Em formação

3.23: Difusão, Transporte Ativo e Canais de Membrana - Biologia


Transporte através das membranas celulares

Todas as células adquirem as moléculas e íons que precisam de seu entorno fluido extracelular (ECF) Existe um tráfego incessante de moléculas e íons dentro e fora da célula através de sua membrana plasmática (Exemplos: glicose, (Na ^ + ), (Ca ^ {2 +} )). Em células eucarióticas, há também transporte para dentro e para fora de compartimentos intracelulares delimitados por membrana, como o núcleo, retículo endoplasmático e mitocôndria (exemplos: proteínas, mRNA, (Ca ^ {2 +} ) e ATP).

Os seguintes problemas podem ocorrer durante o transporte:

1. Concentrações relativas

Moléculas e íons se movem espontaneamente para baixo em seu gradiente de concentração (isto é, de uma região de maior concentração para uma região de menor concentração) por difusão. Moléculas e íons podem ser movidos contra seu gradiente de concentração, mas este processo, chamado transporte Ativo, requer gasto de energia (geralmente de ATP).

2. Bicamadas lipídicas são impermeáveis ​​à maioria das moléculas e íons essenciais.

A bicamada lipídica é permeável a agua moléculas e algumas outras moléculas pequenas, sem carga, como o oxigênio (O2) e dióxido de carbono (CO2) Eles se difundem livremente para dentro e para fora da célula. A difusão da água através da membrana plasmática é tão importante para a célula que recebe um nome especial - osmose. Bicamadas lipídicas são não permeável a íons como K+, N / D+, Ca2+ (chamado cátions porque quando submetidos a um campo elétrico, eles migram em direção ao cátodo [o eletrodo de carga negativa]) e Cl-, HCO3- (chamado ânions porque eles migram em direção ao ânodo [o eletrodo com carga positiva]). Eles também não são permeáveis ​​a pequenos hidrofílicos moléculas como glicose e macro moléculas como proteínas e RNA. As células resolvem o problema de transporte de íons e pequenas moléculas através de suas membranas com a ajuda dos dois mecanismos a seguir:

  • Difusão facilitada: As proteínas transmembrana criam um poro cheio de água através do qual íons e algumas pequenas moléculas hidrofílicas podem passar por difusão. Os canais podem ser abertos (ou fechados) de acordo com a necessidade da célula.
  • Transporte Ativo: Proteínas transmembrana, chamadas transportadoras, usam a energia do ATP para forçar íons ou pequenas moléculas através da membrana contra seu gradiente de concentração.

Difusão facilitada de íons

A difusão facilitada de íons ocorre por meio de proteínas, ou conjuntos de proteínas, embutidas na membrana plasmática. Essas proteínas transmembrana formam um canal cheio de água através do qual o íon pode passar baixa seu gradiente de concentração. Os canais transmembrana que permitem difusão facilitada podem ser abertos ou fechados. Diz-se que são "fechado"; alguns tipos de canais iônicos controlados:

  • fechado por ligante
  • fechado mecanicamente
  • controlado por voltagem
  • com portão de luz

Canais de íons controlados por ligante

Muitos canais de íons abrem ou fecham em resposta à ligação de uma pequena molécula de sinalização ou "ligando". Alguns canais iônicos são bloqueados por ligantes extracelulares; alguns por ligantes intracelulares. Em ambos os casos, o ligante é não a substância que é transportada quando o canal se abre.

Ligantes externos

Ligantes externos (mostrados aqui em verde) se ligam a um local no lado extracelular do canal.

Exemplos:

  • Acetilcolina (ACh) A ligação do neurotransmissor acetilcolina em certas sinapses abre canais que admitem Na+ e iniciar um impulso nervoso ou contração muscular.
  • Ácido gama aminobutírico (GABA) Ligação de GABA em certas sinapses - designada GABAUMA - no sistema nervoso central admite Cl- íons para a célula e inibe a criação de um impulso nervoso

Ligantes internos

Ligantes internos se ligam a um local na proteína do canal exposta ao citosol. Exemplos:

  • "Segundos mensageiros", como AMP cíclico (acampamento) e GMP cíclico (cGMP), regulam os canais envolvidos na iniciação de impulsos em neurônios que respondem a odores e luz, respectivamente.
  • ATP é necessário para abrir o canal que permite o cloreto (Cl-) e bicarbonato (HCO3-) íons para fora da célula. Este canal é defeituoso em pacientes com fibrose cística. Embora a energia liberada pela hidrólise do ATP seja necessária para abrir o canal, isso é não um exemplo de transporte ativo; os íons se difundem através do canal aberto seguindo seu gradiente de concentração.

Canais iônicos mecanicamente controlados

As ondas sonoras que dobram as projeções semelhantes a cílios nas células ciliadas do ouvido interno abrem canais iônicos que levam à criação de impulsos nervosos que o cérebro interpreta como som. A deformação mecânica das células dos receptores de estiramento abre canais iônicos que levam à criação de impulsos nervosos.

Canais iônicos dependentes de voltagem

Nas chamadas células "excitáveis", como neurônios e células musculares, alguns canais abrem ou fecham em resposta a mudanças na carga (medida em volts) através da membrana plasmática. Por exemplo, à medida que um impulso desce por um neurônio, a redução na voltagem abre canais de sódio na porção adjacente da membrana. Isso permite o influxo de (Na ^ + ) no neurônio e, assim, a continuação do impulso nervoso. Cerca de 7.000 íons de sódio passam por cada canal durante o breve período (cerca de 1 milissegundo) que permanece aberto. Isso foi aprendido pelo uso da técnica de patch clamp.

A Técnica Patch Clamp

As propriedades dos canais iônicos podem ser estudadas por meio da técnica de patch clamp. Uma pipeta muito fina (com uma abertura de cerca de 0,5 µm) é pressionada contra a membrana plasmática de uma célula intacta ou a membrana plasmática pode ser retirada da célula e a preparação colocada em uma solução de teste da composição desejada. O fluxo de corrente através de um único canal de íons pode então ser medido.

