Em formação

Os botões sinápticos estão sempre localizados nos axônios?


Estou aprendendo sobre a proteína Sinaptofisina e li que é uma proteína de membrana integral localizada nas vesículas sinápticas. Também li que é um marcador específico e sensível para terminais sinápticos. Neste site, li que os terminais sinápticos são as terminações pré-sinápticas e na Wikipedia que o terminal do axônio pré-sináptico também é conhecido como botão sináptico. Pelo que li online, parece-me que os botões sinápticos estão localizados apenas nos axônios.

No entanto, descobri sobre as sinapses dendrodendríticas que são conexões entre os dendritos de dois neurônios diferentes. O final pré-sináptico de uma sinapse dendrodendrítica pode ser referido como botão sináptico ou os botões sinápticos estão localizados apenas nos axônios? Todos os insights são apreciados.


Botões axonais são nomeados como tal devido à sua forma. As sinapses dendro-dendríticas não se assemelham a esta forma e nunca são chamadas de botões. Não parece que a sinaptofisina é expressa nos dendritos (Fletcher et al. 1991), mas não tenho conhecimento de um estudo que visou especificamente as sinapses dendro-dendríticas.


Referências

Fletcher, TL, P Cameron, P De Camilli e G Banker. 'The Distribution of Synapsin I and Synaptophysin in Hippocampal Neurons Developing in Culture'. The Journal of Neuroscience 11, no. 6 (1 de junho de 1991): 1617. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.11-06-01617.1991.


Os interneurônios contendo encefalina são especializados para inervar outros interneurônios na região CA1 do hipocampo do rato e da cobaia

Sabe-se que as encefalinas têm um efeito profundo na inibição do hipocampo, mas a possível fonte endógena desses neuropeptídeos e sua relação com interneurônios inibitórios ainda não foi identificada. No presente estudo, analisamos as características morfológicas das células imunorreativas da metencefalina na região CA1 do hipocampo de rato e porquinho da índia, sua coexistência com outros marcadores neuronais e sua seletividade alvo nos níveis microscópico de luz e eletrônico.

Vários interneurônios em todos os subcampos do hipocampo foram considerados imunorreativos para metencefalina. Na cobaia, as fibras provenientes de interneurônios imunorreativos foram observadas para formar um plexo na zona de fronteira do estrato oriens / alvéolo e matrizes em forma de cesta de botões em ambos os corpos celulares imunorreativos e imunonegativos encefalina em todos os estratos. Botões imunorreativos sempre estabeleceram contatos sinápticos simétricos no corpo físico e nos eixos dendríticos.

Células imunorreativas à encefalina colocaram GABA, polipeptídeo intestinal vasoativo e calretinina. A coloração de immunogold pós-incorporação para GABA mostrou que todos os botões imunorreativos com encefalina analisados ​​contataram estruturas pós-sinápticas GABAérgicas. Em seções duplamente imunomarcadas, axônios encefalina-positivos foram vistos para inervar calbindina D28k-, somatostatina-, calretinina- e células imunorreativas de polipeptídeo intestinal vasoativo com múltiplos contatos. Com base nessas características, as células contendo encefalina no hipocampo são classificadas como interneurônios especializados para inervar outros interneurônios e representam um subconjunto de células contendo polipeptídeo intestinal vasoativo e calretinina.

A combinação marcante da distribuição do ligante e do receptor no caso da comunicação interneuronal mediada por encefalina sugere que esse neuropeptídeo pode desempenhar um papel importante na sincronização e no tempo de inibição envolvida nas atividades da rede rítmica do hipocampo.


Introdução

Uma compreensão profunda do microcircuito cortical requer medições quantitativas precisas dos parâmetros morfológicos. Essas medições são feitas de forma confiável a partir de reconstruções tridimensionais (3D) da estrutura do tecido usando imagens microscópicas eletrônicas (EM) de seções ultrafinas sucessivas (Fiala et al., 2002 Holtmaat et al., 2006 Karube et al., 2004 Kubota e Kawaguchi , 2000 Kubota et al., 2007 White et al., 1994). Como a geração de reconstruções é trabalhosa e demorada, métodos mais eficientes foram recentemente introduzidos que automatizam o processo de reconstrução e facilitam as medições estruturais (Denk e Horstmann, 2004 Harris et al., 2006 Knott et al., 2008 Micheva e Smith, 2007). No entanto, duas armadilhas na metodologia atual impedem uma reconstrução precisa da morfologia do tecido. O primeiro é a determinação precisa da espessura das seções ultrafinas, em que qualquer erro afetará significativamente a forma das estruturas reconstruídas e as medições quantitativas resultantes. O método comumente usado para estimar a espessura da seção é o método de dobras mínimas (Small, 1968), que mede a largura das estrias no tecido formadas quando pequenas dobras de tecido aderem a si mesmas e se projetam acima do plano da seção. A espessura da seção é considerada metade da largura das cristas. Porém, esse método gera resultados que variam de acordo com o estado da resina, o tipo de tecido embutido e a altura da dobra. Portanto, a precisão dessas medições nem sempre é certa. Outras incertezas podem resultar da distorção da resina ultrafina após o dobramento. A segunda armadilha nas reconstruções seriais é a identificação precisa dos contatos sinápticos. As características clássicas usadas para identificar as sinapses incluem: (1) a existência de um espaço paralelo de cerca de 20 nm de largura entre as membranas pré-sináptica e pós-sináptica, a chamada fenda sináptica, (2) o acúmulo de pequenas vesículas próximas à membrana pré-sináptica no botão pré-sináptico e (3) especialização das membranas pré-sináptica e pós-sináptica. A fenda pode ser mais facilmente identificada quando a seção é cortada perpendicularmente à face da junção sináptica, mas sua identificação torna-se muito mais difícil quando as seções são cortadas paralelamente a ela. Aqui, apresentamos uma nova metodologia que supera essas limitações, permitindo a reconstrução morfológica precisa do tecido neuronal e a identificação de contatos sinápticos que ocorrem em todos os ângulos em relação ao plano de seção.


Estudos estruturais finos em um tipo de neurônio imuriorreativo de somatostatina e suas conexões sinápticas no neostriato de rato: um estudo correlacionado com microscopia de luz e elétron

Neurônios imunorreativos para somatocaína no neostriato de rato foram estudados por microscopia de luz e eletrônica correlacionada usando a técnica imunocitoquímica peroxidase-antipe-roxidase. A imunorreatividade foi localizada em pericários e processos neuronais. Os pericários eram de formato fusiforme ou fusiforme (comprimento médio de 16,9 μm) e foram encontrados em todas as partes do neoestriado. De cada neurônio surgiram dois a quatro processos dendríticos imuno-reativos diretos, que freqüentemente podiam ser rastreados até cerca de 130 μm de seu pericário. Ocasionalmente, foram encontrados processos imunorreativos do tipo axônio varicoso, alguns dos quais eram axônios proximais de células imunorreativas identificadas. Nove dos neurônios identificados ao microscópio de luz que exibiam imunorreatividade para somatostatina foram estudados no microscópio eletrônico, dois deles tinham axônios proximais com varicosidades. Cada neurônio tinha um núcleo oval ou alongado, sempre recortado. Essas características morfológicas correspondem bem às de certos neurônios aspiny de "tamanho médio" classificados por estudos de Golgi. Embora o produto final imunorreativo estivesse difusamente localizado por todo o neurônio, ele estava localizado caracteristicamente nos sáculos e grânulos grandes (diâmetro de 133 nm) do aparelho de Golgi, e grandes vesículas imunorreativas de tamanho semelhante àquelas no aparelho de Golgi freqüentemente ocorriam em todos partes do axônio. Muito pouca entrada sináptica foi encontrada nos pericários e dendritos dos neurônios imunorreativos para somato-estatina. O perikarya e os dendritos proximais receberam entrada sináptica simétrica e assimétrica, enquanto os dendritos distais geralmente receberam botões que formaram contatos assimétricos.

Os botões imunorreativos para somatostatina continham vesículas elétron-lucentes pleomórficas (diâmetro de 39,3 nm) e algumas vesículas granulares imunorreativas grandes - esses botões sempre formaram sinapses simétricas. Seus alvos pós-sinápticos eram eixos dendríticos, espinhos e perfis dendríticos não classificados. Por outro lado, as varicosidades de axônios proximais identificados de neurônios positivos para somatostatina não formaram sinapses típicas, uma vez que careciam de aglomerados de pequenas vesículas, mas algumas delas estavam em aposição direta (via especializações de membrana) a pericarários ou dendritos não marcados.

Conclui-se que a somatostatina é um marcador útil para um tipo particular de neurônio no neostriato. A presença de reatividade imunológica de somatostatina em botões sinápticos é consistente com a visão de que a somatostatina poderia ser um neurotransmissor no neostriato.


Reconhecimentos

Gostaríamos de agradecer a G. Szábo por gentilmente ceder os ratos GAD65-GFP, U.V. Nägerl pela ajuda com a configuração experimental e comentários sobre o manuscrito, N. Stöhr e C. Huber pela assistência técnica e T. Mrsic-Flögel, C. Lohmann e V. Stein pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por Max Planck Gesellschaft, Alexander von Humboldt Stiftung, uma bolsa Marie Curie Intra-European (C.J.W.) e Boehringer Ingelheim Fonds (N.B.).


Neurobio

Em outras palavras, eles são pequenos sinais elétricos aquele ato acabou baixo varia porque eles DIMINUA EM TAMANHO COM DISTÂNCIA. Pequenas mudanças no potencial de membrana em resposta a um estímulo um estímulo mais forte produz uma mudança maior no potencial de membrana.

Potenciais graduados ocorrem ao longo de distâncias curtas, estão confinados a pequenas regiões da membrana plasmática e sua magnitude pode variar (ou seja, eles são graduados).

I = E / R
onde I = corrente, R = resistência e E = tensão (medida em mV)

2. Conforme o potássio sai da célula, o interior da célula se tornará progressivamente mais negativo, o que criará uma força elétrica que atrai os íons de potássio positivos, se essa força elétrica for grande o suficiente, na verdade atrairá os íons de potássio de fora do célula de volta para dentro.

3. Os íons de potássio escaparão do neurônio até a força de atração elétrica da carga negativa em desenvolvimento dentro da célula é igual a a força exercida pelo gradiente de concentração que está forçando o potássio a sair. No ponto em que as forças internas e externas se equilibram, o potássio está em equilíbrio.

4. Esta força é igual ao potencial de equilíbrio de potássio e é de aproximadamente -90mV em neurônios.

2. À medida que o sódio entra na célula, o interior da célula se torna progressivamente mais positivo e cria uma força elétrica que puxa as células de sódio para fora da célula, opondo-se assim à força química.

3. Eventualmente, sódio suficiente entra na célula para que a força elétrica se torne forte o suficiente para se opor ao movimento posterior dos íons de sódio na célula devido à força química neste potencial de membrana, o sódio está em equilíbrio (+60 mV).

* As células excitáveis ​​em repouso são altamente permeáveis ​​ao K + e apenas ligeiramente permeáveis ​​ao Na +. O potencial elétrico resultante da separação da carga atua como uma força para puxar o Na + para dentro da célula. A força química e a força elétrica são quase as mesmas e se movem na mesma direção, de modo que o gradiente de EC leva o Na + para dentro da célula.

2. As forças químicas agem de forma que os íons de potássio deixam a célula e os íons de sódio entram na célula, entretanto, mais potássio sai da célula do que o sódio entra b / c de maior permeabilidade ao potássio. Isso cria um potencial de membrana negativa.

3. As forças elétricas agora agem sobre os íons, atraindo os íons sódio e potássio para a célula. Eventualmente, um curso estável é estabelecido, onde o movimento do sódio para dentro da célula é equilibrado pelo movimento do potássio para fora da célula, e nenhum movimento de carga líquida ocorre. Este potencial = potencial de membrana em repouso, é

1. A redução do potencial de repouso (despolarização) nos axônios abre canais dependentes de voltagem.

2. Se a membrana do neurônio é despolarizada até atingir um valor limite, os canais de sódio dependentes de voltagem da membrana axonal se abrem e a membrana se torna completamente permeável ao Na +.

3. Como resultado, os íons Na + entram rapidamente e o axônio torna-se brevemente mais positivo por dentro do que por fora. Este evento é denominado potencial de ação.

1. O aumento na magnitude dos estímulos leva ao aumento no recrutamento de unidades motoras e aumento na força de contração * (células musculares)

2. Repolarização: o potencial da membrana retorna de +30 mV para descansar em -70 mV. Dentro de 1 ms após o aumento da permeabilidade ao sódio, a permeabilidade ao sódio diminui rapidamente e a permeabilidade ao potássio aumenta. Isso traz o potencial de membrana de volta aos níveis de repouso.

2. Assim, quando uma célula é despolarizada até o limite, os canais de Na + se abrem. A abertura permite que o sódio se mova para dentro da célula, causando mais despolarização e abrindo mais canais.

2. O potássio então sai da célula, repolarizando-a.

3. À medida que a célula se repolariza, o estímulo despolarizante enfraquece e os canais de K + se fecham lentamente.

1. Depois que o potencial de ação é iniciado no outeirinho do axônio, a atividade elétrica do primeiro potencial de ação se espalha e aciona os canais próximos dependentes de voltagem. Uma vez acionado, outro potencial de ação ocorre naquele local afetado. Esse próximo potencial de ação se espalha nas proximidades e inicia outro potencial de ação.

2. Portanto, em um axônio não mielinizado, um potencial de ação será gerado em cada ponto ao longo de todo o axônio.

1. Esta forma de condução é muito mais rápida porque apenas os nós de Ranvier estão envolvidos na condução do potencial de ação.

2. Para que ocorra um potencial de ação, os íons sódio e potássio precisam se mover através da membrana axonal. No entanto, onde quer que a mielina se enrole ao redor do axônio, os íons de sódio e potássio não podem atravessar a membrana, as células de Schwann envolvem com muita força a membrana axonal para que haja qualquer espaço extracelular abaixo delas.

3. Portanto, o único lugar onde um potencial de ação pode ocorrer é no nó de Ranvier - o espaço entre as células de Schwann. Por causa disso, o potencial de ação parece pular de nó em nó ao longo do axônio.

1. Canais de vazamento - aberto o tempo todo.

2. Canais controlados por voltagem - abre ou fecha e responde às mudanças elétricas na membrana plasmática.

1. são altamente específico para cada íon específico com base na carga do íon, no tamanho do íon e na quantidade de água que o íon atrai e mantém ao seu redor.

2. pode ser fechado (ou seja, têm portas que abrem ou fecham o canal) ou não fechado (canais de vazamento que estão sempre abertos).

3. são distribuído de forma variada ao longo da membrana celular.

2. Quando RMP não é igual a K + Eq (-90mV), as forças agindo em K + não são mais iguais e opostas. A -70 mV, a força química que empurra o K + para fora da célula é maior do que a força elétrica que o puxa de volta para a célula. A força de no K + é pequena, mas a membrana plasmática do neurônio é altamente permeável ao K +, então um pequena quantidade de K + se move continuamente através dos canais de vazamento. Em contraste, a força no Na + é grande, mas a membrana plasmática dos neurônios é apenas ligeiramente permeável ao Na +, então apenas uma pequena quantidade de Na + se move através dos canais de vazamento.

3. A célula deve compensar o vazamento de Na + e K + para dentro e para fora da célula. Se o vazamento de íons continuar, o gradiente de concentração de Na + e K + diminuirá. À medida que a concentração diminui, o potencial da membrana se move para 0. Quando não há mais nenhuma força química ou elétrica para mover os íons através da membrana, o neurônio não pode enviar nem receber sinais de que precisa para funcionar adequadamente. Neurônios podem evitar que os gradientes de Na + e K + diminuam, transportando ativamente Na + para fora da célula e K + para dentro da célula.


Resultados

Botões GABAérgicos únicos exibem depressão de pulso pareada

Um terminal rotulado com RH414 que estava bem separado dos terminais vizinhos (Fig. 1UMA e Fig. 2UMA e B) foi selecionado de acordo com os critérios descritos em Métodos. Uma pipeta de vidro cheia de solução salina foi colocada a aproximadamente 1 μm do terminal e um estimulador isolado administrou pulsos de corrente despolarizante curtos (2 ms, 2 μA). A estimulação focal de um único botão produziu uma resposta pós-sináptica inibitória com um declínio exponencial duplo. As constantes de tempo de decaimento médias foram 15 ± 3 e 81 ± 7 ms (n= 12). A natureza GABAérgica da resposta sináptica foi identificada por sua sensibilidade ao metiodeto de bicuculina (IMC, dados de 1–10 μM não mostrados).

A ativação de pulso pareado de botões GABAérgicos únicos sempre induziu depressão (Fig. 3UMA) Em intervalos curtos entre estímulos, a segunda resposta foi sobreposta à decadência da primeira, de modo que a amplitude do eIPSC2 foi medido após subtrair um eIPSC médio escalado para corresponder ao eIPSC1. O período entre um par de estímulos e o próximo par foi de 5 s, o que foi suficiente para a recuperação total do primeiro eIPSC. A dependência da relação de pulso emparelhado (eIPSC2/ eIPSC1) no intervalo interestímulo foi determinado em 26 botões estimulados em Ca 2+ extracelular elevado após o carregamento de OGB-1. A recuperação da depressão exibiu dois componentes cineticamente distintos, com constantes de tempo de 86 ms e 2,0 s (Fig. 3B) Esses dois componentes serão chamados de PPDvelozes e PPDdevagar. No menor intervalo testado (20 ms), a depressão combinada da amplitude do eIPSC foi de 73%. O (s) mecanismo (s) responsável (is) pelo PPDdevagar reduziu a amplitude em 50%, enquanto PPDvelozes contribuiu com 23% para a depressão.

Depressão de pulso emparelhado de eIPSCs em um único terminal inibitório em Ca 2+ extracelular elevado (5 m m)

UMA, eIPSCs em vários intervalos entre estímulos diferentes (Δt) Cada rastreamento é a média de 25 respostas. B, PPD em função do intervalo entre estímulos. Dados agrupados de 26 boutons após o carregamento de OGB-1. A linha contínua representa um ajuste exponencial duplo. C, PPD de eIPSCs não foi alterado pela presença de corante sensível ao Ca 2+.

É bem conhecido que o comportamento de pulso emparelhado de um terminal é influenciado pelos buffers pré-sinápticos de Ca 2+ (ver por exemplo Ohana & Sakmann, 1998 Rozov et al. 2001 Sakaba & Neher, 2001). No presente estudo, usamos OGB-1, um indicador de Ca 2+ de alta afinidade (KD≈200 nm), para monitorar os níveis pré-sinápticos de Ca 2+ no botão estimulado. O uso de uma forma permeante de membrana de um indicador de Ca 2+ impede a estimativa precisa de sua concentração na célula.No entanto, seu valor aproximado foi obtido comparando a fluorescência do botão com a fluorescência produzida no vidro por gotículas de solução intracelular artificial contendo OGB-1 em várias concentrações. Estimamos que a concentração de OGB-1 no terminal era de 30 μM ou menos.

