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Qual é o melhor solvente para o Mutagen X?


Muitos solventes podem ser usados ​​para o mutagênico X (3-cloro-4- (diclorometil) -5-hidroxi-5H-furan-2-ona), no entanto, a estabilidade a longo prazo não é especificada. Qual seria o melhor solvente para armazenamento de longo prazo? Uma vez dissolvido, pode ser armazenado à temperatura ambiente ou -20ºC?

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Os efeitos de longo alcance dos mutagênicos na saúde humana

Para sobreviver, florescer e se reproduzir com sucesso, os organismos contam com um alto grau de estabilidade genética. Os agentes mutagênicos, que podem ameaçar a integridade do código genético ao causar mutações no DNA, representam um sério risco à saúde humana. Há muito tempo eles estão implicados em uma série de doenças geneticamente herdadas, assim como em câncer, envelhecimento e doenças neurodegenerativas como o mal de Alzheimer.

Agora parece que as ameaças mutagênicas à maquinaria sutil de uma célula podem ser muito mais disseminadas do que se imaginava anteriormente. Em um novo estudo, Michael Lynch e seus colegas demonstraram que a própria mutação do DNA pode representar apenas uma fração dos estragos relacionados à saúde causados ​​por mutágenos.

O estudo destaca a capacidade dos compostos mutagênicos de também afetar o processo de transcrição, durante o qual uma sequência de DNA é convertida (ou transcrita) em mRNA, um estágio intermediário anterior à tradução em proteína.

Os resultados da pesquisa, (que destacam erros de transcrição mutagênicos em leveduras, vermes, moscas e camundongos), sugerem que os efeitos prejudiciais dos mutagênicos na transcrição são provavelmente muito mais difundidos do que anteriormente apreciado - um fato que pode ter implicações importantes para a saúde humana.

"Nossos resultados têm o potencial de transformar completamente a maneira como pensamos sobre as consequências dos mutagênicos ambientais", diz Lynch.

O professor Lynch é o diretor do Biodesign Center for Mechanisms in Evolution e pesquisador da Escola de Ciências da Vida da ASU.

Os resultados da pesquisa aparecem na edição atual da revista. PNAS.

Células sob ameaça

Devido ao seu importante papel nos processos de doenças, os compostos mutagênicos têm sido um tópico de intenso estudo científico. Esses agentes incluem luz solar e outras fontes de radiação, quimioterápicos, subprodutos tóxicos do metabolismo celular ou produtos químicos presentes na comida e na água.

Os mutagênicos podem infligir danos ao DNA, que mais tarde podem formar uma bola de neve quando as células se dividem, e a replicação do DNA multiplica esses erros. Essas mutações, se não corrigidas por meio de mecanismos de revisão de DNA, podem ser passadas para as gerações subsequentes e, dependendo do local em que aparecem ao longo do código de três bilhões de letras da fita de DNA humano, podem impactar seriamente a saúde, em alguns casos, com resultados letais.

Mas mesmo se reparado antes da replicação, o DNA danificado transitoriamente também pode interferir na transcrição - o processo de produção de RNA a partir de uma sequência de DNA. Isso pode acontecer quando a RNA polimerase, uma enzima que se move ao longo de uma única fita de DNA, produzindo uma fita de RNA complementar, lê uma sequência mutada de DNA, causando um erro na transcrição de RNA resultante.

Como os transcritos de RNA são os modelos para a produção de proteínas, os erros de transcrição podem produzir proteínas aberrantes prejudiciais à saúde ou encerrar totalmente a síntese de proteínas. Já se sabe que mesmo nas melhores condições, as taxas de erros de transcrição são ordens de magnitude mais altas do que aquelas no nível do DNA.

RNA: uma série de erros?

Embora a existência de erros de transcrição tenha sido reconhecida há muito tempo, sua quantificação tem sido um desafio. O novo estudo descreve uma técnica inteligente para descobrir erros de transcrição causados ​​por mutagênicos e separá-los de artefatos experimentais - mutações causadas durante a preparação da biblioteca de transcrições de RNA por meio de processos de transcrição reversa e sequenciamento.

O método descrito envolve o uso de tecnologia de sequenciamento maciçamente paralelo para identificar apenas os erros na sequência de RNA diretamente causados ​​pela atividade de um mutagênico. Os resultados demonstram que pelo menos alguns compostos mutagênicos são fontes potentes de mutações genômicas e erros de transcrição abundantes.

O ensaio de sequenciamento circular delineado no estudo cria redundâncias na mensagem transcrita reversa, fornecendo um meio de revisar o DNA linear resultante. Dessa forma, os pesquisadores podem confirmar que os erros de transcrição observados são resultado dos efeitos do mutagênico na transcrição e não um artefato de preparação da amostra.

A molécula de DNA mostrou ser particularmente vulnerável a uma classe de mutagênicos conhecidos como agentes alquilantes. Um deles, conhecido como MNNG, foi usado para infligir erros de transcrição nos quatro organismos do estudo. Os efeitos observados foram dependentes da dose, com níveis mais elevados de mutagênico causando um aumento correspondente nos erros de transcrição.

