Em formação

Desnaturação e renaturação de DNA


Se desnaturarmos o dsDNA aquecendo-o e depois resfriando-o rapidamente, o que aconteceria? Eu li esta pergunta, onde estava escrito que se recebêssemos uma amostra de dsDNA que foi completamente desnaturada e então se a resfriaríamos rapidamente. Qual seria o resultado? Será que ele recozia rapidamente ou o recozimento seria lento?

  1. Se observarmos PCR, o tempo de recozimento varia, mas fica em torno de 45 segundos min, com faixa de temperatura de 55-65 ° C (dependendo do valor de Tm). Então minha primeira dúvida é se isso se chama resfriamento rápido?
  2. Em caso de preservação do RNA ou DNA, o resfriamento na bolsa de gelo preserva sua estrutura e evita quaisquer alterações adicionais na estrutura.
  3. Tentei ler jornais e li em algum lugar que, se desnaturarmos completamente, ele recoze lentamente. Isso ocorre em duas etapas - primeiro, ele tentará encontrar sua correspondência completa por meio do processo de colisão. Em segundo lugar, o zíper será fechado. Isso leva cerca de 55 minutos. Isso indica que será um recozimento rápido.

Desnaturar algo pode ter diferentes significados:

No contexto do dsDNA, significa separação dos 2 suportes, enquanto as próprias fitas individuais são fragmentadas.

Presumo que sua pergunta seja sobre PCR. Neste contexto, o resfriamento rápido a temperaturas muito baixas impediria o recozimento dos dois fios separados.

Além disso, quero apontar um equívoco comum, que o resfriamento rápido de alguma forma tem efeitos "destrutivos", o que não é verdade. Quanto mais rápido algo é congelado, melhor sua estrutura é preservada.


Isso realmente depende de uma variedade de fatores. (1) a natureza do dsDNA, é um plasmídeo ou DNA cromossômico? Os plasmídeos se renaturam com mais facilidade do que os cromossomos; portanto, o resfriamento e o aquecimento rápidos não afetam a renaturação dos plasmídeos, mas afetam o DNA.

Resfriar lentamente em algum experimento baseado em PCR pode ser feito se você quiser recozer fragmentos de DNA, mas não tiver certeza sobre a temperatura ideal de recozimento. Normalmente feito se você deseja recozer dois primers juntos, por exemplo. Você precisa ser mais específico para que possamos ajudá-lo.


Desnaturação e Renaturação do DNA

A primeira pista de que o DNA eucariótico contém vários tipos de sequências não presentes no DNA procariótico veio de estudos nos quais o DNA de fita dupla foi separado e então permitiu a reassociação. Quando o DNA de fita dupla em solução é aquecido, as ligações de hidrogênio que mantêm as duas fitas de nucleotídeos juntas são enfraquecidas e, com bastante calor, as duas fitas se separam completamente, um processo chamado desnaturação ou fusão. A temperatura na qual o DNA desnatura, chamada de temperatura de fusão (Tm), depende da sequência de bases da amostra particular de DNA: os pares de bases G – C têm três ligações de hidrogênio, enquanto os pares de bases A – T têm apenas duas, então a separação de pares G – C requer mais calor (energia) do que a separação de pares A – T. A desnaturação do DNA por aquecimento é reversível: se o DNA de fita simples for resfriado lentamente, as fitas simples irão colidir e ligações de hidrogênio se formarão novamente entre pares de bases complementares, produzindo DNA de fita dupla. Essa reação é chamada de renaturação ou reanimação.


Desnaturação e Renaturação do DNA

A desnaturação e a renaturação são características das moléculas de DNA. Os fatores como temperatura, pH e agentes químicos formam ou quebram as ligações de hidrogênio presentes entre as duas fitas de DNA. É um processo reversível e é usado para estudar a complexidade do genoma. Pesquisa genética e tais estudos usam processos de desnaturação e renaturação de DNA.