Para testar se o PPD foi afetado pela presença desta sonda de Ca 2+, seis botões foram testados na ausência de OGB-1. Figura 3C ilustra que o corante não teve efeito significativo na magnitude ou no decurso do tempo de PPD. Por exemplo, em um intervalo entre estímulos de 20 ms, a proporção PPD foi de 0,24 ± 0,01 na ausência de OGB-1 e 0,26 ± 0,03 na sua presença (P & gt 0.8, Student's t teste). A taxa de falha também não foi afetada. Foi de 0,08 ± 0,04 e 0,09 ± 0,03 na ausência e presença do indicador, respectivamente. Portanto, assumimos que a força de tamponamento de Ca 2+ de OGB-1 era baixa em comparação com a força de buffers de Ca 2+ endógenos nesses terminais. Todos os seguintes experimentos foram realizados na presença de OGB-1.

GABAB receptores não contribuem para PPD

Em algumas sinapses inibitórias centrais, o PPD é mediado por GABA pré-sinápticoB autoreceptores. Ativação de GABAB receptores suprimem correntes de Ca 2+ ativadas por voltagem (Pfrieger et al. 1994) e aumenta a atividade pré-sináptica do canal de K + dependente de voltagem (Scholz & Miller, 1991) por meio de um mecanismo mediado pela proteína G. Para testar se GABAB receptores contribuem para PPD nesta preparação, aplicamos um antagonista competitivo, CGP55845A (CGP) (Davies et al. 1993). CGP (5 μM) não teve efeito no PPD. Por exemplo, em um intervalo entre estímulos de 100 ms, a proporção PPD foi de 0,41 ± 0,03 no controle (n= 17) vs. 0,44 ± 0,05 em CGP (n= 8). A recuperação da depressão na presença de GFC foi ajustada por uma função exponencial dupla com constantes de tempo de 92 ms e 1,9 s, que foram semelhantes aos valores de controle (86 ms e 2 s). Assim, a ativação do GABAB os receptores não contribuem para o PPD nas sinapses GABAérgicas nessas culturas colliculares.

Um mecanismo pré-sináptico independente de liberação é responsável pelo PPDdevagar

Para examinar o possível papel do Ca 2+ residual nas respostas de pulso emparelhado, EGTA-AM foi carregado em culturas colliculares. EGTA liga Ca 2+ com cinética relativamente lenta. Portanto, concentrações moderadas deste quelante não devem interferir com os transientes breves, localizados e de alta concentração de Ca 2+ necessários para a liberação do transmissor (Adler et al. 1991 Llinás et al. 1992), mas irá acelerar a eliminação do Ca 2+ residual (Atluri & Regehr, 1996). De fato, a incubação em 5 μM de EGTA-AM por 20 min acelerou a decadência do transiente pré-sináptico de Ca 2+ em mais de 10 vezes, de 427 ± 30 ms (n= 16) no controle para 35 ± 3 ms (n= 5) no EGTA, sem reduzir a amplitude do pico (Fig. 4UMA e B) Uma vez que uma forma de permeante de membrana de EGTA foi usada nesses experimentos, a concentração do quelante nos terminais pré-sinápticos era desconhecida. No entanto, EGTA aumentou a taxa de falha de eIPSCs de 0,08 ± 0,02 (n= 16) no controle para 0,11 ± 0,02 (n= 14), o que sugere que o carregamento de EGTA-AM produziu uma concentração de tampão pré-sináptica mais alta do que o carregamento de OGB-1-AM. Este resultado provavelmente reflete a taxa de carregamento mais rápida do EGTA-AM. Para minimizar o efeito do aumento induzido por EGTA na taxa de falha do primeiro eIPSC, limitamos a análise a seguir a botões com taxas de falha de menos de 0,1 (11 de 14). Essa subpopulação teve uma taxa média de falha semelhante à dos terminais não tratados. As amplitudes médias dos primeiros eIPSCs (excluindo falhas) também foram semelhantes, ou seja, 131 ± 84 pA (média ± dp., n= 16) no controle e 125 ± 91 pA (média ± dp., n= 11) em EGTA. Os experimentos mostraram que PPDdevagar não foi afetado pela depuração acelerada do Ca 2+ pré-sináptico residual (Fig. 4C).

Ca 2+ residual pré-sináptico não determina PPDdevagar

UMA, transientes pré-sinápticos típicos de Ca 2+ sob condições de controle e após pré-incubação com 1 e 5 μM de EGTA-AM além de OGB-1. Concentração extracelular de Ca 2+: 5 m m. B, efeito de EGTA-AM na amplitude do pico (▵) e constantes de tempo de decaimento (τ, ▴) de transientes pré-sinápticos de Ca 2+. C, as razões de pulso emparelhadas de eIPSCs em intervalos entre estímulos & gt 500 ms não foram afetadas por EGTA e CLZ.

É improvável que a dessensibilização do receptor pós-sináptico desempenhe um papel no PPDdevagar, porque experimentos em neurônios do hipocampo mostraram que GABAUMA os receptores se recuperam da dessensibilização em algumas centenas de milissegundos (Jones & Westbrook, 1995). No entanto, examinamos a importância da atividade do receptor pós-sináptico aplicando o benzodiazepínico clonazepam (CLZ). CLZ aumenta a afinidade do GABAUMA receptor e prolonga GABAUMA ocupação do receptor (para revisão ver Costa, 1998). Na presença de CLZ, o decaimento eIPSC foi ajustado com um exponencial duplo (τ = 15 e 160 ms). A segunda constante de tempo foi significativamente maior em CLZ (160 ± 15 ms, n= 6) do que nos controles (81 ± 7 ms, n= 12, P & lt 0,01, dados não mostrados), mas a razão de pulso emparelhado em longos intervalos entre estímulos (≥ 1 s) não foi alterada pela presença de CLZ (em 1 s, 0,67 ± 0,04, n= 8 vs. 0.7 ± 0.09, n= 16, no controle). Assim, a indisponibilidade de GABA pós-sinápticoUMA receptores não é a base do PPDdevagar (Fig. 4C).

Isso deixa dois mecanismos potenciais de PPD com cinética de recuperação lenta: depleção da vesícula e modificação independente da liberação da probabilidade de liberação da vesícula. Se PPDdevagar foi causado pelo esgotamento do pool liberável, então a proporção PPD deve mudar com a taxa de falha. Portanto, examinamos as respostas de pulso pareado em intervalos de 1 s em três diferentes concentrações extracelulares de Ca 2+ (Fig. 5UMA) As taxas de falha e as amplitudes médias do eIPSC foram, respectivamente, 0,08 ± 0,02 e 131 ± 24 pA em Ca 2+ elevado (5 m m, n= 16), 0,29 ± 0,05 e 57 ± 13 pA em Ca 2+ normal (2 m m, n= 9), e 0,53 ± 0,03 e 32 ± 8 pA em baixo Ca 2+ (1 m m, n= 5). Não foi observada uma correlação da razão de pulso emparelhado com a taxa de falha (Fig. 5B).

PPDdevagar não depende da probabilidade de liberação

UMA, pares de eIPSC em um intervalo de 1 s em várias concentrações extracelulares de Ca 2+. Cada rastreamento é a média de 20 respostas. Os vestígios foram obtidos a partir de células diferentes. B, a razão de pulso emparelhado em 1 s não foi dependente da probabilidade de resposta / concentração extracelular de Ca 2+. Os números entre parênteses indicam o número de botões testados. ISI, intervalo entre estímulos.

Em seguida, investigamos a relação entre as amplitudes do primeiro e do segundo eIPSC em um par. Se a depleção de vesículas desempenhar um papel no PPD, haverá menos vesículas restantes para liberação imediata pelo segundo estímulo se o primeiro eIPSC em um par for maior do que a média. Portanto, o segundo eIPSC será menor que a média. Modelamos as flutuações de amplitude eIPSC em um paradigma de pulso emparelhado para determinar se a correlação prevista poderia ser detectada de forma confiável com apenas uma pequena amostra de medições de amplitude eIPSC. Os parâmetros de simulação foram definidos da seguinte forma: 40 eIPSCs emparelhados, oito vesículas no pool prontamente liberável antes do primeiro estímulo de cada par, a probabilidade de liberação foi de 0,4, a probabilidade de que uma vesícula liberada re-encaixada entre os estímulos emparelhados foi de 0,1, cada vesícula produziu uma resposta quantal média de 30 pA, e a amplitude quântica exibiu variabilidade intrínseca com um coeficiente de variação (CV) de 0,3. O modelo prevê PPD em torno de 50%, próximo ao nível médio de PPDdevagar em um intervalo entre estímulos de 1 s. Dez conjuntos de dados foram simulados. Apesar do pequeno tamanho da amostra e da grande dispersão nas amplitudes, a inclinação da linha de regressão foi negativa em todos os 10 casos. A correlação foi estatisticamente significativa em cinco dos 10 casos. Então, se a depleção da vesícula é responsável pelo PPDdevagar, então a correlação negativa é esperada na maioria dos conjuntos de dados e deve ser estatisticamente significativa em pelo menos alguns registros.

Nove botões foram testados para correlação negativa entre o primeiro e o segundo eIPSC em um intervalo entre estímulos de 1 s. A inclinação da linha de regressão foi negativa em apenas 3/9 botões, e não houve correlação significativa em nenhum dos conjuntos de dados. Para aumentar a sensibilidade da busca por uma correlação, os dados de todas as células foram agrupados. Para cada célula, a primeira e a segunda amplitudes eIPSC foram divididas pela amplitude média do primeiro eIPSC. Os dados normalizados foram agrupados e uma linha de regressão foi ajustada (Fig. 6UMA) Nenhuma correlação foi encontrada entre os eIPSCs emparelhados.

PPDdevagar é independente da versão anterior

UMA, gráfico do segundo contra o primeiro eIPSC para pares individuais no intervalo entre estímulos de 1 s. As amplitudes foram normalizadas para a amplitude média do primeiro eIPSC em todo o conjunto de dados (9 botões). A linha tracejada representa a regressão linear. Não houve correlação significativa entre as amplitudes de pico eIPSC (P & gt 0.4). B, binning de segundos eIPSCs de acordo com a amplitude do primeiro eIPSC em cada par. Registra em três diferentes concentrações extracelulares de Ca 2+. A depressão foi observada mesmo após uma falha da primeira resposta. Observe que a amplitude do segundo eIPSC não está relacionada à amplitude do primeiro eIPSC. Os números nas colunas indicam o número eIPSC. Dados agrupados de diferentes botões.

Em seguida, dividimos o primeiro eIPSC normalizado em três grupos (falhas, respostas menores que a média e respostas maiores que a média) e comparamos os segundos eIPSCs em diferentes concentrações extracelulares de Ca 2+ (Fig. 6B) A quantidade de depressão em 1 s novamente não estava relacionada à amplitude do primeiro eIPSC. Mesmo após o fracasso da primeira resposta, houve redução do segundo eIPSC. A proporção média de pulso emparelhado foi de 0,7 ± 0,09 (n= 16), 0.76 ± 0.04 (n= 9) e 0,74 ± 0,05 (n= 5) para Ca 2+ extracelular elevado, normal e baixo, respectivamente.

Tendo eliminado um mecanismo pós-sináptico e um mecanismo pré-sináptico dependente de liberação, a causa mais plausível de PPDdevagar é uma regulação negativa independente da liberação da probabilidade de liberação da vesícula.

Um mecanismo pré-sináptico independente de liberação, mas dependente de Ca 2+, pode fundamentar o PPDvelozes

Em contraste com PPDdevagar, PPDvelozes exibiu uma forte dependência da concentração extracelular de Ca 2+. Em um intervalo entre estímulos de 20 ms, PPDvelozes deprimiu o segundo eIPSC em 23% no Ca 2+ extracelular elevado (5 m m, n= 26), mas apenas 13% em Ca 2+ extracelular normal (2 m m, n= 9). A duração do PPDvelozes também foi menor em 2 m m de Ca 2+. Em baixo Ca 2+ extracelular (1 m m, n= 5) PPDvelozes era quase indetectável (Fig. 7UMA) Em seguida, testamos a dependência da relação de pulso emparelhada na taxa de falha do primeiro eIPSC (Fig. 7B) A depressão em um intervalo entre estímulos de 20 ms aumentou significativamente quando a taxa de falha diminuiu. Figura 7C mostra que a 50 ms a depressão do segundo eIPSC em Ca 2+ normal e elevado foi significativamente menor após uma falha, mesmo se comparado com um primeiro eIPSC mais fraco do que a média. Isso contrasta com PPD em 1 s, que era independente da taxa de falha

PPDvelozes depende da versão anterior e é mais forte em condições de alta probabilidade de liberação

UMA, dependência de PPDvelozes na concentração extracelular de Ca 2+. As linhas representam ajustes exponenciais únicos. B, dependência diferencial de PPDvelozes e PPDdevagar na taxa de falha. C, dependência do PPD na amplitude do primeiro eIPSC. Binning dos segundos eIPSCs de acordo com a amplitude do primeiro eIPSC em cada par. Registros mostrados para três concentrações diferentes de Ca 2+ extracelular. Nesta e nas figuras subsequentes, os asteriscos referem-se a níveis de significância. *P & lt 0,05, ***P & lt 0,001. Os números nas colunas indicam o número eIPSC. Dados agrupados de diferentes botões.

Em seguida, examinamos a relação entre PPDvelozes e a amplitude do primeiro eIPSC (Fig. 7C) Como na Fig. 6B, segundos eIPSCs normalizados foram agrupados em três grupos com base na amplitude do primeiro eIPSC, que foi categorizado como uma falha, uma resposta menor que a média ou uma resposta maior que a média. Em contraste com os resultados em 1 s, a razão de pulso pareado em Ca 2+ extracelular elevado foi sensível à amplitude do primeiro eIPSC. A proporção PPD foi significativamente diferente após primeiros eIPSCs menores (0,45 ± 0,02) vs. primeiros eIPSCs maiores (0,37 ± 0,02, P & lt 0,05).

Vale ressaltar que a facilitação de pulso pareado (PPF) nunca foi detectada. Mesmo quando a amplitude média dos primeiros eIPSCs (excluindo falhas) se aproximou da amplitude média dos IPSCs em miniatura (mIPSCs) (em 1 m m de Ca 2+ extracelular), uma segunda resposta maior do que o controle não foi observada. No entanto, não podemos excluir que uma facilitação sináptica sobreposta influencia a resposta de pulso emparelhado em intervalos menores que 20 ms.

Para investigar melhor a dependência do PPDvelozes no influxo anterior de Ca 2+, aplicamos o seguinte protocolo (Fig. 8UMA) Em um intervalo entre estímulos de 100 ms, os botões foram estimulados alternadamente por dois pares de estímulos diferentes. Um par consistia em um pulso fraco (1 μA) seguido por um pulso padrão. O outro par consistia em dois pulsos padrão (2 μA). O pulso mais fraco induziu um transiente pré-sináptico menor de Ca 2+ e um primeiro eIPSC menor do que o pulso padrão (Kirischuk et al. 1999uma ) O eIPSC1 amplitude evocada pelo pulso fraco foi de 0,72 ± 0,05 (n= 5) da amplitude após o pulso padrão. O eIPSC1 a taxa de falha foi de 0,21 ± 0,03 após um pulso fraco vs. 0.08 ± 0.03 (n= 5) após um pulso padrão.

Ca 2+ residual pré-sináptico contribui para PPDvelozes

UMA, eIPSCs induzidos por um par de estímulos padrão (direita) ou por um pulso padrão precedido por um pulso fraco (esquerda). As inserções ilustram os protocolos de estimulação. Cada traço representa a média de 20 respostas. Ambos os traços da mesma célula. Registros em 5 m m Ca 2+. B, gráfico da amplitude do segundo eIPSC contra a amplitude do primeiro eIPSC em pares individuais. As amplitudes foram normalizadas para a amplitude média do primeiro eIPSC (5 botões). A normalização é baseada nas respostas aos pulsos padrão. Dados agrupados. As linhas tracejadas representam os resultados da regressão linear. C, apenas dados de ensaios com uma faixa estreita de primeiros eIPSCs. As amplitudes dos primeiros eIPSCs estavam entre 0,5 e 1 (intervalo sombreado em B). **P & lt 0,01. D e E, igual a B e C, mas na presença de EGTA. Observe o PPD mais forte em um curto intervalo após o primeiro pulso mais forte nos controles, mas não no EGTA.

Os gráficos da Fig. 8B sugerem que a correlação negativa entre o segundo e o primeiro eIPSCs em intervalos de 100 ms foi mais pronunciada em tentativas com um primeiro pulso fraco. No entanto, aproveitando a ampla gama de flutuações eIPSC, fomos capazes de selecionar casos em que o eIPSC1 amplitudes induzidas pelos pulsos fracos e padrão foram semelhantes em sua média e amplitude de desvio padrão (faixa sombreada na Fig. 8B e D) Se um mecanismo independente de liberação, mas dependente de Ca 2+, contribui para PPDvelozes, a relação PPD deve variar com a força dos primeiros pulsos (porque eles causam influxo de Ca 2+ diferente), embora as amplitudes dos primeiros eIPSCs (a quantidade de transmissor liberado) fossem semelhantes. Em todos os cinco botões testados dessa forma, a amplitude média do segundo eIPSCs foi de fato maior após o primeiro pulso mais fraco. A diferença foi estatisticamente significativa em 4/5 botões (P & lt 0,05). Quando os conjuntos de dados dos cinco botões foram agrupados, a diferença na depressão após o pulso fraco e padrão foi diferente em P & lt 0,01 (Fig. 8C) Os segundos eIPSCs foram deprimidos para 0,61 ± 0,07 (n= 38) e 0,38 ± 0,06 (n= 37) após o pulso fraco e padrão, respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos para uma largura de compartimento maior (primeiros eIPSCs normalizados entre 0,5 e 1,5). Para esclarecer ainda mais a origem do PPDvelozes, repetimos o mesmo protocolo experimental após o carregamento de EGTA-AM (Fig. 8D) Figura 8E mostra que a presença de EGTA removeu a diferença na depressão do segundo eIPSCs após o pulso fraco e padrão (dados agrupados de 5 botões).

Uma explicação para esses resultados é que o Ca 2+ residual após o primeiro estímulo deprime o influxo de Ca 2+ produzido pelo segundo estímulo. Portanto, examinamos os transientes de Ca 2+ obtidos em testes de pulso emparelhados individuais (Fig. 9UMA) Experimentos em 10 botões mostraram que, em intervalos curtos entre estímulos, as segundas respostas de Ca 2+ estavam realmente deprimidas (ΔF2/ ΔF1= 0,44 ± 0,06, em um intervalo de 20 ms). As respostas de Ca 2+ recuperadas do PPD com uma constante de tempo de 180 ms (Fig. 9B) No entanto, a depressão observada do segundo transiente pré-sináptico de Ca 2+ pode refletir a saturação do corante sensível ao Ca 2+ de alta afinidade. Se fosse esse o caso, deveríamos esperar uma correlação negativa entre as amplitudes da primeira e da segunda resposta de Ca 2+, mas não houve correlação (resultados não mostrados). Para fornecer mais evidências de que a depressão do segundo transiente de Ca 2+ não resultou da saturação de OGB-1, experimentos adicionais (6 botões) foram realizados em culturas carregadas com o indicador de Ca 2+ de baixa afinidade MG. Novamente, as amplitudes dos segundos transitórios de Ca 2+ foram menores (ΔF2/ ΔF1= 0,52 ± 0,12, em um intervalo de 20 ms), e recuperado com uma constante de tempo de 120 ms (Fig. 9B) Assim, a depressão de pulso pareada do transiente pré-sináptico de Ca 2+ não foi devido à saturação de OGB-1.