Essas medições revelam que cada canal está totalmente aberto ou totalmente fechado; ou seja, a difusão facilitada por meio de um único canal é "tudo ou nada". Essa técnica forneceu tantas informações valiosas sobre os canais de íons que seus inventores, Erwin Neher e Bert Sakmann, receberam o Prêmio Nobel em 1991.

Difusão facilitada de moléculas

Algumas moléculas orgânicas pequenas e hidrofílicas, como açúcares, podem passar através das membranas celulares por difusão facilitada. Mais uma vez, o processo requer proteínas transmembrana. Em alguns casos, estes - como os canais iônicos - formam poros cheios de água que permitem que a molécula entre (ou saia) da membrana seguindo seu gradiente de concentração.

Exemplo:

Maltoporina. Este homotrímero na membrana externa do E. coli forma poros que permitem que o dissacarídeo maltose e algumas moléculas relacionadas se difundam na célula.

Exemplo: A membrana plasmática dos glóbulos vermelhos humanos contém proteínas transmembrana que permitem a difusão da glicose do sangue para a célula.

Observe que em todos os casos de difusão facilitada através dos canais, os canais são seletivo; ou seja, a estrutura da proteína admite apenas certos tipos de moléculas. Ainda não foi comprovado se todos os casos de difusão facilitada de pequenas moléculas usam canais. Talvez algumas moléculas sejam passadas através da membrana por uma mudança conformacional na forma da proteína transmembrana quando ela se liga à molécula a ser transportada.

Em ambos os casos, a interação entre a molécula que está sendo transportada e seu transportador se assemelha de muitas maneiras à interação entre uma enzima e seu substrato.

Transporte Ativo

O transporte ativo é o bombeamento de moléculas ou íons através de uma membrana contra seu gradiente de concentração. Requer uma proteína transmembrana (geralmente um complexo delas) chamada transportador e energia. A fonte desta energia é ATP.

A energia do ATP pode ser usada direta ou indiretamente.

  • Transporte ativo direto. Alguns transportadores ligam o ATP diretamente e usam a energia de sua hidrólise para conduzir o transporte ativo.
  • Transporte ativo indireto. Outros transportadores usam a energia já armazenada no gradiente de um bombeado diretamente íon. O transporte ativo direto do íon estabelece um gradiente de concentração. Quando isso é aliviado pela difusão facilitada, a energia liberada pode ser aproveitada para o bombeamento de algum outro íon ou molécula.

Transporte Ativo Direto

Então uma+/ K+ ATPase

O citosol das células animais contém uma concentração de íons potássio (K+) até 20 vezes maior do que no líquido extracelular. Por outro lado, o líquido extracelular contém uma concentração de íons de sódio (Na+) até 10 vezes maior do que dentro da célula. Esses gradientes de concentração são estabelecidos pelo transporte ativo de ambos os íons. E, de fato, o mesmo transportador, chamado de Na+/ K+ ATPase faz os dois trabalhos. Ele usa a energia da hidrólise do ATP para

  • transportar ativamente 3 Na+ íons fora da célula
  • para cada 2 K+ íons bombeados para a célula.

Isso realiza várias funções vitais:

  • Ajuda a estabelecer uma carga líquida através da membrana plasmática, com o interior da célula sendo carregado negativamente em relação ao exterior. Esse potencial de repouso prepara as células nervosas e musculares para a propagação dos potenciais de ação que conduzem aos impulsos nervosos e à contração muscular.
  • O acúmulo de íons de sódio fora da célula puxa a água para fora da célula e, portanto, permite que ela mantenha o equilíbrio osmótico (caso contrário, ela aumentaria de tamanho e explodiria com a difusão de água para dentro).
  • O gradiente de íons de sódio é aproveitado para fornecer energia para executar vários tipos de bombas indiretas.

Os papéis cruciais do Na+/ K+ As ATPases são refletidas no fato de que quase um terço de toda a energia gerada pelas mitocôndrias nas células animais é usada apenas para fazer essa bomba funcionar.

O H+/ K+ ATPase

As células parietais do estômago usam essa bomba para secretar suco gástrico. Essas células transportam prótons (H+) a partir de uma concentração de cerca de 4 x 10-8 M dentro da célula a uma concentração de cerca de 0,15 M no suco gástrico (dando-lhe um pH próximo a 1). Não é de admirar que as células parietais estejam cheias de mitocôndrias e usem grandes quantidades de ATP à medida que realizam essa concentração de três milhões de prótons.

O CA2+ ATPases

A Ca2+ ATPase está localizada no membrana de plasma de todas as células eucarióticas. Ele usa a energia fornecida por uma molécula de ATP para bombear um Ca2+ íon para fora da célula. A atividade dessas bombas ajuda a manter o gradiente de concentração de ~ 20.000 vezes de Ca2+ entre o citosol (~ 100 nM) e o LEC (~ 20 mM). No músculo esquelético em repouso, há uma concentração muito maior de íons de cálcio (Ca2+) no retículo sarcoplasmático do que no citosol. A ativação da fibra muscular permite algum deste Ca2+ para passar por difusão facilitada no citosol, onde desencadeia a contração.

Após a contração, este Ca2+ é bombeado de volta para o retículo sarcoplasmático. Isso é feito por outro Ca2+ ATPase que usa a energia de cada molécula de ATP para bombear 2 Ca2+ íons.

Bombas 1. - 3. são designados Transportadores de íons tipo P porque eles usam o mesmo mecanismo básico: uma mudança conformacional nas proteínas à medida que são reversivelmente fosforiladas pelo ATP. E todas as três bombas podem ser feitas para funcionar ao contrário. Ou seja, se os íons bombeados puderem se difundir de volta através do complexo de membrana, o ATP pode ser sintetizado a partir de ADP e fosfato inorgânico.

Transportadores ABC

ABC ("UMATP-Bencontrar Ctransportadores assette ") são proteínas transmembrana que

  • expor um domínio de ligação ao ligante em uma superfície e um
  • Domínio de ligação de ATP na outra superfície.

