Em formação

7.6: Reparo de DNA - Biologia


Definido estritamente, o mecanismo de reparo mais simples não usa uma enzima. Desalquilação ou remoção de grupos alquil (como -CH3 ou —C2H5) envolve apenas a transferência de um grupo alquil de uma O6-metilguanina ou O6-etilguanina para O6-alquilguanil-DNA alquiltransferase. Apesar do nome, a alquiltransferase não é realmente uma enzima, pois é permanentemente alterada e inativada pela reação e, portanto, não se enquadra na definição de catalisador. Observe que isso não corrige a alquilação em N7 ou outros locais, apenas os ligados ao O6.

O próximo mecanismo de reparo mais simples é o desacoplamento dos dímeros de pirimidina ciclobutil. Isso pode ser realizado por meio da atividade do DNA fotoliase, também conhecido como enzimas fotoreativantes. Estes são nomeados não apenas porque a formação dos dímeros de pirimidina ciclobutil é geralmente devido à exposição à luz ultravioleta, mas porque as próprias enzimas de reparo requerem exposição à luz (300-500 nm, perto do UV ao azul visível) para catalisar a reação de quebra do dímero .

Mais especificamente, as fotolases de DNA (uma proteína de ~ 60kD) estão associadas de forma não covalente a um cromóforo (N5, N10-metileniltetrahidrofolato ou 5-deazaflavina) e um FADH—. A fotoliase liga-se ao dímero de pirimidina ciclobutil de DNA de fita simples ou dupla de uma maneira independente da luz e da sequência. No entanto, ele não catalisa nenhuma mudança na ligação até que a luz seja absorvida pelo cromóforo, que então transfere a energia para o FADH—, fazendo com que ele ejete um elétron para o dímero, quebrando-o.

Enquanto a desalquilação e a lise do dímero são processos relativamente simples que fazem apenas uma mudança sutil no DNA, os mecanismos de reparo por excisão são mais complicados e requerem várias etapas enzimáticas para serem concluídos. Quando uma lesão pequena (não estericamente volumosa) é limitada a uma única base, seja ausente na depurinação ou formada incorretamente devido à desaminação ou incorporação incorreta, o processo conhecido como reparo de excisão de base (BER) está engajado. Conforme ilustrado na Figura ( PageIndex {20} ), se uma base não convencional for reconhecida, ela é então removida por um apropriado Glicosilase de DNA. No momento (pesquisa no Genbank, julho de 2009), existem pelo menos 8 genes específicos que codificam glicosilases de DNA humano, embora três codifiquem glicosilases que reconhecem uracila em várias situações. Uma vez que a base foi removida pela glicosilase, uma endonuclease é alistada para quebrar as ligações fosfodiéster que retêm a fosfodesoxirribose agora vazia. A lacuna resultante no DNA é preenchida por uma DNA polimerase e, finalmente, a fita é reconectada pela DNA ligase.

No caso de lesões volumosas que alteram significativamente a apresentação física do DNA às polimerases e outras enzimas que processam o DNA, um tipo diferente de processo de reparo está envolvido. Reparo por excisão de nucleotídeo (NER), talvez melhor denominado poliO reparo por excisão de nucleotídeos envolve a remoção da lesão, bem como alguns dos nucleotídeos nas vizinhanças imediatas. Existem dois iniciadores principais de NER: ou uma porção não transcricionalmente ativa do DNA é digitalizada por XPC (Figura ( PageIndex {21} ) A), que reconhece uma lesão volumosa e recruta o complexo de reparo, ou como um gene está sendo transcrito, a RNA polimerase corre para uma lesão e, em seguida, recruta o complexo de reparo via CSA e CSB (Figura ( PageIndex {21} ) F e G). Se a detecção for por meio de XPC, um dos primeiros fatores de reparo recrutados para o site é o fator de transcrição IIH / XPB / XPD, que é uma helicase de DNA (Figura ( PageIndex {21} ) B). Este tipo de detecção de genoma global é ineficiente e relativamente lento, mas fornece um nível basal de verificação de erros para todo o DNA. No caso do DNA sendo transcrito, o complexo de RNA polimerase já inclui TFIIH, do qual XPB e XPD fazem parte. Essa detecção direcionada por transcrição é mais eficiente e tem como alvo as partes do DNA mais utilizadas em uma determinada célula. Na próxima etapa (Figura ( PageIndex {21} ) C), XPG, associado a BRCA1 / 2, e XPF, associado a ERCC1, extirpam uma parte da fita afetada, incluindo, mas não se limitando à própria lesão. A DNA polimerase δ ou ε pode então adicionar ao 3’OH livre para preencher a lacuna com base na sequência de fita complementar (Figura ( PageIndex {21} ) D). Finalmente, o reparo é conectado em sua extremidade 3 'ao resto da fita pela DNA ligase (Figura ( PageIndex {21} ) E).

O "XP" em XPC, XPB, XPD e os outros na Figura ( PageIndex {21} ) se refere a xeroderma pigmentosa, outra doença autossômica recessiva, cuja principal característica é a formação de carcinomas de pele em uma idade jovem . Como o NER é a principal forma de reparo do dímero de pirimidina (além das fotolases), sua interrupção por mutações em um ou mais genes XP leva a extrema sensibilidade às lesões induzidas por UV. Os indivíduos afetados devem minimizar a exposição ao sol. O nome da doença vem das lesões pigmentadas características (ceratoses) que costumam se formar na pele quando expostas ao sol.

CSA e CSB são nomeados para a síndrome de Cockayne, uma doença autossômica recessiva do envelhecimento. Mutações em qualquer um dos genes podem causar o distúrbio, que é caracterizado por envelhecimento prematuro, crescimento retardado, fotossensibilidade e defeitos de desenvolvimento do sistema nervoso. Presumivelmente, eliminar a capacidade de reparo do DNA de CSA ou CSB leva ao rápido acúmulo de danos, à incapacidade de transcrever os genes necessários e, eventualmente, à morte celular.

Uma espécie de variação do NER é o sistema de reparo de incompatibilidade (MMR). Isso é mais bem compreendido em procariontes: em E. coli, MutS é uma pequena proteína que forma homodímeros em locais de incompatibilidade. Os dímeros MutS recrutam duas proteínas MutL, cada uma das quais interage com uma das unidades MutS. Cada complexo MutS / MutL empurra o DNA para dentro, formando um loop com a incompatibilidade no centro do loop. Isso continua até que um dos complexos MutS / MutL encontre um hemimetilado Sequência GATC. Isso causa o recrutamento de MutH, uma endonuclease altamente especializada que cria um entalhe de fita simples na espinha dorsal da fita não metilada. Isso fornece uma abertura para a exonuclease I 3'-5 'ou a exonuclease VII 5'-3' (ou RecJ) para degradar a fita do entalhe ao ponto de incompatibilidade. Isso é então, como você deve ter adivinhado, preenchido pela DNA polimerase e a estrutura conectada pela ligase. Em eucariotos, vários homólogos para as proteínas MutS e MutL foram descobertos e o processo é semelhante, mas não claramente compreendido ainda, uma vez que nenhum homólogo para MutH foi ainda descoberto.

Lembre-se disso em E. coliAs metiltransferases Dam eventualmente metilam o DNA como um método de proteção de seu genoma, mas o DNA recém-sintetizado não é metilado. Assim, a suposição é que a fita metilada contém a base original e correta, enquanto a incompatibilidade é devido à incorporação incorreta na fita mais recente.

Outro sistema de reparo de DNA procariótico é a resposta SOS. Conforme ilustrado na Figura ( PageIndex {23} ) abaixo, se não houver dano, RecA está inativo, então a proteína LexA pode reprimir a produção de mais proteínas de reparo SOS. No entanto, se houver dano, as proteínas RecA se ligam ao DNA de fita simples e são ativadas. Eles, por sua vez, clivam o repressor LexA, permitindo a produção de vários genes de reparo de DNA.