O Ca 2+ pré-sináptico residual inibe o influxo de Ca 2+

UMA, exemplos de transientes pré-sinápticos de Ca 2+ em resposta a pares de estímulos padrão em intervalos de 50 e 100 ms. Registros baseados no carregamento de OGB-1 ou MG. Traço MG: média de cinco respostas. B, depressão de transitórios pré-sinápticos de Ca 2+ em função do intervalo de estímulo. Os pontos são médias de 100 (OGB-1) e 60 (MG) tentativas. Dez botões (OGB-1) e 6 (MG) botões foram testados. As curvas representam ajustes exponenciais. C, exemplos de transientes pré-sinápticos de Ca 2+ emparelhados registrados com OGB-1 na presença de EGTA. D, depressão de transientes pré-sinápticos de Ca 2+ em função do intervalo de estímulo na presença de EGTA (resultados de 7 botões). E, PPDvelozes na presença e ausência de EGTA. Linhas contínuas representam ajustes exponenciais.

O EGTA acelera a eliminação do Ca 2+ residual, portanto, em intervalos curtos, deve reduzir a depressão da segunda resposta de Ca 2+. Este foi o caso (Fig. 9C e D)Também examinamos o efeito do EGTA no comportamento do pulso emparelhado de correntes pós-sinápticas e descobrimos que o EGTA reduziu o PPDvelozes (Fig. 9E) Em um intervalo entre estímulos de 50 ms, a proporção PPD foi de 0,44 ± 0,05 em EGTA (n= 7), mas 0,36 ± 0,02 no controle (n= 16 diferença significativa em P & lt 0,01). A magnitude e a constante de tempo do PPDvelozes diminuiu de 23% e 86 ms, respectivamente, nos controles para 15% e 61 ms no EGTA. Concluímos, portanto, que nesta preparação a diminuição do influxo pré-sináptico de Ca 2+ pelo Ca 2+ residual representa um mecanismo independente de liberação adicional que pode causar depressão de IPSC em intervalos curtos.

Um mecanismo pós-sináptico dependente de liberação também pode contribuir para PPDvelozes

Os resultados acima não descartam a possibilidade de que um componente da depressão em intervalos curtos aumente com a quantidade do transmissor liberado. Por exemplo, a relação inversa entre o primeiro e o segundo eIPSCs em um intervalo de 100 ms após um primeiro pulso fraco (gráfico à esquerda na Fig. 8B) pode ser devido a uma indisponibilidade transitória de receptores transmissores pós-sinápticos, especialmente em ensaios com liberação multiquantal. Sabe-se que um pulso breve de alta concentração de GABA pode causar saturação e dessensibilização de GABAUMA receptores, tornando-os sem resposta a um segundo pulso do transmissor emitido alguns milissegundos depois (Jones & Westbrook, 1995). Conforme o GABA se difunde, o número de receptores não ligados aumenta, mas, devido à dessensibilização do receptor, a recuperação completa da responsividade leva & gt 100 ms. Este mecanismo tem o curso de tempo correto para contribuir com o PPDvelozes.

Se PPDvelozes resulta, em parte, da disponibilidade diminuída do receptor, então CLZ deve prolongar e aumentar o PPDvelozes. Foi esse o caso. Em um intervalo entre estímulos de 50 ms, CLZ reduziu a proporção PPD para 0,26 ± 0,04 (n= 10), em comparação com um valor de controle de 0,36 ± 0,02 (n= 17, P & lt 0,05, não mostrado). Para caracterizar ainda mais o componente pós-sináptico do PPDvelozes, as experiências de pulso emparelhado foram realizadas na presença de antagonistas GABA competitivos. A justificativa para usar GABAUMA antagonistas do receptor de baixa afinidade com cinética rápida e de alta afinidade com cinética lenta são semelhantes aos de experimentos anteriores com bloqueadores de receptor de AMPA ou NMDA (Liu et al. Chen de 1999 et al. 2002). Resumidamente, no caso extremo de saturação completa, todos os GABAUMA os receptores ligariam o GABA no primeiro pulso e nenhum receptor estaria disponível para um segundo pulso em um intervalo suficientemente curto. Isso resultaria em uma falha na evocação de um segundo eIPSC. Quando um antagonista bloqueia um subconjunto de GABAUMA receptores, GABA ativa os receptores disponíveis desencadeando um primeiro eIPSC que é menor que o controle. No entanto, se a taxa de dissociação do antagonista for menor ou comparável ao tempo de GABA presente na fenda sináptica (Clements et al. 1992), alguns receptores tornam-se disponíveis para um segundo pulso GABA. Como esses receptores foram protegidos pelo antagonista, eles não entraram em um estado de dessensibilização e agora podem gerar um segundo eIPSC. Portanto, na presença do antagonista, a proporção de pulsos emparelhados aumentará. Em contraste, se um antagonista de alta afinidade com uma taxa de desativação lenta bloqueia a mesma fração de GABAUMA receptores, o antagonista permanecerá ligado após o primeiro estímulo, não deixando nenhum receptor disponível para o segundo estímulo. A proporção de pulso emparelhado permanecerá quase inalterada pela presença do antagonista. O mesmo raciocínio se aplica quando a saturação do receptor não está completa e prevê que se GABAUMA a saturação do receptor está desempenhando um papel, um antagonista de alta afinidade / taxa de desaceleração lenta terá pouco efeito sobre o PPDvelozes, enquanto um antagonista de baixa afinidade / antagonista de taxa de desaceleração rápida deve diminuir o PPDvelozes.

Para realizar este teste foi utilizado ácido 1,2,5,6-tetrahidropiridin-4-il-metilfosfínico (TPMPA 300 μM) e metiodeto de bicuculina (IMC 1 μM). TPMPA é um antagonista de baixa afinidade e equilíbrio rápido no GABAUMA receptor (kdesligado≈0,6 ms), enquanto o IMC é um antagonista de GABA de alta afinidade, lentamente equilibrando (kdesligado≈20 ms) (Jones et al. 2001). As concentrações de TPMPA e IMC foram escolhidas para serem próximas ao IC relatado50 valores para Cl induzido por GABA - correntes (Ragozzino et al. 1996 Jonas et al. 1998). Os resultados de seis experimentos com TPMPA e quatro experimentos com IMC estão de acordo com essas previsões. No caso de TPMPA (Fig. 10UMA e B), mas não o IMC (Fig. 10B), o segundo eIPSC foi menos inibido do que o primeiro eIPSC. Consequentemente, a relação PPD foi aumentada pelo TPMPA, mas não pelo IMC. Esses resultados apóiam a ideia de que um componente do PPDvelozes pode ter uma origem pós-sináptica.

Contribuição pós-sináptica para PPDvelozes

UMA, eIPSCs em um intervalo de 20 ms na presença de 300 μM de TPMPA. Acima: traços médios de 20 tentativas. Abaixo: sobreposição dos traços médios após a normalização para o pico do primeiro eIPSC. Ambos os traços do mesmo botão. B, resumo dos resultados para TPMPA e experimentos semelhantes com 1 μM de IMC. Em um intervalo de 20 ms, o TPMPA, mas não o IMC, bloqueou o segundo eIPSC menos do que o primeiro eIPSC. **P & lt 0,01.

A depressão sináptica de curto prazo devido à saturação ou dessensibilização do receptor pós-sináptico pode influenciar a soma das chamadas IPSCs assíncronas (aIPSCs), que em algumas condições seguem a eIPSC bloqueada por estímulo (Goda & Stevens, 1994). Examinamos como as amplitudes de aIPSCs dependem do tempo de sua ocorrência após o estímulo que induz o eIPSC (Fig. 11UMA) A baixa taxa de ocorrência de aIPSCs limitou a análise a poucos botões. Um número razoável de aIPSCs (& gt 20) foi obtido em cinco botões testados em Ca 2+ elevado (5 m m). AIPSCs individuais foram normalizados para a amplitude média de mIPSCs e agrupados para os gráficos da Fig. 11B e C. EIPSCs maiores do que a média foram selecionados para este teste. Descobrimos que aIPSCs ocorrendo em menos de 100 ms após o estímulo foram significativamente suprimidos. Sua amplitude normalizada foi de 0,63 ± 0,04 (51 eventos), enquanto a amplitude de aIPSCs ocorrendo entre 100 e 300 ms após o pulso foi de 0,99 ± 0,03 (86 eventos). A constante de tempo de recuperação da supressão aIPSC foi de 50 ms (Fig. 11C) Embora as frequências mIPSC fossem baixas (0,5 ± 0,3 Hz, n= 16) nas culturas de baixa densidade, temos que considerar uma possível contribuição de mIPSCs decorrentes de outros contatos. No entanto, desde que os mIPSCs ocorram aleatoriamente, sua soma com os eIPSCs não deve variar com o intervalo de tempo. Também é possível que a depressão dependente do tempo de aIPSCs seja devido a uma despolarização local ou shunt no dendrito. No entanto, nem os conjuntos de dados de botões individuais nem os dados agrupados (Fig. 11D) mostraram uma correlação negativa entre as amplitudes eIPSC e aIPSC, o que argumenta contra a despolarização local ou shunt como causa da redução aIPSC em intervalos curtos. Observe que em todos esses experimentos os eIPSCs foram substancialmente maiores do que os aIPSCs, o que significa que os eIPSCs foram, muito provavelmente, induzidos por liberação multiquantal. Assim, os resultados das gravações aIPSC estão em linha com os resultados dos experimentos anteriores que sugeriram que, sob condições de eficácia de alta liberação, PPDvelozes também pode ter um componente pós-sináptico.

Limites funcionais da transmissão de botão único

UMA, sobreposição dependente do tempo de IPSCs assíncronos (seta aIPSCs) e eIPSCs. Experimente em 5 m m Ca 2+. B, aIPSCs foram normalizados para a amplitude média de IPSC em miniatura (mIPSC) e plotados contra o intervalo após o pulso. A linha tracejada representa o ajuste exponencial. C, dependência da depressão aIPSC no intervalo após o estímulo usado para induzir eIPSCs. Mesmos dados de B. Cem binning de milissegundos de intervalos após o pulso. Houve supressão de aIPSCs em intervalos curtos (***P & lt 0,001). D, diagrama de dispersão para mostrar que aIPSCs registrados dentro de 100 ms após o estímulo não estavam relacionados à amplitude de eIPSCs. Dados agrupados de 5 botões. Todas as amplitudes de IPSC foram normalizadas para a amplitude média de mIPSCs.


Estudos ultraestruturais em peptídeos no corno dorsal da medula espinhal - I. Coexistência de galanina com outros peptídeos em aferentes primários em ratos normais

O objetivo do presente estudo foi investigar imunorreatividade semelhante à galanina em terminais aferentes primários e sua relação com outros neuropeptídeos nas lâminas I e II do quarto e quinto segmentos lombares da medula espinhal de rato normal usando imunofluorescência e elétron pré e pós-incorporação -imunocitoquímica microscópica. A coloração por imunofluorescência tripla mostrou que a imunorreatividade semelhante à galanina co-localizada com imunorreatividade semelhante a peptídeo relacionada ao gene da substância P e calcitonina em muitas fibras nervosas e terminais nas lâminas I e II do corno dorsal. No nível ultraestrutural, usando imunocitoquímica pré-embutida, imunorreatividade semelhante à galanina foi encontrada em glomérulos do tipo I com um terminal central denso de elétrons contendo muitas vesículas sinápticas densamente compactadas e várias vesículas de núcleo denso grandes. Tanto o citoplasma quanto o núcleo das vesículas grandes eram imunorreativos. Em glomérulos do tipo II com um terminal central elétron-lucente e vesículas sinápticas fracamente compactadas, as grandes vesículas de núcleo denso e o citoplasma eram apenas fracamente positivos para a galanina. A imunocitoquímica pós-incorporação revelou que a imunorreatividade semelhante à galanina coexistia com imunorreatividade semelhante a peptídeo relacionada ao gene da substância P e calcitonina em muitos terminais e em vesículas de núcleo denso grandes individuais na lâmina II. Esses terminais foram considerados aferentes primários, uma vez que há evidências de que o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina no corno dorsal ocorre apenas nas terminações nervosas originadas nos gânglios da raiz dorsal. Evidências também foram obtidas inesperadamente para a ocorrência de vários outros peptídeos em terminais positivos para peptídeos gerados por calcitonina, isto é, presumivelmente em aferentes primários. Assim, a imunorreatividade semelhante à galanina, às vezes, também co-localizada com imunorreatividade semelhante à colecistocinina e neuropeptídeo tirosina em terminais imunorreativos de peptídeo relacionados ao gene da calcitonina e em algumas vesículas de núcleo denso grandes em tais terminais. Um pequeno número de peptídeos imunorreativos relacionados ao gene da calcitonina, presumivelmente terminais aferentes primários, continham imunorreatividades semelhantes à encefalina, neurotensina (e galanina).

Esses resultados indicaram que a galanina pode ser co-armazenada com vários outros neuropeptídeos em grandes vesículas de núcleo denso em terminais aferentes primários e pode presumivelmente ser liberada junto com eles na camada superficial do corno dorsal. Uma vez que várias combinações de peptídeos, presumivelmente em concentrações variáveis, ocorrem nas vesículas de núcleo denso grandes em uma determinada terminação nervosa, é provável que as vesículas de núcleo denso grandes individuais produzidas em um neurônio sejam heterogêneas no que diz respeito ao conteúdo de peptídeo e, portanto, a a mensagem que eles transmitem após o lançamento.


Os botões sinápticos estão sempre localizados nos axônios? - Biologia

Posição do mapa genético -2R: 12.639.001..12.660.002 [-]

A transição morfológica de cones de crescimento para botões sinápticos caracteriza a sinaptogênese. Este estudo isolou mutações em conexões imaculadas (nome do imac FlyBase unc-104), codificando um membro da família Kinesin-3. Considerando que estudos anteriores em Drosophila implicaram Kinesin-1 no transporte de precursores de vesículas sinápticas, este estudo descobriu que Imac / Unc-104 é essencial para este transporte. Uma característica inesperada dos mutantes imac é a falha na formação de botões sinápticos. Os neurônios motores sem imac direcionam-se adequadamente para os músculos, mas permanecem dentro dos campos-alvo como processos finos, uma estrutura que é distinta de cones de crescimento ou terminais maduros. Poucas zonas ativas se formam nessas terminações. A interrupção da sinaptogênese não é uma consequência secundária da ausência de transmissão. Esses dados, portanto, indicam que o Imac transporta componentes necessários para a maturação sináptica e fornecem uma visão sobre a maturação pré-sináptica como um processo que pode ser diferenciado do crescimento e direcionamento do axônio (Pack-Chung, 2007).

Quando um cone de crescimento neuronal atinge seu campo-alvo e entra em contato com as células apropriadas, o terminal do axônio sofre morfogênese sináptica. Essa transformação é um processo complexo pelo qual as especializações filopodiais do cone de crescimento e do aparelho para extensão e navegação dos axônios são substituídas por terminais nervosos varicosos estáveis ​​especializados em liberar neurotransmissores. Atualmente, os mecanismos moleculares e celulares que orientam a transição dos cones de crescimento para as sinapses maduras não estão bem definidos (Pack-Chung, 2007).

Os cones de crescimento e as sinapses são estruturalmente distintos. Redes de citoesqueleto de actina suportam a borda externa do cone de crescimento e a extensão dos microtúbulos pode direcionar o crescimento axonal. Em contraste, as sinapses maduras contêm maquinaria para interações estáveis ​​com especializações pós-sinápticas, arranjos citoesqueléticos distintos e o aparato para liberação e reciclagem do transmissor. Este aparelho inclui vesículas sinápticas e a zona ativa, uma região de membrana densa de elétrons que contém canais de Ca 2+ e complexos de proteínas necessários para a liberação do transmissor. Assim, há uma distinção entre os componentes de um cone de crescimento e uma sinapse madura que é paralela às suas morfologias distintas (Pack-Chung, 2007).

Os componentes sinápticos são sintetizados principalmente no corpo da célula neuronal e, portanto, para estarem disponíveis para formar sinapses, precisam ser transportados pelo axônio. A formação de sinapses, no entanto, pode ocorrer dentro de 30 minutos do contato axodendrítico inicial. Para permitir essa transição rápida, os materiais sinápticos estão presentes nos axônios antes do início da sinaptogênese e são subsequentemente capturados por contatos sinápticos incipientes. Transportadas como agregados de organelas ligadas à membrana, essas estruturas vesiculares, às vezes chamadas de 'pacotes', incluem proteínas da vesícula sináptica (sinaptotagmina-I, sinaptobrevina, SV2 e sinapsina-1) e proteínas da membrana plasmática (canais de Ca 2+). Essas cargas são imobilizadas em contatos axodendríticos como parte de um processo rápido que leva à conectividade funcional. Uma organela de transporte é conhecida como PTV (vesícula de transporte Piccolo-Bassoon) e acredita-se que forneça muitos componentes de zonas ativas. Tanto os pacotes quanto os PTVs mostram movimento bidirecional nos axônios, mas nenhum motor foi mostrado para mediar esse movimento (Pack-Chung, 2007).

Essas organelas de transporte ocorrem nas sinapses periféricas e centrais dos vertebrados, e sistemas análogos são provavelmente necessários nas junções neuromusculares de Drosophila (NMJs). Nesta sinapse, os cones de crescimento do neurônio motor se transformam em NMJs funcionais, mas imaturos, dentro de uma hora do contato inicial com os músculos alvo. A maturação morfológica em botões sinápticos, entretanto, requer 3-5 h. Como nos sistemas de mamíferos, a sinaptotagmina-I e outros componentes sinápticos estão presentes nos axônios antes de atingirem seus alvos. A formação de botons se correlaciona com aumentos na imunorreatividade da sinaptotagmina, em vesículas de núcleo claro e denso e em zonas ativas. O transporte desses componentes durante o desenvolvimento do NMJ está, portanto, implícito, embora os motores necessários permaneçam desconhecidos (Pack-Chung, 2007).

Este estudo relata a identificação de um locus genético que codifica uma cinesina necessária para a maturação pré-sináptica. Mutações no gene conexões imaculadas evitar que as terminações nervosas se transformem em botões sinápticos: os cones de crescimento ficam contraídos, mas permanecem dentro dos campos de contato como processos finos que não têm varicosidades ou botões. Além de não ter componentes de vesículas sinápticas e de núcleo denso, imac as terminações nervosas mutantes também contêm muito poucas zonas ativas. Caracterização de imac assim, implica um motor específico no processo de maturação pré-sináptica e fornece uma visão sobre as relações entre os motores e a formação de sinapses e a diferenciação pré e pós-sináptica (Pack-Chung, 2007).

Uma triagem genética direta foi realizada para isolar genes que afetam as sinapses. Nesta tela, o EGUF-escondido O método foi usado para produzir olhos mutantes homozigotos em uma mosca heterozigótica, e a função sináptica foi avaliada selecionando para cegueira e eletrorretinogramas anormais (ERGs). Um grupo de complementação consistia em oito alelos derivados independentemente. Olhos mutantes homozigotos externamente pareciam normais e seus ERGs mostraram respostas robustas à luz, no entanto, os "transitórios on-off" do ERG, que requerem transmissão sináptica sináptica dos fotorreceptores para neurônios de segunda ordem, estavam ausentes em olhos que eram homozigotos para qualquer dos alelos mutantes. Moscas homozigotas de cada alelo morreram como embriões não eclodidos em estágio final. A morfologia geral desses embriões foi comparável à de uma mosca do tipo selvagem que completou a embriogênese 20-22 h após a postura dos ovos (AEL). Os mutantes, no entanto, estavam paralisados ​​e não tinham o peristaltismo muscular coordenado necessário para a incubação. Essa paralisia sugeria um déficit neurológico e, portanto, o padrão de desenvolvimento de neurônios individuais foi examinado (Pack-Chung, 2007).