Erros ocultos podem custar caro para a saúde

Os erros de transcrição diferem das mutações no genoma em pelo menos um aspecto vital. Enquanto a replicação do DNA durante a divisão celular atua para amplificar mutações no genoma, os erros de transcrição podem se acumular em células que não se dividem, com um único modelo de DNA mutado dando origem a vários transcritos de RNA anormais.

Os efeitos totais desses erros de transcrição na saúde humana permanecem em grande parte especulativos porque eles não foram passíveis de estudo até agora. Usando a nova técnica, os pesquisadores podem explorar o transcriptoma - a biblioteca completa dos transcritos de RNA de uma célula viva, em busca de erros causados ​​por mutágenos.

Embora a nova pesquisa ofereça esperança de uma compreensão mais completa da relação entre vários mutagênicos e a saúde humana, é também um conto de advertência. A preocupação com defeitos mutacionais na sequência de DNA pode ter cegado a ciência para os efeitos potenciais dos agentes que resultam em erros de transcrição sem deixar rastros permanentes no genoma.

Esse fato levanta a possibilidade de que uma ampla gama de fatores ambientais, bem como produtos químicos e alimentos considerados seguros para consumo humano, necessitem de uma reavaliação cuidadosa com base em seu potencial para produzir mutagênese transcricional. Além disso, os erros de transcrição em ambos os tipos de células em divisão e não divisão são provavelmente jogadores-chave nos processos complexos de envelhecimento físico e declínio mental.


Qual é o melhor solvente para o Mutagen X? - Biologia

Um mutagênico é um agente de substância que pode provocar uma alteração permanente na composição física de um gene de DNA, de modo que a mensagem genética seja alterada.

Uma vez que o gene foi danificado ou alterado, o mRNA transcrito daquele gene agora carregará uma mensagem alterada.

O polipeptídeo produzido pela tradução do mRNA alterado agora conterá uma sequência diferente de aminoácidos. A função da proteína produzida ao dobrar esse polipeptídeo provavelmente será alterada ou perdida. Neste exemplo, a enzima que está catalisando a produção do pigmento da cor da flor foi alterada de tal forma que não catalisa mais a produção do pigmento vermelho.

Nenhum produto (pigmento vermelho) é produzido pela proteína alterada.

  • imitam as bases de nucleotídeos corretas em uma molécula de DNA, mas falham em emparelhar corretamente durante a replicação do DNA.
  • remover partes do nucleotídeo (como o grupo amino na adenina), novamente causando o pareamento impróprio de bases durante a replicação do DNA.
  • adicionar grupos de hidrocarbonetos a vários nucleotídeos, também causando emparelhamento incorreto de bases durante a replicação do DNA.

Radiação A radiação de alta energia de um material radioativo ou de raios X é absorvida pelos átomos nas moléculas de água que cercam o DNA. Essa energia é transferida para os elétrons, que então voam para longe do átomo. Deixado para trás está um radical livre, que é uma molécula altamente perigosa e reativa que ataca a molécula de DNA e a altera de várias maneiras.
A radiação também pode causar quebras de fita dupla na molécula de DNA, que os mecanismos de reparo da célula não podem corrigir.

A luz solar contém radiação ultravioleta (o componente que causa o bronzeado) que, quando absorvida pelo DNA, causa a formação de uma ligação cruzada entre certas bases adjacentes. Na maioria dos casos normais, as células podem reparar esse dano, mas dímeros não reparados desse tipo fazem com que o sistema de replicação pule o erro, deixando uma lacuna, que deve ser preenchida posteriormente.
A exposição desprotegida à radiação ultravioleta pela pele humana pode causar sérios danos e pode levar ao câncer de pele e extensos tumores de pele.

As mutações espontâneas ocorrem sem exposição a qualquer agente mutagênico óbvio. Às vezes, os nucleotídeos do DNA mudam sem aviso para uma forma química diferente (conhecida como isômero) que, por sua vez, formará uma série diferente de ligações de hidrogênio com seu parceiro. Isso leva a erros no momento da replicação do DNA.

Ciência à Distância
e cópia 1997, 1998, 1999, 2000 Professor John Blamire


3.3C: Determinando qual solvente usar

  • Contribuição de Lisa Nichols
  • Professor (Química) na Butte College

O fator mais importante no sucesso da cristalização é provavelmente o solvente escolhido. Além de ter as propriedades de solubilidade cruciais para a cristalização (o composto deve ser solúvel no solvente quente e tão insolúvel quanto possível no solvente frio), existem outros fatores que determinam um solvente apropriado.

Um solvente de cristalização ideal deve ser não reativo, barato e ter baixa toxicidade. Também é importante que o solvente tenha um ponto de ebulição relativamente baixo (p.e. frequentemente (& lt 100 ^ text exto) já que é melhor se o solvente evaporar prontamente do sólido uma vez recuperado. A Tabela 3.1 mostra uma lista de solventes comuns usados ​​com a cristalização. O tolueno tem o ponto de ebulição mais alto ( left (111 ^ text exto right) ) da lista, e deve ser evitado caso existam alternativas por este motivo (bem como sua toxicidade e cheiro). Junto com a evaporação rápida, um solvente de ponto de ebulição relativamente baixo também é ideal para cristalização, pois minimiza a probabilidade de um composto "quotilando", onde o material sai da solução acima de seu ponto de fusão e forma um líquido em vez de um sólido. Quando um composto se liquefaz primeiro, raramente se cristaliza bem.