Até agora, os reparos foram baseados na suposição de que uma lesão afeta apenas um fio, e o outro fio pode fornecer um modelo confiável para efetuar reparos sem a perda de informações. Infelizmente, nem sempre é o caso, e algumas lesões e processos de reparo necessariamente levam à perda da sequência. Quando ocorre uma quebra de fita dupla, talvez como produto de radiação ionizante, o mecanismo de reparo mais comum é conhecido como junção de extremidade não homóloga (NHEJ). As extremidades de fita dupla são primeiro reconhecidas por Ku, uma proteína circular heterodimérica que se liga às extremidades do DNA. Ku então recruta a quinase DNA-PKCS. O DNA-PKCS atua como uma ponte para unir as duas extremidades, e uma ligase de DNA pode então unir as duas extremidades. Se as fitas foram quebradas em locais diferentes, resultando em saliências de fita simples complementares em cada extremidade (como aquelas geradas por algumas endonucleases de restrição), então o reparo é muitas vezes perfeito, uma vez que as sequências complementares alinham as duas extremidades corretamente em suas posições originais. No entanto, se as extremidades da fita já foram influenciadas pelas nucleases e não são mais complementares, então a junção das extremidades provavelmente levará à perda de informações. Em algumas partes do DNA, isso teria pouco efeito, mas se acontecesse dentro de um gene, o produto do gene mutado poderia ter função anormal ou comprometida.


7 alimentos que revertem os danos ao DNA

Ter bons genes não depende apenas da sorte. Embora você possa estar preso aos olhos castanhos e à estrutura esguia de sua mãe, muitos ficam surpresos ao saber que nem todo DNA é não editável. A epigenética - o estudo de como fatores externos alteram o DNA ao ligar e desligar genes - nos mostra exatamente como nossas dietas podem impactar nossos códigos genéticos.

"'O que você come e não come pode influenciar quais genes são ativados e quando'", disse Kevin L. Schalinske, Ph.D., professor do Departamento de Ciência dos Alimentos e Nutrição Humana da Iowa State University a David Zinczenko em Dieta Zero Barriga. "'Comer alimentos errados, deficiências na dieta e escolhas de estilo de vida, como fumar, podem ligar as coisas.'"

Portanto, em vez de danificar seu DNA fumando tabaco, tomando banho de sol excessivamente ou estocando alimentos processados, você pode modificar seus hábitos para melhorar sua composição genética e, como resultado, potencialmente prevenir doenças crônicas como diabetes, obesidade e Alzheimer.

Sim, você leu corretamente: a mão genética que você recebeu ao nascer não é o seu destino.

Portanto, em vez de desejar ter ganhado na loteria do gene, você pode começar reformulando sua lista de compras. Certos alimentos, como os que compilamos a seguir, foram cientificamente comprovados para prevenir e reparar danos ao DNA causados ​​por muitos desses maus hábitos que fazem você engordar. Dê uma olhada nesses alimentos que revertem os danos ao DNA, junte-os para o jantar e ponha de lado os maus hábitos - e você estará a caminho de genes mais saudáveis, uma dupla hélice de cada vez.


Química e biologia do ensino médio e BIOC300.1x OU compreensão e conhecimento da estrutura e função da proteína

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Sobre este curso

O DNA codifica nossa informação genética e é transmitido dentro das células para manter os organismos vivos e produzir a próxima geração. O reconhecimento do DNA como o material genético e a consequente identificação de sua estrutura e mecanismo de codificação foram revolucionários e fundamentais. Essas descobertas levaram à integração transformacional entre as ciências biológicas com um entendimento comum desta unidade fundamental da vida! Junte-se a esta exploração da estrutura, embalagem, replicação e manipulação do DNA.

O curso utiliza aulas em vídeo, artigos de pesquisa, estudos de caso e modelos moleculares para transmitir informações. A nota do curso será baseada em perguntas com cada aula de vídeo, questionários, trabalhos de casa e um exame final.

Más información sobre este curso

Lo que aprenderás

  • Métodos que identificaram o DNA como o material genético
  • Estrutura do DNA e métodos para empacotar o DNA na célula
  • Impactos do empacotamento na expressão de DNA em organismos superiores e passagem de informações sem alteração no DNA (epigenética)
  • Expressão de DNA específica de localização na célula
  • Máquinas para replicar DNA com uma taxa de erro extremamente baixa
  • Local de origem e tempo para a replicação do DNA
  • Mecanismos para "preservar" as extremidades do DNA linear
  • Tipos de danos que afetam a estrutura do DNA e como o DNA se move
  • Procedimentos para amplificar sequências de DNA e para determinar a sequência de bases
  • Enzimas para fragmentar o DNA em segmentos específicos que podem ser separados
  • Métodos para recombinar segmentos de DNA de diferentes fontes
  • Maneiras de introduzir DNA recombinado em células, incluindo células humanas

Ampliar lo que aprenderás

Plan de estudios

Composto por apenas quatro monômeros, o DNA serve como o material genético dos organismos vivos. Exploramos como o DNA foi identificado como material genético, revisamos as características e a estrutura do DNA, examinamos as informações codificadas nesta interessante macromolécula e exploramos as implicações das variações no tamanho e na sequência do DNA.

Aula 2: Organização do DNA

Exploramos como o DNA é organizado, empacotado e organizado dentro da célula. Examinamos a arquitetura da cromatina, como a cromatina é modificada pelas histonas e como a epigenética pode afetar a expressão do gene.

Aula 3: Replicação de DNA I

Exploramos os mecanismos pelos quais o DNA é copiado e as complicações que surgem devido à construção assimétrica do DNA em relação às suas extremidades 3 'e 5'. Nós examinamos a natureza dinâmica das proteínas de replicação e a especificidade requintada com a qual essas proteínas podem catalisar reações bioquímicas essenciais e como a atividade enzimática pode ser regulada dentro do contexto mais amplo da célula.

Aula 4: Replicação de DNA II

Nós exploramos mais a maquinaria de replicação que permite a coordenação da síntese de fita principal e tardia durante a replicação do DNA, uma característica da replicação de DNA procariótica e eucariótica. Examinamos o início da replicação do DNA nas origens da replicação. Também discutimos o envolvimento de nucleossomos e histonas neste processo, que é uma característica única do DNA eucariótico. Também examinamos a determinação da replicação do DNA e o envolvimento da telomerase na solução de um problema único de replicação eucariótica do DNA: o encurtamento das extremidades cromossômicas durante a replicação do DNA.

Aula 5: Manipulação de DNA

Examinamos a manipulação do DNA. A célula pode restaurar (ou às vezes alterar) o DNA, reparando danos de uma variedade de fontes ambientais. O reparo de quebras de fita dupla inclui recombinação (ou troca de sequências de DNA entre dois dsDNAs diferentes). Examinamos métodos de amplificação, análise, "clonagem" e sequenciamento de DNA. Essas formas de "manipulação" do DNA empregam enzimas e propriedades funcionais que discutimos. Nossa capacidade cada vez mais eficiente e econômica de sequenciar e recombinar fragmentos de DNA transformou as ciências biológicas e biomédicas, e ainda há muito a ser descoberto!


Reparo e regeneração

A restauração da função normal do tendão após a lesão requer o restabelecimento das fibras do tendão e do mecanismo de deslizamento entre o tendão e suas estruturas circundantes.24, 25, 26 O estágio inicial do reparo envolve a formação de tecido cicatricial que fornece continuidade no local da lesão 27 no entanto, falta de estímulo mecânico no tendão causará a proliferação de tecido cicatricial e subsequentes aderências que são indesejáveis ​​e prejudiciais porque impedem a função normal do tendão, particularmente em


71 Reparo de DNA

Ao final desta seção, você será capaz de fazer o seguinte:

A replicação do DNA é um processo altamente preciso, mas ocasionalmente podem ocorrer erros, como a inserção da DNA polimerase em uma base errada. Erros não corrigidos às vezes podem levar a consequências sérias, como câncer. Mecanismos de reparo corrigem os erros. Em casos raros, os erros não são corrigidos, levando a mutações; em outros casos, as próprias enzimas de reparo sofrem mutação ou são defeituosas.