A desnaturação é definida como mudança na estrutura nativa da biomolécula. A quebra de ligações não covalentes como o hidrogênio, forças iônicas e van der waals etc. causa a desnaturação. O DNA é uma estrutura helicoidal destra, consiste em dois polinucleotídeos que são mantidos juntos por ligações de hidrogênio que são formadas entre os pares de bases de nitrogênio complementares. A desnaturação do DNA significa a quebra de ligações de hidrogênio que causa a separação de duas fitas.

A ligação de hidrogênio é a força de atração entre o átomo de hidrogênio de um átomo ou grupo covalentemente eletronegativo com outro átomo ou grupo eletronegativo. É uma ligação fraca e sua resistência varia de 4 kJ a 50 kJ por mol. A força da ligação de hidrogênio é de apenas 5% em comparação com a ligação covalente. Devido à fraqueza, as ligações de hidrogênio tendem a se quebrar. Diferentes fatores como temperatura, pH e agentes químicos podem causar a quebra das ligações de hidrogênio. E, portanto, a desnaturação também é afetada pelos mesmos fatores.

A temperatura acima de 80 ° C causa desnaturação do DNA, quebrando as ligações de hidrogênio e produzindo duas fitas separadas. A temperatura na qual o DNA desnatura é chamada de ponto de fusão do DNA ou temperatura de fusão (Tm). O ponto de fusão é característico do DNA porque a Tm é afetada pelo conteúdo de ATGC. A sequência com mais conteúdo de AT teria menos Tm do que a sequência de DNA com GC. É porque GC tem ligações triplas e, portanto, mais temperatura ou energia é necessária para quebrar três ligações do que duas.

O aumento ou diminuição do pH provoca alterações nas cargas iônicas das bases nitrogenadas (purinas e pirimidinas). Em pH baixo, os grupos amino tornam-se protonados e pH alto causa sua desprotonação. Ambas as condições não são favoráveis ​​para formar as ligações de hidrogênio e, portanto, interrompe a estrutura nativa do DNA e leva à desnaturação.

Uréia e formamida ou formaldeído são conhecidos por quebrar as ligações de hidrogênio da hélice do DNA. Esses produtos químicos tendem a formar ligações de hidrogênio com os centros eletronegativos das bases de nitrogênio. Isso causa a ruptura das ligações de hidrogênio nativas entre os pares de bases complementares da estrutura do DNA. O ponto de fusão do DNA ou Tm pode ser alterado adicionando tais produtos químicos.

Características do DNA desnaturado
1) Viscosidade: A estrutura helicoidal de fita dupla é viscosa na natureza. Quando o DNA é desnaturado por qualquer um dos fatores mencionados, ele perde sua viscosidade.
2) Rotação óptica: A estrutura nativa do DNA é opticamente ativa. A desnaturação do DNA causa diminuição da atividade óptica.
4) Absorção de UV: A estrutura nativa do DNA absorve luz UV a 260 nm por causa dos anéis aromáticos de bases de nitrogênio. Quando o DNA se desnatura, a absorbância da luz ultravioleta aumenta devido à exposição das bases de nitrogênio e é chamado de deslocamento hipercrômico ou hicromacidade.
Portanto, a extensão da desnaturação do DNA pode ser observada de estudo pela absorção de luz ultravioleta.

PS: A desnaturação e renaturação do DNA também é usada para entender a relatividade de dois genomas e sequências repetitivas presentes em um genoma.

Renaturação:
Quando as duas fitas separadas de DNA se unem novamente, isso é chamado de renaturação do DNA. Isso significa que é a transformação de uma estrutura desnaturada em uma nativa. A renaturação do DNA ocorre em temperatura ambiente ou pH neutro ou na ausência de agentes químicos desnaturantes. A baixa temperatura reduz a entropia e favorece a colisão e o contato dos dois fios. Quando duas fitas se aproximam, elas tendem a formar ligações de hidrogênio novamente, formando uma hélice de fita dupla. Portanto, a desnaturação é um processo reversível.

