Em formação

Técnica de laboratório para distinguir entre DNA de fita simples e de fita dupla?


Quais técnicas de laboratório existem para diferenciar entre DNA de fita simples e de fita dupla?


O DNA de fita simples e dupla tem diferentes mobilidades eletroforéticas, o ssDNA se moverá mais rápido em um gel de agarose, então se você souber o comprimento do seu DNA e ele se mover mais longe do que você espera em relação a uma escada de dsDNA, é provavelmente o ssDNA. O efeito hipercrômico significa que o ssDNA também absorve mais fortemente do que o dsDNA, então você pode aquecer o seu DNA e se a absorbância mudar era dsDNA e se não mudar, então o seu ssDNA (você deve pegar uma alíquota para isso para que você tenha o resto sua amostra no tato). Você também pode pegar uma alíquota e adicionar uma exonuclease de fita simples e executar os produtos em um gel junto com o DNA antes da digestão, se nada estiver presente depois no poço digerido, então você teve ssDNA se ainda houver uma banda depois disso você teve dsDNA (não acho que este método seja realmente usado, pois você poderia apenas executá-lo em um gel que é mais simples e você perde menos amostra, mas ainda deve funcionar).


O que é RNA de cadeia dupla? (com fotos)

O ácido ribonucléico (RNA) de fita dupla é uma forma única de RNA que aparece com duas fitas complementares, em vez de uma fita simples isolada, como é mais comum neste material genético. O RNA contém o código para uma série de atividades biológicas e desempenha um papel importante nos organismos vivos. O RNA de fita dupla, também conhecido como dsRNA, geralmente aparece em vírus e é um tanto incomum. Em vírus, é uma característica única e apenas um pequeno número de famílias virais exibe essa característica.

O RNA é formado por cadeias de ácidos nucléicos que se ligam uns aos outros para formar uma fita conectada. As formas de cadeia única podem ter uma estrutura muito complexa porque se dobram umas sobre as outras e criam formas tridimensionais elaboradas. O RNA de fita dupla pode se tornar ainda mais complexo, pois as duas cadeias de material genético também se dobram e se retorcem para realizar funções diferentes. A obtenção de imagens de RNA é um desafio devido ao tamanho extremamente pequeno. Sistemas de imagem muito sensíveis e poderosos são necessários para ver o RNA em um ambiente de laboratório.

Pesquisadores com interesse em RNA de fita dupla podem isolá-lo em laboratório, introduzindo enzimas de corte em uma amostra de RNA. As enzimas terão como alvo quaisquer cadeias simples de RNA para separá-las, deixando as cadeias duplas para trás. Essas enzimas estão disponíveis em fornecedores científicos ou os laboratórios podem fazer as suas próprias para pesquisas específicas. Normalmente, um ambiente controlado é necessário para clivar o RNA com enzimas, pois contaminantes podem interromper o processo.

Uma função do RNA de fita dupla é a interferência ou silenciamento. As fitas podem mudar a forma como um gene se expressa ou desligá-lo completamente. Para vírus dsRNA, isso confere uma vantagem distinta. O vírus pode entrar em uma célula e desligar os genes para se proteger e sequestrar a célula para produzir mais cópias do vírus. Os vírus nesse grupo podem ser difíceis de tratar, pois podem se tornar um alvo móvel no corpo e podem lutar contra os medicamentos que um médico pode prescrever para tratá-los.

Assim como sua contraparte mais conhecida, o DNA, o RNA pode ser sequenciado com equipamentos que irão identificar a cadeia química em cada fita. Os ácidos nucléicos no RNA formarão pares complementares e isso pode facilitar a extrapolação de um padrão. Sequenciar a genética do RNA de fita dupla pode ser importante para entender como ele funciona em organismos vivos, o que permitirá aos pesquisadores desenvolver drogas antivirais para atacar os vírus que carregam essa carga genética única.

Desde que começou a contribuir para o site há vários anos, Mary abraçou o desafio emocionante de ser uma pesquisadora e redatora do InfoBloom. Mary é formada em artes liberais pelo Goddard College e passa seu tempo livre lendo, cozinhando e explorando a natureza.

Desde que começou a contribuir para o site há vários anos, Mary abraçou o desafio emocionante de ser uma pesquisadora e redatora do InfoBloom. Mary é formada em artes liberais pelo Goddard College e passa seu tempo livre lendo, cozinhando e explorando a natureza.