A maioria dos erros durante a replicação do DNA é prontamente corrigida pela capacidade de revisão da própria DNA polimerase. ((Figura)). Na revisão, o DNA pol lê a base recém-adicionada antes de adicionar a próxima, para que uma correção possa ser feita. A polimerase verifica se a base recém-adicionada foi emparelhada corretamente com a base na fita do molde. Se for a base certa, o próximo nucleotídeo é adicionado. Se uma base incorreta for adicionada, a enzima faz um corte na ligação fosfodiéster e libera o nucleotídeo errado. Isto é realizado pela ação de exonuclease 3 & # 8242 do DNA pol. Uma vez que o nucleotídeo incorreto foi removido, ele pode ser substituído pelo correto.


Alguns erros não são corrigidos durante a replicação, mas, em vez disso, são corrigidos após a conclusão da replicação; esse tipo de reparo é conhecido como reparo de incompatibilidade ((Figura)). Enzimas de reparo específicas reconhecem o nucleotídeo emparelhado incorretamente e excisam parte da fita que o contém; a região excisada é então ressintetizada. Se a incompatibilidade permanecer sem correção, pode levar a danos mais permanentes quando o DNA incompatível for replicado. Como as enzimas de reparo incompatíveis reconhecem qual das duas bases é a incorreta? No E. coli, após a replicação, a base nitrogenada adenina adquire um grupo metil - a fita de DNA parental terá grupos metil, enquanto a fita recém-sintetizada não os possui. Assim, a DNA polimerase é capaz de remover as bases incorretamente incorporadas da fita não metilada recém-sintetizada. Em eucariotos, o mecanismo não é muito bem compreendido, mas acredita-se que envolva o reconhecimento de cortes não selados na nova fita, bem como uma associação contínua de curto prazo de algumas das proteínas de replicação com a nova fita filha após a conclusão da replicação .


Outro tipo de mecanismo de reparo, o reparo por excisão de nucleotídeos, é semelhante ao reparo de incompatibilidade, exceto que é usado para remover bases danificadas em vez de bases incompatíveis. As enzimas de reparo substituem as bases anormais fazendo um corte nas extremidades 3 & # 8242 e 5 & # 8242 da base danificada ((Figura)). O segmento de DNA é removido e substituído pelos nucleotídeos emparelhados corretamente pela ação do DNA pol. Uma vez que as bases são preenchidas, a lacuna restante é selada com uma ligação fosfodiéster catalisada pela DNA ligase. Este mecanismo de reparo é frequentemente empregado quando a exposição aos raios ultravioleta causa a formação de dímeros de pirimidina.


Um exemplo bem estudado de erros que não foram corrigidos é visto em pessoas que sofrem de xeroderma pigmentosa ((Figura)). Os indivíduos afetados têm uma pele altamente sensível aos raios ultravioleta do sol. Quando os indivíduos são expostos à luz ultravioleta, formam-se dímeros de pirimidina, principalmente os de timina, as pessoas com xerodermia pigmentosa não são capazes de reparar os danos. Estes não são reparados devido a um defeito nas enzimas de reparo por excisão de nucleotídeos, enquanto em indivíduos normais, os dímeros de timina são excisados ​​e o defeito é corrigido. Os dímeros de timina distorcem a estrutura da dupla hélice do DNA, e isso pode causar problemas durante a replicação do DNA. Pessoas com xeroderma pigmentosa podem ter um risco maior de contrair câncer de pele do que aqueles que não têm a doença.


Erros durante a replicação do DNA não são a única razão pela qual surgem mutações no DNA. Mutações, variações na sequência de nucleotídeos de um genoma, também podem ocorrer por causa de danos ao DNA. Essas mutações podem ser de dois tipos: induzidas ou espontâneas. Mutações induzidas são aquelas que resultam de uma exposição a produtos químicos, raios UV, raios X ou algum outro agente ambiental. As mutações espontâneas ocorrem sem qualquer exposição a qualquer agente ambiental, são o resultado de reações naturais que ocorrem dentro do corpo.

As mutações podem ter uma ampla gama de efeitos. Mutações pontuais são aquelas mutações que afetam um único par de bases. As mutações de nucleotídeos mais comuns são as substituições, nas quais uma base é substituída por outra. Essas substituições podem ser de dois tipos, transições ou transversões. A substituição de transição refere-se a uma purina ou pirimidina sendo substituída por uma base do mesmo tipo, por exemplo, uma purina como a adenina pode ser substituída pela purina guanina. Substituição de conversão refere-se a uma purina sendo substituída por uma pirimidina, ou vice-versa, por exemplo, citosina, uma pirimidina, é substituída por adenina, uma purina. Algumas mutações pontuais não são expressas, são conhecidas como mutações silenciosas. Mutações silenciosas geralmente são devidas a uma substituição na terceira base de um códon, que freqüentemente representa o mesmo aminoácido que o códon original. Outras mutações pontuais podem resultar na substituição de um aminoácido por outro, o que pode alterar a função da proteína. Mutações pontuais que geram um códon de parada podem encerrar uma proteína precocemente.

Algumas mutações podem resultar em um número maior de cópias do mesmo códon. Elas são chamadas de expansões de repetição de trinucleotídeos e resultam em regiões repetidas do mesmo aminoácido. As mutações também podem ser o resultado da adição de uma base, conhecida como inserção, ou da remoção de uma base, também conhecida como deleção. Se uma inserção ou exclusão resultar na alteração do quadro de leitura translacional (uma mutação de deslocamento de quadro), a proteína resultante geralmente não é funcional. Às vezes, um pedaço de DNA de um cromossomo pode ser translocado para outro cromossomo ou para outra região do mesmo cromossomo, isso também é conhecido como translocação. Esses tipos de mutação são mostrados na (Figura).


Uma mutação de frameshift que resulta na inserção de três nucleotídeos é freqüentemente menos deletéria do que uma mutação que resulta na inserção de um nucleotídeo. Porque?

Sabe-se que mutações em genes de reparo causam câncer. Muitos genes de reparo mutados foram implicados em certas formas de câncer de pâncreas, câncer de cólon e câncer colorretal. As mutações podem afetar células somáticas ou células germinativas. Se muitas mutações se acumulam em uma célula somática, elas podem levar a problemas como a divisão celular descontrolada observada no câncer. Se ocorrer uma mutação nas células germinativas, a mutação será passada para a próxima geração, como no caso da hemofilia e da xeroderma pigmentosa.

Resumo da Seção

A DNA polimerase pode cometer erros ao adicionar nucleotídeos. Ele edita o DNA revisando cada base recém-adicionada. As bases incorretas são removidas e substituídas pela base correta antes de prosseguir com o alongamento. A maioria dos erros é corrigida durante a replicação, embora, quando isso não acontece, o mecanismo de reparo de incompatibilidade seja empregado. As enzimas de reparo incompatíveis reconhecem a base incorretamente incorporada e a extirpam do DNA, substituindo-a pela base correta. Em ainda outro tipo de reparo, o reparo por excisão de nucleotídeo, uma base danificada é removida junto com algumas bases nas extremidades 5 & # 8242 e 3 & # 8242, e estas são substituídas pela cópia do modelo com a ajuda da DNA polimerase. As extremidades do fragmento recém-sintetizado são anexadas ao resto do DNA usando DNA ligase, que cria uma ligação fosfodiéster.

A maioria dos erros é corrigida e, caso não o seja, pode resultar em uma mutação, definida como uma mudança permanente na sequência do DNA. As mutações podem ser de vários tipos, como substituição, deleção, inserção e expansões de repetição de trinucleotídeos. Mutações em genes de reparo podem levar a consequências graves, como câncer. As mutações podem ser induzidas ou podem ocorrer espontaneamente.

Perguntas de conexão visual

(Figura) Uma mutação frameshift que resulta na inserção de três nucleotídeos é frequentemente menos deletéria do que uma mutação que resulta na inserção de um nucleotídeo. Porque?

(Figura) Se três nucleotídeos forem adicionados, um aminoácido adicional será incorporado na cadeia da proteína, mas a estrutura de leitura não mudará.