Quando o DNA desnaturado é renaturado, a absorbância de UV em 260 nm diminui devido à ocultação das bases de nitrogênio. E isso é chamado de mudança hipocrômica.

O DNA de fita simples também tende a formar ligações de hidrogênio com o DNA SS de fontes diferentes. Acontece quando SS DNA de origem diferente tem sequência complementar. Este processo é denominado hibridização. É usado para estudar a relação evolutiva de diferentes espécies.
A renaturação de depende da concentração de DNA e do tempo. Quanto maior a concentração de DNA, mais rápida é a renaturação. E, portanto, o termo é dado como Cot (concentração x tempo)

Fonte: Lehninger, Nelson e Cox

O gráfico descreve a renaturação do DNA de fita dupla de células procarióticas. O cot (concentração de DNA x tempo) está no eixo X e a porcentagem ou fração de SS DNA está no eixo Y. A curva que começa na parte superior esquerda do eixo Y indica o início da reação de renaturação. 1 ou 100% no eixo X significa que todo o DNA está presente na forma de fita simples. Com o passar do tempo, as fitas de DNA reanimam-se e a proporção ou porcentagem do DNA de fita simples diminui. Quando todo o DNA é reanimado ou renaturado, a proporção de DNA SS torna-se zero. O ponto em que metade do DNA é renaturado é denominado Cot1 / 2.

O DNA contém sequências únicas e repetitivas. Único significa genes para um determinado personagem, que estão presentes apenas uma ou duas vezes no DNA. Sequência repetitiva significa um trecho de nucleotídeo que é repetido várias vezes no DNA. Britten e Davidson descobriram que quanto maior o número de sequências repetitivas presentes no DNA, mais rápido é o processo de renaturação ou anelamento. Como a mesma sequência está em várias cópias, a probabilidade de colisão com sua sequência complementar aumenta. As sequências repetitivas podem ser altamente ou moderadamente repetidas.

Para entender a declaração acima, vamos dar um exemplo. Imagine uma banheira com bolas vermelhas, azuis e brancas. Suponha que a caixa tenha 60 bolas vermelhas, 30 bolas azuis e 10 bolas brancas. Se você tentar pegar essas bolas aleatoriamente, a probabilidade de pegar bolas vermelhas é maior do que bolas azuis e muito maior do que bolas brancas. Da mesma forma, a colisão de sequências repetitivas entre si é mais do que uma sequência única.

Portanto, com base nos tipos de sequência (genes altamente repetitivos, moderadamente repetitivos ou únicos) presentes no DNA afetam a taxa de renaturação. A taxa de renaturação é diretamente proporcional ao número de sequências repetitivas. A análise de Cot é usada para medir sequências repetitivas e complexidade do genoma.

A desnaturação e renaturação do DNA desempenha um papel fundamental em muitos métodos e aplicações e são consideradas como uma etapa principal e crucial em aplicações práticas.

D. Nelson e M, Cox, Freeman, 2004,

Bioquímica (9ª edição) Jeremy M. Berg, Lubert Stryer, John Tymoczko, Gregory Gatto, WH Freeman

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Desnaturação cíclica e renaturação de DNA de fita dupla por troca de estado redox de intercaladores de DNA