Tabela 3.1: Ponto de ebulição de solventes comuns na cristalização. Nota: o éter de petróleo é uma mistura de hidrocarbonetos e é muito apolar. O termo "éter" vem de sua volatilidade, não dos grupos funcionais presentes.
Solvente Ponto de ebulição (& degC)
Éter dietílico 35
Acetona 56
Éter de petróleo (baixo ponto de ebulição) 30-60
Ligroína (éter de petróleo de alto ponto de ebulição) 60-90
Metanol 65
Hexanos 69
Acetato de atila 77
Etanol 78
Água 100
Tolueno 111

Solventes com pontos de ebulição muito baixos (por exemplo, éter dietílico, acetona e éter de petróleo de baixo ponto de ebulição) são altamente inflamáveis ​​e podem ser difíceis de trabalhar, pois evaporam rapidamente. Eles ainda podem ser usados ​​com cuidado, mas se houver alternativas, geralmente são preferíveis.

Existem algumas tendências gerais na previsão do solvente apropriado para um determinado composto. Como o composto precisa ser solúvel no solvente em ebulição, ajuda se o composto e o solvente tiverem forças intermoleculares semelhantes. Por exemplo, se um composto pode fazer uma ligação de hidrogênio (álcoois, ácidos carboxílicos e aminas), às vezes pode ser cristalizado a partir de água. Se um composto tem polaridade moderada, às vezes é cristalizado a partir do etanol. Se um composto é principalmente não polar, às vezes é cristalizado de éter de petróleo ou hexanos, ou pode exigir uma mistura de solvente.

Como pode ser difícil prever o solvente ideal para a cristalização, muitas vezes um procedimento publicado em um artigo de jornal indicará o solvente apropriado. Se nenhum solvente estiver listado, um solvente apropriado pode ser previsto usando dados de solubilidade (próxima seção), determinado experimentalmente ou escolhido de Perrin Purificação de Produtos Químicos Orgânicos, (^ 4 ) um livro de referência que lista os procedimentos de purificação para cerca de 5700 compostos conhecidos.

(^ 4 ) D.D. Perrin, W.L.F. Armarego, Purificação de Produtos Químicos Orgânicos, Pergamon Press, 3 (^ text) edição, 1988.


3. A natureza dos cristais de proteína & # x000a0

A análise de raios X é um evento singular e confinado ao laboratório de pesquisa e o produto final é o conhecimento científico básico. Os próprios cristais, com algumas exceções, não têm valor medicinal ou farmacêutico, mas simplesmente servem como intermediários no processo cristalográfico. Os cristais fornecem os padrões de difração de raios-X que, por sua vez, servem como dados brutos que permitem a visualização direta das macromoléculas ou dos complexos dos quais os cristais são compostos. Alguns exemplos de cristais de proteínas e vírus cultivados em um dos laboratórios do autor & # x02019s (AM) são mostrados na Fig. 1 & # x025b6.

Microfotografias de cristais de proteínas e vírus cultivados no laboratório da AM mostrando a variedade de hábitos comuns aos cristais macromoleculares. (uma, b, f) Vírus do mosaico do tabaco via satélite, (c) Vírus desmodium yellow mottle, (d) canavalina hexagonal e (e) anticorpo anti-linfoma canino intacto.

Ao cristalizar proteínas para análise de difração de raios-X, geralmente se lida com macromoléculas homogêneas, muitas vezes excepcionalmente puras, e o objetivo pode ser fazer crescer apenas alguns cristais grandes, de alta qualidade e alto desempenho. É importante enfatizar que, embora o número de cristais necessários possa ser pequeno, muitas vezes a quantidade de proteína disponível pode ser severamente limitada. Isso, por sua vez, impõe sérias restrições às abordagens e estratégias que podem ser usadas para obter esses cristais. Embora novas metodologias, como radiação síncrotron (Helliwell, 1992 & # x025b6) e criocristalografia (Garman & # x00026 Schneider, 1997 & # x025b6) tenham conduzido o tamanho necessário e o número de cristais de amostra de forma consistente para baixo, eles não aliviaram a necessidade de cristal qualidade e estabilidade.

Os cristais macromoleculares são compostos por aproximadamente 50% de solvente em média, embora isso possa variar de 25 a 90%, dependendo da macromolécula específica. A proteína ou o ácido nucléico ocupa o volume restante, de modo que todo o cristal é, de muitas maneiras, um gel ordenado permeado por extensos espaços intersticiais através dos quais o solvente e outras pequenas moléculas se difundem livremente.

Em proporção à sua massa molecular, o número de ligações (pontes de sal, ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas) que uma molécula convencional forma com seus vizinhos em um cristal excede em muito as poucas exibidas por macromoléculas cristalinas. Uma vez que esses contatos fornecem as interações de rede essenciais para a manutenção do cristal, isso explica em grande parte a diferença nas propriedades entre os cristais de sais ou pequenas moléculas e as macromoléculas (Chernov, 2003 & # x025b6 Vekilov & # x00026 Chernov, 2002 & # x025b6).