INTRODUÇÃO

No início do estudo de vírus capazes de matar bactérias (isto é, bacteriófagos ou fagos), o primeiro fago de DNA de fita simples (ssDNA) φX174 foi isolado dos esgotos de Paris (Sertic e Bulgakov 1935). Embora a natureza de seu genoma não tenha sido compreendida até décadas depois (Sinsheimer 1959), o fato de que este vírus manteve a infectividade mesmo depois de passar pelos menores filtros de tamanho de poro disponíveis na época indicava o tamanho extremamente pequeno deste fago em comparação com outros isolados . No início da década de 1960, os fagos Ff, um grupo distinto de fagos ssDNA filamentosos que infectam o conjugativo Escherichia coli cepas (isto é, cepas F-pilus positivas), também foram isoladas de sistemas de esgoto na Europa e nos EUA (Loeb 1960 Hofschneider 1963 Marvin e Hoffmann-Berling 1963). Os pequenos genomas ssDNA circulares de φX174 e os fagos Ff levaram a seus papéis proeminentes como sistemas e ferramentas modelo na era de ouro da biologia molecular. Entre muitos outros marcos, φX174 foi o primeiro genoma de DNA a ser sequenciado (Sanger, Nicklen e Coulson 1977) e o primeiro genoma a ser construído em vitro a partir de oligonucleotídeos sintetizados (Smith et al. 2003), enquanto os fagos Ff, especialmente M13, foram usados ​​para clonagem (Messing et al. 1977), exibição de fago (Smith 1985) e nanotecnologia (Finnigan et al. 2004).

Durante a maior parte do século passado, a descoberta de novos fagos permaneceu dependente de técnicas clássicas de ensaio de placa usando hospedeiros bacterianos cultivados. Como resultado, a maioria dos fagos na última versão de taxonomia do Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV) (Adams et al. 2015), foram isolados em hospedeiros bacterianos pertencentes a grupos de cultura relativamente fácil. Além disso, a maioria dos fagos reconhecidos por ICTV são fagos de DNA de fita dupla (dsDNA) pertencentes à ordem Caudovirales (Fig. 1a). Apesar da importância dos fagos ssDNA no desenvolvimento da biologia molecular e sua exploração pesada para fins biotecnológicos, os fagos ssDNA representam apenas 11% dos fagos no banco de dados ICTV. A maioria destes são fagos filamentosos pertencentes à família Inoviridae, incluindo os fagos Ff descritos acima, enquanto a família Microviridae, que inclui φX174, representa apenas 2% do banco de dados. Com base no banco de dados ICTV, a análise microscópica eletrônica de fagos cultivados (Ackermann 2007) e a análise do tamanho do genoma de genomas virais ambientais (Wommack et al. 1999), o paradigma geral por muitos anos tem sido que a grande maioria dos fagos são fagos de dsDNA com cauda.

Composição taxonômica hierárquica de (uma) espécies de fago reconhecidas pelo ICTV (b) e leituras de sequência identificadas como fagos em metaviromas depositados em Metavir (Roux et al. 2014b). Para a geração de (b), apenas metaviromas previamente publicados com leituras desmontadas disponíveis foram incluídos para poder verificar os métodos de geração da biblioteca (total = 181 Tabela S1, Informações de Apoio). A composição taxonômica das leituras foi calculada pelo Metavir realizando a comparação BLASTx com o banco de dados de sequência de proteínas de genomas virais completos NCBI Refseq (lançamento de 2015-01-05). As leituras foram comprimento do genoma normalizado usando GAAS (Angly et al. 2009) e apenas as leituras que apresentaram um acerto significativo (limite de 50 no bitcore do BLAST) foram incluídas.

Composição taxonômica hierárquica de (uma) espécies de fago reconhecidas pelo ICTV (b) e leituras de sequência identificadas como fagos em metaviromas depositados em Metavir (Roux et al. 2014b). Para a geração de (b), apenas metaviromas previamente publicados com leituras desmontadas disponíveis foram incluídos para poder verificar os métodos de geração da biblioteca (total = 181 Tabela S1, Informações de Apoio). A composição taxonômica das leituras foi calculada pelo Metavir realizando a comparação BLASTx com o banco de dados de sequência de proteínas de genomas virais completos NCBI Refseq (lançamento de 2015-01-05). As leituras foram comprimento do genoma normalizado usando GAAS (Angly et al. 2009) e apenas as leituras que apresentaram um acerto significativo (limite de 50 no bitcore do BLAST) foram incluídas.