O domínio de ligação ao ligante é geralmente restrito a um único tipo de molécula.

O ATP ligado ao seu domínio fornece a energia para bombear o ligante através da membrana.

O genoma humano contém 48 genes para transportadores ABC. Alguns exemplos:

  • CFTR - o regulador da condutância transmembrana da fibrose cística
  • TOCAR, o transportador associado ao processamento de antígeno
  • O transportador que as células do fígado usam para bombear os sais dos ácidos biliares para a bile.
  • Transportadores ABC que bombeiam drogas quimioterápicas para fora das células cancerosas, reduzindo assim sua eficácia.

Os transportadores ABC devem ter evoluído no início da história da vida. Os domínios de ligação de ATP em arquéias, eubactérias e eucariotos compartilham uma estrutura homóloga, o "cassete" de ligação de ATP.

Transporte Ativo Indireto

O transporte ativo indireto usa o fluxo descendente de um íon para bombear alguma outra molécula ou íon contra seu gradiente. O íon condutor é geralmente o sódio (Na+) com seu gradiente estabelecido pelo Na+/ K+ ATPase.

Symport Pumps

Neste tipo de transporte ativo indireto, o íon condutor (Na+) e a molécula bombeada passa através da bomba de membrana no mesmo direção. Exemplos:

  • Então uma+/ transportador de glicose. Esta proteína transmembrana permite que íons de sódio e glicose entrem na célula juntos. O fluxo de íons de sódio baixa seu gradiente de concentração enquanto as moléculas de glicose são bombeadas acima deles. Mais tarde, o sódio é bombeado de volta para fora da célula pelo Na+/ K+ ATPase. Então uma+/ transportador de glicose é usado para transportar ativamente a glicose para fora do intestino e também para fora dos túbulos renais e de volta para o sangue.
  • Todos aminoácidos pode ser transportado ativamente, por exemplo, para fora dos túbulos renais e para o sangue, por bombas simpáticas movidas a sódio.
  • As bombas simétricas movidas a sódio também retornam neurotransmissores para o neurônio pré-sináptico.
  • Então uma+/ transportador de iodeto. Este simportador bombeia íons de iodeto nas células da glândula tireóide (para a fabricação de tiroxina) e também nas células da glândula mamária (para suprir a necessidade de iodeto do bebê).
  • o permease codificado pelo operon lac de E. coli que transporta a lactose para a célula.

Bombas Antiport

Nas bombas antiportas, o íon condutor (novamente, geralmente o sódio) se difunde através da bomba em uma direção, fornecendo a energia para o transporte ativo de alguma outra molécula ou íon na direção oposta. Exemplo:

Ca2+ os íons são bombeados para fora das células por bombas antiportas movidas a sódio. As bombas antiportas no vacúolo de algumas plantas aproveitam a difusão facilitada para fora dos prótons (eles próprios bombeados para o vacúolo por um H+ ATPase) para o transporte interno ativo de íons de sódio. Esta bomba antiporta sódio / próton permite à planta sequestrar íons sódio em seu vacúolo. Tomateiros transgênicos que superexpressam essa bomba antiporta de sódio / próton são capazes de se desenvolver em solos salinos muito salgados para os tomates convencionais. Bombas antiportas para o transporte interno ativo de íons nitrato (NO3)

Algumas doenças hereditárias dos canais iônicos

Descobriu-se que um número crescente de doenças humanas são causadas por mutações hereditárias em genes que codificam canais.

Exemplos:

  • Canal de cloreto doenças
    • fibrose cística
    • tendência hereditária a cálculos renais (causada por um tipo de canal de cloreto diferente daquele envolvido na fibrose cística)
  • Canal de potássio doenças
    • a maioria dos casos de síndrome do QT longo, um distúrbio hereditário do batimento cardíaco
    • uma tendência hereditária rara a ataques epilépticos no recém-nascido
    • vários tipos de hereditários surdez
  • Canal de sódio doenças
    • tendência hereditária a certos tipos de espasmos musculares
    • Síndrome de Liddle. O transporte inadequado de sódio para fora dos rins, por causa de um canal de sódio mutante, leva à elevação pressão osmótica do sangue e hipertensão resultante (pressão alta)

Osmose

Osmose é um termo especial usado para a difusão de água através das membranas celulares. Embora a água seja uma molécula polar, ela é capaz de passar pela bicamada lipídica da membrana plasmática. Aquaporinas - proteínas transmembrana que formam canais hidrofílicos - aceleram muito o processo, mas mesmo sem elas, a água ainda é capaz de passar. A água passa por difusão de uma região de maior concentração para uma região de menor concentração. Observe que isso se refere à concentração de água, NÃO à concentração de quaisquer solutos presentes na água. A água nunca é transportada ativamente; isto é, ele nunca se move contra seu gradiente de concentração. No entanto, a concentração de água pode ser alterada pelo transporte ativo de solutos e, desta forma, o movimento da água para dentro e para fora da célula pode ser controlado. Exemplo: a reabsorção de água dos túbulos renais de volta ao sangue depende da água que segue por trás do transporte ativo de (Na ^ + ).