Os sistemas vivos baseiam-se quase exclusivamente na química aquosa dentro de faixas estreitas de temperatura e pH. Assim, as macromoléculas desenvolveram uma compatibilidade apropriada, e desvios ou perturbações sérios raramente são tolerados. Como consequência, todas as proteínas e cristais de ácido nucléico devem crescer a partir de soluções aquosas às quais são tolerantes, e essas soluções são chamadas de licores-mãe. Os cristais macromoleculares até agora só foram cultivados nesses meios.

Embora comparáveis ​​em suas morfologias e aparência, existem diferenças práticas importantes entre cristais de compostos de baixa massa molecular e cristais de proteínas e ácidos nucléicos. Os cristais de moléculas convencionais são caracterizados por forças de rede firmes, são relativamente altamente ordenados, são geralmente fisicamente duros e quebradiços, são fáceis de manipular, geralmente podem ser expostos ao ar, têm fortes propriedades ópticas e difratam os raios X intensamente. Os cristais macromoleculares são, em comparação, geralmente mais limitados em tamanho, são muito macios e se esmagam facilmente, desintegram-se se desidratados, exibem propriedades ópticas fracas e difratam mal os raios-X. Os cristais macromoleculares são sensíveis à temperatura e sofrem extensos danos após exposição prolongada à radiação. Freqüentemente, vários ou mesmo muitos cristais devem ser analisados ​​para que uma determinação de estrutura seja bem-sucedida, embora o advento da criocristalografia (Pflugrath, 1992 & # x025b6), detectores de área CCD de alta eficiência de contagem de fótons e faixa dinâmica (Gruner et al., 2001 & # x025b6), fontes de raios-X síncrotron de alta intensidade (Pflugrath, 1992 & # x025b6 Helliwell, 1992 & # x025b6) e novos métodos de faseamento (Rossmann & # x00026 Arnold, 2001 & # x025b6) diminuíram muito essa restrição .

A extensão do padrão de difração de um cristal está diretamente correlacionada com seu grau de ordem interna. Quanto mais vasto o padrão, ou quanto maior a resolução para a qual ele se estende, mais uniformes estruturalmente são as moléculas no cristal e mais preciso é seu arranjo periódico. O nível de detalhe ao qual as posições atômicas podem ser determinadas pela análise da estrutura cristalina corresponde intimamente a este grau de ordem cristalina. Enquanto os cristais convencionais freqüentemente difratam até seu limite teórico de resolução, os cristais de proteína, por comparação, produzem padrões de difração de extensão mais limitada.

Os canais de líquido e cavidades cheias de solvente que permeiam os cristais macromoleculares são os principais responsáveis ​​pela resolução limitada dos padrões de difração. Por causa dos espaços relativamente grandes entre as moléculas adjacentes e as conseqüentes forças da rede fraca, todas as moléculas no cristal podem não ocupar orientações e posições exatamente equivalentes, mas podem variar ligeiramente dentro ou entre as células unitárias. Além disso, devido à sua complexidade estrutural e ao seu potencial para dinâmica conformacional, as moléculas de proteína em um cristal particular podem exibir ligeiras variações no curso de suas cadeias polipeptídicas ou na disposição de grupos laterais de um para o outro.

Embora a presença de extensas regiões de solvente seja o principal contribuinte para a qualidade de difração geralmente modesta dos cristais de proteína, ela também é responsável por seu valor para os bioquímicos. Por causa do alto teor de solvente, as macromoléculas individuais nos cristais de proteína são cercadas por camadas de água que mantêm sua estrutura praticamente inalterada daquela encontrada na solução. Como consequência, a ligação do ligante, as características enzimáticas, espectroscópicas e a maioria das outras características bioquímicas são essencialmente as mesmas que para a molécula totalmente solvatada. Os compostos químicos convencionais, que podem ser íons, ligantes, substratos, coenzimas, inibidores, drogas ou outras moléculas efetoras, podem ser difundidos livremente para dentro e para fora dos cristais. As enzimas cristalinas, embora imobilizadas, são completamente acessíveis para experimentação simplesmente por meio da alteração do licor-mãe circundante.

O polimorfismo, como é evidente na Fig. 1 e # x025b6, é um fenômeno comum para proteínas, ácidos nucléicos e cristais de vírus. Presumivelmente, isso é uma consequência de sua faixa dinâmica conformacional e da sensibilidade dos contatos de rede envolvidos. Assim, hábitos diferentes e células unitárias diferentes podem surgir do que, pela maioria dos padrões, seriam chamadas de condições idênticas. Na verdade, várias formas de cristal às vezes são vistas coexistindo na mesma amostra de água-mãe.