Perguntas de revisão

Durante a revisão, qual das seguintes enzimas lê o DNA?

O mecanismo inicial para reparar erros de nucleotídeos no DNA é ________.

  1. reparo de incompatibilidade
  2. Revisão de DNA polimerase
  3. reparo de excisão de nucleotídeo
  4. dímeros de timina

Um cientista cria larvas de mosca-das-frutas com uma mutação que elimina a função de exonuclease do DNA pol III. Qual previsão sobre a carga mutacional nas moscas-das-frutas adultas tem maior probabilidade de ser correta?

  1. Os adultos com a mutação DNA pol III terão significativamente mais mutações do que a média.
  2. Os adultos com a mutação DNA pol III terão um pouco mais mutações do que a média.
  3. Os adultos com a mutação DNA pol III terão o mesmo número de mutações que a média.
  4. Os adultos com a mutação DNA pol III terão menos mutações do que a média.

Questões de pensamento crítico

Qual é a consequência da mutação de uma enzima de reparo incompatível? Como isso afetará a função de um gene?

As mutações não são reparadas, como no caso da xeroderma pigmentosa. A função do gene pode ser afetada ou pode não ser expressa.

Um adulto com histórico de bronzeamento tem seu genoma sequenciado. O início de uma região codificadora de proteína de seu DNA é ATGGGGATATGGCAT. Se a região codificadora de proteína de um adulto saudável for ATGGGGATATGAGCAT, identifique o local e o tipo de mutação.

Esta é uma mutação de frameshift com uma exclusão de um “A” na 12ª posição da região de codificação.

Glossário


  • Ao analisar dados genômicos de vermes, os cientistas detalharam como as mutações são causadas por uma combinação de danos ao DNA e reparo impreciso
  • Isso mostra que um único agente de dano ao DNA pode gerar uma infinidade de assinaturas mutacionais, dependendo dos mecanismos de reparo envolvidos na correção do dano original
  • A pesquisa pode ajudar a identificar as causas das mutações encontradas nos genomas de pacientes com câncer e indivíduos saudáveis

1 de maio de 2020, Cambridge - Pesquisadores do Instituto Europeu de Bioinformática do EMBL (EMBL-EBI), da Universidade de Dundee e do Instituto Wellcome Sanger analisaram mais de 2700 genomas de C. elegans vermes para melhor compreender as causas das mutações. Suas descobertas, publicadas hoje na Nature Communications, caracterizam como as mutações no DNA resultam da ação combinada de danos ao DNA e mecanismos imprecisos de reparo do DNA.

O DNA de uma célula é constantemente exposto a estresses físicos e químicos - ou genotoxinas - que podem danificá-lo e causar mutações. No entanto, as células têm uma miríade de mecanismos de reparo para consertar lesões de DNA logo após seu surgimento. Ocasionalmente, o processo de reparo restaurador falha, seja cometendo erros extras ou deixando de detectar as lesões de DNA completamente. Isso leva a mutações, que são a causa raiz do câncer.

Muitas genotoxinas, como as encontradas na fumaça do tabaco, foram consideradas como causadoras de um conjunto único de mutações no genoma, reconhecível como um assinatura mutacional. “A detecção de tais assinaturas no câncer permite que os cientistas rastreiem o que causou o dano em primeiro lugar e auxiliam no prognóstico e no tratamento, apontando para certas vulnerabilidades”, explica Nadezda Volkova, recém-graduada em PhD no EMBL-EBI.

No entanto, muitas assinaturas mutacionais observadas em genomas de câncer não parecem estar relacionadas a nenhuma genotoxina única e outras parecem resultar de uma combinação de fatores. Para entender a origem dessas assinaturas, Volkova e colegas testaram os efeitos de mais de 150 combinações de doze genotoxinas em C. elegans vermes cujos mecanismos de reparo do DNA estavam inalterados ou defeituosos. Os cientistas demonstraram experimentalmente que as assinaturas mutacionais resultam de uma ação combinada de danos ao DNA e mecanismos de reparo específicos.

Reparação de DNA e assinaturas mutacionais

“Muitas alterações de DNA que observamos em nosso estudo ocorrem no câncer humano também, mas descobrimos que as assinaturas mutacionais são mais variáveis ​​do que pensávamos anteriormente”, diz Volkova.

Os cientistas descobriram que diferentes tipos de alterações de DNA induzidas pela mesma genotoxina são freqüentemente corrigidas por diferentes vias de reparo de DNA, algumas livres de erros, outras sujeitas a erros. Como resultado, uma única genotoxina pode deixar uma variedade de assinaturas mutacionais em várias taxas, dependendo do processo de reparo.

Embora a maioria dos reparos de DNA evite mutações, também pode causá-las. Por exemplo, Volkova e colegas demonstraram que um mecanismo particular, chamado síntese de translesão, é responsável pela maioria das mutações de base causadas pela exposição à genotoxina como uma troca por mutações mais graves e potencialmente mais deletérias. Embora muitas dessas pequenas mutações possam ser inofensivas, em humanos elas podem aumentar a probabilidade de desenvolver um tumor.

“Na genômica do câncer, há uma expectativa implícita de que, para cada assinatura, pode-se encontrar uma única causa: nossa análise desafia essa expectativa. Por trás de cada padrão, há pelo menos duas incógnitas: o dano que ocorre e a capacidade de reparo da célula ”, diz Moritz Gerstung, líder do grupo EMBL-EBI.

Combinando genômica do câncer e reparo de DNA

Embora os mecanismos moleculares de reparo do DNA estejam muito bem estabelecidos, os tipos exatos e a frequência de mutações que eles podem gerar permaneceram obscuros até que o sequenciamento de alto rendimento entrou em cena.

Este estudo combina o sequenciamento do genoma inteiro com uma tela experimental para entender melhor as causas das assinaturas mutacionais. Os resultados têm implicações potenciais para a pesquisa, diagnóstico e tratamento do câncer.

“Compreender a interação entre o dano e o reparo do DNA ajuda a avaliar melhor o risco de predisposição ao câncer e a entender a resposta ao tratamento do câncer”, disse Bettina Meier, Pesquisadora Associada Sênior da Universidade de Dundee.

As assinaturas mutacionais se tornaram um pilar da análise do genoma do câncer porque podem lançar luz sobre os carcinógenos aos quais as células cancerosas foram expostas e os mecanismos de reparo que foram perturbados.

No entanto, nem todas as assinaturas mutacionais observadas e suas facetas individuais são totalmente compreendidas. Uma abordagem experimental garante que os padrões observados são consequências diretas das condições estabelecidas pelos cientistas. Também ajuda a entender como vários processos de reparo de DNA moldam assinaturas mutacionais em conjunto.

“Demorou anos para gerar todos esses defeitos de reparo C. elegans, para os expor sistematicamente a um painel de genotoxinas e para preparar, sequenciar e analisar o seu DNA. É ótimo ver que o trabalho experimental em C. elegans é diretamente relevante para a interpretação de genomas de câncer ”, diz Anton Gartner, líder de grupo na Universidade de Dundee, recentemente nomeado diretor associado do Centro IBS para Integridade Genômica da UNIST Ulsan, Coreia do Sul.


Aplicações Futuras

Embora o dano ao DNA seja um fator chave no desenvolvimento e evolução das células cancerosas, o dano contínuo é usado como parte dos tratamentos clínicos para o câncer, forçando as células malignas à apoptose ou senescência. Muitas drogas quimioterápicas, como bleomicina, mitomicina e cisplatina, são eficazes porque causam mais danos ao DNA em células cancerosas que se replicam em uma taxa mais rápida do que o tecido circundante. Os mecanismos de reparo do DNA celular são uma faca de dois gumes, reduzindo as mutações que podem levar ao câncer. Esses processos buscam a integridade genômica, mas os mesmos mecanismos nas células malignas permitem que essas células sobrevivam a danos adicionais ao DNA e continuem o crescimento descontrolado. A fim de bloquear este mecanismo de sobrevivência dentro das células cancerosas, os ensaios clínicos estão agora sendo realizados usando inibidores para enzimas de reparo de DNA específicas, incluindo MGMT, PARP e DNA-PK. 35-38


Art Connection

As mutações podem levar a alterações na sequência da proteína codificada pelo DNA.