  • Soluções hipotônicas: Se a concentração de água no meio ao redor de uma célula for maior do que a do citosol, o meio é dito ser hipotônico. A água entra na célula por osmose. Um glóbulo vermelho colocado em uma solução hipotônica (por exemplo, água pura) explode imediatamente ("hemólise") com o influxo de água. As células vegetais e as células bacterianas evitam estourar em ambientes hipotônicos por causa de suas fortes paredes celulares. Isso permite o acúmulo de turgor dentro da célula. Quando a pressão de turgor é igual à pressão osmótica, a osmose cessa.
  • Soluções isotônicas: Quando os glóbulos vermelhos são colocados em uma solução de sal a 0,9%, eles não ganham nem perdem água por osmose. Tal solução é considerada isotônico. O líquido extracelular (LEC) das células de mamíferos é isotônico ao seu citoplasma. Esse equilíbrio deve ser mantido ativamente devido ao grande número de moléculas orgânicas dissolvidas no citosol, mas não presentes no LEC. Essas moléculas orgânicas exercem um efeito osmótico que, se não for compensado, fará com que a célula absorva tanta água que incha e pode até explodir. Este destino é evitado bombeando íons de sódio para fora da célula com o Na+/ K+ ATPase.
  • Soluções hipertônicas: Se os glóbulos vermelhos forem colocados na água do mar (cerca de 3% de sal), eles perdem água por osmose e murcham. Água do mar é hipertônico ao seu citosol. Da mesma forma, se um tecido de planta é colocado na água do mar, o conteúdo da célula se retrai da parede celular rígida. Isso é chamado plasmólise. A água do mar também é hipertônica para o LEC da maioria dos vertebrados marinhos. Para evitar a desidratação fatal, esses animais (por exemplo, peixes ósseos como o bacalhau) devem beber água do mar continuamente e, em seguida, dessalinizá-la bombeando íons para fora de suas guelras por meio de transporte ativo.

Aves marinhas, que podem passar longos períodos longe de água doce, e tartarugas marinhas usam um dispositivo semelhante. Eles também bebem água salgada para cuidar de suas necessidades hídricas e usam a energia metabólica para dessalinizá-la. Na gaivota-arenosa, mostrada aqui, o sal é extraído por duas glândulas na cabeça e liberado (em uma solução muito concentrada - é mais salgado que o sangue) para o exterior pelas narinas. As cobras marinhas usam um mecanismo de dessalinização semelhante.


Bioquímica. 5ª edição.

Figura

O fluxo de íons através de um único canal de membrana (os canais são mostrados em vermelho na ilustração à esquerda) pode ser detectado pela técnica patch clamp, que registra as mudanças de corrente conforme o canal transita entre os estados aberto e fechado. [(Esquerda) (mais.)

A bicamada lipídica das membranas biológicas, conforme discutido no Capítulo 12, é intrinsecamente impermeável a íons e moléculas polares. A permeabilidade é conferida por duas classes de proteínas de membrana, bombas e canais. As bombas usam uma fonte de energia livre, como ATP ou luz, para conduzir o transporte termodinamicamente ascendente de íons ou moléculas. A ação da bomba é um exemplo de transporte Ativo. Os canais, em contraste, permitem que os íons fluam rapidamente através das membranas em uma direção descendente. A ação do canal ilustra transporte passivo, ou difusão facilitada.

As bombas são transdutores de energia, pois convertem uma forma de energia livre em outra. Dois tipos de bombas acionadas por ATP, ATPases do tipo P e as bombas de cassete de ligação de ATP, sofrem mudanças conformacionais na ligação e hidrólise de ATP que fazem com que um íon ligado seja transportado através da membrana. A fosforilação e a desfosforilação das bombas de Ca 2+ -ATPase e Na + -K + -ATPase, que são representativas da ATPase do tipo P, são acopladas a mudanças na orientação e afinidade de seus locais de ligação a íons.

Um mecanismo diferente de transporte ativo, que utiliza o gradiente de um íon para conduzir o transporte ativo de outro, será ilustrado pelo trocador de cálcio de sódio & # x02014. Esta bomba desempenha um papel importante na expulsão de Ca 2+ das células.

Começamos nosso exame de canais com o receptor de acetilcolina, um canal que medeia a transmissão de sinais nervosos através das sinapses, as junções funcionais entre os neurônios. O receptor de acetilcolina é um fechado por ligante canal em que o canal se abre em resposta à ligação da acetilcolina (Figura 13.1). Em contraste, os canais de sódio e potássio, que medeiam os potenciais de ação nas membranas dos axônios dos neurônios, são abertos pela despolarização da membrana, e não pela ligação de um efetor alostérico. Esses canais são controlado por voltagem. Esses canais também são de interesse porque eles rapidamente e habilmente distinguem entre íons bastante semelhantes (por exemplo, Na + e K +). O fluxo de íons através de um único canal em uma membrana pode ser facilmente detectado usando o técnica de patch-clamp.

Figura 13.1

Receptores de acetilcolina. Uma micrografia eletrônica mostra os receptores de acetilcolina densamente empacotados embutidos em uma membrana pós-sináptica. [Cortesia do Dr. John Heuser e Dr. Shelly Salpeter.]

O capítulo termina com uma visão de um tipo diferente de canal & # x02014 o canal célula a célula, ou junção de lacuna. Esses canais permitem o transporte de íons e metabólitos entre as células.

  • 13.1. O transporte de moléculas através de uma membrana pode ser ativo ou passivo
  • 13,2. Uma família de proteínas de membrana usa a hidrólise de ATP para bombear íons através das membranas
  • 13,3. Resistência a múltiplas drogas e fibrose cística destacam uma família de proteínas de membrana com domínios de cassete de ligação de ATP
  • 13,4. Os transportadores secundários usam um gradiente de concentração para alimentar a formação de outro
  • 13,5. Canais específicos podem transportar íons rapidamente através das membranas
  • 13.6. Junções de lacuna permitem que íons e pequenas moléculas fluam entre as células em comunicação
  • Resumo
  • Problemas
  • Leituras Selecionadas

Por acordo com a editora, este livro pode ser acessado pelo recurso de pesquisa, mas não pode ser navegado.


O que é difusão passiva

A difusão passiva se refere ao movimento de íons ou moléculas através da membrana celular através de um gradiente de concentração sem utilizar a energia celular. Portanto, a difusão passiva usa a entropia natural das moléculas para passar pela membrana celular. O movimento das moléculas ocorre até que sua concentração se torne igual em ambos os lados. Os quatro tipos principais de difusão passiva são osmose, difusão simples, difusão facilitada e filtração.

Difusão simples

O simples movimento das moléculas através de uma membrana permeável é denominado difusão simples. Moléculas pequenas e apolares usam difusão simples. A distância de difusão deve ser menor para manter um melhor fluxo. A difusão simples é mostrada em Figura 3.