Os avanços na biologia molecular revelaram a vasta diversidade de bactérias ambientais que não podiam ser cultivadas usando métodos de laboratório padrão (Pace et al. 1986) prenunciando a grave subestimação da diversidade de fagos representada por isolados de cultura (Breitbart, Miyake e Rohwer 2004). Ironicamente, embora as técnicas de biologia molecular tenham sido desenvolvidas por meio do uso de fagos, a falta de genes de fago universais, como os genes de RNA ribossômico encontrados em organismos celulares, limita substancialmente a aplicação de técnicas moleculares para estudar a diversidade de fagos. Numerosos estudos utilizaram a amplificação de 'genes de assinatura', que são conservados entre membros limitados de grupos de fagos específicos para estudar a diversidade de fagos não cultivados (Adriaenssens e Cowan 2014), no entanto, foi a introdução da metagenômica viral em 2002 que primeiro esclareceu a vasta diversidade de vírus no ambiente (Breitbart et al. 2002). Avanços subsequentes no campo da metagenômica viral permitiram a recuperação de vírus ssDNA (Angly et al. 2006) e vírus de RNA (Culley, Lang e Suttle 2006) também.

Estudos virais metagenômicos forneceram uma visão significativa sobre a diversidade, ecologia, conteúdo genético, distribuição em profundidade e biogeografia de fagos dsDNA (Rosario e Breitbart 2011). Menos pesquisas abordaram a prevalência e os papéis ecológicos dos fagos ssDNA ou compararam as distribuições desses dois tipos de fagos de DNA. Esta lacuna de conhecimento é significativa, uma vez que a proporção de fagos ssDNA para fagos dsDNA entre as bibliotecas de metaviroma publicadas e depositadas no Metavir, um servidor web projetado para anotar conjuntos de dados metagenômicos virais (Roux et al. 2014b), é mais do que o dobro da proporção na base de dados ICTV (Fig. 1b). Além disso, a maioria dos fagos ssDNA nos metaviromas estão relacionados a membros da família Microviridae, que é normalmente considerado como um grupo de fagos especializados que infectam apenas uma estreita faixa de hospedeiros (Enterobactérias e parasitas intracelulares, como Clamídia) (Cherwa e Fane 2011). No entanto, a geração de conjuntos de dados metagenômicos virais tem muitos vieses conhecidos (Kim e Bae 2011) e potenciais, o que leva a incertezas quanto à verdadeira abundância e importância dos fagos ssDNA. Portanto, o escopo desta revisão é apresentar as seguintes questões no que diz respeito à sua relevância para o estudo de fagos ssDNA em amostras ambientais: (i) os principais aspectos em que os fagos ssDNA diferem dos fagos dsDNA com cauda (Caudovirales) e (ii) a prevalência de fagos ssDNA em estudos ambientais anteriores e as limitações atuais do seu estudo.


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Eletroforese em Gel

Como os ácidos nucléicos são íons carregados negativamente em pH neutro ou alcalino em um ambiente aquoso, eles podem ser movidos por um campo elétrico. A eletroforese em gel é uma técnica usada para separar moléculas carregadas com base no tamanho e na carga. Os ácidos nucleicos podem ser separados como cromossomos inteiros ou como fragmentos. Os ácidos nucléicos são carregados em uma fenda em uma extremidade de uma matriz de gel, uma corrente elétrica é aplicada e moléculas carregadas negativamente são puxadas em direção à extremidade oposta do gel (a extremidade com o eletrodo positivo). Moléculas menores se movem através dos poros no gel mais rápido do que moléculas maiores. Essa diferença na taxa de migração separa os fragmentos com base no tamanho. Os ácidos nucléicos em uma matriz de gel são invisíveis até serem corados com um composto que permite sua visualização, como um corante. Fragmentos distintos de ácidos nucléicos aparecem como bandas a distâncias específicas do topo do gel (a extremidade do eletrodo negativo) que são baseadas em seu tamanho (Figura 10.3). Uma mistura de muitos fragmentos de tamanhos variados aparece como um esfregaço longo, enquanto o DNA genômico não cortado é geralmente muito grande para percorrer o gel e forma uma única banda grande na parte superior do gel.

Figura 10.3 São mostrados fragmentos de DNA de seis amostras executadas em um gel, coradas com um corante fluorescente e visualizadas sob luz ultravioleta. (crédito: modificação do trabalho de James Jacob, Tompkins Cortland Community College)


Concentração de DNA de cadeia simples livre de células no LCR como biomarcador para diagnosticar a doença de Alzheimer

A neuropatologia da doença de Alzheimer (DA) é bem conhecida como uma degradação das conexões neurais no cérebro causada por vários depósitos de placas de peptídeo beta-amilóide, bem como emaranhados neurofibrilares de proteínas tau [1]. Devido a isso e à pesquisa bem-sucedida, os níveis de beta-amiloide 42 e de proteína tau no líquido cefalorraquidiano atualmente servem como biomarcadores importantes para o diagnóstico de DA de acordo com os Novos Critérios de Pesquisa para o Diagnóstico de DA fornecidos pelo Grupo de Trabalho Internacional (IWG) [ 2].