Especificamente, o NMJ embrionário, um sistema no qual o tempo e a anatomia da inervação e da sinaptogênese foram descritos em detalhes, foi explorado. Para o nervo intersegmentar b (ISNb), o foco foi colocado nos ramos que inervam os músculos longitudinais ventrais (músculos 6, 7, 11 e 12). Os cones de crescimento chegam às 12 h AEL. Esses contatos amadurecem rapidamente e, por

14 h AEL (estágio 16), os neuritos se estendem ao longo dos limites entre as fibras musculares adjacentes. Esses contatos então se transformam em sinapses que têm ramos finos característicos com varicosidades ou botões que se assemelham a 'contas em um fio' (Pack-Chung, 2007).

Em embriões mutantes deste grupo de complementação, incluindo aqueles homozigotos para alelos nulos, os axônios ISNb entraram em contato com seus músculos por 14 h AEL. Apesar do crescimento axonal normal e direcionamento, os contatos não tinham ramos estendidos. Estruturas semelhantes às do filipodia às vezes eram observadas, mas não se restringiam aos limites dos músculos. Às 21 h AEL, o nervo era visível em suas regiões-alvo, mas os contatos não haviam se transformado em sinapses maduras; os nervos não tinham os botões semelhantes a contas vistos em embriões do tipo selvagem. Em vez disso, as terminações e seus ramos eram mais restritos do que aqueles nas 14 h AEL e frequentemente retinham alguns processos semelhantes aos dos filipódios. A falha em formar botões foi completamente penetrante, foi observada em todos os segmentos abdominais de todos os genótipos examinados (alelos imac 52 , imac 102 , imac 160 , imac 116 e imac 170 como homozigotos ou em combinação com Df (2R) DAlk21) (Pack-Chung, 2007).

Às vezes, axônios nos limites dos músculos 12 e 13 não eram observados, levantando a possibilidade de que alguns tivessem retraído.Ocasionalmente, projeções ectópicas foram observadas de nervos vizinhos. Essas entradas se formam como resultado da desnervação das fibras musculares-alvo e, portanto, são consistentes com a ausência de sinapses nesses músculos. Ao contrário dos botões maduros formados por ramos ectópicos em outros mutantes, no entanto, aqueles que se formaram em imac embriões mutantes não tinham botões. Consequentemente, tanto a inervação normal quanto a projeção ectópica ocasional eram incapazes de morfogênese normal. Assim, o crescimento axonal e o direcionamento de neurônios motores mutantes ocorreram, mas a formação de sinapses subsequentes foi interrompida. O gene foi nomeado conexões imaculadas (imac) para indicar a completa falta de botões sinápticos no mutante (Pack-Chung, 2007).

Reação em cadeia da polimerase (PCR) mapeamento de polimorfismo de comprimento (PLP) colocado imac entre 53C e 54E. Uma deficiência, Df (2R) DAlk21, que descobriu a região 53C7 a 53D não complementou o imac alelos. Nesta região, um gene predito que codifica um homólogo de cinesina (símbolo FlyBase Klp53D) foi identificado como um gene candidato plausível. Sequenciamento de DNA genômico em todos os oito alelos de imac identificaram mutações pontuais que alteraram o produto proteico previsto deste gene. Como essas mutações foram induzidas em um fundo genético isozigoto e porque os genes próximos não mostraram diferenças de sequência entre si ou em comparação com o cromossomo parental, a cinesina prevista foi identificada como Imac. Esta identificação foi confirmada pelo resgate da letalidade embrionária pela expressão de um imac Transgene de cDNA sob controle de um driver da-GAL4 ou elav-GAL4. Com a expressão neuronal restaurada da cinesina, as larvas mutantes surgiram com botões sinápticos em seus NMJs (Pack-Chung, 2007).

O produto Imac previsto representa uma isoforma de cinesina que não foi estudada anteriormente em Drosophila, mas contém um domínio associado a forkhead (FHA), uma característica da família de motores Kinesin-3. Imac mostra maior homologia com Unc-104, um Kinesin-3 de Caenorhabditis elegans (51% de identidade de aminoácidos) e as cinesinas murinas KIF1A (53%) e KIF1B & # 946 (51%). Embora o genoma da Drosophila preveja a existência de outros membros da família Kinesin-3, Imac é o único membro que inclui um domínio de homologia de pleckstrina (PH) terminal carboxi, uma característica compartilhada com Unc-104, KIF1A e KIF1B & # 946. imac 170 tem um códon de parada precoce em Trp58 e, portanto, é provável que seja um alelo nulo. Este alelo foi, portanto, usado para a maioria das análises fenotípicas, seja como um homozigoto ou durante Df (2R) DAlk21 para evitar os efeitos de possíveis mutações de segundo local. Dois dos alelos contêm substituições de aminoácidos no domínio motor conservado. Um desses, imac 52, tem uma substituição de serina em Gly97, um resíduo essencial no local de ligação de ATP de todos os motores de cinesina. A interrupção da formação pré-sináptica do botão no imac 52 mutante foi comparável ao mutante do alelo nulo, indicando que o defeito de desenvolvimento resultou da perda de uma função motora dependente de ATP do Imac (Pack-Chung, 2007).

Os anticorpos policlonais foram gerados para uma porção do domínio do pedúnculo do Imac. A imunocoloração de embriões de tipo selvagem em 21 h AEL mostrou enriquecimento de Imac no sistema nervoso, em particular nas regiões ricas em sinapses. A coloração com Imac estava ausente em embriões mutantes homozigotos, verificando a especificidade do anti-soro para Imac. Em embriões de montagem inteira, a expressão neural de Imac foi detectada pela primeira vez nos estágios 11-12 e permaneceu enriquecida no sistema nervoso pelo restante da embriogênese. O início da expressão Imac corresponde à expressão de muitas proteínas pré-sinápticas. Assim, a expressão temporal e espacial do Imac impede uma contribuição materna significativa da proteína e, em vez disso, sugere uma função tardia no desenvolvimento neuronal (Pack-Chung, 2007).

A identificação do Imac como uma cinesina sugeriu que a interrupção da sinaptogênese pode resultar de uma falha no transporte das cargas necessárias. Homólogos do Imac em C. elegans (Unc-104) e camundongo (KIF1A) estão implicados no transporte de proteínas associadas à vesícula sináptica (Hall, 1991 Okada, 1995 Klopfenstein, 2004 Yonekawa 1998 Zhao, 2001). Em neurônios Drosophila, por outro lado, a cinesina convencional (Kinesin-1 ou KHC) foi relatada para transportar vesículas sinápticas com base no aparecimento de agregados axonais de vesículas sinápticas em mutantes de perda parcial de função de cadeia pesada de cinesina (khc) Portanto, a localização dos componentes sinápticos foi examinada em imac mutantes. NMJs de embriões de tipo selvagem em 21 h AEL mostraram agrupamentos de vários componentes pré-sinápticos em botões sinápticos. Por exemplo, a sinaptotagmina-I, uma proteína da membrana da vesícula sináptica, foi restrita a zonas discretas nas varicosidades sinápticas. Pouca ou nenhuma sinaptotagmina-I foi observada ao longo dos axônios de embriões de tipo selvagem. No imac mutantes, no entanto, a coloração de sinaptotagmina-I estava ausente tanto nas terminações nervosas quanto no tronco do axônio. A imunorreatividade da sinaptotagmina-I foi restaurada nos mutantes pela expressão imac cDNA em neurônios. Da mesma forma, a coloração terminal e axonal nos mutantes foi desprezível com anticorpos para o transportador vesicular de glutamato (VGlut) (Pack-Chung, 2007).

Terminais de axônio também podem liberar peptídeos que são armazenados em vesículas de núcleo denso. Essas organelas são sintetizadas no corpo celular e passam por transporte dependente de microtúbulos mediado por cinesina para o local de secreção. Para examinar se o transporte de vesículas de núcleo denso foi afetado em imac mutantes, a expressão de um transgene que codifica a proteína fluorescente verde (GFP) fundida ao precursor do fator natriurético atrial (ANF) de rato foi monitorada. Este transgene (UAS-ANF-GFP) sofre processamento, transporte e liberação de maneira semelhante a outros neuropeptídeos em Drosophila. A expressão robusta de pontos GFP foi observada nos terminais sinápticos das linhas de controle. ANF-GFP não foi detectado nos axônios do motor ou seus terminais em imac mutantes. Assim, semelhante ao envolvimento de C. elegans Unc-104 no movimento de vesículas de núcleo denso (Jacob, 2003), Imac provavelmente medeia o transporte axonal de vesículas de núcleo denso em Drosophila (Pack-Chung, 2007).

A falta de componentes da vesícula sináptica e de núcleo denso nos terminais nervosos pode ser atribuída a uma falha em sintetizar essas proteínas, uma incapacidade de exportá-las dos corpos celulares ou uma incapacidade de retê-las nas sinapses nascentes. Para explorar essas possibilidades, a localização das moléculas sinápticas no SNC foi examinada. No SNC de embriões de Drosophila, o neurópilo define uma região livre de corpo celular que é enriquecida em contatos sinápticos, axônios e glia. O córtex, uma região que circunda o neurópilo, contém principalmente os corpos celulares neuronais. As seções transversais do SNC podem, portanto, ser usadas para monitorar as concentrações de proteínas em corpos celulares em relação às regiões axonal e sináptica em uma ampla amostragem de tipos neuronais. A marcação das membranas plasmáticas dos neurônios com anticorpos contra a peroxidase de rábano (HRP), um marcador da membrana neuronal, revelou a arquitetura geral do SNC. A densidade da membrana no neurópilo faz com que essa estrutura seja mais intensamente marcada do que o córtex. Este padrão não foi alterado de forma detectável em imac mutantes, indicando que os mutantes não tinham defeito anatômico grave (Pack-Chung, 2007).

Os componentes das vesículas sinápticas e de núcleo denso foram, no entanto, marcadamente redistribuídos em imac mutantes. A imunorreatividade da sinaptotagmina-I, por exemplo, é normalmente intensamente concentrada no neurópilo e escassa no córtex. No imac mutantes, esse padrão foi revertido: a sinaptotagmina-I acumulou-se nos corpos celulares e estava baixa no neurópilo. Synaptotagamin-I-GFP, expresso no imac sistema nervoso mutante por um driver elav-GAL4, mostrou a mesma redistribuição. VGlut, normalmente encontrado em algumas sinapses do SNC que são glutamatérgicas, foi redistribuído de forma semelhante do neurópilo para os corpos celulares em imac mutantes, assim como a proteína da cadeia de cisteína e ANF-GFP. A concentração das proteínas vesiculares em imac corpos celulares mutantes indicam que essas proteínas são sintetizadas nos mutantes. A perda desses marcadores nos tratos dos axônios e nas regiões sinápticas indica um defeito em seu transporte dos corpos celulares. A ausência de imunorreatividade dessas moléculas nos axônios periféricos dos neurônios motores também apóia a ideia de que o Imac tem um papel direto no transporte de materiais sinápticos. Além disso, a imagem de células vivas de precursores de vesículas nos nervos segmentares de um imac mutante revelou defeitos no movimento anterógrado dessas cargas (R. Barkus e W. Saxton, comunicação pessoal para Pack-Chung, 2007), corroborando ainda mais a ideia de que o Imac tem uma função motora (Pack-Chung, 2007).

Para determinar se Imac está envolvido no transporte de outras proteínas e organelas, a distribuição de vários componentes intracelulares foi examinada. O crescimento axonal normal e orientação observada em imac mutantes implica que o transporte de vesículas pós-Golgi com novas proteínas de membrana e de superfície celular persiste. O marcador de membrana neuronal, HRP, não revelou quaisquer diferenças significativas entre o tipo selvagem e imac mutantes. O tráfego de membrana pós-Golgi foi examinado em imac mutantes usando uma fusão dos domínios extracelulares e transmembrana de CD8 a um GFP citoplasmático, um construto que serve como um repórter não específico do transporte constitutivo de proteínas de membrana para a superfície celular, incluindo axônios e terminais. A distribuição de CD8-GFP não foi afetada em imac mutantes. Da mesma forma, Fasciclin II (FasII), um homólogo de Drosophila de moléculas de adesão de células neurais de vertebrados e um regulador essencial do crescimento e orientação do neurônio motor, permaneceu concentrado nos tratos axônicos e regiões sinápticas em imac mutantes. Outra proteína da membrana plasmática, a sintaxina, é necessária para a exocitose e adição de membrana à superfície celular. Nenhuma mudança na distribuição da sintaxina, visualizada com o anticorpo monoclonal 8C3, foi detectada em imac-embriões nulos. Esses dados são consistentes com a observação de que o crescimento do axônio e o direcionamento ocorrem normalmente em imac mutantes, e eles demonstram que as vesículas necessárias para a extensão da membrana e direcionamento do axônio não são transportadas pelo Imac. Além disso, os dados suportam o modelo atual em que os mecanismos que regulam o crescimento da membrana são distintos da exocitose da vesícula sináptica madura (Pack-Chung, 2007).

Terminais sinápticos também são enriquecidos em mitocôndrias, uma organela transportada pela cinesina-1. As mitocôndrias foram visualizadas usando Mito-GFP, uma variante GFP direcionada mitocondrialmente. Wild-type e imac nervos mutantes tinham distribuições semelhantes de mitocôndrias, indicando seu transporte adequado nos axônios do neurônio motor (Pack-Chung, 2007).

Por causa da ausência de botões semelhantes a contas em imac mutantes, o componente neuronal do citoesqueleto Futsch, uma proteína de Drosophila com homologia com a proteína associada ao microtúbulo de vertebrado MAP1B, foi examinado. Loops de microtúbulos agrupados contendo Futsch estão presentes em muitos botões sinápticos de tipo selvagem em NMJs de larvas de terceiro ínstar e podem contribuir para a estrutura arredondada do botão. Em contraste, microtúbulos não agrupados caracterizam cones de crescimento, e Futsch provavelmente contribui para a transição de microtúbulos não agrupados para agrupados. Em embriões, no entanto, a importância do Futsch no NMJ não é conhecida (Pack-Chung, 2007).

Em embriões de tipo selvagem, a imunorreatividade de Futsch era abundante nos axônios dos neurônios motores e nas sinapses no NMJ, embora loops de microtúbulos imunorreativos para Futsch fossem discerníveis apenas ocasionalmente em botões. No imac mutantes, Futsch foi detectado de forma semelhante em axônios motores e no NMJ, embora a imunorreatividade foi mais descontínua do que no tipo selvagem. Consistente com a ausência de botões, nenhum loop de imunorreatividade de Futsch foi visto em imac mutantes. Embora a distribuição de Futsch sugira que ocorreram mudanças no citoesqueleto de imac mutantes, a presença de Futsch nas terminações indica que esta proteína do citoesqueleto é transportada independentemente do Imac. Esse achado é consistente com o movimento conhecido de muitos componentes do citoesqueleto por transporte axonal lento. Além disso, a distribuição normal de mitocôndrias e trans-Marcadores de vesículas derivados de Golgi indicam que a falha no transporte de componentes sinápticos não pode ser secundária a defeitos de microtúbulos. Da mesma forma, a ausência de botões em imac mutantes não podem ser atribuídos à ausência de Futsch (Pack-Chung, 2007).

A localização foi examinada de duas proteínas sinápticas que são citoplasmáticas ao invés de organelas associadas ou citoesqueléticas. Ambas as proteínas, LAP (também conhecido como AP180) e endofilina, estão envolvidas na endocitose das vesículas sinápticas. Sua distribuição no sistema nervoso foi enriquecida, mas não estritamente limitada a, neurópilo tanto no tipo selvagem quanto imac mutantes. Assim, as mislocalizations observadas em imac mutantes parecem ser específicos para um subconjunto de proteínas sinápticas (Pack-Chung, 2007).

Os componentes da zona ativa podem chegar às sinapses nascentes, pelo menos em parte, por meio de PTVs, embora essa classe de vesícula não tenha sido descrita em Drosophila. Para determinar a extensão do transporte e montagem da zona ativa em imac mutantes, um marcador de zona ativa, anticorpo monoclonal nc82, foi examinado, o qual demonstrou reconhecer Brp, um membro da família de proteínas ELKS / CAST / ERC e um provável componente da barra T, um corpo denso que se projeta de volta para dentro o citoplasma da densidade de elétrons na membrana plasmática. NMJs de tipo selvagem em 21 h AEL mostraram aglomerados de nc82 puncta em botões. imac mutantes mostraram apenas 11% dos pontos do tipo selvagem e esses pontos também eram mais fracos. Esta redução não pode ser explicada por uma diminuição na área de superfície dos contatos nervo-músculo no mutante: a quantidade de nc82 puncta por área HRP foi de apenas 23% do tipo selvagem. Para verificar esse ponto em imac mutantes não estavam sendo perdidos devido a uma diminuição na intensidade da imunorreatividade do nc82, os pontos foram recontados com uma configuração de ganho confocal mais alta que não pôde ser usada em NMJs de tipo selvagem por causa da saturação e consequente fusão óptica dos pontos. Mesmo com esse viés de supercontagem no mutante, apenas 24% dos pontos observados no tipo selvagem foram observados. Além disso, dentro da área contada, muitos dos pontos em imac os mutantes ocorreram ao longo dos axônios, e não nas terminações, onde normalmente estão localizados. No SNC, a proporção de coloração de nc82 na região do corpo celular em relação ao neurópilo também foi maior em imac mutantes do que no tipo selvagem (Pack-Chung, 2007).

Como a mudança na imunorreatividade do nc82 não foi tão absoluta quanto a diferença observada para os marcadores da vesícula sináptica, a emergência da imunorreatividade do nc82 no NMJs de ISNb foi examinada quantitativamente. No tipo selvagem, alguns pontos de imunorreatividade do nc82 foram detectados às 13 e 14 h AEL, quando o cone de crescimento entra em contato com o músculo e os processos começam a se alongar ao longo dos limites do músculo. Às 15 h AEL, entretanto, o número de puncta aumentou acentuadamente, e aumentos modestos subsequentes ocorreram até a eclosão. Às 13 e 14 h AEL, imac embriões, como embriões de tipo selvagem, tinham apenas alguns pontos nc82. No imac mutantes, no entanto, o grande aumento em 15 h AEL não ocorreu. Em vez disso, o número de puncta diminuiu modestamente durante o restante do desenvolvimento embrionário. Mesmo levando em consideração a menor área de superfície dos contatos nervo-músculo em imac mutantes, nc82 puncta eram mais esparsos em imac mutantes do que no tipo selvagem. Apesar de sua escassez, a presença de alguns pontos nc82 (mas não proteínas da vesícula sináptica) nos mutantes nos estágios iniciais sugeriu que alguma proteína da zona ativa pode se difundir ou ser transportada para os axônios independentemente de imac, pelo menos nesta fase inicial. A falta de aumento na coloração de nc82, no entanto, é um fenótipo inicial dos mutantes que é aparente antes do estágio em que as varicosidades deixam de se formar (Pack-Chung, 2007).