A hibridização de fitas de ácido nucleico complementares é fundamental para quase todos os métodos bioanalíticos moleculares, desde a reação em cadeia da polimerase e biossensores de DNA até o sequenciamento de última geração. Para métodos de amplificação de ácido nucleico, a desnaturação e renaturação de DNA controlada é particularmente essencial e obtida por ciclos de temperaturas elevadas. Embora esta seja de longe a técnica mais usada, o gerenciamento de mudanças rápidas de temperatura requer instrumentação volumosa e fonte de alimentação intensa. Esses fatores, até agora, impediram o desenvolvimento de verdadeiros testes de ponto de atendimento para diagnósticos moleculares. Para superar essa limitação, exploramos a possibilidade de usar meios eletroquímicos para controlar a hibridização reversível do DNA usando o intercalador eletroativo daunomicina (DM). Nós mostramos que a mudança de estado redox de DM alterou suas propriedades de ligação ao DNA para não ligação, sob outras condições constantes, e assim alterou a estabilidade termodinâmica do DNA duplex. O princípio operacional foi demonstrado usando oligonucleotídeos de DNA 20mer e 40mer sintéticos complementares. A análise da curva de fusão baseada em absorvância revelou temperaturas de fusão significativamente mais altas para DNA na presença de oxidado em comparação com DM quimicamente reduzido. Esta diferença foi explorada para conduzir a desnaturação e renaturação controlada eletroquimicamente cíclica. Análises com UV-vis in situ e espectroeletroquímica de dicroísmo circular, como duas técnicas independentes, indicaram que até 80% do DNA foi hibridizado reversivelmente. Esta demonstração notável de controle eletroquímico de cinco ciclos de desnaturação e renaturação de DNA, sob outras condições constantes, poderia ter implicações abrangentes para o desenvolvimento futuro de sistemas analíticos miniaturizados para diagnóstico molecular e além.


Renaturação

Definição
substantivo, plural: renaturações
(biologia molecular) A conversão de proteína desnaturada ou ácido nucleico em sua configuração nativa
Suplemento
Renaturação em biologia molecular refere-se à reconstrução de uma proteína ou ácido nucléico (como o DNA) à sua forma original, especialmente após a desnaturação. Este processo é, portanto, o inverso da desnaturação. Na desnaturação, as proteínas ou ácidos nucléicos perdem sua estrutura biomolecular nativa. Por exemplo, uma molécula de DNA é desnaturada por meio de aquecimento. O DNA desnaturado pelo calor se separa em duas fitas. Quanto às proteínas, a desnaturação é realizada pela aplicação de um estresse externo ou composto, como um ácido ou base forte, um sal inorgânico concentrado, um solvente orgânico, radiação ou calor. 1 A reconstrução do ácido nucléico desnaturado ou da proteína em sua forma original é feita pelo processo de renaturação. Por exemplo, um DNA desnaturado por calor pode reverter à sua forma original resfriando lentamente as duas fitas e, em seguida, reformar sua hélice de fita dupla original. Uma proteína desnaturada pode ser restaurada após a desnaturação, embora não seja tão comum como pode ser feito em ácidos nucleicos desnaturados. Uma maneira pela qual uma proteína desnaturada é restaurada à sua forma original é removendo o SDS e os agentes desnaturantes após a desnaturação durante a identificação da proteína PAGE ou IEF. 2
Veja também:

1 Desnaturação (bioquímica). (n.d.) Mosby & # 8217s Medical Dictionary, 8ª edição. (2009). Recuperado em 23 de março de 2015 de http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/Denaturation+(biochemistry).

2 Rosenberg, I. (2005). Técnicas de bancada de análise e purificação de proteínas. Boston: Birkhäuser.


Sandwalk


Vários alunos me escreveram com perguntas sobre a estrutura do DNA. As perguntas mais preocupantes vêm de alunos que leram o artigo que escrevi sobre um artigo que mede as interações de empilhamento em polinucleotídeos [Measuring Stacking Interactions]. Nessa postagem eu escrevi.

As duas fitas de DNA de fita dupla são mantidas juntas por uma série de interações fracas, como ligações de hidrogênio, interações de empilhamento e efeitos hidrofóbicos [A Estrutura Tridimensional do DNA].

Destes, as interações de empilhamento entre os pares de bases são as mais significativas. A força das interações de empilhamento de base depende das bases. É mais forte para pilhas de pares de bases G / C e mais fraco para pilhas de pares de bases A / T e é por isso que é mais fácil derreter DNA rico em A / T em alta temperatura. (Muitas vezes é incorretamente assumido que isso é devido a ter apenas duas ligações de hidrogênio entre os pares de bases A / T e três entre os pares de bases G / C.)