Antes da adição atual de biomarcadores, os critérios de diagnóstico de AD para o status “provável” de AD usavam apenas métodos de exclusão clínica de outras possíveis causas de demência, reduzindo-se a um diagnóstico de AD por dedução [2]. No entanto, esses critérios foram revisados ​​recentemente para incluir biomarcadores beta-amilóide e tau, bem como exames de PET amilóide. Desde essas mudanças, os biomarcadores da DA têm distinguido com sucesso a demência da DA de pacientes com ajuste cognitivo, com uma estatística de especificidade em alguns estudos entre 85 a 95% [3] [4]. No entanto, apesar da correlação direta entre os biomarcadores centrais da DA e a patologia da DA, a precisão do diagnóstico clínico varia amplamente. O uso de biomarcadores AD em todo o mundo carece de padronização e harmonização de intervalos e dados normais, o que também aumenta a margem de erro humano na coleta de dados. Por causa disso, há uma necessidade compreensível de biomarcadores adicionais para aumentar a precisão do diagnóstico [5] [6]. Neste estudo, estamos olhando para o DNA de fita simples livre de células (cfssDNA) como um possível biomarcador suplementar de AD aos biomarcadores principais de AD, onde os métodos e os dados são simples, baratos e, em sua maioria, padronizados. DNA livre de células: em um paciente normal e saudável, o DNA livre de células é principalmente o resultado de células que sofreram apoptose. Uma vez no sistema circulatório do corpo, o fígado dissipa rapidamente o DNA livre de células em 10-15 minutos [7]. O DNA livre de células é mais comumente conhecido e usado como biomarcador para vários tipos de câncer, uma vez que a pesquisa mostrou diferenças notáveis ​​entre o DNA livre de células de um paciente com câncer e o de um paciente normal. Por causa disso, muitos dos métodos de extração e análise de dados de DNA livre de células foram estudados e padronizados [8] [9]. Estudos recentes foram realizados em DNA mitocondrial livre de células (mtDNA) para testar sua viabilidade como um biomarcador de DA. Demonstrou-se que os baixos níveis de concentração de mtDNA nos níveis de AD são muito significativos em um grupo de 48 pacientes com AD em comparação com 36 controles. Essas baixas concentrações também parecem distinguir a DA de outras doenças causadoras de demência, como a demência frontotemporal e a doença de Creutzfeldt-Jakob [10]. No entanto, estudos de replicação demonstraram que níveis baixos de mtDNA também foram encontrados em pacientes com doença de Parkinson, tornando o mtDNA obscuro como uma característica distintiva na DA ou uma característica compartilhada para várias doenças neurodegenerativas [11] [12]. Com outros tipos de DNA livre de células já sendo estudados como possíveis biomarcadores de DA, nosso estudo visa avaliar a viabilidade do DNA de fita simples livre de células como um biomarcador suplementar para o diagnóstico de DA.

Métodos:

Amostras humanas: Inicialmente, um total de 145 amostras de líquido cefalorraquidiano lombar foram obtidas de pacientes com deficiência cognitiva de clínicas de memória italiana e sueca (sueca 1 e sueca 2). Os pacientes foram designados como AD ou não AD de acordo com o nível de biomarcadores do líquido cefalorraquidiano (LCR) usando pontos de corte estabelecidos: tau total (T-tau) & gt400 ng / L, tau-fósforo (P-tau) & gt60 ng / L e beta amilóide 42 (Ab-42) & lt500 ng / L. Todas as amostras foram armazenadas a -80 graus Celsius. De ambas as coortes suecas, a idade média é de 73 anos com um desvio padrão da idade dos pacientes de 10,26 e 11,68 anos. A proporção de mulheres nas coortes suecas é de 37% e 40%, respectivamente. A coorte italiana representa uma maior porcentagem de mulheres, com 53% de proporção de mulheres. No geral, nossos estudos tiveram 72 casos conhecidos de AD diagnosticados como resultado do cumprimento dos limites de biomarcadores estabelecidos e 73 controles com uma proporção geral de sexo sendo 41% feminino Contando células em CFS Usando técnicas de hemocitômetro, 10 μL de CFS foram usados ​​para contar o número de células presentes por amostra. Extração de DNA total do líquido cefalorraquidiano: 200 μL de CSF foram usados ​​para extração de DNA com o protocolo de purificação de DNA do QIAamp DNA Blood Mini Kit, conforme descrito pelo fabricante. O DNA foi eluído em um volume final de 50 μL e armazenado a -20 graus Celsius aguardando análise. Seguimos as práticas e protocolos de laboratório para evitar a contaminação cruzada entre as amostras. Triagem e análise de DNA: usando a tecnologia de ensaio Qubit e seguindo os protocolos de fabricação, usamos 5 a 10 μL de DNA para quantificação. Todas as amostras foram triadas em três momentos independentes e separados. A média desses valores foi utilizada para determinar a concentração de DNA em cada amostra. Todas as medições foram escaladas em ng / L. Além disso, fizemos a triagem de DNA de fita dupla, RNA e DNA de fita simples. As análises estatísticas foram realizadas usando um teste T pareado para determinar a diferença na média dos dois grupos. A análise de regressão nominal não paramétrica foi usada para determinar se cfssDNA é uma variável significativa para determinar o estado de DA. Para determinar isso, rodamos nosso modelo com cfssDNA como variável única e uma análise separada onde a idade de início e o sexo foram introduzidos como co-variantes. Além disso, a regressão nominal não paramétrica foi usada para obter a curva da Característica Operacional (ROC) e o valor da área sob a curva (AUC). A análise multivariada foi feita para observar as correlações dos casos de AD com Ab-42 e P-tau.

Resultados:

O protocolo de ensaio do hemocitômetro falhou em detectar células presentes no SFC. O ensaio Qubit mostrou concentrações detectáveis ​​apenas para ssDNA. A análise de teste T emparelhado determinou que cfssDNA em casos de AD é significativamente menor do que o controle não AD, com um valor de p bicaudal de 0,0007 e uma diferença de média de 21,66 ng / L. Além disso, os intervalos de confiança de 95% da média para casos de AD variam entre 68,85 ng / L e 86,4 ng / L, ao passo que em casos não AD esta faixa oscila entre 90,57 ng / L e 108ng / L. A análise de regressão nominal não paramétrica mostrou que cfssDNA é uma variável significativa para predizer o estado de DA, a significância da predição aumenta quando a idade de início e o sexo são introduzidos como co-variantes (X2 p-valor 0,0273). Finalmente, a curva ROC teve uma AUC de 0,82901. Esses resultados foram consistentes, independentemente se as coortes foram analisadas de forma independente ou combinadas.

Discussão:

As medições do hemocitômetro não conseguiram detectar as células presentes no LCR. Isso é consistente com as revisões anteriores da literatura, indicando que a contagem normal de células no LCR não excede cinco células por mL [13]. Portanto, podemos inferir que qualquer material de núcleo extraído de amostras de LCR se origina de uma fonte livre de células. Estes resultados demonstram que os casos de AD têm concentração de cfssDNA significativamente mais baixa do que os controles. Todos os três conjuntos de dados tiveram AUC superior a 0,80, isto é comparável à AUC que é observada com Ab42 e P-tau em outros relatórios. Como a medição da concentração de cfssDNA é barata, confiável e fácil de conduzir, o cfssDNA pode representar um biomarcador significativo e de baixo custo para a DA. Mais estudos da sensibilidade desta medição são necessários para estabelecer ainda mais CFssDNA como um biomarcador para AD e compará-lo a outros biomarcadores potenciais para AD, como Ab42 e pTau.

Tabela 1. Descrição demográfica da coorte sueca 1 e 2 e italiana.

Tabela 2. teste t pareado, regressão nominal não paramétrica X2

Figura 1. A) Distribuição da concentração de cfssDNA (ng / L) por casos de DA e não. B) Curva de característica de operação do receptor (AUC = 0,82901)

Trabalhos citados:

1. Höglund, K., et al., Alzheimer & # 8217s disease - Recentes desenvolvimentos de biomarcadores em relação a critérios de diagnóstico atualizados. Clinica Chimica Acta, 2015. 449: p. 3-8.

2. Dubois, B., et al., Critérios de pesquisa para o diagnóstico da doença de Alzheimer & # 8217s: revisando os critérios NINCDS – ADRDA. The Lancet Neurology, 2007. 6 (8): p. 734-746.