Para determinar a natureza dos contatos nervo-músculo mutantes e procurar sinais de formação de zona ativa ou acúmulo de vesículas que podem não ter sido detectados por imunocitoquímica, a microscopia eletrônica foi realizada. Em um determinado corte transversal através de um embrião de tipo selvagem, em média dez NMJs foram identificados, entre os quais cinco zonas ativas e três barras T foram vistas. A identificação de NMJs de tipo selvagem foi relativamente simples, pois os terminais continham vesículas sinápticas de tamanho uniforme. No imac mutantes, no entanto, a maioria dos contatos nervo-músculo não tinha vesículas e foram, portanto, reconhecidos com base na aposição próxima da terminação do nervo elétron-lucente às fibras musculares e na presença da membrana basal sobreposta à terminação nervosa. Usando esses critérios, contatos de 0-2 nervo-músculo foram normalmente identificados por seção. A ausência de vesículas sinápticas dificultou a identificação dos nervos em imac mutantes e, conseqüentemente, alguns contatos podem ter sido perdidos (Pack-Chung, 2007).

Para sistematizar esta caracterização desses contatos nervo-músculo, microscopia eletrônica serial de cortes transversais de imac embriões foi realizada. As contagens da zona ativa e da barra T foram normalizadas para a área de superfície medida da neurita para levar em consideração a escassez de contatos reconhecíveis em imac mutantes e mudanças em seu tamanho. Zonas ativas foram de fato reconhecidas em imac terminações nervosas mutantes, mas em

60% da frequência encontrada no tipo selvagem, quando o número da zona ativa ou a área da zona ativa foi normalizada para a área de superfície neuronal total nas seções. imac mutantes mostraram uma redução maior (17% do controle) na frequência da barra T. Além disso, imac As barras T eram frequentemente menores do que as barras T do tipo selvagem. Ocasionalmente, eles eram circundados por material denso de elétrons difuso que não se assemelhava a vesículas de membrana. Em média, 70 perfis de vesículas sinápticas foram contados por seção de botões de tipo selvagem. Assim, como esperado da imunocitoquímica, imac as terminações nervosas eram menos extensas, raramente ou nunca continham vesículas sinápticas e tinham poucas zonas ativas e muito poucas barras T (Pack-Chung, 2007).

Esses estudos revelaram que um motor molecular tem um papel na maturação pré-sináptica e fornecem informações sobre a formação de sinapses.Especificamente, esta análise fenotípica demonstra, em primeiro lugar, que o Imac transporta componentes necessários para a transformação morfológica de cones de crescimento axonal em botões maduros, segundo, que a membrana e as proteínas que suportam o crescimento de axônio, orientação de axônio e reconhecimento de alvo não dependem da mesma cinesina para seu transporte como aquele que suporta a sinaptogênese e, terceiro, que a diferenciação pós-sináptica não depende do agrupamento de vesículas sinápticas, transmissão sináptica ou formação de botão pré-sináptica. Além disso, a descoberta de que o Imac é essencial para o transporte de precursores da vesícula sináptica sugere que este é seu motor principal, ao invés de KHC. Outros componentes da sinapse podem ser classificados como dependentes ou independentes do Imac com base em seu fenótipo de transporte (Pack-Chung, 2007).

O fenótipo de imac mutantes não tem precedentes, apesar da extensa análise genética do Drosophila NMJ como um sistema modelo para o desenvolvimento de sinapses. Estudos anteriores descobriram moléculas que são cruciais para o pathfinding dos axônios e, no entanto, apesar do direcionamento incorreto, os axônios nesses mutantes ainda formam botões se atingirem um músculo. Em contraste, a mutação de imac afeta todos os NMJs no embrião que foram analisados ​​e previne a formação de varicosidades, apesar dos sinais de crescimento adequado, orientação e reconhecimento do alvo do nervo. Muitas vias de sinalização, incluindo aquelas mediadas por atividade elétrica, Wingless, proteínas morfogenéticas ósseas, Highwire e fasciclinas, podem regular o crescimento e a plasticidade dessas sinapses. Essas vias influenciam o número do botão e o tamanho, comprimento e ramificação das terminações, mas não impedem a formação do botão de imediato. Da mesma forma, os mutantes que afetam a especificidade da sinapse em C. elegans (por exemplo, syg-1 e syg-2) formam sinapses estruturalmente normais (Pack-Chung, 2007).

Apesar das evidências de C. elegans e sistemas de mamíferos implicando motores Kinesin-3 (Unc-104 e KIF1A) no transporte axonal de precursores de vesículas sinápticas, motores Kinesin-1 de mamíferos também foram associados com transporte de vesículas sinápticas. Além disso, KHC, um Kinesin-1, tem sido o candidato predominante para este transporte em Drosophila. A principal evidência implicando KHC tem sido a presença em khc larvas mutantes de inchaços axonais preenchidos com várias vesículas e organelas, incluindo marcadores de vesículas sinápticas. Esses acúmulos, às vezes chamados de 'engarrafamentos', são distintos dos imac fenótipo mutante: isto é, a ausência categórica de marcadores de vesículas sinápticas de axônios de neurônios motores e o transporte persistente de outras organelas (Pack-Chung, 2007).

A ausência de vesículas de axônios em imac mutantes parecem indicar que nenhum outro motor pode substituir o Imac durante a formação do NMJ, embora o KHC esteja presente nesses neurônios motores e transporte mitocôndrias na ausência do Imac. O acúmulo de proteínas da vesícula sináptica em intumescências axonais em khc mutantes podem surgir indiretamente da falha de outras classes de transporte, potencialmente atrapalhando o tráfego nos axônios. Alternativamente, o transporte mediado por KHC pode suplementar Imac em Drosophila mais velha, apesar do papel essencial de Imac no transporte de vesículas sinápticas durante de novo sinaptogênese embrionária (Pack-Chung, 2007).

Acredita-se que os PTVs carreguem muitos constituintes da zona ativa dos mamíferos, mas nada se sabe sobre o transporte da zona ativa em Drosophila. Assim, a mudança na distribuição de Brp (nc82) e o fenótipo ultraestrutural de imac relatados neste estudo representam uma investigação inicial desse processo. Esses fenótipos não são tão absolutos, entretanto, como aqueles observados para marcadores de vesículas sinápticas e de núcleo denso, portanto, a entrega de proteínas da zona ativa pode ser mais complexa. A escassez dessas proteínas em imac terminações nervosas mutantes podem ocorrer porque Imac tem um papel direto em seu transporte ou porque pode haver uma falha em prendê-los ou concentrá-los no terminal (Pack-Chung, 2007).

Em contraste, a persistência de alguns Brp em axônios e suas terminações, embora drasticamente reduzida em NMJs, sugere que o transporte ou difusão de Brp pode persistir, mas que sua captura nas sinapses pode ser prejudicada pela falta de maturação sináptica. Em contraste, as reduções nos pontos imunorreativos nc82 e contagens da zona ativa foram maiores do que poderia ser explicado pela diminuição no tamanho dos contatos nervo-músculo. Além disso, a escassez de nc82 puncta foi aparente por 15 h AEL, antes do estágio em que os botões se formam. Assim, a falha em formar zonas ativas e barras T suficientes é improvável que seja secundária à falha em formar botões. Em vez disso, sugere que o Imac é diretamente responsável pelo transporte de uma porção das proteínas da zona ativa ou pelo transporte de uma proteína necessária para retê-las nos contatos musculares (Pack-Chung, 2007).

No imac mutantes, a diferenciação pós-sináptica foi avaliada por dois métodos: primeiro, a presença de densidades pós-sinápticas por microscopia eletrônica e, segundo, o agrupamento de receptores de glutamato por imunocitoquímica. Por ambos os critérios, a especialização da membrana pós-sináptica no local de contato do nervo ocorreu na ausência de vesículas sinápticas e sem a transição morfológica para um botão sináptico. Acredita-se que as mudanças estruturais pós-sinápticas, indicadas pelo agrupamento de receptores, sejam induzidas pelo contato com o nervo. A importância da liberação do transmissor nesses processos, no entanto, tem sido controversa, em parte porque não há mutantes disponíveis que evitem claramente a liberação evocada e a liberação espontânea de vesículas sinápticas sem também comprometer a sobrevivência do axônio. Axônios em imac mutantes carecem de componentes essenciais para a liberação de neurotransmissores, incluindo VGlut, que é necessário para carregar vesículas com glutamato e, de fato, carecem das próprias vesículas sinápticas. Apesar disso, as subunidades do receptor de glutamato agrupam-se no músculo abaixo das membranas neuronais, indicando que o transmissor vesicular é liberado per se não é necessário para a diferenciação pós-sináptica (Pack-Chung, 2007).

Não se pode excluir a possibilidade de que o glutamato não vesicular induza a resposta pós-sináptica ou que outras moléculas sejam liberadas do cone de crescimento. O desenvolvimento pré e pós-sináptico não pode ser completamente independente porque os locais de liberação e os grupos de receptores precisam ser alinhados. No imac mutantes, esse alinhamento é preservado, apesar do número reduzido de zonas ativas e da imunorreatividade do nc82 diminuída. Assim, a maquinaria envolvida na correspondência de estruturas pré e pós-sinápticas persiste, pelo menos em parte, em imac mutantes. Os aglomerados de receptores de glutamato não foram reduzidos em número ou intensidade tão marcadamente quanto zonas ativas reconhecíveis em imagens de microscopia eletrônica ou como a intensidade de nc82 puncta em terminações nervosas. Assim, a baixa concentração de imunorreatividade nc82 oposta à maioria dos agrupamentos de receptores de glutamato pode representar zonas ativas incompletamente montadas (Pack-Chung, 2007).

Esta análise de imac mutantes facilitou a dissecção dos mecanismos de transporte que funcionam durante uma fase crucial do desenvolvimento neuronal. A existência de um motor para a maturação pré-sináptica diferente daquele para o crescimento e orientação dos axônios pode refletir as diferentes necessidades regulatórias para a distribuição das moléculas que medeiam esses eventos. A nova membrana, por exemplo, é trazida de forma consistente para a ponta crescente do axônio, enquanto os precursores sinápticos viajam em ambas as direções no axônio, procurando sinais de células-alvo que determinarão onde formarão uma conexão funcional. Uma maior compreensão da sinaptogênese exigirá a identificação dos fatores que regulam esses motores e as cargas particulares que alteram a morfologia das terminações nervosas (Pack-Chung, 2007).

Identificação de um motor axonal de cinesina-3 para transporte vesicular anterógrado rápido que facilita o transporte retrógrado de neuropeptídeos

Uma triagem para genes necessários no desenvolvimento do olho de Drosophila identificou um motor de microtúbulo de cinesina-3 relacionado a UNC-104 / Kif1. A análise de mutantes sugeriu que Drosophila Unc-104 tem funções neuronais que são distintas daquelas do motor axonal anterógrado clássico, Kinesin-1. Em particular, unc-104 as mutações não causaram a paralisia distal e intumescências axonais focais características da cinesina-1 (Khc) mutações. No entanto, como Khc mutações, unc-104 mutações causaram atrofia terminal do motoneurônio. As distribuições e comportamentos de transporte de organelas marcadas com proteína fluorescente verde em axônios motores indicam que Unc-104 é um dos principais contribuintes para o transporte rápido anterógrado de vesículas cheias de neuropeptídeos, que também contribui para o transporte anterógrado de vesículas contendo sinaptotagmina, e que contribui pouco ou nada para o transporte anterógrado das mitocôndrias, que são transportadas principalmente por Khc. Notavelmente, unc-104 as mutações inibiram as corridas retrógradas por vesículas neurossecretoras, mas não pelas outras duas organelas. Isso sugere que o Unc-104, um membro de uma subfamília de cinesina anterógrada, contribui para um mecanismo de transporte retrógrado dirigido por dineína específico para organelas (Barkus, 2008).

Para obter informações sobre os mecanismos de transporte axonal, as consequências da inibição de uma cinesina-3 foram estudadas em Drosophila. O fundador da subfamília kinesin-3, UNC-104, foi descoberto como uma proteína C. elegans necessária para o comportamento de rastreamento coordenado. Estudos subsequentes de C. elegans UNC-104, mamífero Kif1A, B e outros membros da família da cinesina-3 revelaram que diferentes motores da cinesina-3, que se movem relativamente rápido em direção às extremidades positivas dos microtúbulos, podem transportar uma variedade de cargas diferentes, incluindo endossomos, mitocôndrias e várias vesículas. Os resultados indicam que Drosophila Unc-104 pode transportar pelo menos dois tipos de vesículas anterógradas em axônios motores, o fator natriurético atrial específico cardíaco (ANF), vesículas de núcleo denso carregando neuropeptídeo (DCVs) e pequenas vesículas de transporte com sinaptotagmina (STVs ) O Unc-104 também pode transportar outros tipos de organelas, mas nenhuma evidência foi encontrada para o transporte de mitocôndrias axonais (Barkus, 2008).

Sabe-se que o transporte axonal envolve o movimento energético de organelas individuais, cada uma puxada ao longo dos filamentos do citoesqueleto por proteínas motoras. A análise de lapso de tempo relatada neste estudo enfatiza o quão distintos os comportamentos de transporte de diferentes organelas podem ser, e levanta questões sobre os fundamentos mecanicistas dessas diferenças. Uma possibilidade é que a velocidade varia inversamente com o tamanho da organela, implicando que a resistência citoplasmática ao movimento (arrasto viscoso) é um determinante chave do comportamento de transporte e, portanto, da dinâmica de distribuição de carga. As mitocôndrias nos axônios das larvas de Drosophila variam amplamente em comprimento, até vários micrômetros, e têm um diâmetro médio de 150 nm. DCVs são principalmente esféricos com diâmetros de cerca de 100 nm. A velocidade e o comprimento médios de corrida do DCV foram, respectivamente, 4 e 20 vezes maiores do que os das mitocôndrias, consistentes com uma relação tamanho-velocidade inversa. No entanto, embora o diâmetro do DCV seja duas a três vezes maior do que o dos STVs (

30 nm), as médias de velocidade e comprimento de corrida de DCV foram, respectivamente, 1,5 e 4 vezes maiores do que as de STVs. Além disso, foi relatado anteriormente que as velocidades de execução das mitocôndrias nos axônios motores das larvas eram independentes do comprimento das mitocôndrias. Essas observações argumentam que o comportamento de transporte é determinado principalmente pela identidade de organela e diferenças específicas de organela nos mecanismos de transporte, ao invés de diferenças no arrasto viscoso dependente do tamanho (Barkus, 2008).

Uma fonte provável de diferenças no mecanismo de transporte são as capacidades mecanoquímicas intrínsecas de diferentes motores. Os resultados apresentados neste estudo indicam que muitas DCVs anterógradas em axônios motores de Drosophila usam Unc-104 (cinesina-3). Trabalhos anteriores no mesmo sistema mostraram que as mitocôndrias anterógradas usam Khc (cinesina-1). Corridas de DCV têm velocidade mais alta e corridas anterógradas mais longas que as mitocôndrias, consistente com testes in vitro que mostram que as construções Unc-104 diméricas se movem com velocidade e processividade mais altas do que as construções Khc diméricas. Esse tipo de diferença mecanoquímica direta, no entanto, falha em explicar por que STVs marcados com sinaptotagmina, que também usam Unc-104, têm execuções mais lentas e mais curtas do que DCVs. Além disso, as velocidades e comprimentos de corrida retrógrada que foram medidos para os três tipos de organela foram bastante diferentes, apesar do fato de que a cadeia pesada da dineína citoplasmática (Dhc64C) é o único motor de microtúbulo retrógrado rápido conhecido disponível em Drosophila. Assim, embora as diferenças nas propriedades mecanoquímicas dos motores sejam importantes para o comportamento diferencial do transporte de organelas, parece claro que o desempenho do motor pode ser influenciado pela identidade da carga (Barkus, 2008).

Fatores específicos da carga que podem alterar a saída de um motor incluem modificação motora pós-tradução, proteínas de ligação motor-carga e a presença de outros motores na mesma organela. Cinesina-3s são relatados como monoméricos in vitro, e monômeros individuais movem-se lentamente nos microtúbulos. No entanto, a dimerização induzida artificialmente permite um movimento mais processivo mais rápido, apoiando a hipótese de que o agrupamento de motores em uma organela pode ser um determinante importante do comportamento de transporte. Como o Unc-104 pode se ligar diretamente às membranas das vesículas através de um domínio de âncora lipídica FH, uma variação no agrupamento controlado pela dinâmica do lipid raft pode produzir variação na velocidade e na processabilidade. Além disso, algumas cargas são conhecidas por usar vários tipos de motores anterógrados. Estudos recentes mostraram que duas cinesinas diferentes com velocidades distintas, quando ativas na mesma carga dendrítica, geram movimento a uma velocidade intermediária. Assim, as velocidades mais lentas dos STVs relatadas neste estudo podem refletir o uso misto de Unc-104 rápido e Khc mais lento, enquanto as velocidades de DCV mais rápidas podem refletir clusters de Unc-104 sozinho (Barkus, 2008).

Os resultados do rastreamento de organelas sugerem uma influência positiva específica do anterógrado Unc-104 na velocidade e comprimento retrógrado do DCV. Um estudo anterior do transporte mitocondrial em axônios de Drosophila mostrou que a cinesina-1 é crítica para o fluxo retrógrado da mitocôndria impulsionado pela dineína. Embora esse tipo de influência positiva de um motor oposto possa refletir uma interação física direta entre a cinesina-1 e o complexo da dineína, também pode refletir a dependência logística simples por duas razões. (1) Para que números normais de mitocôndrias se movam retrógrados, os números normais devem ser transportados anterógrados. Como o kineisn-1 é o motor anterógrado, as mutações Khc resultam em um baixo número de mitocôndrias nos axônios distais. (2) A própria dineína deve ser transportada para o axônio distal, antes que possa funcionar no transporte retrógrado, e a cinesina-1 é provavelmente responsável por parte desse movimento anterógrado da dineína. Em contraste, as diminuições de velocidade e comprimento de corrida retrógrada de DCV observadas em axônios mutantes unc-104 não foram gerais, isto é, para STVs ou mitocôndrias, diminuições estatisticamente significativas na velocidade de corrida retrógrada ou comprimento não foram observadas. Isso sugere que o Unc-104 tem uma influência positiva específica para a organela na função da dineína ligada ao DCV (Barkus, 2008).

Como o Unc-104 poderia contribuir para o transporte retrógrado do DCV? Possivelmente, ele pode ser responsável por fornecer fatores reguladores de dineína específicos de DCV no axônio que aumentam a velocidade e o comprimento retrógrados da corrida. Isso não exigiria nenhuma associação específica de Unc-104 com organelas retrógradas. No entanto, o fato de que o movimento retrógrado de Unc-104 :: GFP foi observado em axônios de C. elegans e Drosophila, juntamente com um relatório de que C. elegans UNC-104 é uma carga retrógrada de dineína sugere possibilidades mais diretas. (1) Os complexos de acoplamento de motores específicos de DCV podem justapor motores anterógrados e retrógrados de modo que o próprio Unc-104 atue como um ativador alostérico para dineína. (2) Unc-104 em DCVs pode facilitar seu transporte retrógrado biofisicamente, por exemplo, gerando intermitentemente tensão reversa e movimento que ajuda os complexos dineína-DCV a ultrapassar as barreiras estéricas no axônio (Barkus, 2008).