Ácido desoxirribonucléico (DNA) Muitos alunos escreveram para dizer que minhas declarações contradizem seus professores e seus livros didáticos. Não estou surpreso. A visão antiquada da desnaturação do DNA (pré-1990) supôs que as diferenças entre o DNA rico em A / T e o DNA rico em G / C se deviam à ligação de hidrogênio extra nos pares de bases G / C. Muitos dos professores que ensinam introdução à bioquímica não estão cientes do fato de que essa visão é incorreta. Ainda mais surpreendente, alguns dos livros didáticos atuais não se preocuparam em atualizar seu material sobre a estrutura do DNA.

Aqui está a história como a conhecemos hoje. Para os alunos que escreveram para mim, repito o cuidado que mencionei em minha resposta a você & mdash, certifique-se de verificar com seu professor antes de escrever qualquer teste. Certifique-se de que ele / ela entendeu por que você está contradizendo o que foi dito em sala de aula para que você não tire notas. É sempre melhor fazer isso com antecedência em vez de argumentar depois de perder notas no teste.

Vejamos primeiro o que acontece quando o DNA é desnaturado pelo aumento da temperatura.

Conforme a temperatura aumenta, você começa a obter o desenrolamento local do DNA de fita dupla. Este desenrolamento ocorre preferencialmente em regiões onde os dois fios são mantidos juntos com menos força. Nessas regiões, os fios se separam para formar bolhas de regiões de fita simples. A sequência de DNA nessas regiões é enriquecida em pares de bases A / T porque as interações entre as duas fitas são mais fracas nas regiões ricas em A / T. Em regiões ricas em G / C, os fios são mantidos juntos com mais força para que não se desenrolem até temperaturas mais altas.

A propósito, mesmo em temperaturas normais da célula, o DNA "respira" e as regiões locais se desenrolam temporariamente. Como você pode esperar, as regiões ricas em A / T têm maior probabilidade de se abrir do que as regiões ricas em G / C. Esta é uma das razões pelas quais as bolhas de iniciação da transcrição e as origens de replicação do DNA são frequentemente ricas em A / T. É mais fácil para as proteínas (RNA polimerase e proteínas de ligação de origem) criar as regiões desenroladas localmente.

Quando todas as interações de base são quebradas, as duas fitas se separam. Isso é chamado de desnaturação. (O desenrolamento local é não desnaturação.)

A base agora está exposta ao ambiente aquoso. O DNA de fita simples é mais estável do que o DNA de fita dupla em temperaturas mais altas. Observe que as bordas das bases ainda formarão ligações de hidrogênio nesta situação. Eles formam ligações de hidrogênio com moléculas de água. Na verdade, eles formarão muito mais ligações de hidrogênio com a água do que com bases complementares no DNA de fita dupla.

À medida que a temperatura diminui, a forma de fita dupla torna-se mais estável do que a fita simples em solução, e o DNA renatura. A primeira etapa é um evento de nucleação onde duas regiões complementares entram em contato. A nucleação é a etapa limitadora da taxa na renaturação. Assim que ocorre a nucleação, o resto da molécula se fecha muito rapidamente.

É fácil acompanhar a desnaturação do DNA porque há uma diferença na absorbância da luz ultravioleta entre o DNA de fita simples e dupla. O DNA de fita simples é absorvido com mais força.

Em uma curva de fusão típica, você mede o aumento na absorbância de UV conforme a temperatura aumenta. Isso rastreia o desenrolar e a desnaturação do DNA. O ponto de fusão (Tm) é a temperatura na qual metade do DNA é desenrolado.

O DNA que consiste inteiramente de pares de bases AT derrete a cerca de 70 ° e o DNA que tem apenas pares de bases G / C derrete a mais de 100 ° C. Você pode calcular o Tm de qualquer molécula de DNA, se você souber a composição da base. As fórmulas mais simples levam em consideração a composição geral e não são muito precisas. Uma fórmula mais precisa usará as interações de empilhamento de cada par de bases para prever a temperatura de fusão [Wikipedia: DNA melting].