Existem outras diferenças que complicam a cristalização de macromoléculas em comparação com pequenas moléculas convencionais (Feigelson, 1988 & # x025b6 Feher, 1986 & # x025b6 Durbin & # x00026 Feher, 1996 & # x025b6 McPherson, 1982 & # x025b6, 1999 & # x025b6 McPherson et al., 1995 & # x025b6). Em primeiro lugar, as macromoléculas podem assumir vários estados sólidos distintos que incluem precipitados amorfos, óleos ou géis, bem como cristais, e muitos destes são cineticamente favorecidos. Em segundo lugar, os cristais macromoleculares nucleados, ou iniciam o desenvolvimento, apenas em níveis muito elevados de supersaturação, muitas vezes duas a três ordens de magnitude maior do que o necessário para sustentar o crescimento. Finalmente, a cinética de nucleação e crescimento do cristal macromolecular é geralmente duas a três ordens de magnitude mais lenta do que para as moléculas convencionais (Kuznetsov et al., 1995 e # x025b6 Malkin et al., 1996 & # x025b6, 1997 & # x025b6). Esta última diferença surge de seu tamanho consideravelmente maior, difusividade reduzida e tendências de associação mais fracas em comparação com moléculas pequenas ou íons, bem como a menor probabilidade de incorporação de uma macromolécula de entrada em uma etapa de crescimento (Chernov, 2003 & # x025b6 Vekilov & # x00026 Chernov, 2002 & # x025b6).


Mutagênicos químicos:

Os produtos químicos são realmente perigosos para o mundo inteiro. O primeiro efeito mutagênico da mostarda nitrogenada foi relatado por charlotte Auerbach em 1942.

(a mostarda de nitrogênio é um gás venenoso usado durante as guerras mundiais 1 e 2).

Analógicos de base:

Os análogos de base são produtos químicos semelhantes às bases de DNA-purina e pirimidinas ou estruturalmente assemelham-se às bases de DNA. Bromouracil e aminopurina são dois análogos de bases comuns incorporados ao DNA - em vez de bases normais, durante o processo de replicação.

O 5-bromouracil são moléculas sintetizadas artificialmente - um análogo de base utilizado na pesquisa genética que é incorporado no DNA no lugar da timina. Em vez do grupo metil da timina, o bromouracil contém o grupo Br - muito parecido com a timina.

Emparelha-se com a adenina da mesma forma que com a timina e produz a mutação. Veja a imagem abaixo,

O emparelhamento de adenina e 5-bromouracil.

O mecanismo de ação do 5-BU é bastante interessante. Durante a replicação, em vez de timina, ele gera a guanina que emparelha com a citosina. Veja a imagem abaixo,

O bromouracil substitui a adenina e emparelha-se com a guanina durante a replicação.

Assim, o par de bases TA é substituído pelo par de bases GC no final da replicação e isso acontece por causa da mudança tautomérica de 5-BU da forma 'enol' para 'ceto'. Todo o mecanismo é mostrado na figura abaixo,

Ilustração gráfica do efeito do análogo de base bromouracil no DNA. A conversa do par de bases AT com o par de bases CG.

Aminopurinas:

Outro análogo de base é AP ou aminopurina que é semelhante à adenina e pode emparelhar com T ou C, embora o emparelhamento com C seja menos frequente. Também pode causar a transição de AT para GC ou GC para AT durante a replicação.

Agentes alquilantes:

Etilnitrosoureia, gás mostarda e cloreto de vinila são agentes alquilantes comuns que adicionam grupo alquil ao DNA e o danificam. Os agentes induzem erros de pareamento de bases aumentando a ionização e produzem lacunas na fita de DNA.

As bases de purinas alquiladas são removidas pelo fenômeno denominado depurinação, embora a depurinação não seja mutagênica e possa ser reparada pela via de reparo do DNA.

  1. Metilhidrazina
  2. Temozolomida
  3. Dacarbazina
  4. Busulfan
  5. Tio-TEPA
  6. Carmustina
  7. lomustina
  8. Sulfato de dimetil
  9. Sulfato de etil etano

“Quando nitritos (conservantes de alimentos) adicionados à carne defumada, formam nitrosaminas como um mutagênico que pode quebrar o DNA ou criar ligações cruzadas de DNA”.

Agentes intercalantes:

Alguma coisa bate em sua mente?

Nosso brometo de EtBr-etídio usado durante a eletroforese em gel de agarose é um dos agentes intercalantes. Outros agentes intercalantes como proflavina, laranja de acridina ou daunorrubicina operados pelo mesmo mecanismo como o EtBr.

As moléculas se intercalam entre as bases do DNA e interrompem sua estrutura. Se for incorporado durante a replicação, pode causar mutação de frameshift. Também pode bloquear a transcrição.

A ilustração gráfica do efeito de um agente intercalante no DNA.

Os agentes intercalantes causam exclusão ou inserção e interrompem a estrutura do DNA.

Íons metálicos:

Os íons metálicos também são perigosos para o nosso DNA, pois atuam de maneiras diferentes. Níquel, cromo, cobalto, cádmio, arsênio, cromo e ferro são alguns dos íons metálicos comuns que causam mutações.

Os íons metálicos atuam produzindo ROS (espécies reativas de oxigênio), dificultando a via de reparo do DNA, causando hipermetilação do DNA ou podendo danificar diretamente o DNA.