Figura 3: Difusão Simples

Difusão facilitada

Moléculas polares e moléculas grandes passam pela membrana celular por difusão facilitada. Os três tipos de proteínas de transporte envolvidas na difusão facilitada são proteínas de canal, aquaporinas e proteínas transportadoras. As proteínas do canal fazem túneis hidrofóbicos através da membrana, permitindo que as moléculas hidrofóbicas selecionadas passem através da membrana. Algumas proteínas do canal estão abertas o tempo todo, e algumas são bloqueadas como proteínas do canal iônico. As aquaporinas permitem que a água atravesse a membrana rapidamente. As proteínas transportadoras mudam de forma, transportando moléculas-alvo através da membrana. A difusão facilitada é mostrada em figura 4.

Figura 4: Difusão Facilitada

Filtração

Filtração é o movimento de solutos junto com a água devido à pressão hidrostática gerada pelo sistema cardiovascular. Ocorre na cápsula de Bowman no rim. A filtração é mostrada em figura 5.

Figura 5: Filtração

Osmose

Osmose é o movimento da água através de uma membrana seletivamente permeável. Ocorre de um potencial hídrico alto para um potencial hídrico baixo. O efeito da pressão osmótica sobre os glóbulos vermelhos é mostrado em figura 6. Os glóbulos vermelhos em uma solução hipertônica podem perder água das células. As soluções hipertônicas contêm uma concentração maior de solutos do que o citoplasma dos glóbulos vermelhos. As soluções isotônicas contêm uma concentração de solutos semelhante à do citoplasma. Portanto, o movimento líquido da água para dentro e para fora da célula é zero. As soluções hipotônicas contêm baixas concentrações de soluto do que o citoplasma. Os glóbulos vermelhos recebem água de soluções hipotônicas.

Figura 6: Pressão osmótica nos glóbulos vermelhos

As moléculas lipossolúveis passam passivamente pela bicamada fosfolipídica. As moléculas solúveis em água passam pela membrana celular por meio de proteínas transmembrana.


Osmose

As membranas biológicas são permeáveis ​​à água, mas não aos íons ou pequenas moléculas orgânicas polares. Devido a essa diferença na permeabilidade, a água se move através da membrana de uma região de baixa concentração de soluto para uma região de alta concentração de soluto. Este transporte passivo de água é chamado osmose. Imagine duas câmaras que contêm diferentes concentrações de um soluto e que são separadas por uma membrana permeável à água, mas não ao soluto. Haverá um fluxo líquido de água do compartimento com a concentração mais baixa de soluto para o compartimento com a concentração mais alta até que o equilíbrio seja alcançado e os dois compartimentos contenham concentrações iguais de soluto. O compartimento que contém a maior concentração de soluto é o hipertônico solução, e o compartimento que contém a menor concentração de soluto é o hipotônico solução. Quando os compartimentos contêm soluções de igual concentração, eles são isotônico soluções.


O que é difusão

A difusão é o movimento passivo de moléculas ao longo de um gradiente de concentração de uma concentração mais alta para uma concentração mais baixa. Três métodos principais de difusão podem ser identificados: difusão simples, difusão facilitada e osmose.

Difusão simples

A difusão simples é um tipo de difusão não assistida em que uma partícula se move de uma concentração mais alta para uma mais baixa. Uma vez que as moléculas são distribuídas uniformemente por difusão simples, as moléculas em ambos os lados da membrana celular atingem um equilíbrio onde nenhum movimento líquido das moléculas é observado. Moléculas pequenas e não polares, como oxigênio, dióxido de carbono e etanol, movem-se através da membrana celular por difusão simples.

Difusão facilitada

A difusão facilitada é o transporte de substâncias através de uma membrana biológica através de um gradiente de concentração por meio de uma molécula transportadora. Íons grandes e moléculas polares que são dissolvidos em água são transportados por proteínas transmembrana específicas na membrana celular. Os íons polares se difundem através das proteínas do canal transmembrana e moléculas grandes se difundem através das proteínas transportadoras transmembrana. Aquaporinas são o outro tipo de proteínas transmembrana, que transportam água através da membrana celular rapidamente.

Figura 1: Difusão facilitada através de proteínas transportadoras

Osmose

Osmose refere-se à difusão livre de moléculas de água através da membrana celular por meio de uma pressão osmótica.