É aparente que os neurônios usam uma variedade de mecanismos de transporte baseados em microtúbulos para suportar axônios longos. Cada tipo de organela, RNP e complexo proteico deve ter uma distribuição e taxa de substituição ideais para manter a fisiologia e função adequadas do axônio. Assim, embora pareça que apenas alguns motores básicos geradores de força são usados, a diversidade em sua produção de transporte por meio de influências motor-motor específicas de carga e outros esquemas regulatórios é provavelmente importante para otimizar a função do sistema nervoso. Como as proteínas motoras têm efeitos complexos em vários processos em neurônios e outras células, a identificação de fatores de controle motor específicos de carga será importante, tanto para a compreensão dos mecanismos básicos da organização citoplasmática quanto para fornecer novos alvos potenciais para drogas que podem retardar o progresso de axônios. doenças neurodegenerativas relacionadas ao transporte (Barkus, 2008).

A localização baseada em microtúbulos de um complexo de sinalização de cálcio sináptico é necessária para a assimetria neuronal esquerda-direita em C. elegans

Os axônios de C. elegans neurônios olfatórios de AWC esquerdo e direito se comunicam em sinapses por meio de um complexo de sinalização de cálcio para regular identidades celulares assimétricas estocásticas chamadas AWC (ON) e AWC (OFF). No entanto, não se sabe como o complexo de sinalização de cálcio, que consiste em UNC-43 / CaMKII, proteína adaptadora TIR-1 / SARM e NSY-1 / ASK1 MAPKKK, está localizado em locais pós-sinápticos nos axônios AWC para esta interação lateral . Este estudo mostra que a localização baseada em microtúbulos do complexo de sinalização TIR-1 para as sinapses regula a assimetria de AWC. Igual a unc-43, tir-1 e nsy-1 mutantes de perda de função, a interrupção específica dos microtúbulos em AWC pelo nocodazol gera dois neurônios AWC (ON). A localização reduzida das proteínas UNC-43, TIR-1 e NSY-1 nos axônios AWC se correlaciona fortemente com o fenótipo 2AWC (ON) em animais tratados com nocodazol. Motor Kinesin unc-104 / kif1a foram identificados mutantes para aumento do fenótipo 2AWC (ON) de um mutante tir-1 hipomórfico. Mutações em unc-104, como a despolimerização de microtúbulos, leva a um nível reduzido de proteínas UNC-43, TIR-1 e NSY-1 nos axônios AWC. Além disso, o transporte dinâmico de TIR-1 nos axônios AWC depende de unc-104, o principal motor necessário para o transporte de vesículas pré-sinápticas. Além disso, unc-104 atua de forma não celular de forma autônoma no neurônio AWC (ON) para regular a identidade AWC (OFF).Juntos, esses resultados sugerem um modelo no qual UNC-104 pode transportar algum (s) fator (es) pré-sináptico (s) desconhecido (s) na célula AWC (ON) futura que não celular controla autonomamente o tráfego do complexo de sinalização TIR-1 para regiões pós-sinápticas do AWC axônios para regular a identidade AWC (OFF) (Chang, 2011).

Perda de syd-1 de neurônios R7 interrompe duas fases distintas do desenvolvimento pré-sináptico

Análises genéticas em verme e mosca identificaram a proteína semelhante a RhoGAP Syd-1 (RhoGAP100F) como um regulador positivo chave da montagem pré-sináptica. No verme, perda de syd-1 pode ser totalmente resgatado pela superexpressão de Liprin- & alpha de tipo selvagem, sugerindo que a função primária de Syd-1 neste processo é recrutar Liprin- & alpha. Este estudo mostra que a perda de syd-1 dos fotorreceptores Drosophila R7 causa dois defeitos morfológicos que ocorrem em pontos de tempo de desenvolvimento distintos. Primeiro, syd-1 axônios mutantes R7 muitas vezes falham em formar botões terminais em sua camada alvo M6 normal. Mais tarde, os axônios mutantes que entram em contato com M6 costumam projetar extensões finas além dele. O defeito anterior coincide com uma falha em localizar vesículas sinápticas (SVs), sugerindo que ele reflete uma falha na montagem pré-sináptica. O relacionamento entre syd-1 e Liprin- & alpha em R7s foi analisado. Verificou-se que a perda de Liprin- & alpha causa um defeito inicial R7 mais forte e fornece uma possível explicação para esta disparidade: Liprin- & alpha promove o transporte de axônio mediado por Kinesin-3 / Unc-104 / Imac independentemente de Syd-1 e que Kinesin-3 / Unc-104 / Imac é necessário para a formação normal do botão R7. Ao contrário da perda de syd-1, a perda de Liprin- & alpha não causa extensões R7 tardias. Foi demonstrado que a superexpressão de Liprin- & alpha resgata parcialmente os primeiros, mas não os últimos syd-1 defeito R7 mutante. Conclui-se, portanto, que os dois defeitos são causados ​​por mecanismos moleculares distintos. A superexpressão do trio foi encontrada para resgatar ambos syd-1 defeitos e que trio e syd-1 têm fenótipos de perda e ganho de função semelhantes, sugerindo que a função primária de Syd-1 em R7s pode ser promover a atividade do Trio (Holbrook, 2012).

Proteínas SV fundidas com GFP, como Syt-GFP, são ferramentas clássicas para estudar o desenvolvimento pré-sináptico, mas não foram usadas anteriormente para analisar R7s. Este estudo descobriu que, como esperado, Syt-GFP dentro de R7s é enriquecido em locais conhecidos por microscopia eletrônica para conter zonas ativas. Perda de LAR, Liprin- & alpha, ou syd-1 faz com que os terminais R7 falhem em contatar sua camada normal, M6, de destino. Este estudo demonstrou que este defeito morfológico se correlaciona temporalmente com uma falha em localizar VSs em locais pré-sinápticos e, portanto, é provável que reflita um defeito no desenvolvimento pré-sináptico de R7, em vez de simplesmente na seleção da camada alvo (Holbrook, 2012).

Liprin- & alpha não é apenas um andaime para a montagem e retenção de componentes pré-sinápticos, incluindo SVs, em locais pré-sinápticos, mas também um regulador positivo do transporte axônio dependente de Kinesin-3 / Unc-104 / Imac desses componentes. Este estudo mostra que, ao contrário de Liprin- & alpha, Syd-1 não é necessário para o transporte normal mediado por Kinesin-3 / Unc-104 / Imac. No entanto, os VVs são igualmente mal localizados em Liprin- & alpha e syd-1 axônios mutantes R7 que contatam M6. Uma interpretação simples é que essa localização incorreta reflete um requisito para Liprin- & alpha e syd-1 na retenção de SVs dentro de terminais R7 em apoio a isso, verificou-se que os SVs são localizados normalmente para syd-1 terminais do axônio mutante R7 às 24 h APF, antes da sinaptogênese. Foi hipotetizado que a interrupção adicional do transporte do axônio em Liprin- o mutante alfa R7s é refletido em sua maior incapacidade de manter contato com M6 em apoio a isso, verificou-se que imac axônios mutantes R7 também perdem contato com M6 (Holbrook, 2012).

Embora ambos Liprin- & alpha e syd-1 são necessários para o agrupamento de SVs em sinapses en passant no worm, syd-1 não é necessário para a localização de SVs para terminais NMJ em voo. Os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento pré-sináptico em NMJ e em R7s foram mostrados anteriormente para diferir em vários aspectos. A descoberta atual destaca ainda mais a importância de analisar o desenvolvimento de sinapses usando vários tipos de neurônios (Holbrook, 2012).

Embora as mitocôndrias sejam frequentemente enriquecidas nas sinapses, ainda não está claro qual proporção delas pode ser associada de forma estável a locais pré-sinápticos, em vez de ser transportados para lá em resposta às necessidades agudas de energia. Em pelo menos alguns axônios, a maioria dos aglomerados de mitocôndrias estacionárias residem em locais não sinápticos. Em R7s, Mito-GFP foi encontrado para ser enriquecido em locais pré-sinápticos. Como os neurônios fotorreceptores de artrópodes liberam neurotransmissores continuamente em resposta à luz, esse enriquecimento pode ser simplesmente causado por necessidades contínuas de energia. No entanto, este estudo descobriu que as mitocôndrias permaneceram enriquecidas nos terminais R7 mesmo na ausência de atividade evocada pela luz, indicando que a liberação espontânea é suficiente para o seu recrutamento ou um mecanismo independente da atividade é responsável. Especula-se que as demandas permanentemente altas de energia nas sinapses dos fotorreceptores podem ter sido selecionadas para a associação independente da atividade das mitocôndrias com as sinapses R7 e que esta localização requer syd-1 e Liprin-&alfa. Mito-GFP está mal localizado em imac R7s mutantes, apesar do trabalho anterior indicar que Kinesin-3 / Unc-104 / Imac não é necessário para o transporte de mitocôndrias. Portanto, pensa-se que as mitocôndrias são normalmente amarradas em locais pré-sinápticos R7 e que a perda de imac indiretamente causa sua localização incorreta, interrompendo o transporte dos componentes necessários para que o tethering ocorra (Holbrook, 2012).

Trabalhos anteriores identificaram dois fenótipos diferentes associados à perda de LAR/Liprin / trio caminho: perda de LAR ou Liprin- & alpha fez com que os axônios R7 terminassem antes de sua camada alvo M6, enquanto a perda de Liprin- & beta ou trio fez com que os axônios R7 projetassem extensões além de M6. Uma possibilidade é que esses dois defeitos sejam simplesmente manifestações diferentes do mesmo defeito celular: uma diminuição na estabilidade do contato sináptico entre R7s e seus alvos. No entanto, este estudo mostrou que a perda de um único gene, syd-1, causa ambos os defeitos e que os defeitos ocorrem em pontos de tempo de desenvolvimento distintos, sugerindo que eles ocorrem por mecanismos distintos. Em apoio a isso, a superexpressão de Liprin- & alpha pode resgatar os primeiros, mas não os tardios syd-1 defeito (Holbrook, 2012).

O defeito anterior, a falta de contato com M6, se correlaciona com a falha em localizar VSs, sugerindo, como mencionado acima, que isso representa uma falha na montagem das sinapses. No entanto, a causa do defeito morfológico posterior e a natureza precisa das extensões permanecem obscuras. É observado que as extensões muitas vezes terminam em pequenas varicosidades que podem conter Syt-GFP e Mito-GFP, indicando que eles não são simplesmente filopódios, mas podem representar locais de montagem pré-sináptica ectópica. Uma possibilidade é que, como no NMJ, a perda de syd-1 causa acúmulos ectópicos de Liprin- & alpha, Brp, Nrx-1 ou outras proteínas pré-sinápticas e que podem então promover montagem pré-sináptica ectópica anormal. Uma segunda possibilidade é que as extensões podem ser uma consequência indireta da função de syd-1 no desenvolvimento pós-sináptico: talvez as extensões sejam a resposta do syd-1 terminal R7 mutante para defeitos em seu alvo pós-sináptico. Perda de Liprin- & alpha não causa tal efeito pós-sináptico, fornecendo uma explicação do porquê Liprin- & alpha R7s mutantes não formam extensões. Uma terceira possibilidade é que os R7s formem tipos distintos de sinapses em diferentes momentos. A falha em montar um tipo de sinapse, que R7s montam primeiro, causa diminuição do contato com M6, enquanto a falha em montar um segundo tipo, que ocorre mais tarde, resulta em extensões. Consistente com este modelo, R7s formam sinapses com mais de um tipo de neurônio (Holbrook, 2012).

Perda de syd-1 tem um efeito significativamente mais fraco no desenvolvimento do NMJ da mosca do que a perda de Liprin-&alfa. Da mesma forma, este estudo mostra que a fase inicial do desenvolvimento terminal R7, durante a qual os componentes pré-sinápticos são localizados, é menos afetada pela perda de syd-1 do que por perda de Liprin-&alfa. Uma possível explicação para essa diferença é identificada: perda de Liprin- & alfa, mas não de syd-1, diminui significativamente o transporte de axônio mediado por Kinesin-3 / Unc-104 / Imac, e Kinesin-3 / Unc-104 / Imac é necessário para R7s para formar botões em M6 (Holbrook, 2012).

Tanto no verme quanto na mosca, Syd-1 é necessário para a localização normal de Liprin- & alpha e Brp / ELKS em locais pré-sinápticos. No verme, perda de syd-1 pode ser resgatado pela superexpressão de Liprin- & alfa de tipo selvagem completo ou pela superexpressão de um domínio de Liprin- & alfa que promove a oligomerização de proteínas Liprin- & alfa, ou por uma mutação que aumenta a capacidade de Liprin- & alfa de se ligar a Brp / ELKS. Esses resultados sugerem que a função primária do Syd-1 é potencializar as atividades do Liprin- e alfa. No entanto, este sutyd descobriu que a superexpressão de Liprin- & alpha resgata apenas parcialmente o defeito inicial que syd-1 mutantes R7s têm na montagem de sinapses. Isso sugere que, como no verme, o Liprin- e alfa pode atuar parcialmente independentemente do Syd-1 durante a montagem pré-sináptica, mas que, ao contrário do verme, o Syd-1 também tem alguma função independente do Liprin e alfa. Em contraste, a superexpressão de Liprin- & alpha não resgata de forma alguma as extensões tardias causadas pela perda de syd-1. Como especulado acima, uma possibilidade é que essas extensões possam ser causadas por Liprin- & alpha, Brp ou Nrx-1 mal localizados (Holbrook, 2012).

Ao contrário de Liprin- & alpha, a superexpressão Trio resgata totalmente os primeiros e parcialmente resgata o defeito tardio causado pela perda de syd-1, sugerindo que Syd-1 promove o desenvolvimento do terminal sináptico R7 principalmente pela potencialização da atividade do Trio. Consistente com este modelo, perda de trio perda de fenocópias de syd-1 de R7s, e a superexpressão de Syd-1 ou Trio ignora a necessidade de LAR em graus semelhantes. No fly NMJ, o Trio promove o desenvolvimento pré-sináptico agindo como um GEF para Rac1. Syd-1 tem um domínio RhoGAP, embora um que não tenha demonstrado interagir com GTPases. Syd-1 pode atuar distantemente a montante do Trio. No entanto, também é possível que Syd-1 possa regular uma ou mais pequenas GTPases em paralelo com Trio. GAPs e GEFs têm efeitos opostos sobre GTPases, mas perda de trio ou syd-1 causa defeitos semelhantes no NMJ e no R7s. Uma possibilidade, portanto, é que Syd-1 atue como um GAP não para Rac1, mas para Rho, que muitas vezes funciona em oposição a Rac. Alternativamente, Syd-1 pode atuar como um GAP atípico para Rac1 - talvez sem atividade GAP, mas capaz de se ligar e proteger Rac1-GTP de GAPs convencionais - ou Syd-1 pode ainda atuar como um GAP convencional para Rac1 se for o taxa de ciclagem entre os estados de Rac1 ligados ao PIB e ao GTP (em vez de simplesmente a quantidade de GTPase que está no estado 'ativo' ligado ao GTP) que promove o desenvolvimento pré-sináptico (Holbrook, 2012).

O controle do destino das células intestinais pelo reposicionamento dinâmico do fuso mitótico influencia a homeostase epitelial e a longevidade

A homeostase dos tecidos depende da regulação precisa, porém plástica, dos destinos das células-tronco. Durante o crescimento, as células-tronco intestinais de Drosophila (ISCs) ajustam o destino mudando de linhagens assimétricas para simétricas para dimensionar o tamanho da população ISC. Usando uma combinação de imagem ao vivo de longo prazo, rastreamento de linhagem e perturbações genéticas, este estudo demonstra que essa mudança é executada por meio do controle da orientação do fuso mitótico pela sinalização da quinase Jun-N-terminal (JNK). JNK interage com a proteína Wdr62 de repetição WD40 no fuso e reprime transcricionalmente a cinesina Kif1a para promover a orientação plana do fuso. Em condições de estresse, essa função torna-se deletéria, resultando em superabundância de destinos simétricos e contribuindo para a perda da homeostase do tecido no animal envelhecido. Restaurar a orientação normal do fuso ISC perturbando o eixo JNK / Wdr62 / Kif1a é suficiente para melhorar a fisiologia intestinal e estender a vida útil. Esses achados revelam um papel crítico para o controle dinâmico da orientação do fuso SC na manutenção epitelial (Hu, 2019).

Este estudo demonstra diretamente que o destino da célula e a orientação do fuso estão intimamente ligados e identifica uma função para a sinalização JNK na promoção de linhagens simétricas por meio do realinhamento do fuso mitótico. Os dados suportam um modelo no qual o recrutamento mútuo de JNK fosforilado (pJNK) e Wdr62 para o fuso, bem como a repressão transcricional dependente de JNK de Kif1a, é necessária para o posicionamento do fuso em direção a uma orientação planar. Como a ativação de JNK também impede a localização cortical de lama, é proposto que a atividade de JNK interrompe o engajamento do fuso com os determinantes corticais da orientação do fuso e limita a força exercida nos microtúbulos astrais pela repressão da expressão de Kif1a (Hu, 2019).

Os resultados de rastreamento de linhagem de longo prazo revelam que os fusos planares resultam em resultados de divisão simétrica, enquanto os fusos oblíquos precedem os resultados assimétricos. Dessa forma, as mudanças na orientação do fuso (após o paraquat, realimentação de curto prazo e idade) refletem mudanças nos modos de divisão. Embora a imagem ao vivo seja uma ferramenta poderosa para visualizar diretamente a orientação do fuso e os resultados do destino, a resolução mais baixa em comparação com a imagem fixa pode causar uma faixa de erro mais ampla nas medições do ângulo do fuso. No entanto, a capacidade de visualizar claramente o vetor dividindo a segregação dos dois corpos celulares durante a telófase e o vetor que reveste a região basal das células-tronco vizinhas ajuda a aliviar esse problema. Outra advertência potencial nesta análise é que os destinos das células-filhas ISC podem ter sido mal avaliados devido a um atraso na ativação de Su (H). No entanto, um resultado assimétrico nunca foi observado derivando de fusos planares, e os resultados da divisão foram pontuados como simétricos apenas se a atividade Su (H) não foi observada no final do registro de lapso de tempo, que foi

4 h após a ativação de Su (H) foi observada pela primeira vez em divisões com resultados classificados como assimétricos. Em animais expostos ao paraquat que superexpressaram Kif1a em ISCs, a expressão de Su (H) foi detectada em resultados classificados como assimétricos aproximadamente no mesmo período de tempo que em condições de controle, sugerindo que condições de estresse como a exposição ao paraquat não perturbam grosseiramente a regulação de Su (H ) expressão (Hu, 2019).

O ângulo do fuso que separa as divisões simétricas e assimétricas é

15 e deg, e não está claro se a especificação do destino da célula durante as divisões com a orientação do fuso em torno desse ângulo é determinística ou estocástica. Um pequeno subconjunto de orientações do fuso acima de 20 & deg (2 de 22 exemplos) resultou em 2 células YFP + em vez de 1 célula YFP + e 1 célula YFP + / mCherry +. É possível que essas divisões ainda resultem em um resultado assimétrico, mas podem ter gerado uma célula mCherry-EE em vez de uma célula mCherry + EB. A rara ocorrência desses eventos é consistente com a população menor de EEs em comparação com EB / ECs no intestino, e a orientação do fuso durante a especificação de destino de EE pode ser importante para segregar prospero (Hu, 2019).