A questão é por que existe uma relação entre a composição de bases do DNA e a estabilidade das regiões de fita dupla?

As primeiras pessoas a pensar sobre essa questão não entenderam realmente o papel de empilhar as interações entre os pares de bases no meio do DNA de fita dupla. Eles também não apreciavam as ligações de hidrogênio. Eles ingenuamente presumiram que as diferenças entre o DNA rico em G / C e o DNA rico em A / T se deviam ao fato de que os pares de bases G / C têm três ligações de hidrogênio e os pares de bases A / T têm apenas duas [The Chemical Structure of Double-stranded DNA].

Agora sabemos que essa explicação não faz sentido. Não há perda líquida de ligações de hidrogênio quando o DNA é desnaturado, muito pelo contrário, na verdade. Existem mais ligações de hidrogênio formadas entre as bases no DNA de fita simples e as moléculas de água do que entre os pares de bases no DNA. Não há razão para que o DNA de fita simples se renature se a formação de DNA de fita dupla for impulsionada pela criação de ligações de hidrogênio entre pares de bases. Para cada ligação de hidrogênio entre as bases, você teria que quebrar quase duas ligações de hidrogênio com as moléculas de água.

As interações mais importantes no DNA de fita dupla são as interações de empilhamento entre pares de bases adjacentes. Você pode pensar nisso como as interações de elétrons nas superfícies superior e inferior dos anéis que formam as bases.

Existem dez possíveis interações entre pares de bases adjacentes. As energias dessas interações são mostradas na tabela à esquerda. As setas indicam a direção do DNA de 3 & prime & rarr5 & prime [The Chemical Structure of Double-Stranded DNA].

Observe, em primeiro lugar, que a força dessas interações de empilhamento (cerca de 30 kJ mol -1 em média) são maiores do que o força de estabilidade conferida por ligações de hidrogênio (cerca de 3 4 kJ mol -1) 1 . Supondo que haja em média seis três ligações de hidrogênio por em dois par de bases G / C empilhadas, a força total das ligações de hidrogênio (18 12 kJ mol -1) ainda é muito menos do que as interações de empilhamento.

Em segundo lugar, observe que as interações de empilhamento envolvendo pares de bases G / C são mais fortes (mais negativas) do que aquelas envolvendo pares de bases A / T. É por isso que a temperatura de fusão do DNA depende da composição da base. Não é porque os pares de bases G / C têm uma ligação de hidrogênio a mais do que os pares de bases A / T, é porque os pares de bases G / C formam interações de empilhamento mais fortes.

É por isso que você pode calcular uma temperatura de fusão mais precisa para os oligonucleotídeos se usar as interações de empilhamento. São as interações de empilhamento que determinam a estabilidade do DNA de fita dupla e as interações de empilhamento que são interrompidas conforme a temperatura aumenta e mais energia térmica é adicionada à molécula.

Finalmente, o artigo que discuti em julho [Measuring Stacking Interactions] mediu as interações de empilhamento no DNA de fita simples (poli A). Acontece que as interações de empilhamento entre bases simples são, em alguns casos, fortes o suficiente para forçar o DNA de fita simples em uma estrutura helicoidal. Esta é mais uma evidência da importância das interações de empilhamento para conferir estabilidade à dupla hélice.


Desnaturação e Renaturação de DNA - Biologia

Aula 3 de Biologia Molecular

Estrutura Física e Química do DNA

Estrutura da subunidade de DNA (nucleotídeo):

Estudos de difração de raios-X por Rossalind Franklin, bem como Watson e Crick mostraram que:

O DNA é helicoidal hélice de fita dupla

As bases de nucleotídeos são empilhadas

A análise química mostrou que:

(essas proporções referem-se apenas ao DNA de fita dupla. Também há DNA de fita simples em muitos vírus)

A estrutura fundamental: (fig. 3-1 e fig 3-5)