Parte 2: Acesso alternado do transportador de glicose

00: 00: 09.01 Oi. Sou Nieng Yan.
00: 00: 10.05 Sou professor da Faculdade de Medicina,
00: 00: 13,28 Tsinghua University, Pequim, China.
00: 00: 15.02 Bem-vindo à série de seminários iBiology.
00: 00: 17.25 Na parte 2,
00: 00: 19.13 Eu gostaria de compartilhar com você
00: 00: 20.29 um grande interesse de pesquisa em meu laboratório.
00: 00: 24.03 Ou seja, a elucidação da estrutura
00: 00: 25,29 de um processo fisiológico fundamental
00: 00: 29,16, a captação celular de glicose.
00: 00: 33.25 Todos nós sabemos que a glicose é a principal fonte de energia
00: 00: 37.10 para a maioria das vidas na Terra.
00: 00: 39,28 Do livro didático de bioquímica
00: 00: 42,23 ou biologia celular,
00: 00: 44,10 todos vocês aprenderam como a glicose é queimada
00: 00: 48.08 para liberar energia para sustentar a vida.
00: 00: 50.14 Sabemos através da glicólise,
00: 00: 52.08 uma molécula de glicose é dividida em
00: 00: 55,29 duas moléculas de piruvato,
00: 00: 57,06 e durante este processo
00: 00: 59.01 duas moléculas de ATP são geradas.
00: 01: 01.23 E nas condições aeróbicas,
00: 01: 05.13 as moléculas de piruvato
00: 01: 08.06 são posteriormente queimados através do ciclo TCA,
00: 01: 10,24 ou o ciclo do ácido cítrico,
00: 01: 13.02 e a cadeia de transporte de elétrons,
00: 01: 15,17 para gerar dióxido de carbono.
00: 01: 20,03 E durante esse processo.
00: 01: 21.20 Quer dizer, se for metabolismo completo,
00: 01: 24.05, então uma glicose pode ser usada para
00: 01: 26,26 produzem mais de 30 moléculas de ATP.
00: 01: 30.00 Essa é a moeda da energia para toda a vida.
00: 01: 34.13 No entanto, antes do metabolismo da glicose,
00: 01: 38.12 há também uma etapa crítica
00: 01: 40,17 - isto é, levar a glicose para a célula.
00: 01: 44,15 Da parte 1,
00: 01: 46.07 Já falei que a glicose
00: 01: 47,28 é altamente hidrofílico,
00: 01: 51.08 isso significa que são solúveis em água.
00: 01: 52.08 No entanto, a célula é cercada por
00: 01: 56,22 a bicamada lipídica hidrofóbica.
00: 01: 57,26 Então, a glicose não pode entrar na célula
00: 02: 00.02 por difusão livre.
00: 02: 01.13 Deve haver proteínas diferentes
00: 02: 04,24 para mediar este processo.
00: 02: 06.18 Essas proteínas são chamadas de transportadores de glicose.
00: 02: 10.14 Então, como vemos aqui,
00: 02: 14,19 o transportador de glicose é importante,
00: 02: 16.16 é essencial para a captação celular de glicose.
00: 02: 20,07 E, ao longo dos anos,
00: 02: 23.14 identificamos diferentes tipos de transportadores de glicose,
00: 02: 27.01 e mais transportadores de glicose estão sendo identificados,
00: 02: 31,06, mas entre todas essas,
00: 02: 33.03 os mais rigorosamente caracterizados
00: 02: 37.13 são chamados de GLUTs, conforme mostrado aqui,
00: 02: 38,25 G-L-U-T,
00: 02: 40,26 transportadores de glicose.
00: 02: 43,18 Então, em corpos humanos,
00: 02: 47.22 há uma grande família chamada
00: 02: 49.15 superfamília de facilitadores principais,
00: 02: 51.07 e os GLUTs pertencem a esta família.
00: 02: 52.16 Mesmo dentro da família GLUT,
00: 02: 54,23 existem 14 isoformas diferentes
00: 02: 57.01 que exibem especificidade de tecido
00: 02: 59,28 e especificidade do substrato.
00: 03: 02.05 Conforme resumido aqui, por exemplo,
00: 03: 05.04 GLUT1 funciona no cérebro e nos glóbulos vermelhos,
00: 03: 08.28 e GLUT2 é para fígado.
00: 03: 11.28 GLUT3 também é chamado de transportador neuronal de glicose,
00: 03: 14,27 indicando que funciona em neurônios.
00: 03: 17.10 E o GLUT4 é muito famoso
00: 03: 19,14 - leva glicose para os adipócitos e células musculares.
00: 03: 24.27 Então, esses são os quatro GLUTs mais famosos
00: 03: 28,19 - GLUT 1, 2, 3, 4.
00: 03: 30.13 E para as outras 10 isoformas diferentes,
00: 03: 32,28 infelizmente, para alguns deles,
00: 03: 35.07 seus substratos permanecem descaracterizados.
00: 03: 38,24 Oh, além disso, para esses transportadores de glicose,
00: 03: 41.07 apesar da semelhança de sequência entre si,
00: 03: 44.00 eles realmente podem ter
00: 03: 47.11 diferentes afinidades de ligação para a glicose
00: 03: 51,06 e para outros açúcares semelhantes,
00: 03: 54.19 e eles têm taxas de rotatividade diferentes.
00: 03: 56.24 Por exemplo, GLUT1 pode levar
00: 04: 00.25 até 1.200 glicose por segundo,
00: 04: 04.09 mas isso é. sim, isso é muito rápido.
00: 04: 06.13 no entanto, GLUT3.
00: 04: 08.19 para GLUT3, o número é 6.000.
00: 04: 10.09 é cinco vezes mais rápido que o GLUT1,
00: 04: 13.15 e isso é incrível.
00: 04: 15.05 Por causa de seu fundamento
00: 04: 18,02 significância na fisiologia,
00: 04: 19,28 você pode imaginar,
00: 04: 21,10 mau funcionamento ou desregulação dessas proteínas
00: 04: 24,29 estão associados a várias doenças.
00: 04: 28.17 Por exemplo, síndrome de deficiência de GLUT1
00: 04: 31.20 é na verdade uma doença genética rara
00: 04: 34.13 manifestada por convulsão de início precoce
00: 04: 37,24 ou desenvolvimento retardado.
00: 04: 40.10 E o GLUT2, porque está associado ao fígado.
00: 04: 43,15 então, mutações de GLUT2
00: 04: 46.11 estão associados a
00: 04: 50.12 um tipo de doença chamada síndrome de Fanconi-Bickel.
00: 04: 52,24 E mais e mais evidências mostram que
00: 04: 57.02 GLUT1 e GLUT3 são superexpressos em células cancerosas,
00: 05: 01.19 especialmente células tumorais sólidas,
00: 05: 04.11 por causa do chamado efeito Warburg.
00: 05: 06.01 Acabei de lhe dizer,
00: 05: 08.26 sem oxigênio, uma glicose pode ser
00: 05: 11,23 convertido em piruvato.
00: 05: 13.01 Durante este processo, duas moléculas de ATP são geradas.
00: 05: 15.17 No entanto, na presença de oxigênio,
00: 05: 18,23 ou seja, aromático.
00: 05: 20.18 ou, desculpe, condições aeróbicas,
00: 05: 22,28 aproximadamente. Quero dizer, mais de 30 moléculas de ATP