Outros mutagênicos químicos:

Espécies ROS-reativas de oxigênio, benzeno, borracha sintética e produtos de borracha, azida sódica, aminas aromáticas, alcalóides, agentes desaminantes e PAH (hidrocarbonetos policíclicos aromáticos) são outros mutagênicos que criam diferentes mutações.

O análogo de base e o agente intercalante, 5-bromouracil e acridina, respectivamente.


Observações finais e perguntas não respondidas

Conforme observado ao longo deste capítulo, Drosófila está faltando uma série de proteínas que são críticas para o reparo do DNA em outros organismos modelo. Por esta razão, Drosófila às vezes é visto como uma raridade. No entanto, uma vez que as vias de reparo parecem ser geralmente semelhantes às de outros organismos, é provável que estudos continuados de reparo de DNA em Drosófila levará a novos insights sobre os mecanismos de reparo, revelando como as vias de reparo funcionam na ausência de componentes importantes. Perguntas interessantes incluem:

Como é Drosófila capaz de tolerar grandes quantidades de uracila no DNA dos tecidos larvais?

Quais são as consequências da falta de NER acoplado à transcrição, que é importante tanto em fungos quanto em mamíferos?

Como vai Drosófila processar extremidades DSB não complementares para NHEJ, dado que não há polimerases da família B e nenhuma nuclease de Artemis?

Como vai Drosófila realizar a formação do filamento Rad51 sem BRCA1, Rad52 ou Rad51B?

Quais são os sinais que recrutam polimerases de transição para bases danificadas encontradas por bifurcações de replicação?

As respostas provavelmente incluirão a promoção de vias secundárias para funções primárias, fornecendo uma via para entender melhor essas vias e o recrutamento ou invenção de outras proteínas para tomar o lugar daquelas que estão faltando (ver Kohl et al. 2012 para um exemplo disso na recombinação meiótica).

Uma área em que Drosófila fez contribuições particularmente importantes como organismo modelo para estudar os mecanismos e consequências de reparo de DSB, começando com a descoberta de que os raios X induzem rearranjos e recombinação cromossômica (Muller 1927 Friesen 1933 Patterson e Suche 1934), e continuando com análises mais recentes de lacuna reparo seguindo P excisão do elemento, que resultou no modelo SDSA de HR (Nassif et al. 1994), e a descoberta do papel-chave de Polθ em EJ independente de Ku (Chan et al. 2010). Muitos dos detalhes desses processos ainda precisam ser elucidados. Curiosamente, um único evento de reparo pode envolver SDSA e TMEJ (Adams et al. 2003) uma questão importante agora é o que faz com que uma célula mude de SDSA para TMEJ (Figura 2).

Compreender os mecanismos de reparo do DSB é ainda mais importante com o recente desenvolvimento dos sistemas bacterianos CRISPR / Cas9 para realizar a engenharia do genoma (Cong et al. 2013 Mali et al. 2013). Dados empíricos de esforços de tentativa e erro, embora baseados em nosso entendimento incompleto das vias de reparo DSB, conseguiram melhorar e expandir os usos da tecnologia CRISPR / Cas9 para fazer mudanças genômicas precisas em uma ampla variedade de organismos, tanto modelos tradicionais quanto espécies anteriormente não passível de análises genéticas (revisado em Zhang et al. 2016). No entanto, discussões com colegas e observações feitas em meu próprio laboratório sugerem que eventos de reparo que não são facilmente explicados pelos paradigmas atuais não são raros. Pode nunca ser possível explicar todos os eventos incomuns de reparo, mas certamente um melhor entendimento da complexa rede de possibilidades ajudará a desenvolver ainda mais essa tecnologia. Experimentos que aproveitam as inúmeras ferramentas disponíveis para Drosófila os pesquisadores devem ser instrumentais nesse esforço.


  • Os antibióticos são os metabólitos secundários dos microrganismos.
  • Durante o processamento, o antibiótico deve ser extraído e purificado em um produto cristalino.
  • Antibióticos úteis são frequentemente descobertos usando um processo de triagem ou um processo de projeto racional.
  • antibiótico: Qualquer substância que pode destruir ou inibir o crescimento de bactérias e microrganismos semelhantes.
  • fermentação: Qualquer uma das muitas reações bioquímicas anaeróbicas nas quais uma enzima (ou várias enzimas produzidas por um microrganismo) catalisa a conversão de uma substância em outra, especialmente a conversão (usando levedura) de açúcares em álcool ou ácido acético com a evolução de dióxido de carbono.
  • metabólito: Qualquer substância produzida por, ou participando de uma reação metabólica.

Os antibióticos são produzidos industrialmente por um processo de fermentação, onde o microrganismo de origem é cultivado em grandes recipientes (100.000 & ndash 150.000 litros ou mais) contendo um meio de crescimento líquido.

A concentração de oxigênio, temperatura, pH e níveis de nutrientes devem ser ideais e são monitorados de perto e ajustados, se necessário. Como os antibióticos são metabólitos secundários, o tamanho da população deve ser controlado com muito cuidado para garantir que o rendimento máximo seja obtido antes que as células morram. Assim que o processo for concluído, o antibiótico deve ser extraído e purificado em um produto cristalino. Isso é mais simples de se conseguir se o antibiótico for solúvel em solvente orgânico. Caso contrário, deve primeiro ser removido por troca iônica, adsorção ou precipitação química.