10 bases por volta helicoidal (em B-DNA, a forma predominante)

duas ranhuras: (permitem a ligação de proteínas)

groove largo / groove principal

ranhura estreita / ranhura menor

Também uma hélice destra ligeiramente mais estreita: A-DNA

Isso tem 11 bases por turno (RNA de fita dupla, DNA desidratado)

Emparelhamento de base (fig. 3-2, 3-3, 3-4)

Observe que A-T tem duas ligações H G-C tem três ligações H

Lembre-se da polaridade 5 3 dos fios

Os fios são anti-paralelos

Significância das razões G + C (ou% G + C): para muitos organismos é perto de 50% (para Campylobacter é 35%. Ou seja, Campy é um organismo muito rico em AT .

Muitas bactérias e fagos têm DNA circular (figs 3-6 e 3-7)

Superenrolado (+ [mesma direção] ou [direção oposta])

(-) o superenrolamento pode introduzir bolhas e, se houver bases compatíveis, obter estruturas stem-loop ou estruturas cruciformes .

Isso é especialmente verdadeiro se houver repetições invertidas ou sequências palindrômicas presentes:

Os locais de ligação da enzima são frequentemente associados a esses tipos de estruturas.

As topoisomerases cortam uma ou ambas as fitas de DNA e então se enrolam ou se desenrolam.

Desnaturação de DNA: (fig 3-8) Curva de fusão

Aquecer DNA de fita dupla (DNA nativo) Desnatura ou derrete e torna-se de fita simples.

Isso pode ser medido por espectrofotetria, uma vez que o A260 é menor para DNA de fita dupla do que para DNA de fita simples.

Tm ou T derretimento é o ponto de 50%

A temperatura de derretimento é muito quente

Acontece muito rápido (faixa de temperatura estreita)

Apenas ligações não covalentes estão envolvidas

Tm é o ponto em que 1/2 das moléculas são desnaturadas

Quanto maior o conteúdo de G + C, maior o Tm

O pH alto facilita a desnaturação, pois interfere no pareamento de bases. PH alto (& gt 11,3) pode ser usado para desnaturar o DNA. [Não use isso para RNA, no entanto. O RNA hidrolisa em pH alto].

Água destilada pode desnaturar o DNA. O backbone carregado negativamente precisa ser estabilizado com cátions carregados positivamente.

Renaturação de DNA ou hibridização de DNA.

Isso ocorre de maneira ideal em 20-25 o abaixo do Tm.

Precisa de algum Na + ou Mg ++ para ocorrer

A curva (fig. 3-9) permite que você veja se sequências repetitivas ou não repetitivas estão envolvidas.

As técnicas de hibridização são amplamente utilizadas no laboratório (fig. 3-11)

ssDNA é anexado a uma membrana (nitrocelulose)

então uma solução de ssDNA ou RNA marcado é lavada sobre a membrana.

Lave e visualize por uma variedade de técnicas

Dez vezes mais abundante que o DNA

De fita simples, comumente se forma

Estruturas de haste em alça (grampo de cabelo, cruciforme) (fig. 3-12)

Freqüentemente contém bases modificadas

Hidrólise de ácidos nucléicos

PH baixo (menos de pH 1) RNA e DNA hidrolisam (as ligações do fosfodiéster se rompem e as bases se rompem).

PH alto (maior que pH 11) hidrolisa o RNA. O DNA irá desnaturar, mas o esqueleto do fosfodispositor permanece intacto.

Exonuclease, endonuclease, endonuclease de restrição

Sequenciamento de DNA Método Sanger (técnica de terminação de cadeia didesoxi)

Lembre-se de que as polimerases apenas catalisam a síntese de DNA 5 3 , e novos nucleotídeos são adicionados a um grupo 3 -OH livre.

Esta técnica usa didesoxinucleotídeos para encerrar uma proporção das reações de síntese de DNA.

Quatro reações separadas são executadas. Você tem que executar uma reação separada para cada um dos quatro nucleotídeos.