3. Johansson, P., et al., Cerebrospinal fluid biomarkers for Alzheimer & # 8217s disease: diagnostic performance in a homogeneous mono-center population. Journal of Alzheimer’s Disease, 2011. 24 (3): p. 537-546.

4. Landau, S.M., et al., Comparing preditores de conversão e declínio no comprometimento cognitivo leve. Neurology, 2010. 75 (3): p. 230-238.

5. Fagan, A. e R. Perrin, Upcoming cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. Biomark Medical, 2013. 6 (4): p. 455-476.

6. G.M., S., et ai., The Clinical Use of Cerebrospinal Fluid Biomarkers for Alzheimer & # 8217s Disease Diagnosis: The Italian Selfie. Journal of Alzheimer’s Disease, 2017. 55 (4): p. 1659-1666.

7. Suzuki, N., et al., Characterization of circulating DNA in healthy human plasma. Clinica Chimica Acta, 2008. 387 (1-2): p. 55-58.

8. Alegre, E., et al., Circulating Biomarkers in Malignant Melanoma. Advances in Clinical Chemistry, 2015. 69: p. 47-89.

9. Diaz Jr., L.A. e A. Bardelli, Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Journal of Clinical Oncology, 2014. 32 (6): p. 579-586.

10. Podlesniy, P., et al., Low cerebrospinal fluid focus of mitochondrial DNA in preclinical Alzheimer disease. Annals of Neurology, 2013. 74 (5): p. 655-668.

11. Pyle, A., et al., Reduced CSF mitochondrial DNA is a biomarker for early stage Parkinson & # 8217s disease. Annals of Neurology, 2015. 38: p. 216.e7-216.e10.

12. Cervera-Carles, L., et al., Cerebrospinal fluid mitochondrial DNA in the Alzheimer’s disease continuum. Neruobiology of Aging, 2015. 53: p. 192.e1-192.e4.

13. Sakka, L., G. Coll e J. Chazal, Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. Eur Ann Otorhinolaryngol Head Neck Dis, 2011. 128 (6): p. 309-16.


Reação de deslocamento de cadeia de DNA: uma ferramenta poderosa para discriminar variantes de nucleotídeo único

Variantes de nucleotídeo único (SNVs) que estão fortemente associadas a muitas doenças genéticas e tumores são importantes biológica e clinicamente. A detecção de SNVs possui grande potencial para diagnóstico e prognóstico de doenças. Avanços recentes na nanotecnologia de DNA têm oferecido vários princípios e estratégias passíveis de detecção e quantificação de SNVs com alta sensibilidade, especificidade e programabilidade. Nesta revisão, enfocaremos nossa discussão em técnicas emergentes que fazem uso de deslocamento de fita de DNA, um bloco de construção básico em nanotecnologia de DNA dinâmica. Com base em seus princípios de operação, classificamos os métodos atuais de detecção de SNV em três categorias principais, incluindo estratégias que usam reações de deslocamento de fita mediadas pelo dedo do pé, reações de troca do dedo do pé e reações de deslocamento de fita mediadas por enzima. Esses métodos de detecção discriminam SNVs de suas contrapartes de tipo selvagem por meio de diferenças sutis na termodinâmica, cinética ou resposta à manipulação enzimática. A notável programabilidade da nanotecnologia de DNA dinâmica também permite o projeto previsível e a operação flexível de diversas sondas e / ou primers de deslocamento de fita. Aqui, oferecemos um levantamento sistemático das estratégias atuais, com ênfase nos mecanismos moleculares e sua aplicabilidade ao diagnóstico in vitro.

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Morfologia Viral

Os vírus de todas as formas e tamanhos consistem em um núcleo de ácido nucleico, um revestimento externo de proteína ou cápside e, às vezes, um envelope externo.

Objetivos de aprendizado

Descreva a relação entre o genoma viral, capsídeo e envelope

Principais vantagens

Pontos chave

  • Os vírus são classificados em quatro grupos com base na forma: filamentoso, isométrico (ou icosaédrico), envelopado e cabeça e cauda.
  • Muitos vírus se ligam às células hospedeiras para facilitar a penetração na membrana celular, permitindo sua replicação dentro da célula.
  • Os vírus sem envelope podem ser mais resistentes a mudanças de temperatura, pH e alguns desinfetantes do que os vírus com envelope.
  • O núcleo do vírus contém o pequeno genoma de fita simples ou dupla que codifica as proteínas que o vírus não consegue obter da célula hospedeira.