Uma mutação de frameshift que resulta na inserção de três nucleotídeos é freqüentemente menos deletéria do que uma mutação que resulta na inserção de um nucleotídeo. Porque?

Sabe-se que mutações em genes de reparo causam câncer. Muitos genes de reparo mutados foram implicados em certas formas de câncer pancreático, câncer de cólon e câncer colorretal. As mutações podem afetar células somáticas ou células germinativas. Se muitas mutações se acumulam em uma célula somática, elas podem levar a problemas como a divisão celular descontrolada observada no câncer. Se ocorrer uma mutação nas células germinativas, a mutação será passada para a próxima geração, como no caso da hemofilia e da xeroderma pigmentosa.


A restauração de genes de reparo de DNA deficientes mitiga a instabilidade do genoma e aumenta a produtividade das células do ovário do hamster chinês

As células de ovário de hamster chinês (CHO) são o hospedeiro primário usado para a fabricação de proteínas terapêuticas. No entanto, a instabilidade de produção de linhas de células de alto título é um grande problema e está associada à instabilidade do genoma, pois as aberrações cromossômicas reduzem o número de cópias do transgene e diminuem o título de proteína. Analisamos dados de sequenciamento do genoma completo de 11 linhas de células CHO e encontramos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) deletérios em genes de reparo de DNA. A comparação com outras células de mamíferos confirmou que o reparo do DNA está comprometido em CHO. A restauração dos principais genes de reparo de DNA por reversão de SNP ou expressão de cDNAs intactos melhorou o reparo de DNA e a estabilidade do genoma. Além disso, a restauração de LIG4 e XRCC6 em uma linha de células CHO que expressa fosfatase alcalina secretada mitigou a perda de cópias do transgene e melhorou a retenção do título de proteína. Estes resultados mostram pela primeira vez que a correção de genes-chave de reparo de DNA produz melhorias consideráveis ​​na estabilidade e expressão de proteínas em CHO, e fornece novas oportunidades para o desenvolvimento de linha celular e uma produção mais eficiente e sustentável de proteínas terapêuticas.

Declaração de interesses concorrentes

Os autores são listados como inventores em dois pedidos de patentes pendentes da University of Delaware e da University of California, relacionados às observações neste manuscrito.


A biologia evolutiva do envelhecimento, reprodução sexual e reparo do DNA.

Os fenômenos do envelhecimento e da reprodução sexual estão certamente entre os resultados mais contra-intuitivos e enigmáticos que evoluíram sob a influência da seleção natural. Why should individuals of most species senesce and die when Darwinian selection seemingly would favor any genetic predisposition for greater longevity and continued reproduction? And why should individuals engage in sexual as opposed to asexual reproduction, when by so doing they not only expend time and energy in finding a mate, but also dilute (by 50%!) their genetic contribution to each offspring? Evolutionary biologists have long pondered these issues, and the theoretical and empirical results recently have been summarized eloquently in three landmark books. This commentary will address primarily the contribution by Bernstein and Bernstein (1991) on DNA repair as it relates to the evolution of aging and sexual reproduction, but for useful background some comments first will be made about the important volumes by Rose (1991) on aging and by Michod and Levin (1988) on sex.

Under Rose's evolutionary definition, aging is "a persistent decline in the age-specific fitness components of an organism [survival probability or reproductive output] due to internal physiological deterioration" (Rose 1991, p. 38). The central thesis of Rose's book is that the mathematical framework of evolutionary genetics has solved the paradox of aging in age-structured populations by showing that the phenomenon is an inevitable outcome of the declining force of natural selection through successive age classes. Under the formal theory that Rose cogently summarizes, natural selection is simply indifferent to problems of somatic deterioration with advancing age, because as measured by effects on fitness (representation in successive generations) these problems are trivial compared with those that might appear earlier in life. Thus, aging and death exist not for any ineluctable physiological cause, but because of "a failure of natural selection to 'pay attention' to the problem". Particular genetic mechanisms of aging are not specified by this evolutionary theory, but two leading candidates for which explicit theoretical treatments are available are (1) antagonistic pleiotropy, in which alleles tend to evolve that have beneficial effects at early ages of life but antagonistic deleterious effects later, and (2) age specificity of gene action, in which alleles with age-delayed deleterious somatic effects accumulate in evolution simply because they are nearly neutral in terms of fitness because of weak selection in later age classes. Regardless of the means by which aging is played out from the basic evolutionary script, the take-home message is that "given age-structured populations and genetic variation in life histories, aging is a straightforward corollary of population genetics theory". This theory should apply to all organisms in which there is a clear distinction between somatic cells and germ-line cells.

Having established a conceptual primacy for the evolutionary theory of aging, Rose then chastises the field of gerontology for lack of this orienting foundation. For example, according to the evolutionary view, "the search for an ultimate physiological cause of aging is no more cogent than a search for a physiological cause of evolutionary adaptation would be. . . . This implies that one of the basic goals of gerontology, that of finding the physiological cause(s) of aging, is misconceived". Rose provided extended reviews of the experimental evidence for several physiological theories for aging previously advanced (involving "wear and tear," rate-of-living considerations, hormonal influences, metabolic pathologies, and a host of others), and finds all to be wanting as universal explanations. Although many of these factors no doubt play proximate roles in the aging process, none provides the ultimate explanation for aging that is embodied in the evolutionary view.

From experimental findings as well as comparative aspects of aging across life forms, Rose concluded that there are multiple causes for aging and that these can be arranged hierarchically with regard to explanatory power. The ultimate (evolutionary) cause is the attenuation of the force of natural selection with respect to the age of gene effects in species with soma. At the penultimate level are the population genetic explanations of antagonistic pleiotropy and mutation accumulation, and at the bottom tier are the highly idiosyncratic molecular, cellular, and physiological pathways by which the genetic underpinnings of aging happen to have been executed in a particular population or species.

Rose's book is a seminal contribution because it provides one of the clearest, most coherent, and forceful documentations of why aging is not incompatible with natural selection after all. This new perspective should revolutionize the conceptual framework of gerontology, which as a discipline had remained one of the last bastions of biology relatively untouched by evolutionary thought. However, I don't quite share Rose's enthusiasm that this new theoretical orientation will revolutionize the day-to-day practice of gerontological research (any more than did Darwin's [1859] classic "On the Origin of Species by Means of Natural Selection, or the Preservation of Favored Races in the Struggle for Life" change the day-to-day practice of naming and describing species). Thus, an important empirical task in gerontology will remain the identification of particular molecular or cellular events involved in the aging process, idiosyncratic as they may be. This effort is especially important in humans or other species in which ameliorative efforts might then be contemplated. Furthermore, if the arguments by Bernstein and Bernstein (1991) are correct, Rose's sounding of the death knell for global molecular mechanisms underlying aging may have been premature.

Sexual reproduction entails the generation of new combinations of genes by the mixing of genomes, or portions thereof. In most evolutionary definitions, sex is synonymous with genetic recombination, although some authors emphasize usual components of the process, such as physical recombination (the breakage and reunion of two different DNA molecules), and outcrossing (the mixing of DNA molecules from separate individuals). Why should various mechanisms for genetic mixis have evolved so nearly universally across life? Michod and Levin's edited book brings together authoritative and stimulating contributions on this topic from most of the major architects of recent theories on the evolutionary significance of sexual reproduction.