Embora os resultados sejam, portanto, compatíveis com um modelo determinístico para a especificação do destino da célula, eles não descartam um papel para a deriva neutra. Em um modelo de deriva neutra, o pool de células-tronco é mantido por um equilíbrio de perda de ISC (gerando duas células diferenciadas) e duplicação. Não se sabe como a regulação da orientação do fuso afeta o desvio neutro e se a orientação do fuso difere entre as divisões levando a dois ISCs ou dois EBs. Abordar essas questões será importante para uma compreensão abrangente da determinação do destino celular neste sistema (Hu, 2019).

A disparidade entre os comportamentos do fuso após o tratamento com paraquat e aqueles após a infecção com Ecc15 mostra que a natureza do gatilho ambiental é crítica. Embora ambos os estresses induzam fortes respostas proliferativas, seus efeitos sobre a orientação do fuso e o resultado do destino celular correspondente são diferentes. Com base nos dados deste estudo, essa disparidade é provavelmente causada por diferentes níveis de atividade JNK. O JNK é ativado pelo estresse oxidativo e, portanto, fortemente induzido pela exposição ao paraquat. A infecção Ecc15, por sua vez, promove a proliferação de ISC estimulando predominantemente JAK / transdutor de sinal e ativação do ativador de transcrição (STAT) em ISCs e apenas ativando JNK transitoriamente. JNK foi mostrado para ser ativado imediatamente após a infecção Ecc15 (30 min pós-infecção), mas os genes que codificam componentes da via JNK não foram mais regulados positivamente tão cedo quanto 4 h após a infecção. Estas observações são consistentes com a análise 16-20 h pós-infecção, particularmente a ausência de JNK fosforilado no fuso mitótico em animais infectados com Ecc15. No entanto, um possível papel de JNK na orientação do fuso em momentos anteriores após a infecção não pode ser descartado (Hu, 2019).

Estudos anteriores relataram que, semelhante às observações atuais com Ecc15, a infecção de outra cepa de bactéria, Pseudomonas entomophila, promoveu em grande parte resultados de destino assimétricos. No entanto, a atividade de JNK ainda foi detectada em todo o intestino 2 dias após a infecção, embora o tipo de célula específico (células-tronco versus células diferenciadas) em que JNK foi ativado não foi examinado. A possibilidade de que JNK seja ativado em ISCs após a infecção por P. entomophila não foi descartada. A diferença na patologia de P. entomophila - que é letal, ao contrário de Ecc15 - pode contribuir para uma resposta diferente na ativação de JNK. Uma hipótese é que, embora JNK possa ser ativado após a infecção por P. entomophila em ISCs, ele não é recrutado para o fuso mitótico e, portanto, não afetaria a orientação do fuso. Estudos futuros são necessários para testar essa hipótese e explorar possíveis mecanismos de uma diferença específica do patógeno (Hu, 2019).

No recrutamento para o fuso, pJNK e Wdr62 dependem um do outro. Embora JNK desempenhe claramente um papel crítico neste processo, os dados não descartam um papel para outras quinases que foram relatadas para recrutar Wdr62 para o centrossoma, incluindo Aurora A e quinase semelhante a Polo. Ao contrário de outros relatórios em células-tronco neurais, este estudo não encontrou um papel óbvio para Wdr62 na manutenção de fusos bipolares.Os relatórios também identificaram papéis para Wdr62 na estabilização de microtúbulos e centrossomas em células-tronco neurais de interfase e, embora os efeitos da depleção de Wdr62 durante a interfase não tenham sido testados neste estudo, a ausência de defeitos mitóticos grosseiros sugere que em ISCs de Drosophila, Wdr62 pode funcionar seletivamente na orientação do fuso. No entanto, tamanhos de clones um pouco menores foram observados de linhagens ISC deficientes para Wdr62 e, portanto, uma função para a interfase Wdr62 não pode ser descartada. A interrupção da atividade de Wdr62 durante a interfase também pode contribuir para o efeito inconsistente na expectativa de vida observada após o esgotamento de Wdr62, apesar da restauração de fusos oblíquos em ISCs de moscas velhas (Hu, 2019).

As consequências da perda de Pins e lama parecem variar dependendo do tecido: romper Pins e lama em neuroblastos de Drosophila randomiza o fuso mitótico, mas na pele de mamíferos, as células-tronco basais com LGN esgotado favorecem fusos planos, semelhantes às observações em Drosophila ISCs. Uma perda de lama cortical foi observada após a ativação de JNK, apoiando a noção de que JNK regula a interação entre os microtúbulos astrais e o córtex celular para promover fusos planos. Até que ponto o JNK ou Wdr62 interage diretamente com a lama é uma questão importante para um estudo mais aprofundado (Hu, 2019).

O mecanismo pelo qual Kif1a promove a orientação oblíqua do fuso em ISCs não está claro. Acredita-se que Khc-73, uma cinesina da mesma família Kinesin-3, interage com Pinos ou Disco Grande em células Drosophila S2 e neuroblastos para orientar os microtúbulos astrais para o córtex celular, e Kif1a pode desempenhar papéis semelhantes em ISCs. Embora os dados sugiram que JNK regula os níveis de Kif1a transcricionalmente, é possível que JNK também regula Kif1a no nível de proteína e pode direcionar sua possível interação com a maquinaria de recrutamento do fuso (Hu, 2019).

Os dados revelam como um papel fisiológico para a sinalização JNK na regulação do posicionamento do fuso durante os períodos de redimensionamento do tecido torna-se sequestrado sob estresse e idade, limitando a homeostase do tecido e encurtando a vida útil. Ainda não está claro como o JNK é ativado em ISCs durante a realimentação por inanição, mas a sinalização da insulina tem sido implicada na promoção de resultados simétricos durante o redimensionamento adaptativo do intestino de Drosophila. Será interessante testar se a sinalização de insulina e JNK interagem para regular o posicionamento do fuso em ISCs, porque a atividade elevada de sinalização de insulina também pode contribuir para a ativação crônica de JNK relacionada à idade. A tendência relacionada à idade em direção às orientações do fuso planar é uma reminiscência das mudanças na orientação do fuso das células-tronco da linha germinativa em moscas machos idosos e a restauração da orientação do fuso oblíquo em ISCs idosos aumentando a expressão de Kif1a é suficiente para melhorar a fisiologia intestinal e estender a vida útil. Compreender os mecanismos exatos e as consequências do posicionamento do fuso ISC será fundamental para identificar novas estratégias de intervenção para aliviar a disfunção relacionada à idade em epitélios de barreira (Hu, 2019).

É provável que tais intervenções tenham relevância clínica significativa, porque os epitélios de barreira em mamíferos se regeneram e envelhecem por meio de mecanismos semelhantes aos do epitélio intestinal de Drosophila. No entanto, embora a determinação do destino de SC por mudanças na orientação do fuso seja observada em vários tecidos de mamíferos durante o desenvolvimento, a extensão em que mecanismos semelhantes determinam o destino de células em tecidos de mamíferos adultos não é clara. ISCs de camundongo dentro do intestino adulto usam mecanismos diferentes para estabelecer o destino da célula, porque a orientação do fuso é amplamente plana e os sinais extrínsecos diferenciam preferencialmente uma das células-filhas. Na traqueia de camundongos, no entanto, foi relatado que a orientação do fuso flutua nas células-tronco basais em resposta à lesão e pode afetar a especificação do destino celular. Dada a variação na linhagem, composição celular e organização em diferentes tecidos adultos, é provável que a importância da orientação do fuso na especificação celular difira entre os tecidos. Determinar os tecidos nos quais a orientação do fuso está ligada ao destino da célula e testar se o papel de JNK na regulação da orientação do fuso nesses SCs é conservado, fornecerá informações importantes sobre a biologia regenerativa (Hu, 2019). Funções de ortólogos Unc-104 em outras espécies

KIF1A / UNC-104 transporta ATG-9 para regular o neurodesenvolvimento e autofagia nas sinapses

A autofagia é um processo de degradação celular importante para o desenvolvimento e sobrevivência neuronal. Os neurônios são células altamente polarizadas nas quais a biogênese do autofagossomo é espacialmente compartimentada. Os mecanismos e a importância fisiológica desta compartimentação espacial da autofagia no desenvolvimento neuronal de animais vivos não são bem compreendidos. Este estudo determina que, em Caenorhabditis elegans neurônios, autofagossomos formam perto das sinapses e são necessários para o neurodesenvolvimento. Foi demonstrado por meio de telas genéticas imparciais e análises genéticas sistemáticas que a autofagia é uma célula necessária de forma autônoma para a montagem pré-sináptica e para a dinâmica de crescimento de axônio em neurônios específicos. A biogênese do autofagossomo no axônio perto das sinapses foi observada, e esta localização foi encontrada para depender da vesícula cinesina sináptica, KIF1A / UNC-104 (ver Drosófila Unc-104). KIF1A / UNC-104 coordena a formação de autofagossomo localizada, regulando o transporte da proteína de autofagia de membrana integral ATG-9 (ver Drosófila Atg9). Esses achados indicam que a autofagia é regulada espacialmente em neurônios por meio do transporte de ATG-9 por KIF1A / UNC-104 para regular o neurodesenvolvimento (Stavoe, 2016).

Barkus, R. V., et al. (2008). Identificação de um motor axonal de cinesina-3 para transporte vesicular anterógrado rápido que facilita o transporte retrógrado de neuropeptídeos. Mol. Biol. Cell 19 (1): 274-83. ID PubMed: 17989365

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Métodos

Animais

Para este estudo, camundongos de tipo selvagem (C57BL / 6) e as seguintes linhas de camundongos transgênicos foram usados: PV-Cre (B6129P2-Pvalbtm1 (cre) Arbr / J), SOM-Cre (SST tm2.1 (cre) Zjh / J), NOS-Cre (B6129S-Nos1tm1.1 (cre / ERT2) Zjh / J), LoxP-ChR2 (B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm32 (CAG-COP4 * H134R / EYFP) Hze / J), e Camundongos VGAT-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Slc32a1-COP4 * H134R / EYFP) 8Gfng / J). Todos os camundongos transgênicos foram obtidos no Laboratório Jackson e foram criados pelo emparelhamento de camundongos transgênicos hemizigóticos com animais C57BL / 6 de tipo selvagem. Para experimentos optogenéticos, foram usados ​​descendentes de cruzamentos de camundongos Cre homozigotos com camundongos LoxP-ChR2 homozigóticos e camundongos VGAT-ChR2-YFP hemizigóticos.

Os camundongos foram alojados em grupos de até cinco animais em gaiolas padrão ventiladas individualmente em condições padrão de laboratório com um ciclo claro / escuro de 12 horas e acesso a comida e água ad libitum. Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Cantonal de Basileia em Experimentação Animal de acordo com os regulamentos federais e cantonais.

Preparação de fatias para gravações de patch-clamp

Camundongos adultos machos e fêmeas de 5 a 10 semanas de idade foram anestesiados com isoflurano (4% em O2, Vapor, Draeger) e mortos por decapitação, de acordo com as diretrizes nacionais e institucionais. A fim de aumentar a viabilidade celular para gravações de patch-clamp de uma única célula, os animais foram expostos a uma atmosfera enriquecida com oxigênio por 10 minutos antes da decapitação. As fatias foram cortadas conforme descrito anteriormente 56,57. Resumidamente, o cérebro foi dissecado em solução à base de sacarose gelada a cerca de 4 ° C. Fatias cerebrais horizontais do hipocampo com 350 μm de espessura foram cortadas em um ângulo de 20 ° com a superfície dorsal do cérebro ao longo dos eixos dorsoventrais do hipocampo usando um vibratome Leica VT1200. Para corte e armazenamento, foi utilizada uma solução à base de sacarose, contendo 87 NaCl, 25 NaHCO3, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 75 sacarose, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, e 10 de glicose (equilibrada com 95% de O2/ 5% CO2) As fatias foram mantidas a 35 ° C por 30 min após o fatiamento e, posteriormente, armazenadas em temperatura ambiente até a realização dos experimentos.

Gravações patch-clamp

Os neurônios piramidais CA1 foram identificados visualmente na camada de células piramidais perto da borda de SR usando microscopia de vídeo de contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC). As fatias foram continuamente superfundidas com líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) em temperatura próxima à fisiológica (32-33 ° C) na maioria dos experimentos. Experimentos com estimulação optogenética para Fig. 3, Figs. 4k e 5c, bem como experimentos suplementares na Figura 1 e na Figura 2 suplementares foram realizados a 20–22 ° C. O ACSF continha (em mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3, Glicose 25, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 2 CaCl2, e 1 MgCl2 (equilibrado com 95% O2/ 5% CO2) As pipetas foram retiradas de tubos de vidro de borossilicato com diâmetro externo de 2,0 mm e espessura de parede de 0,5 mm (Hilgenberg GmbH, Malsfeld, Alemanha) em um extrator Flaming-Brown P-97 (Sutter Instruments, Novato, EUA).

Para gravações de pinça de corrente, pipetas de patch (4-7 MΩ) foram preenchidas com uma solução contendo (em mM) 135 KMeSO4, 4 KCl, 10 EGTA, 10 Hepes, 2 MgCl2, 2 Na2ATP, 0,3 GTP e 0,2% de biocitina ajustados para pH 7,3 com KOH.

Para gravações de tensão-clamp de grandes IPSCs internos (Figs. 1, 3 e Figura 2 suplementar), pipetas de patch de baixa resistência (2–4 MΩ) foram preenchidas com uma solução à base de CsCl contendo (em mM) 100 CsCl, 40 Cs-gluconato, 10 EGTA, 10 Hepes, 2 MgCl2, 2 Na2ATP, 0,3 GTP e 5 QX314 ajustados para pH 7,3 com CsOH. Para todas as outras gravações de tensão-clamp (Figs. 4, 5, Figuras Suplementares 1, 5 e 6), as pipetas de patch (2–4 MΩ) foram preenchidas com uma solução à base de Cs-gluconato com baixo teor de cloreto (8 mM) contendo (em mM) 135 CsGluc, 2 CsCl, 10 EGTA, 10 Hepes, 2 MgCl2, 2 Na2ATP, 2 TEA-Cl e 5 QX314 ajustados para pH 7,3 com CsOH.

Os sinais de tensão e corrente foram medidos com um amplificador Multiclamp 700 A (Molecular Devices, Palo Alto, CA, EUA), filtrado em passa-baixo com uma frequência de corte de 8 kHz e digitalizado a 20 kHz usando uma interface CED Power 1401 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido). O equilíbrio da ponte foi usado para compensar a resistência em série (RS = 10–40 MΩ) nas gravações do grampo de corrente. A resistência em série (& lt20 MΩ) em experimentos de pinça de tensão foi monitorada online e os experimentos foram descartados se RS mudou mais de 20%. Em gravações de pinça de tensão para examinar a dependência de tensão e curso de tempo de correntes pós-sinápticas (Figs. 4, 5, Figuras suplementares 5, 6), compensação de resistência em série de célula inteira (5–12 MΩ) foi usada (correção de 60–80% e previsão). Nesses experimentos, PSCs foram registrados em potenciais de membrana crescentes com comandos de voltagem variando de −94 a +26 mV em etapas de 12 mV ou –90 a + 10 mV em etapas de 20 mV. A aquisição de dados foi controlada usando IGOR Pro 6.31 (WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon) e o suporte da biblioteca CFS do CED (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK).

Inibição tônica e IPSCs espontâneos

Em células piramidais CA1, uma corrente tônica sensível à picrotoxina (PTX) contribuiu com 9,6 ± 4,2 pA (n = 3) para a corrente de retenção durante gravações de pinça de tensão com solução interna baseada em CsCl. Para estudar a contribuição de α5-GABAUMARs para correntes tônicas por meios farmacológicos, maiores correntes tônicas dependentes de GABA foram evocadas por aplicação em banho de 5 µM de GABA na presença de 25 µM de AP5 e 10 µM de CNQX semelhantes aos estudos publicados anteriormente 58. Em alguns experimentos, gabazina 200 nM foi usado para separar a corrente tônica de IPSCs espontâneos rápidos (Figura suplementar 2G).

Avaliação da excitabilidade celular

Para avaliar as propriedades celulares, pulsos de corrente de 1 s de comprimento de amplitude crescente (etapas de 25 pA) foram injetados durante as gravações de pinça de corrente. Para avaliar as mudanças na resistência de entrada, pulsos de corrente de 100 ms foram aplicados a cada 5 s. As respostas de voltagem foram calculadas em média ao longo de 3 minutos antes do início e ao longo de 3 minutos após a conclusão de uma fase de lavagem de 5 minutos. Para avaliar as mudanças na excitabilidade, pulsos de corrente de 30 ms de 12 amplitudes diferentes (tamanho do passo de 5 pA) em torno do limite de corrente AP foram aplicados repetidamente (6–10 repetições, intervalo interestímulo de 3 s) antes e mais de 5 min após a lavagem do α5-NAM (1 µM). Em todos os protocolos de pinça de corrente, o potencial de membrana em repouso foi mantido constante perto do potencial inicial de cerca de -70 mV por pequenas injeções de corrente constante durante todo o experimento.

Estimulação sináptica extracelular

Para estimulação de entradas sinápticas, pipetas de 4–6 MΩ preenchidas com solução rica em Na 2+ tamponada com HEPES foram usadas para aplicar breves pulsos de corrente negativa (5–40 µA, 200 µs). A fim de estimular as fibras locais, as pipetas foram colocadas perto da célula gravada a uma distância de & lt200 µm em SR, SLM ou SP. Para gravações com pinça de tensão, a força de estimulação SP foi geralmente reduzida para ≤10 µA para garantir o recrutamento de axônios perisomáticos / células em cesta locais. Em gravações de tensão-clamp de IPSCs com uma solução interna baseada em CsCl (Figs. 1, 3), o neurônio foi preso a -70 mV, e as correntes internas mediadas por GABAR foram medidas na presença de NBQX de 10 µM e 25 µM AP5. Os artefatos de estímulo foram truncados em algumas figuras para maior clareza.

Localização assistida por canalrodopsina de α5-GABAUMARs

Um laser de diodo (DL-473, Rapp Optoeletrônico) foi acoplado à porta epifluorescente do microscópio (Zeiss Examiner, equipado com uma objetiva de imersão em água 63x NA1.0 Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha) via fibra óptica. O laser foi controlado por meio de pulsos TTL. Para a ativação optogenética do axônio de subpopulações de interneurônios específicos, o campo de visão foi alterado, de modo que o neurônio registrado e os botões GABAérgicos estivessem fora da área iluminada, usando intensidades de laser de 0,1–0,5 mW por 5 ms.

Para o sCRACM, o campo de iluminação foi restrito a uma área com um diâmetro de 20–50 μm localizada no centro do campo de visão. Cinco flashes de luz (1 ms, 473 nm) foram aplicados a 500 Hz para evocar um PSC. A estimulação foi direcionada para botões GABAérgicos no soma ou para o dendrito apical 200–300 μm do corpo celular. O dendrito foi visualizado por epifluorescência de Alexa-594 (10 μM) na solução interna. As intensidades de estimulação variaram de 0,1 a 0,5 mW para estímulos somáticos e 0,5–3 mW para estímulos dendríticos. Para garantir a ativação localizada dos terminais pré-sinápticos sem propagação de AP axonal, os experimentos foram realizados na presença de TTX 1 µM, 4-AP 75 µM e CGP 1 µM. Para aumentar a estabilidade das respostas evocadas, o sCRACM foi realizado à temperatura ambiente (20–22 ° C) e o ACSF continha (em mM) 1,5 CaCl2 e 1,5 MgCl2. As estimulações foram repetidas em um intervalo de ≥ 55 s para minimizar o resumo das respostas registradas. Apenas experimentos com um mínimo de cinco respostas estáveis ​​antes e após a lavagem de α5-NAM (1 µM) foram incluídos na análise.