00: 05: 25.02 pode ser gerado.
00: 05: 26.10 Para tumores sólidos,
00: 05: 27,26 é geralmente em condições de hipóxia.
00: 05: 30,23 Isso. você sabe, isso significa que só pode.
00: 05: 34.22 uma glicose só pode gerar dois ATPs.
00: 05: 37.10 Consequentemente, mais transportadores de glicose
00: 05: 39,25 deve ser expressa
00: 05: 43,14 para levar mais açúcar para
00: 05: 46,08 compensar esses valores.
00: 05: 47,23 E para GLUT4,
00: 05: 49.12 é muito famoso por causa de
00: 05: 51.10 sua associação com diabetes mellitus tipo 2
00: 05: 54,17 e obesidade.
00: 05: 56.29 Então, como acabei de mencionar,
00: 05: 59.03 transportadores de glicose pertencem a
00: 06: 01.12 a chamada superfamília dos facilitadores principais.
00: 06: 04.25 Na verdade,
00: 06: 06.27 eles são os protótipos deste
00: 06: 09.10 maior família de transportadores ativos secundários.
00: 06: 12.22 E para os membros desta família,
00: 06: 16.00 na verdade, eles estão espalhados por todas as espécies,
00: 06: 19.04 de bactérias para seres humanos.
00:06:20.17 And members in this family
00:06:22.07 have a very broad spectrum of substrates,
00:06:25.22 from ions, sugars,
00:06:28.07 amino acids, or even peptides.
00:06:31.05 And in terms of transport mechanisms,
00:06:35.26 if you watched part 1 already,
00:06:39.08 actually, members in this family can be
00:06:42.02 uniporters, symporters, or antiporters.
00:06:44.15 That's in terms of the orientations of the transport.
00:06:47.00 And, as I also told you,
00:06:49.20 a general alternating access
00:06:53.18 model or mechanism
00:06:55.08 has been proposed to account
00:06:56.29 for all the secondary transporters.
00:06:58.23 Especially for MFS members,
00:07:01.05 this works very well.
00:07:02.27 And we thought that because
00:07:04.24 GLUTs are the prototypes in the understanding of this family,
00:07:07.17 so structural and biochemical characterization of GLUTs
00:07:12.17 may also shed light on the understanding
00:07:15.04 of other members of this largest family.
00:07:18.07 Okay, why is it a prototype,
00:07:20.16 especially GLUT1?
00:07:22.08 Because it was one of the
00:07:24.29 first transporters to be cloned
00:07:26.26 and characterized.
00:07:29.06 So, let me bring you to the history.
00:07:31.05 Actually, the characterization of glucose uptake
00:07:35.15 into our blood cells
00:07:38.01 can be dated back to about a century ago.
00:07:40.15 And at that time it was already discovered that
00:07:45.22 the uptake rate or the "diffusion".
00:07:47.15 at that time people didn't know it's active transport,
00:07:50.03 so they still called it diffusion.
00:07:52.25 but one PhD student found that
00:07:56.03 the diffusion coefficient is actually concentration dependent,
00:07:59.09 suggesting it was not free diffusion.
00:08:02.00 In 1948, LeFevre, in one paper,
00:08:05.24 speculated on the active transport component,
00:08:10.03 although he didn't specify
00:08:11.22 whether it was protein or something else,
00:08:13.15 but he just speculated there would be
00:08:16.15 an active transport mechanism.
00:08:19.04 And in the 1950s, Widdas,
00:08:21.00 in his very famous paper,
00:08:23.12 proposed a so-called mobile solute carrier mechanism.
00:08:26.21 As a matter of fact,
00:08:29.02 this mechanism was so famous
00:08:30.19 that all the secondary transporters in humans
00:08:35.15 are named after SLC.
00:08:38.24 So, for example, GLUT1 is actually.
00:08:41.08 the gene name for GLUT1 is SLC2A1,
00:08:45.06 but don't call it slack,
00:08:47.02 because scientists don't like that name,
00:08:49.11 so it's SLC.
00:08:51.17 And then.
00:08:53.04 and so far it's all about these components.
00:08:55.04 And in 1977, these scientists
00:08:58.18 actually were able to purify
00:09:01.14 the protein component from red blood cells
00:09:04.01 and reconstitute them into a liposome,
00:09:07.01 and they reconstituted the uptake of glucose.
00:09:10.13 So, they named this protein component
00:09:12.22 GLUT1.
00:09:14.17 And then, in 1985,
00:09:16.12 Harvey Lodish's lab cloned GLUT1,
00:09:19.20 and when the sequence was available
00:09:22.20 it was clear that this protein contains
00:09:25.16 12 transmembrane helices.
00:09:27.24 And in the 1990s,
00:09:30.26 the study efforts were shifted
00:09:33.16 to the pathophysiological investigations,
00:09:35.25 as well as structural characterizations,
00:09:38.10 because we would like to understand their structure,
00:09:41.07 to see their structure,
00:09:42.17 so as to understand
00:09:44.18 its functional mechanism and disease mechanism.
00:09:47.13 However, 30 years.
00:09:49.24 almost 30 years passed.
00:09:52.11 so what we learned from the textbook
00:09:54.01 about the structure of GLUT1 was still this,
00:09:56.26 the one published by Harvey Lodish in 1985.
00:10:00.19 This is the topological structure.
00:10:03.06 Alright, umm.
00:10:05.12 so, I started my lab in 2007
00:10:07.17 and we were very interested in the structure of GLUTs
00:10:10.14 because we thought it could help
00:10:13.00 address a lot of interesting questions,
00:10:14.25 as listed here.
00:10:16.05 Of course, the first thing is
00:10:19.01 you try to see the architecture of GLUTs,
00:10:21.18 that's the most direct, but superficial, purpose.
00:10:25.04 And with the structure
00:10:27.14 we might be able to reveal
00:10:29.11 the molecular basis underlying the substrate selectivity,
00:10:32.14 why it selects glucose,
00:10:35.22 but not, for example, maltose.
00:10:38.19 And we.
00:10:40.14 because we understand that these transporters
00:10:43.09 follow this alternating access cycle,
00:10:46.07 so we'd like to reveal the conformational changes
00:10:48.26 during the transport cycle,
00:10:50.12 to understand their functional mechanism.
00:10:54.00 And we also hope to