These diverse hypotheses can be divided into two categories that are nearly opposite in orientation, though not necessarily mutually exclusive. The first category of theories perceives a benefit per se for sex, either at the immediate level of individual fitness or at the evolutionary level of group persistence. Thus, genetic mixis itself is the object of selection. Theories of this type are united by the theme that genetic variability arising from mixis and molecular recombination must somehow be advantageous in an ecological or evolutionary theater, such that the benefits to individuals (or perhaps to extended groups) outweigh the rather obvious and substantial costs of sex to individuals. Three advantages classically proposed for sexual reproduction are as follows: (1) to facilitate the incorporation of beneficial mutations into an evolutionary lineage (2) to facilitate the removal of deleterious mutations (i.e., to overcome Muller's ratchet, the ineluctable process by which the mutational load in strictly asexual lineages can remain only the same or increase through time) and (3) to allow adjustments to spatial or temporal changes in the physical and biotic environment. Several chapters (by Bell, Crow, Ghiselin, Maynard Smith, Seger and Hamilton, Williams, and others) formalize and elaborate these hypotheses, all of which can rationalize the prevalence of sexual modes of reproduction. However, some of the arguments are less than fully convincing, particularly when it comes to proposed short-term benefits of sex that are required under a strictly individual-selectionist framework.

The second category of theories proposes instead that sex is a coincidental evolutionary by-product of other primary consequences for mixis. For example, Hickey and Rose propose that sex is an outcome of subgenomic selection on parasitic DNA sequences that "imposed" biparental sexual reproduction on host genomes to favor their own spread. Another set of scenarios in this category (chapters by Bernstein et al., Holliday, Levin, and Shields) proposes that the evolution (and perhaps maintenance) of sexual reproduction involved selection pressures favoring mechanisms for the correction of genetic errors. This leads us finally to discussion of the DNA repair theory of sex and aging, as further elaborated by Bernstein and Bernstein (1991).

AGING AND SEX AS RELATED PHENOMENA

A fundamental tenet of the Bernsteins' theory is that damages to genetic material are a universal problem for life. These damages, defined as structural irregularities in DNA that cannot be replicated or inherited (unlike mutations), are of many types: single- and double-stranded breaks, modified bases, depurinations, cross-links, and so on. They arise inevitably from insults both endogenous and exogenous to the organism (e.g., oxidative damage from the molecular by-products of cellular respiration, and UV irradiation and DNA-damaging environmental chemicals, respectively). From empirical evidence, the cumulative numbers of such damages are astounding: for example, a typical mammalian cell experiences tens of thousands of DNA damages per day! These damages, if unrepaired, interfere with gene transcription and DNA replication and can cause progressive impairment of cell function and eventual cell death. The deterioration of somatic cellular function in turn leads to organismal senescence and death.

Damages to DNA can, however, be recognized and repaired by cells (though not necessarily at a rate that keeps pace with their production). Enzymatic machineries for repair of DNA damages are evolutionarily widespread, and their molecular details have been worked out to varying degrees in several model organisms ranging from viruses and bacteria to mammals. DNA repair processes almost invariably require the replacement of damaged genetic material through use of the intact information derived from a redundant copy. One source of redundancy is the complementary strand in double-helical DNA, which can serve as a template for repair when damage is confined to a single DNA strand. For example, all known forms of excision repair that occur regularly in somatic cells involve removal of the damaged section from one DNA strand and replacement by copying from the complementary undamaged strand.

A second source of redundancy for repair is the presence of another duplex DNA molecule with information homologous to that of the original copy. Such undamaged template appears necessary for the recombinational repair of double-stranded DNA damage. The Bernsteins argue that the exchange of genetic information between multiple infective phages, as well as the process of transformation whereby some bacterial cells actively take up naked DNA from the surrounding medium, are examples of primary adaptations for DNA repair in these microbes. So too they argue is meiosis in higher organisms, which is viewed as an adaptation for promoting recombinational repair of the DNA passed on to gametes. In general, all mechanisms for molecular recombination are interpreted by the authors as evolutionary adaptations that originated and are actively maintained by natural selection explicitly for the functions they serve in recombinational repair of DNA damage. Furthermore, in diploid multi-cellular reproductive systems with recombination, the Bernsteins suggest that outcrossing is favored because it promotes the masking of deleterious mutations. Thus, "DNA damage selects for recombination, and mutation in the presence of recombination selects for outcrossing".

According to the DNA repair theory, aging processes resulting from DNA damage should occur in all organisms, and not just those with a clear distinction between somatic tissues and germ-line cells. There appears to be a conflict of opinion (or perhaps merely a semantic distinction?) about whether senescence occurs in unicellular creatures such as bacteria, and in vegetatively reproducing multicellular creatures such as some plants and invertebrate animals. Rose concludes that "species that unequivocally lack such a separation of the soma, such as some sea anemones, some protozoa, and all known prokaryotes, appear to lack aging". However, the Bernsteins suggest that although populations of cells may survive indefinitely (e.g., in clonally reproducing trees and bacterial colonies), nonetheless "one would not expect to find old cells in a tree any more than one would find old cells in a growing culture of bacteria". To account for the persistence of such asexual populations of cells, the Bernsteins also introduce the concept of cellular replacement, in which lethally damaged cells are replaced by replication of undamaged ones. This strategy should work in any cell population in which "the incidence of unrepaired lethal damages is low enough at each generation to permit replacement of losses". Thus, the Bernsteins propose that there are two possible pathways to immortality for a cell lineage: (1) recombinational repair of DNA damages (which applies to germ cells) and (2) cellular replacement (which applies to predominantly clonal cells as in many bacteria).

In summary, the joint pillars of the Bernsteins' theory are that aging is a direct consequence of the accumulation of DNA damage, and that sex where it occurs is a consequence of the need to transmit damage-free genetic information to progeny. The theory as presented does not imply that the production of allelic variation through recombination and outcrossing is unimportant for long-term evolution: "Infrequent beneficial allelic variants generated by recombination undoubtedly promote long-term evolutionary success, just as infrequent beneficial mutations do." Nonetheless, "the tendency toward randomization of genetic information that occurs with recombination and outcrossing, under general conditions, has a negative effect on fitness in the short run, just as mutations, in general, do".

I think that the DNA repair theory as expounded by the Bernsteins is extremely important for several reasons. First, it provides a conceptual framework for linking the widespread phenomena of aging and sex, two evolutionary subjects that more typically have been dealt with separately (as in the Rose and Michod and Levin volumes). Second, the theory appears both logically consistent internally, and eminently plausible empirically--at least as much so as many of the traditional theories on sex and aging. Indeed, much of the Bernsteins' book constitutes a detailed compilation of observations and experimental data that appear either consistent with or positively supportive of the DNA repair view. Third, the DNA repair theory envisions immediate selective advantages that apply to individuals and their offspring and not merely to longer-term group benefits.

Finally, the DNA repair theory represents a dramatic and refreshing (to me) conceptual departure from the more traditional evolutionary theories of sex, which sometimes seem to go to rather great lengths in attempts to identify short-term benefits for the genetic variability generated by recombination. Under the Bernsteins' view, genetic variability is an immediate curse rather than a blessing, with any long-term benefits derived from recombinational variation being fortuitous epiphenomena of cellular and molecular processes that evolved under selection pressures to repair DNA damages and mask deleterious mutations. In this regard, I am reminded of the opposing world views on genetic variation expressed in another evolutionary arena--the debate between the selectionists and the neutralists. When extensive genetic variation was first uncovered in protein-electrophoretic and other molecular assays, many evolutionists assumed that the variability must be actively maintained by natural selection, and they sought hard to identify the balancing selective forces involved. But from the neutralist perspective [which grew out of the "classical" school in which genomes were perceived as heavily burdened by mutational load (see Lewontin 1974)], the overall magnitude of molecular variation was actually much lower than expected, given suspected mutation rates and effective population sizes. Thus, under the neutralist (and classicist) world views, if selection was involved appreciably in molding molecular genetic variability, it must act primarily in a diversity-reducing rather than diversity-enhancing fashion (Nei and Graur 1984).

Where does the DNA repair hypothesis fall within the hierarchical framework of causes for aging as advanced by Rose? If correct, the theory cannot be placed at the bottom of the hierarchy as just another idiosyncratic physiological mechanism for aging, because it is general, and an explicit selective force is involved. Indeed, the hypothesis is in some respects more universal than that of the declining force of natural selection with advancing age, because it applies to all forms of life, including those without a clear distinction between somatic and germ cells. However, for organisms with soma, the DNA repair hypothesis does not appear incompatible with Rose's evolutionary view: the declining impact of natural selection with age would mean that any organismal benefits to accrue from DNA repair processes in the later cohorts of an age-structured population would provide insufficient selective force to circumvent the evolutionary appearance of senescence and somatic death.