Termos chave

  • capsídeo: a camada externa de proteína de um vírus
  • envelope: uma estrutura envolvente ou cobertura, como uma membrana
  • filamentoso: Tendo a forma de fios ou filamentos
  • isométrico: de, ou sendo um sistema geométrico de três eixos iguais dispostos em ângulos retos entre si (especialmente na cristalografia)

Morfologia Viral

Os vírus são acelulares, o que significa que são entidades biológicas que não possuem uma estrutura celular. Portanto, eles carecem da maioria dos componentes das células, como organelas, ribossomos e a membrana plasmática. Um vírion consiste em um núcleo de ácido nucléico, um revestimento externo de proteína ou capsídeo e, às vezes, um envelope externo feito de proteínas e membranas fosfolipídicas derivadas da célula hospedeira. O capsídeo é composto por subunidades de proteínas chamadas capsômeros. Os vírus também podem conter proteínas adicionais, como enzimas. A diferença mais óbvia entre os membros de famílias virais é sua morfologia, que é bastante diversa. Uma característica interessante da complexidade viral é que a complexidade do hospedeiro e do vírion não estão correlacionadas. Algumas das estruturas mais intrincadas do vírion são observadas nos bacteriófagos, vírus que infectam os organismos vivos mais simples: as bactérias.

Morfologia

Os vírus vêm em muitas formas e tamanhos, mas são consistentes e distintos para cada família viral. Em geral, as formas dos vírus são classificadas em quatro grupos: filamentosos, isométricos (ou icosaédricos), envelopados e cabeça e cauda. Os vírus filamentosos são longos e cilíndricos. Muitos vírus de plantas são filamentosos, incluindo o TMV (vírus do mosaico do tabaco). Os vírus isométricos têm formas quase esféricas, como o poliovírus ou o vírus do herpes. Os vírus envelopados possuem membranas ao redor dos capsídeos. Os vírus animais, como o HIV, são freqüentemente envolvidos. Os vírus da cabeça e da cauda infectam bactérias. Eles têm uma cabeça semelhante à dos vírus icosaédricos e uma cauda semelhante à dos vírus filamentosos.

Muitos vírus usam algum tipo de glicoproteína para se anexar às células hospedeiras por meio de moléculas na célula chamadas de receptores virais. Para esses vírus, a fixação é um requisito para posterior penetração na membrana celular, permitindo que completem sua replicação dentro da célula. Os receptores usados ​​pelos vírus são moléculas normalmente encontradas na superfície das células e têm suas próprias funções fisiológicas. Os vírus simplesmente evoluíram para fazer uso dessas moléculas para sua própria replicação.

Exemplo de um vírus se ligando à sua célula hospedeira: O vírus KSHV se liga ao receptor xCT na superfície das células humanas. Este anexo permite a penetração posterior da membrana celular e a replicação dentro da célula.

No geral, a forma do vírion e a presença ou ausência de um envelope nos dizem pouco sobre a doença que o vírus pode causar ou quais espécies ele pode infectar, mas ainda são meios úteis para iniciar a classificação viral. Entre os vírions mais complexos conhecidos, o bacteriófago T4, que infecta o Escherichia coli bactéria, tem uma estrutura de cauda que o vírus usa para se ligar às células hospedeiras e uma estrutura de cabeça que abriga seu DNA. O adenovírus, um vírus animal sem envelope que causa doenças respiratórias em humanos, usa picos de glicoproteína que se projetam de seus capsômeros para se anexar às células hospedeiras. Os vírus sem envelope também incluem aqueles que causam poliomielite (poliovírus), verrugas plantares (papilomavírus) e hepatite A (vírus da hepatite A).

Exemplos de formas de vírus: Os vírus podem ter uma forma complexa ou relativamente simples. Esta figura mostra três vírions relativamente complexos: o bacteriófago T4, com seu grupo de cabeça contendo DNA e fibras da cauda que se ligam a adenovírus de células hospedeiras, que usa picos de seu capsídeo para se ligar a células hospedeiras e HIV, que usa glicoproteínas embutidas em seu envelope para se ligar às células hospedeiras.

Os vírions envelopados, como o HIV, consistem em ácido nucléico e proteínas do capsídeo rodeados por um envelope de bicamada fosfolipídica e suas proteínas associadas. As glicoproteínas incorporadas no envelope viral são usadas para se anexar às células hospedeiras. Outras proteínas do envelope incluem as proteínas da matriz que estabilizam o envelope e frequentemente desempenham um papel na montagem dos vírions da progênie. Varicela, gripe e caxumba são exemplos de doenças causadas por vírus com envelopes. Devido à fragilidade do envelope, os vírus sem envelope são mais resistentes a mudanças de temperatura, pH e alguns desinfetantes do que os vírus com envelope.