Os microrganismos usados ​​na fermentação raramente são idênticos aos seus homólogos na natureza. Isso ocorre porque as espécies são frequentemente modificadas geneticamente para produzir a quantidade máxima de antibióticos. A mutação é freqüentemente usada e estimulada pela introdução de agentes mutagênicos, como radiação ultravioleta, raios-x ou certos produtos químicos. A seleção e posterior reprodução das cepas de maior rendimento ao longo de muitas gerações pode aumentar a produção em 20 vezes ou mais. Outra técnica usada para aumentar os rendimentos é a amplificação de genes, onde cópias de genes que codificam enzimas envolvidas na produção de antibióticos podem ser inseridas de volta em uma célula, por meio de vetores como plasmídeos. Este processo deve estar intimamente ligado a um novo teste da produção e eficácia do antibiótico.

Figura: Uma placa de ágar com microorganismos: Esta é uma placa de ágar semeada com microrganismos.

Apesar da grande variedade de antibióticos conhecida, menos de 1% dos agentes antimicrobianos têm valor médico ou comercial. Por exemplo, embora a penicilina tenha um alto índice terapêutico, uma vez que geralmente não afeta as células humanas, esse não é o caso de muitos antibióticos. Outros antibióticos simplesmente carecem de vantagem sobre os já em uso ou não têm outras aplicações práticas.

Antibióticos úteis são frequentemente descobertos por meio de um processo de triagem. Para conduzir tal triagem, isolados de muitos microrganismos diferentes são cultivados e, em seguida, testados para a produção de produtos difusíveis que inibem o crescimento dos organismos de teste. A maioria dos antibióticos identificados em tal triagem já são conhecidos e, portanto, devem ser desconsiderados. O restante deve ser testado quanto a suas toxicidades seletivas e atividades terapêuticas, e os melhores candidatos podem ser examinados e possivelmente modificados.

Uma versão mais moderna dessa abordagem é um programa de design racional. Isso envolve a triagem direcionada para encontrar novos produtos naturais que inibem um alvo específico, como uma enzima encontrada apenas no patógeno alvo, ao invés de testes para mostrar a inibição geral de uma cultura.


Método

EU ) Isolar uma cepa auxotrófica de Salmonella Typhimurium para histidina. (ou seja, His-ve)

II) Prepare uma suspensão teste de his-ve Salmonella Typhimurium em um tampão simples com o produto químico em estudo (por exemplo, 2-aminofluoreno). Adicione também uma pequena quantidade de histidina.

Nota: uma pequena quantidade de histidina é necessária para que as bactérias comecem a crescer. Uma vez que a histidina está esgotada, apenas as bactérias sofrem mutação para ganhar a capacidade de sintetizar colônias de forma de histidina.

III) Prepare também uma suspensão de controle de His-ve Salmonella Typhimurium, mas sem produtos químicos de teste.

4) Incubate the suspensions at 37°C for 20 minutes

V) Prepare the two agar plate and spread the suspension on agar plate.

VI) Incubate the plates at 37°C for 48 hours.

VII) After48 hours count the number of colonies in each plate.


Gene Mutations: Causes, Examples, and Types

The term ‘mutation’ was introduced by Hugo De Vries, a Dutch Botanist and also rediscovered of Mendel’s laws of heredity.

Mutation is a sudden, hereditary change in the genetic make up of an organism. Mutation is of two types gene mutations or point mutations and chromosomal mutations.

Gene mutations include changes in the structure or composition of genes whereas chromosomal mutations or chromosomal aberrations involve changes in the structure or number of chromosomes about which discussions have been made in the preceding paragraphs.

Since gene consists of few segments of DNA, gene mutations include changes in the number or arrangement of nucleotides. Thus, gene mutations alter or modify the expressions of a particular gene. Sickle cell anemia, chlorophyll deficiencies in plants and albinism (loss of pigment) are caused by gene mutations. Naturally occurring mutations are known as spontaneous mutations. In 1910, Morgan found few white eyed Drosophila in a population of no – mal red eyed Drosophila. In Drosophila many mutant forms such as white eye, black body, vestigial wings arose through spontaneous mutations.

Mutations caused by mutagenic agents like X-ray, Ultra-violet rays, mustard gas, formaldehyde, caffeine, phenol etc. are known as induced mutations. In contrast to spontaneous mutations, the frequency of induced mutations is high.

Causes of Gene Mutations:

Since gene mutations or point mutations involve changes in the number of nucleotides in a DNA segment or cistron, it is otherwise known as the frame shift mutations. Addition or insertion of one or more nucleotides or deletion of one or more nucleotides changes the sequence of amino acids during protein synthesis. If a nucleotide pair (= nitrogenous base pair) is substituted (substitution mutations) by another pair it will also produce gene mutations.

These substitutions are caused either as:

In transition, a purine is replaced by another purine and a pyrimidine is replaced by another pyrimidine i.e., A = T is replaced by G = C or vice-versa. In trans version, a purine is replaced by a pyrimidine or a pyrimidine by a purine, i.e., C = G is replaced by G = C or A = I is replaced by T = A.