Having heartily applauded the Bernsteins' contribution, I must add however that I seriously doubt it tells the whole story on the significance of genetic variation. Once recombinational processes had evolved (for whatever reason, of which the need for DNA repair must now be considered a leading candidate), it seems probable that the genetic variability thereby generated would have been exploited for other functions as well. For example, the extensive molecular variability in the repertoire of the immune response in higher animals is in part recombinationally derived, and undoubtedly fosters enhanced disease resistance that often must be of immediate fitness benefit. Furthermore, the increased genetic variance stemming from recombination might well allow sexual reproducers to outpersist asexual reproducers in changing environments, despite the fact that such explanations tend to be group selectionist. Finally, as emphasized by several authors in the Michod and Levin volume (e.g., Brooks, Felsenstein, Maynard Smith, Trivers, Uyenoyama, and Williams), rates and patterns of genetic recombination (and the linkage disequilibria that they entail) can vary remarkably: across different regions of the genome, between the sexes, temporally within the life cycle (e.g., in taxa with an alternation of generations between sexual and asexual modes), across populations and species, and spatially across habitats. Many of these differences have been interpreted as adaptive adjustments to varying selection regimes. As stated by Ghiselin (Michod and Levin 1988, p. 20), "The eukaryotic genome turns out to be very highly organized, and the whole apparatus shows every indication that the amount, kind, and timing of recombination, and also the release of variability, are adaptive. . . . [T]he DNA repair hypothesis suggests that there should be little correlation between what goes on and when and where it happens. Such a correlation definitely does exist."

NEGLECTED OR UNDEREMPHASIZED TOPICS

In any event, I would like to stimulate further thought and discussion about two general considerations that seemed grossly underrepresented in all three books.

(1) Cytoplasmic genomes.--There are two major reasons why a relative neglect of mitochondrial (mt) genomes in these volumes was surprising (similar sentiments could also be expressed about chloroplast DNA). First, in organisms as diverse as fungi and humans, elsewhere there has been a tremendous resurgence of interest in the possible roles of mitochondrial DNA (mtDNA) damage in the aging process (e.g., Griffiths 1992 Wallace 1992a). In humans for example, this interest has been prompted by empirical findings that specifiable defects in mtDNA accumulate with advancing age in somatic cells, and that these defects tend to compromise physiological functions particularly in tissues and organ systems with high energy demands (e.g., the central nervous system, optic nerve, heart and skeletal muscle fibers, kidney, and liver). These are also the organ systems commonly associated with degenerative diseases and chronic illnesses of the elderly, thus suggesting a possible cause and effect relationship between mtDNA damage and the aging process (Wallace 1992b).

Further empirical and conceptual reasons exist for postulating that mtDNA might play a disproportionate role in aging. Mitochondrial DNA molecules are housed in an intracellular environment where they would seem to be especially prone to damage from oxygen radicals generated by oxidative phosphorylation (Bandy and Davison 1990). Indeed, mammalian mtDNA receives about 16-fold more oxidative damage on a per-nucleotide basis than does nuclear DNA (Richter et al. 1988, as quoted in Bernstein and Bernstein 1991). Yet ironically, animal mitochondria are thought to possess only limited DNA repair systems, and indeed this provides one conventional explanation as to why animal mtDNA evolves so rapidly at the nucleotide sequence level (Wilson et al. 1985). Animal mtDNA is packed tightly with genes crucial to the energy metabolism of cells, and for this reason, too, it would seem highly desirable for organisms to have evolved refined mechanisms for the repair of mtDNA damage. The paradox is heightened further because there are many copies of mtDNA within most cells. Thus it would seem that any repair capability should in principle be especially workable, because of the many available templates against which DNA damages might be corrected. (The hypothesis that an immunity from selection pressures stems from mtDNA redundancy and a possible excess metabolic capacity seems gratuitous and is also probably untenable evolutionarily.) Perhaps eukaryotic organisms have evolved more highly refined mtDNA repair mechanisms that, despite intensive searches, thus far have remained undiscovered. But if not, why not? And how can organisms have persisted evolutionarily without such enzymatic repair services for the crucial cytoplasmic genomes they depend upon for energy supplies?

A second reason for surprise over the relative neglect of mtDNA in these volumes relates to mtDNA's asexual inheritance. The transmission of mtDNA in most higher eukaryotes is predominantly uniparental, with effective genetic recombination between maternally and paternally derived molecules unknown. If meiosis and the recombinational aspects of gametogenesis provide evolutionary benefits, as surely they must (either via repair of DNA damages, and/or through generation of advantageous recombinational variation), then why doesn't mtDNA play by these rules? The entire answer cannot simply be that mitochondrial elements have been physically confined to the cytoplasm and hence unable to avail themselves of meiosis, because transfers and successful incorporations of some mitochondrial genes to nuclear chromosomes are known to have occurred over evolutionary time (see Avise 1991).

If meiosis is primarily a process for correcting DNA damages (as proposed by the Bernsteins), then mtDNA damages must be overcome by some process other than meiotic recombinational repair. One possibility is that mtDNA molecules might occasionally undergo (nonmeiotic) recombination or gene conversion within the germ line, perhaps in such a way that damage-free mtDNA templates correct faulty ones. The relatively few experimental attempts to uncover physical recombination in animal mtDNA through use of genetic markers have been hampered by the usual predominance of only one or a few detectable mtDNA clones within most individuals. More intensive searches for mtDNA recombination should be launched. Promising systems for further study involve species such as some mollusks, in which extensive paternal leakage of mtDNA into zygotes (e.g., Zouros et al. 1992) is known to have generated cell lineages jointly housing distinctive maternally and paternally derived mtDNA molecules that should provide useful genetic markers for detecting potential mtDNA recombination. Another possibility (elaborated beyond) is that processes of mtDNA replication and sorting during gameto-genesis provide an alternative, strictly nonrecombinational pathway for circumventing the accumulation of genetic damages.

(2) Cellular autonomy.--Another issue that was underemphasized in these volumes concerns the evolutionary ramifications of varying degrees of cellular autonomy. The somatic cells of an individual usually are interdependent, both structurally and functionally, whereas gametes are relatively autonomous (except perhaps in rather "trivial" respects such as the collaborative efforts required of sperm in penetrating the eggs of some species). In other words, gametes tend to be cellular free agents, whereas somatic cells (particularly in tightly organized creatures with determinate growth, such as many higher animals) are trapped in a web of interdependencies. Crow (Michod and Levin 1988, p. 68) raised an important question: "Is passing through a single-cell stage itself important? . . . Starting with a single cell, sexual or asexual, permits each generation to begin with a tabula rasa largely unencumbered by the somatic mutations from previous generations." Crow went on to lament that "I have never heard the importance of going through a single-cell stage expressed before, and would welcome comments . . . as to its possible merits."

It seems to me that many of the fundamental distinctions commonly made in discussions of aging and sex--senescence versus immortality, sexual versus asexual reproduction, somatic versus germ-line tissue, unicellularity versus multicellularity, and individuals versus groups--are inextricably related, and might profitably be viewed through a common denominator revolving on the concept of cellular autonomy, as described next.

EMBELLISHMENTS TO THE DNA REPAIR THEORY OF AGING AND SEX

Here I would like to propose some possible extensions to the Bernsteins' theory of DNA repair, and by so doing suggest how concepts of cellular and molecular autonomy might usefully be added to future discussions on aging and sex.

As mentioned above, two potential pathways to immortality seem available to life. The first is predominantly or exclusively asexual and is exemplified most clearly by unicellular organisms such as bacteria. Here, cell proliferation apparently can outstrip the rate of accumulation of DNA damages and deleterious mutations, with the net result that Muller's ratchet is circumvented and an indefinite continuation of the population occurs via cellular replacement. The second pathway is sexual and is exemplified most clearly by germ-cell lineages in multicellular organisms such as vertebrates. Here, repair of nuclear DNA damages by genetic recombination supposedly operates in conjunction with cell proliferation and intercellular selection to counter the accumulation of nuclear DNA damages and deleterious mutations that would otherwise be expected.