Tipos de ácido nucléico

Ao contrário de quase todos os organismos vivos que usam DNA como material genético, os vírus podem usar DNA ou RNA. O núcleo do vírus contém o genoma ou o conteúdo genético total do vírus. Os genomas virais tendem a ser pequenos, contendo apenas os genes que codificam proteínas que o vírus não pode obter da célula hospedeira. Este material genético pode ser de fita simples ou dupla. Também pode ser linear ou circular. Enquanto a maioria dos vírus contém um único ácido nucléico, outros têm genomas que possuem vários, chamados segmentos.

Em vírus de DNA, o DNA viral direciona as proteínas de replicação da célula hospedeira & # 8217s para sintetizar novas cópias do genoma viral e para transcrever e traduzir esse genoma em proteínas virais. Os vírus de DNA causam doenças humanas, como varicela, hepatite B e algumas doenças venéreas, como herpes e verrugas genitais.

Os vírus de RNA contêm apenas RNA como seu material genético. Para replicar seus genomas na célula hospedeira, os vírus de RNA codificam enzimas que podem replicar o RNA em DNA, o que não pode ser feito pela célula hospedeira. Essas enzimas de RNA polimerase são mais propensas a cometer erros de cópia do que as de DNA polimerases e, portanto, costumam cometer erros durante a transcrição. Por esse motivo, as mutações em vírus de RNA ocorrem com mais freqüência do que em vírus de DNA. Isso faz com que eles mudem e se adaptem mais rapidamente ao hospedeiro. As doenças humanas causadas por vírus de RNA incluem hepatite C, sarampo e raiva.


A tecnologia de DNA recombinante é possível devido a várias ferramentas úteis para manipular moléculas de DNA e transformar células - incluindo plasmídeos, enzimas de restrição e DNA ligase. Este laboratório apresenta plasmídeos e enzimas de restrição, bem como a técnica de laboratório de eletroforese em gel. Experimentos de laboratório posteriores apresentarão a você as outras ferramentas da biotecnologia.

Enzimas de restrição (também chamado endonucleases de restrição) são proteínas feitas por muitas espécies bacterianas, para se defender contra infecções virais. Cada enzima de restrição se move ao longo de uma molécula de DNA até encontrar um específico sequência de reconhecimento no DNA. A enzima corta o DNA de fita dupla, resultando em fragmentos de DNA. Mais de 3000 enzimas de restrição que reconhecem sequências palindrômicas curtas (4-8 bp) foram descobertas.

Figura 1. Sequência de reconhecimento para a enzima Hind III

A Figura 1 mostra a sequência de reconhecimento para a enzima de restrição Hind III. Observe que a sequência de reconhecimento é um palíndromo, e lê o mesmo indo e voltando. A enzima Hind III faz um cambaleando corte do DNA e produz fragmentos que possuem áreas de fita simples chamadas de & ldquosticky ends & rdquo. A Figura 2 mostra a sequência de reconhecimento de duas outras enzimas de restrição Sca 1 e Pst 1. A enzima Pst 1 faz um corte escalonado do DNA na sua sequência de reconhecimento. Mas a enzima de restrição Sca I faz um cego corte em sua sequência de reconhecimento para gerar fragmentos de DNA sem extremidades pegajosas.

Figura 2: Locais de reconhecimento da enzima de restrição.

As células bacterianas têm todos os seus genes (genoma) em um único cromossomo circular. Mas as células bacterianas também podem carregar pedaços não essenciais de DNA chamados plasmídeos. Um plasmídeo é um pequeno DNA circular capaz de se replicar e transportar alguns genes de célula para célula. Os cientistas são capazes de projetar plasmídeos recombinantes para transportar genes específicos em uma célula hospedeira alvo.

Figura 3: Mapa de plasmídeo de pUC19.

O mapa genético de um plasmídeo & ldquopUC19 & rdquo é mostrado na Figura 3. O tamanho total do plasmídeo é 2.686 pb. Existe um local de reconhecimento Pst I na posição 439, local de reconhecimento Hind III na posição 447 e local de reconhecimento Sca I em 2179. Se uma enzima de restrição for usada para cortar o plasmídeo pUC19, o que seria produzido?

Determine quais fragmentos de DNA são produzidos quando duas enzimas de restrição são usadas para cortar o DNA do plasmídeo pUC19.

Corte com enzimas de restrição

Sca I e Pst I

Sca I and Hind III

Pst I and Hind III

Resulting DNA fragment sizes


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