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Resultado da pesquisa: contribuição para o jornal ›Artigo› revisão por pares

T1 - Efeito do íon guanidínio na desnaturação e renaturação do DNA

N1 - Informações de financiamento: Este estudo é financiado pela National Science Foundation (GB 5497)

O cloreto de N2-guanidínio (GuCl) em soluções concentradas tem sido usado na desnaturação de proteínas (Tanford, Kawachara e Lapanje 1967) e por esta razão, também foi sugerido para uso no isolamento de ácidos nucléicos de nucleoproteínas (Cox 1968). Embora não haja efeito aparente desse procedimento nos produtos assim isolados, pouco foi relatado sobre sua ação apenas no DNA. Rice e Doty (1957) observaram anteriormente que a diminuição da viscosidade intrínseca do DNA do timo de bezerro ocorria a uma temperatura mais baixa em GuCl 3,2 M do que em NaCl 0,8 M, mas a ureia 8 M era mais eficaz do que GuCl 3,2 M. Os presentes estudos empregam a medição do perfil de absorbância-temperatura (Rice e Doty 1957, Cavalieri e Rosenberg 1957, Marmur e Doty 1962) e mostram que o grau de estabilização da helicidade do DNA por GuCl em baixa força iônica é proporcional à molaridade de o sal, enquanto em altas concentrações, o inverso é o caso. Assim, os resultados sugerem um efeito duplo único do GuCl, incomum para a maioria dos desnaturantes.

AB - Guanidinium chloride (GuCl) in concentrated solutions has been used in denaturing proteins (Tanford, Kawachara and Lapanje 1967) and for this reason, it has also been suggested for use in the isolation of nucleic acids from nucleoproteins (Cox 1968). While there is no apparent effect of this procedure on the products so isolated, little has been reported as to its action on DNA alone. Rice and Doty (1957) observed earlier that the decrease in intrinsic viscosity of calf thymus DNA occurred at a lower temperature in 3.2 M GuCl than in 0.8 M NaCl, but 8 M urea was more effective than 3.2 M GuCl. The present studies employ the measurement of the absorbance-temperature profile (Rice and Doty 1957, Cavalieri and Rosenberg 1957, Marmur and Doty 1962) and show that the degree of stabilization of DNA helicity by GuCl at low ionic strength is proportional to the molarity of the salt, whereas at high concentrations, the reverse is the case. Thus, the results suggest a unique, dual effect of GuCl uncommon to most denaturants.


Resumo

Experimental data have demonstrated that nucleic acid in the form of DNA is the genetic material of cells. The structure of the DNA double helix and the complementary base pairing make double-stranded DNA uniquely suited as a template during replication. The two strands of double-stranded DNA can be denatured by heat and then renatured in a complementary fashion. This property of DNA is exploited in nucleic acid hybridization, where a short single-stranded probe can hybridize to the complementary sequence in denatured DNA or RNA. The melting temperature (Tm) of double-stranded DNA is a function of nucleotide length and composition. The DNA in the nucleus is found in the chromosomes, which are composed of linear DNA associated with proteins. Each chromosome has a centromere, two telomeres, and several origins of replication (ORI). Mitotic chromosomes are highly condensed and easiest to visualize in a karyotype. The genome of a typical eukaryote is composed of unique DNA sequences, interspersed repeated DNA, and short tandem repeats. The DNA in chromatin is highly packed and compressed. The first level of packaging is the nucleosome, DNA wrapped around the core histones. The nucleosomes (so-called "beads on a string") are further packaged into 30-nm chromatin fibers, looped domains of chromatin, and finally, the condensed mitotic chromosome. The interphase chromosomes are less condensed in the regions of the euchromatin, and more condensed in the regions of the heterochromatin. The interphase chromosomes reside in the nucleus, whose nuclear envelope has a double membrane. Transport of molecules, in and out of the nucleus, occurs through the nuclear pores.


Assista o vídeo: Como acontece a replicação do DNA? (Janeiro 2022).