In both routes to immortality, many cells (bacteria or gametes) may die genetic deaths (e.g., from the inevitable imperfections of any DNA repair mechanism), but these deaths do not compromise the continuance of cell lineages that happen to have escaped or repaired DNA damage. Thus, the efficacy of both pathways to immortality would seem to depend critically on the autonomy of the proliferating cells. To emphasize why this is so, consider the prospect of somatic immortality for a multicellular organism such as a vertebrate. Even if some somatic cells and tissues could keep pace with DNA damage via the nonsexual strategy of cellular replacement [as may essentially be true for epithelial cells of the digestive tract of mammals, or for hemopoietic stem cells (Bernstein and Bernstein, p. 165)], these replacements are to no avail in conferring immortality, because the final fate of these cell lineages remains inextricably tied to the remainder of the individual's soma (which as a whole inevitably senesces, as predicted by Rose's evolutionary theory). However, autonomous gametes and the genomes they contain can escape the sinking somatic ship.

This line of reasoning also illustrates the difficulty (semantically and otherwise) of disentangling the issue of immortality from that of the distinction between somatic and germ-line cells. Without the presence of somatic tissue, the evolutionary theory of Rose predicts no age-structure in a population, and hence no aging but without aging, there is no compelling evolutionary stimulus for the escape of autonomous cells from a soma that inevitably deteriorates (either from DNA damage or other causes). These ruminations also point out why the distinction between an individual and a population can become rather vague in discussions of aging and immortality in unicellular taxa. A bacterial colony may survive indefinitely, but without a distinction between somatic and germ cells, what is the organismal entity to which this immortality refers? In truth, what persists are certain cell lineages, but in this sense the "individuals" or "populations" are no more well defined than are the potentially immortal germ-cell lineages in higher taxa. Furthermore, many bacterial cells inevitably die genetic deaths but without somatic benchmarks to assess chronological age, it is debatable whether this should properly be referred to as an "aging" phenomenon.

In many plants and invertebrate animals with various asexual modes of reproduction, the usual distinctions between individuals and populations, between somatic lines and germ lines, and between aging and immortality, all become even more ambiguous (Rose). For example, vegetative cell lines of some plants can be maintained indefinitely (perhaps by the strategy of cellular replacement), whereas others appear to senesce (perhaps because cellular replacement cannot keep pace with DNA damage). The former might well be considered potentially immortal, but according to Rose they do not violate the evolutionary theory of aging because specification of germ-line tissue in these cases is problematic. Whether this is a definitional slight of hand or a bona fide consideration is unclear to me, but in any event a more critical factor may be degree of cellular autonomy displayed. Diploid cells or collections thereof that have a capacity to survive and reproduce mostly independently of other cells exhibit considerable cellular autonomy (by definition). Thus, to a vegetatively spreading plant or coral, death of a portion of the "soma" may have relatively little influence on survival and reproduction of the remaining cells of the genet (a given clonal genotype, regardless of how it is physically partitioned). This contrasts with the situation in vertebrates, in which the death of a critical tissue dooms all somatic cells within each well-demarcated individual. Thus, any cell lineages characterized by increased levels of functional and replicative autonomy carry the potential for indefinite evolutionary persistence. Whether this potential could be realized then depends on additional factors, including whether the available processes of cellular repair and replacement are adequate to control DNA damages and to circumvent Muller's ratchet.

One important consideration on whether such cellular processes are workable indefinitely concerns genomic size. Formal models indicate that Muller's ratchet may well set an upper limit on the size of the genome in asexual organisms, particularly when their populations are small (Crow, Felsenstein, and Maynard Smith in Michod and Levin 1988). Bell notes that the small size of mtDNA molecules in higher animals ([is congruent to] 16 kilobases) may be a reflection of Muller's ratchet, and furthermore the somewhat larger mtDNA molecules of yeast and plants "would have to recombine in order to maintain the integrity of their genomes, as seems to be the case". From this perspective, nuclear genomes are vastly too large for long-term effectiveness of a cellular proliferation strategy acting alone to compensate for accumulation of DNA damages and deleterious mutations, hence the additional requirements for sexual reproduction and recombination. Crow and others have regarded this as an important factor accounting for why species with obligate parthenogenesis or other forms of asexual reproduction "are the twigs on the phylogenetic tree, not the main stems and branches".

I would like to propose that elements of both the recombinational repair and replacement strategies are employed simultaneously within the germ-cell lineages of higher organisms. Under this view, recombinational repair helps purge the nuclear genome of DNA damages, and a molecular-level analogue of cellular replacement ("molecular replacement") facilitates the purging of both DNA damages and deleterious mutations in nonrecombining cytoplasmic genomes. The immediate effect of these collaborative processes is to increase the probability that at least some gametes are produced that are free from genetic defects that had accumulated during the lifetime of the parent. In turn, the zygotes and early embryos produced by such "cleansed" gametes have a higher initial likelihood of being unburdened from the load of parental DNA defects.

The molecular replacement process is proposed to operate through the replicative segregation of mtDNA molecules in the lineages of germ cells (particularly oocytes). Unlike nuclear genes in diploid organisms, each of which exists as a single allelic copy per gamete, thousands of mtDNA molecules populate most cells, and several hundred thousand copies may cohabit a mature oocyte (Michaels et al. 1982). As cells undergo mitotic or meiotic cytokinesis, particular mtDNA mutations may fluctuate in frequency because of intracellular selection (differential replication) and genetic drift. Notably, the many mtDNAs in mature oocytes probably stem from a vastly smaller pool of mtDNA molecules that survive the process of replicative segregation in earlier cytokinetic divisions of the germ-cell lineage. Evidence for this conclusion comes from the empirical generality that the vast majority of the heterogeneity in mtDNA genotypes is distributed among rather than within individuals [implying relative mtDNA population bottlenecks in germ lines (Chapman et al. 1982)], and from observed rates of mtDNA clonal sorting in the gametes and progeny of heteroplasmic females (review in Avise 1991). In any event, mtDNA molecules that survive and replicate to populate a mature oocyte presumably have been rather scrupulously screened by natural selection for replicative capacity and functional competency in the germ-cell lineages they inhabit.

To the extent that these two damage-repair processes (recombinational repair of nuclear DNA, and molecular replacement of cytoplasmic DNA) fail during gametogenesis, the metabolic functions of some germ cells will be compromised, and there will be gametic deaths. These gametic screening processes would appear to have considerable scope and impact, for at least two reasons. First, germ-line cells are highly active metabolically (Hastings 1989), such that any functional defects likely would be exposed to cellular-level selection. Second, gametes are produced in prodigious quantities by most species (e.g., males produce billions of sperm, and the number of oocytes present in a human female at birth is approximately 2,000,000 Baker 1963). Furthermore, subsequent rounds of selective screening no doubt occur at the zygotic stage and during embryonic development, as genomes from the surviving functional gametes are called upon to interact properly in diploid condition. Failures at this level would be registered as embryonic abortions, which also are known to occur at high frequency (e.g., the loss of all human conceptions has been estimated at nearly 80% Roberts and Lowe 1975). In general, the Bernsteins interpret such observations to indicate that DNA damage is so pervasive that "recombinational repair during meiosis, as well as other repair and protective processes, may be just barely able to cope with DNA damage".

The Bernsteins' DNA repair theory by itself probably cannot account for all of the variety and nuances of sexual reproduction and aging processes. Nonetheless, it represents an exciting and important piece of a jigsaw puzzle whose other elements are summarized so eloquently in the Rose and Michod/Levin volumes. Furthermore, in this puzzle's emerging picture, aging and sex can be seen more clearly as interrelated phenomena, both evolutionarily and mechanistically. Undeniably, certain cell lineages in all extant life-forms have solved the problem of innate mortality (at least over the 4 billion yr of life on earth), and the strategies of genetic recombination, cellular replacement, and molecular replacement by which this has been accomplished are coming into sharper focus.

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