e proteínas. É utilizado para a precipitação ou fracionamento de proteínas ou para purificação de anticorpos. Também é útil para análise cristalográfica de ácidos nucléicos e proteínas. O sulfato de amônio também é amplamente utilizado em HPLC de proteínas, como na cromatografia de interação hidrofóbica. O sulfato de amônio é usado em tampão de PCR longo, em solução de lise de PCR e na síntese de cDNA de segunda cadeia. Também é usado para a análise de fosfolipídios por HPLC.

Примечания

Ссылки на литературу

Gilad Haran. Rivka Cohen. Liliana K Bar. Yechezkel Barenholz. Gradientes de sulfato de amônio transmembrana em lipossomas produzem aprisionamento eficiente e estável de bases fracas anfipáticas. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranas. 1993, 1151 (2), 201-215.

Tage Astrup. Sten Mullertz. O método da placa de fibrina para estimar a atividade fibrinolítica. Arquivos de Bioquímica e Biofísica. 1952, 40 (2), 346-351.

Фразы опасности и предосторожности СГС

Фразы опасности (ЕС): H303

Pode ser perigoso se engolido.

Фразы предосторожности: P270-P301 + P312-P403-P501c

Não coma, beba ou fume ao usar este produto. EM CASO DE INGESTÃO: Ligue para um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou médico / médico se não se sentir bem. Armazene em local bem ventilado. Descarte o conteúdo / recipiente em uma estação aprovada de eliminação de resíduos


Discussão

Estudos recentes mostraram que os interferons do tipo III (IFNs) possuem atividades biológicas semelhantes aos IFNs do tipo I. O IFN-λ pode inibir a replicação da hepatite B em células humanas [13] e tem um efeito semelhante ao IFN-α em pacientes com o vírus da hepatite C (HCV) [14]. O IFN tipo III pode inibir muitos outros tipos de vírus, incluindo o vírus herpes simplex (HSV) [15] e o citomegalovírus (CMV) [16], de forma semelhante ao IFN tipo I. O IFN tipo III também participa da resposta imune adquirida [17] e pode inibir células cancerosas com potencial para aplicação clínica [15].

IFN-λR1, que é um IFN tipo III estritamente expresso por certos tipos de células epiteliais e subconjuntos específicos de células imunes, tem uma subunidade de receptor diferente de suas contrapartes de IFN tipo I [18]. Isso significa que a terapia com IFN-λ pode causar menos efeitos colaterais do que a terapia com IFN-α, que geralmente causa efeitos colaterais intoleráveis. Um estudo de terapia de HCV indicou que o IFN-λ1 peguilado possuía atividade antiviral semelhante ao IFN-α2b peguilado, mas com menos efeitos colaterais [19]. Além disso, a característica de expressão restrita ao tecido do receptor de IFN-λ torna o IFN-λ1 um candidato promissor para aplicação clínica, especialmente para algumas doenças do tecido epitelial nos tratos respiratório, gastrointestinal e reprodutivo. Por exemplo, há evidências de que o sistema IFN tipo III desempenha um papel importante no tratamento da asma [20].

Nosso sistema de expressão em células CHO expressou rhIFN-λ1 estável e continuamente. As células Flp-In-CHO contêm o mesmo local FRT cromossômico que o vetor, portanto, quando o pDF-IFN-λ1 recombinante e o plasmídeo auxiliar pOG44 são co-transfectados em células Flp-In-CHO, a recombinase flp codificada por pOG44 pode mediar homólogos recombinação entre o gene exógeno e o DNA do hospedeiro, resultando em expressão estável. Aqui, precipitação com sulfato de amônio e três etapas de cromatografia foram usadas para purificar a proteína alvo porque rhIFN-λ1 não foi fundido a uma etiqueta para purificação. Isso ocorre porque as drogas de proteína recombinante para uso clínico não devem possuir uma etiqueta. A proteína purificada possuía alta atividade antiviral. Além disso, o sistema de expressão de CHO fornece glicosilação pós-tradução semelhante à encontrada na proteína humana endógena [21]. Esses resultados estabelecem a base para o desenvolvimento de um rhIFN-λ1 que pode ser aplicado clinicamente.


Assista o vídeo: Equilíbrio solubilidade 4 Separação de íons por reações de precipitação Grupo 2 (Novembro 2021).