Examples of Gene Mutations:

The earliest record of gene mutations dates back to 1791, when Seth Wright observed a lamb with unusually short legs in his flock of sheep. This short legged or Ancon sheep could not gel over the low stone fence and damage the crop in the nearby fields. Wright thought that it would be worthwhile to have a whole flock of these short legged sheep for this reason.

In the successive generations, this character was transferred and a line was developed where all sheep had short legs. This trait resulted from a recessive mutation and the short legged individuals were homozygous recessive. This gene mutation was discovered at a time when the science of genetics did not even have its birth.

The scientific study of mutations started in 1910, when T.H. Morgan started his work on fruitfully, Drosophila melanogaster, and reported white eyed male individuals among normal red eyed females. Later it was found that the gene for this character was found on sex chromosome.

The human blood disease sickle cell anemia is another example of point mutation. It is caused due to abnormal haemoglobin S which is an insufficient oxygen carrier. It has been observed that the abnormal haemoglobin differs from the normal one only in its two P polypeptide chains (haemoglobin 2 alpha and 2 beta chains) which contain amino acid valine instead of glutamic acid at the position sixth.

Minor change involving two nucleotides in DNA brings substitution in amino acid and thus producing profound change preventing synthesis of normal haemoglobin. Thalassemia, Phenyl ketonuria, alcaptonuria and many other human diseases are caused by simple base substitution in the nucleotide that prevents synthesis of normal protein. Gene mutations although cause minute change in the base pairing, its impact is largely felt by the organisms bearing such mutant gene.

Types of Mutations:

Generally mutations are harmful or deleterious and do not produce visible effects. Less than 20% mutations are lethal. The mutant genes when present in homozygous condition cause death of the organism. Mutant genes are mostly recessive to the normal gene. These genes produce their effects only in homozygous condition hence remain undetected for a period of time. It means that the mutation rate is actually much higher than the frequency of visible or detectable mutations.

(i) Forward and Reverse Mutations:

A mutation from wild type (original type) to a new type is known as forward mutation. The mutated gene may mutate back to the wild type. It is known as reverse mutation.

(ii) Somatic and Gametic Mutations:

Mutations occurring in somatic or non-reproductive cells are called somatic mutations, these are not heritable and are lost with ‘he death of the mutant organism. Mutations occurring in germ cells or gametes produce gametic mutations which are heritable.

(iii) Spontaneous and Induced Mutations.

Spontaneous mutations occur in natural conditions and have a very low frequency. Under experimental or artificial conditions induced mutations are caused. Any physical or chemical agent which introduces mutation in an organism is a mutagen or mutagenic agent. H.J. Muller (1927) induced mutations in Drosophila by X-rays and observed that the frequency of mutations is directly proportional to the amount of X-ray.

Role of Mutation in Evolution:

Hugo De Vries (1901) of Netherland propounded the mutation theory of evolution. According to him new species evolve from earlier species, not by natural selection and accumulation of small, continuous variations through generations, but by sudden heritable changes in the characteristics of the individuals. Later, the mutation theory was widely criticized on the point that “new species arose only by mutation”.

At present mutations are considered to be raw material for evolution. Other forces of evolution like natural selection, isolation, genetic drift etc. operate on mutations to bring divergence in the naturally inter breeding populations. Though, majority of mutations are harmful or disadvantageous to their possessors, but some may be harmless and a few advantageous.

Usefulness of Mutation:

Methods for inducing mutations are being widely used all over the world in the improvement of crop plants including food, fodder, horticulture, medicinal or industrial commodity plants. This is done with the help of some mutagens such as some chemicals and radiations. Nitrous oxide, ethylene, colchicine, mustard gas etc. are used as chemical mutagens.

Irradiations by X-rays, gamma rays etc. are also used to induce mutations. Many high yielding, high protein and high vitamin containing crops have been developed by irradiation. Sugar contents of sugarcane, oil contents of oil seed, fibre contents of many fibre yielding plants have been improved with the help of artificial mutation. Some insect pests are sterilized through artificial mutation which is an important attempt towards pest control.

(ii) In Animal Breeding:

Breeding of useful animals through mutation may lead to more healthy and disease resistant animal varieties. However, induced mutants have rarely been tried for this purpose although a number of mutant varieties of animals have also been found beneficial.

Short legged Acorn breed of sheep described in the earlier paragraph belongs lo this category. Now certain mutant varieties of cattle, horses, pigeon and cats have been selected and interbred to maintain their races. Some new breeds of sheep have been developed in U.S.A., Australia and New Zealand.

(iii) In Microorganisms:

It is easy to induce mutations in microorganisms like bread mould- Neurospora (a unicellular fungus) and intestinal bacterium Escherichia coli than the higher plants and animals. Haploid micro organisms have just one copy of each gene. In them, each and every mutation is expressed in the same generation and thus easy to locate mutation. Development of better varieties of yeast, Penicillium and some other microorganisms may increase commercial production of alcohol, antibiotics, acids and solvents.