Drogas e reagentes

4-Aminopiridina (4-AP, 100 mM Merck), D-AP5 (50 mM Tocris) e tetrodotoxina (TTX, 1 mM Alomone labs) foram dissolvidos em água. A picrotoxina foi dissolvida a 50 mM em etanol. Cloridrato de CGP 54626 (Tocris 10 mM), CNQX (Tocris 20 mM), NBQX (Tocris 20 mM), L-655.708 (Tocris 1 mM) e α5-NAM RO4938581 (F. Hoffmann-La Roche 10 mM) foram dissolvidos em DMSO.

Análise de dados e estatísticas

A análise dos dados do patch-clamp foi realizada offline usando o software de análise de código aberto Stimfit 59 (https://neurodroid.github.io/stimfit) e scripts personalizados escritos em Python.

Durante a análise, as amplitudes medidas foram plotadas em relação ao tempo para verificar a estabilidade dos sinais registrados. A análise final dos dados do clamp de tensão foi realizada em formas de onda médias com média de 5 a 10 varreduras. Ascensão e decadência τ de PSCs foram obtidos ajustando a soma de duas funções exponenciais em toda a forma de onda de PSC. Para IPSCs, a decadência τ foi a média ponderada de um ajuste biexponencial apenas para a fase de decaimento do PSC começando em 95% de sua amplitude. Para cálculos da integral, os traços foram filtrados em passa-baixa (Butterworth de terceira ordem, corte de 100 Hz) para determinar o ponto inicial e final da integral como a interseção do traço suavizado com a linha de base. A integral foi então calculada como a soma de todos os valores do traço original menos a linha de base entre o ponto inicial e final.

Dependência da voltagem da condutância mediada por GABAR e NMDAR normalizada (Fig.4j, Figuras suplementares 6, 7) foi calculado para cada experimento individualmente dividindo as amplitudes do PSC pela diferença do comando de voltagem do potencial de reversão estimado. Todas as condutâncias foram normalizadas pela condutância medida em +14 mV para GABAR- e em +26 mV para correntes NMDAR, respectivamente. Uma função sigmoidal foi ajustada ao gráfico de dispersão da condutância normalizada média versus comando de voltagem. Para a análise das amplitudes de PSC mediadas por NMDAR na Figura Suplementar 3B, o potencial de junção de líquido foi corrigido em cerca de -5 mV, levando a uma relação corrente-tensão média revertendo em aproximadamente 0 mV (ENMDA = 0,35 ± 1,12 mV, n = 6) conforme esperado para uma condutância catiônica não específica.

Para a visualização da retificação externa de correntes mediadas por GABAR, as amplitudes de corrente foram normalizadas pelo valor em -70 mV (eunorma) As correntes normalizadas foram ajustadas no GraphPad Prism6 usando uma condutância dependente de voltagem sigmoidal:

com v representando o potencial de membrana, Erev o GABAUMA potencial de reversão, gmin e gmax a condutância mínima e máxima, V50 o potencial de membrana na metade do aumento máximo da condutância dependente da voltagem e a inclinação determinando a inclinação do sigmoidal, que foi restringida a ser pelo menos a diferença de voltagem entre dois pontos de dados adjacentes.

Para comparar a força da retificação observada em diferentes condições experimentais, calculamos um índice de retificação (RI) que foi quantificado como a razão da condutância obtida a partir do ajuste linear para as correntes de saída acima de −40 mV dividido pelo valor medido em - 82 mV (1 = sem desvio).

Para avaliar o impacto de α5-NAM nas correntes tônicas GABA, medianas de épocas de 5 s da corrente de espera foram medidas. A mediana foi minimamente sensível a IPSCs espontâneos esporádicos. A média de todas as medianas de uma época específica foi salva e comparada entre as épocas para efeitos específicos do medicamento.

A análise de PSPs de burst em gravações de pinça de corrente foi realizada em dados de teste único para evitar distorção por descarga ocasional de AP. Em casos raros de disparo de AP, os APs foram removidos digitalmente cortando os picos no limite do AP, definido pela inclinação da tensão (10 Vs −1) antes de calcular a integral.

A análise estatística foi realizada no GraphPad Prism 6. Antes da avaliação estatística, os dados foram sempre testados para normalidade pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Na maioria dos casos, as estimativas estatísticas de significância de dados emparelhados, em particular dados normalizados em relação a 100% de controle, foram derivadas de Student bicaudal emparelhado t testes. Para comparações entre os grupos, os testes estatísticos foram de Student bicaudal de duas amostras t testes. Se os desvios padrão dos grupos pareciam ser diferentes, uma correção de Welch foi usada. Os conjuntos de dados que falharam no teste de normalidade de Shapiro-Wilk foram subsequentemente analisados ​​com os testes não paramétricos de Wilcoxon assinado e Mann-Whitney para dados pareados e não pareados, respectivamente. O nível de significância foi definido para P= 0,05. Todos os dados são apresentados como média ± s.e.m. O tamanho da amostra foi determinado pela reprodutibilidade dos experimentos e com base em nossa experiência com experimentos semelhantes. Salvo indicação em contrário, o número n de observações indicadas reflete o número de células registradas de.

Modelagem computacional

Dois modelos computacionais foram projetados no ambiente de simulação NEURON 60. O modelo multicompartimental e a maioria dos arquivos mod para várias condutâncias foram baseados no modelo publicado por Bloss et al. 35 O primeiro modelo consistia em um pedaço passivo de dendrito de 100 µm de comprimento e 2 µm de diâmetro. Incluímos uma sinapse de glutamato, incluindo uma condutância mediada por AMPAR e NMDAR, e uma sinapse GABAérgica na mesma localização central. A condutância AMPA, NMDA e GABA foram modeladas com aumento e queda exponencial usando a classe Exp2Syn. Para a condutância AMPA, a constante de tempo (τ) para ascensão e decadência τ foi definido em 0,2 ms e 2 ms, respectivamente. Para a condutância NMDA, a ascensão e decadência foram definidas como τsubir = 3 ms e τdecair = 35 ms, com base em nossos dados experimentais para correntes NMDA no intervalo entre –60 e –20 mV (Figura Suplementar 6). O bloco de magnésio dependente de voltagem (Mg 2+) de NMDARs foi modelado como

com base em nossas próprias observações experimentais (inserção da Figura Suplementar 6B, veja o perfil de corrente-tensão resultante na Figura Suplementar 7C) e gravações de canal único publicadas anteriormente 61. A concentração extracelular de magnésio [Mg 2+] foi ajustada para 1 mM de acordo com a concentração em nosso ACSF.

As sinapses GABAérgicas não lineares que mostraram retificação externa conforme observado experimentalmente (Fig. 3), foram modeladas como a soma de duas sinapses da classe Exp2Syn em NEURON. O primeiro componente foi modelado como uma condutância linear e foi atribuído a 20% do peso sináptico total. O segundo componente de condutância retificadora foi atribuído a 80% do peso sináptico total. A retificação externa dependente de voltagem de 4 vezes deste segundo componente foi modelada como

com base no ajuste ao perfil de condutância obtido experimentalmente do componente IPSC lento medido a 30 ms após o pico (a Fig. 4j mostra uma versão em escala desta curva). De acordo com os dados ajustados, Vdeclive foi definido para 3 mV. A ativação meia-máxima foi ajustada para V50 = –52 mV, que foi 5 mV mais negativo do que o valor ajustado (−47 mV) para corrigir a diferença de potencial da junção líquida semelhante à dependência de tensão das correntes NMDAR. Os componentes de condutância GABA linear e de retificação externa obtiveram diferentes parâmetros cinéticos para modelar a dependência da tensão do decaimento no tempo de correntes dendríticas GABAérgicas (Fig. 5). Para a sinapse GABA linear, ascensão e decadência τ foram definidos para 0,5 e 15 ms, respectivamente para a sinapse GABA retificadora para fora, a ascensão e decadência τ foram definidos para 1 e 30 ms, respectivamente.

Para as simulações de dendrito único mostradas na Fig. 6, uma sinapse de glutamato (com condutância AMPAR e NMDAR) e uma sinapse GABA não linear foram colocadas na mesma localização central do ramo dendrítico. As condutâncias máximas foram definidas para 0,14 nS para condutâncias AMPAR e NMDAR, e para 0,7 nS para a sinapse GABAérgica não linear para gerar um equilíbrio E / I de 1: 1 com 5 entradas glutamatérgicas. As entradas colaterais de Schaffer mostraram facilitação de pulso pareado durante atividade de rajada breve (5 @ 50 Hz), resultando em um aumento relativo na amplitude EPSC durante o 2º, 3º, 4º e 5º pulso por um fator de 1,5 ± 0,2, 1,8 ± 0,3, 1,9 ± 0,4 e 2,0 ± 0,5 (n = 4), respectivamente. Para explicar essa plasticidade de curto prazo determinada experimentalmente durante a estimulação repetitiva, o peso sináptico das sinapses de glutamato (condutâncias AMPAR e NMDAR) foi ajustado para 1,5 vezes o peso no segundo estímulo e 2 vezes o peso para todos os estímulos subsequentes. A simulação foi repetida 10 vezes com um número crescente de entradas glutamatérgicas que foram simuladas simplesmente aumentando o peso sináptico da sinapse de glutamato modelado. Para explorar o impacto das propriedades funcionais das sinapses GABAérgicas na despolarização dendrítica, o modelo não linear foi modificado da seguinte maneira: para a inibição linear (Fig. 6b), a dependência de tensão do componente retificador foi desligada e seu peso foi fixado em 0,25 da condutância máxima original, resultando em uma condutância completamente linear a 40% de 0,7 nS (isso reflete a interpretação tradicional de IPSCs internos registrados no potencial de repouso com níveis de cloreto simétrico) para apenas a inibição de retificação (Fig. 6c), a condutância linear foi transformada desligado para simulação do efeito α5-NAM (Fig. 6d), o peso sináptico do componente retificador foi reduzido pela metade, resultando em condutâncias de linha de base e máximas de 30% e 60% de 0,7 nS. Na Fig. 6, a ascensão e decadência τ da condutância retificadora foi diminuída por um fator de 5 (ou seja, aumento τ = 0,2 ms, decaimento τ = 6 ms Fig. 7b). Em uma segunda etapa, o peso sináptico deste componente foi aumentado pelo mesmo fator (de 0,56 para 2,8 nS) para atingir o mesmo PSC integral (isto é, transferência de carga) como com a sinapse não linear lenta original (Fig. 6c).

O segundo modelo foi o neurônio piramidal CA1 multicompartimental retirado de Bloss et al. 35 e modificado das seguintes maneiras. Potenciais de reversão de sódio e potássio foram definidos para EN / D = 55 mV e EK = –95 mV. A capacitância específica da membrana era Cm = 1 µF / cm 2. A resistividade interna era Reu = 200 Ωcm e a resistência específica da membrana foi definida para Rm = 60 kΩcm 2. A condutância retificadora de potássio atrasada foi deletada de todos os dendritos & gt 100 µm do soma 62. A densidade de condutância de potássio do tipo A proximal foi ajustada para 0,001 S / cm 2 e aumentada com uma inclinação de 1% / µm a distâncias entre 50 e 300 µm do soma. Os canais de sódio não foram incluídos. Canais de HCN (canal de cátions ativado por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização) foram incluídos conforme modelado em Migliore et al. 63 A densidade foi fixada em 0,2 mS / cm 2 no soma e dendritos basais, e aumentada nos dendritos apicais linearmente com 3% / µm até uma distância de 500 µm do soma 63. A reversão da corrente H foi de –30 mV. E a reversão da corrente de fuga foi ajustada para –90 mV. Nessas condições, o potencial de membrana em repouso estava perto de -70 mV (experimento: -67,2 ± 0,4 mV, n = 25), a resistência de entrada aparente da célula foi de 95,4 MΩ (exp .: 90,3 ± 4,5 MΩ) medida por pequenas injeções de corrente positiva no soma, e uma etapa de corrente negativa de -100 pA produziu um Ihafundamento dependente de 2,1 mV (exp .: 2,4 ± 0,2 mV). Se os canais HCN foram removidos, a resistência aparente de entrada aumentou para 219,4 MΩ (exp .: 217,8 ± 23,5 MΩ, n = 11) e a constante de tempo de membrana medida como o declínio do potencial de membrana de uma pequena etapa de corrente de despolarização foi de 43,7 ms (exp .: 44,3 ± 2,7 ms, n = 11). A distribuição espacial de entradas sinápticas glutamatérgicas e GABAérgicas foi implementada conforme descrito em Bloss et al. 35 A decadência τ da condutância AMPA foi definida para 3 ms.

Na Fig. 8, o número crescente de sinapses de glutamato escolhidas aleatoriamente em conjunto com 10 sinapses GABA não lineares fixas (

3,5% do total de 280 sinapses GABAérgicas em dendritos em tufo) foram ativadas em uma estimulação de rajada curta (3 @ 200 Hz) para induzir picos dendríticos mediados por NMDAR locais em dendritos em tufo. Com base em Maccaferri et al. 17, cada sinapse GABA tinha um peso sináptico total de 1 nS, gerando um pico de condutância de 0,4 nS a -70 mV, semelhante ao que foi relatado para sinapses de células piramidais de interneurônio SOM unitário. A probabilidade de liberação foi definida como 1 devido à taxa de falha notavelmente baixa de entradas de interneurônios SOM + OLM 17.

Para sinapses de glutamato, a probabilidade de liberação foi assumida como sendo 0,1, de modo que a ativação de 150 sinapses (

10% de 1464) rendeu 15 sinapses ativas no primeiro pulso. A probabilidade de liberação foi aumentada por um fator de 1,5 e 1,8 nos estímulos subsequentes de acordo com dados experimentais (veja acima). A plasticidade sináptica de curto prazo (STP) foi implementada pela introdução de objetos de conexão de rede (NetCon) separados para cada estímulo e sinapse. Isso permitiu a ativação independente de qualquer número de sinapses pelos três estímulos representados por objetos NetStim individuais. Durante cada rodada da simulação, o número de sinapses de glutamato potencialmente ativas foi aumentado em 150 sinapses, ou seja, em 15 entradas ativadas adicionalmente durante o primeiro pulso de cada explosão subsequente. As seguintes modificações de nosso modelo de sinapse GABA não linear foram testadas: para inibição linear (Fig. 8d), a retificação dependente de tensão foi desligada e o peso sináptico foi fixado em 40% de 1 nS para entradas com cinética típica para PV + cesta- entradas de células (Fig. 8e), aumento e decadência τ da retificação e condutância linear foram definidas para 0,2 ms e 6 ms, respectivamente, e o peso sináptico total foi aumentado de 1 nS para 4,5 nS (= 0,2 nS / 0,4 + 0,8 nS / 0,2) para atingir o mesmo PSC integral (ou seja , transferência de carga) quanto à inibição não linear lenta.

Para modelar aproximadamente a situação experimental com estimulação simultânea em SR e SLM (Suplementar Fig. 8, Fig. 2d), as entradas foram distribuídas por toda a árvore dendrítica apical e ativadas durante uma estimulação em burst de 5 estímulos a 50 Hz. Todas as sinapses GABAérgicas dendríticas foram modeladas como sinapses GABA não lineares, semelhante ao que foi descrito acima. As sinapses consistiam em um componente linear de 20% e um componente retificador de 80% com Vdeclive = 4 mV e uma ativação meia máxima em V50 = –60 mV.

Cerca de 34% de todas as sinapses GABAérgicas foram selecionadas e ativadas aleatoriamente (95 em SLM e 50 em SR). O peso sináptico de todas as sinapses dendríticas GABAérgicas foi definido como 0,7 nS e a probabilidade de liberação inicial foi definida como 0,5. Como as sinapses GABAérgicas localizadas em toda a árvore dendrítica são uma mistura complexa formada por muitos tipos diferentes de interneurônios, tentamos determinar experimentalmente o STP médio durante a estimulação de rajada breve (5 a 50 Hz). Em SR, a depressão relativa de curto prazo de IPSCs durante o 2º, 3º, 4º e 5º pulso em relação ao controle foi 0,7 ± 0,1, 0,8 ± 0,2, 0,7 ± 0,1 e 0,7 ± 0,1 (n = 11), respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos com estimulação SLM (0,6 ± 0,1, 0,5 ± 0,1, 0,4 ± 0,1 e 0,4 ± 0,1, n = 16). Consequentemente, a probabilidade de liberação foi dimensionada durante a estimulação de rajada breve em 0,7 em SR e em 0,6, 0,5, 0,4 e 0,4 em SLM. Além das condutâncias descritas, este modelo incluiu um GABA lentoB condutância que foi obtida com pequenas modificações de Poirazi et al. 64 Cada GABAUMA sinapse tinha diretamente ao lado um GABAB parceiro e o GABA máximoB a condutância foi definida como 0,4 nS para obter GABABIPSPs mediados por IPSPs semelhantes ao que observamos em condições experimentais comparáveis ​​(dados não mostrados).

O número crescente de sinapses glutamatérgicas foi ativado começando com 200 sinapses em SR (

3% de cerca de 6.000) e 50 em SLM (

3,3% de 1464). A probabilidade de liberação foi definida como 0,1 e escalonada com o STP determinado experimentalmente de 1, 1,5, 1,8, 1,9 e 2,0. Durante cada rodada da simulação, o número de sinapses de glutamato potencialmente ativas foi aumentado em 250 sinapses adicionais, ou seja, em 25 entradas ativadas no primeiro pulso. Na rodada 3 (75 entradas glutamatérgicas), havia uma razão de condutância E / I de

1: 2 para entradas em dendritos dentro de SR (gerado por 60 entradas glutamatérgicas e 25 GABAérgicas), semelhante ao que observamos em experimentos de tensão-clamp com estimulação SR (dados não publicados). Este número de sinapses resultou em um pico de despolarização de

13 mV medido no soma que era muito semelhante aos registros de corrente de pinça de PSPs de explosão na Fig. 2d.

Para testar a contribuição potencial da inibição tônica (TI) para o efeito de α5-NAM em rajadas de PSP (Fig. 9 suplementar), incluímos a condutância tônica retificadora para fora descrita em Pavlov et al. 38 A densidade de condutância TI aumentou com uma inclinação de 3% / µm a distâncias entre 50 e 300 µm do soma. A densidade de condutância TI inicial foi ajustada no modo de pinça de corrente com IH desligado para obter uma mudança na condutância de repouso aparente (o inverso de Rno) após redução de 50% do TI comparável ao efeito do α5-NAM em experimentos na presença de ZD. Uma densidade de 0,1 mS / cm 2 atendeu a esse requisito. Isso baixou o somático Rno de 219,1 MΩ a 192,9 MΩ (isto é, condutância tônica de 0,62 nS). O bloqueio da metade desta condutância aumentou o Rno a 204,9 MΩ, ou seja, uma mudança na condutância de repouso de 0,30 nS comparável à observação experimental na tensão e corrente do grampo (Figuras suplementares 2G, 3A). Nas etapas subsequentes, a densidade de condutância de TI foi aumentada por fatores de 10 e 100 para simular contribuições irrealisticamente altas de TI para a condutância de repouso.

Disponibilidade de código

O código para as simulações no NEURON será depositado no ModelDB: https://senselab.med.yale.edu/modeldb/