00:10:57.12 provide a molecular interpretation
00:10:59.10 for all these disease-related mutations.
00:11:03.26 And, for my own research,
00:11:06.27 I'm also very interested in the difference,
00:11:08.21 the mechanistic difference,
00:11:10.05 between symporters,
00:11:11.20 particularly proton symporters,
00:11:13.16 and facilitators,
00:11:15.01 but I may not have time to go into the details of this part.
00:11:17.27 And finally, because membrane proteins
00:11:21.18 are embedded in the lipid bilayer,
00:11:24.05 we would really like to understand
00:11:27.00 how they are modulated by lipids,
00:11:28.28 and there are more and more questions.
00:11:30.15 they just emerge during your research.
00:11:32.26 So, to address these questions,
00:11:34.27 we started not with a glucose transporter,
00:11:37.26 but with their relatives,
00:11:40.21 their relatives from E. coli,
00:11:42.21 which are technically easier than the human protein.
00:11:46.24 So we determined the two structures of
00:11:50.09 E. coli proton-sugar symporters,
00:11:53.02 FucP and XylE.
00:11:55.21 So, as the name indicated,
00:11:58.02 they are proton symporters,
00:11:59.12 meaning they exploit this transmembrane proton gradient
00:12:02.18 to drive the uptake of the substrates,
00:12:05.08 either L-fucose or D-xylose,
00:12:07.21 from a low concentration environment
00:12:10.20 to the high concentration interior of the cell.
00:12:13.13 In the past three years, we were very lucky.
00:12:16.27 We were finally able to determine
00:12:18.21 the crystal structures of GLUT1,
00:12:21.08 and its closely related GLUT3,
00:12:24.25 in three different conformations.
00:12:27.02 That means they adopt different states
00:12:30.04 during a transport cycle,
00:12:31.21 as shown here.
00:12:32.25 So, all the way from
00:12:35.22 outward-open, occluded, and inward-open.
00:12:37.18 When I say outward or inward,
00:12:40.08 that refers to the substrate binding site,
00:12:42.21 that is. remember, for the alternating access,
00:12:47.01 that is. the substrate binding site
00:12:48.28 can never be exposed
00:12:50.29 to both sides of the membrane,
00:12:54.09 so it's always open to one side,
00:12:55.27 the substrate comes,
00:12:57.07 and this protein undergoes conformational change
00:13:00.04 to expose the substrate
00:13:02.07 to the other side.
00:13:03.20 This is called alternating access.
00:13:05.13 So, with these three structures,
00:13:07.00 we have a relatively better understanding
00:13:08.23 of this transport cycle of GLUTs.
00:13:11.16 Alright, first thing.
00:13:13.06 To address the question of the architecture.
00:13:15.19 but, before that, I know
00:13:19.18 many people are interested in the crystallization of membrane proteins
00:13:21.28 and GLUT1 has been a target for several decades.
00:13:25.12 Why were we able to crystallize
00:13:28.19 and determine the structure
00:13:30.17 of this very intriguing protein?
00:13:31.15 In retrospect, there are three key elements
00:13:35.23 that contributed to the crystallization of GLUT1
00:13:38.26 and gave us the diffracting crystals.
00:13:41.21 First, we actually introduced point mutations.
00:13:45.01 first is to eliminate glycosylation,
00:13:47.10 which really represents major troubles
00:13:50.29 for crystallization.
00:13:52.12 And the other point mutation,
00:13:54.17 glutamate-329 to glutamine,
00:13:57.10 this one is a disease-related mutation
00:14:00.18 originally identified in GLUT4,
00:14:03.02 and it was suggested to l
00:14:05.21 ock the protein in the inward-open conformation,
00:14:08.24 which was exactly the case, as seen in our structure.
00:14:12.09 And second, on the detergent we used for crystallization
00:14:16.01 is nonyl-glucoside.
00:14:17.03 I will come back later with
00:14:19.01 why this was important.
00:14:20.04 And third, you know, for glucose transporters,
00:14:22.05 they are highly mobile,
00:14:23.14 so we would try to slow them down,
00:14:25.08 to lock them at certain conformations,
00:14:27.08 so we did all the experiments at low temperature,
00:14:29.21 at 4 degrees Celsius
00:14:31.08 -- that helped a lot.
00:14:33.06 And to cut a long story short,
00:14:35.25 one particular day my student showed me these crystals,
00:14:39.06 these tiny crystals.
00:14:40.21 I thought, probably,
00:14:43.02 they were contaminations from insect cells,
00:14:45.08 however, you know,
00:14:47.07 it doesn't hurt to send them to the synchrotron
00:14:49.29 for data collection
00:14:51.08 and we sent this single crystal
00:14:53.08 to the Shanghai synchrotron,
00:14:54.24 and several hours later
00:14:56.12 we solved the structure
00:14:58.13 that was exactly our target, GLUT1.
00:15:00.16 As shown here, this structure
00:15:04.00 exhibits a very typical MFS fold,
00:15:08.02 remember, major facilitator superfamily.
00:15:10.11 It contains 12 transmembrane helices,
00:15:13.10 with the first 6 named the
00:15:17.14 N-domain or the N-terminal domains,
00:15:19.03 shown in silver,
00:15:20.26 and the C-terminal one in blue.
00:15:23.07 And very unexpectedly,
00:15:25.01 we also see an intracellular helical domain,
00:15:28.25 we named it ICH.
00:15:30.07 Actually, this domain.
00:15:32.03 this little domain harbors
00:15:34.03 a lot of serine or threonine or lysine,
00:15:36.27 so these residues are probably
00:15:38.28 important for their post-translation modification.
00:15:42.01 Now, with this structure,
00:15:43.27 we really can provide the answer to many questions.
00:15:49.05 So, as I asked at the beginning
00:15:52.03 -- so, what is the mechanism of substrate selectivity?
00:15:55.07 For this purpose, we actually examined,
00:15:57.18 through a biochemical approach,
00:16:01.13 the sugar selectivity by GLUT1 and GLUT3,
00:16:04.09 shown here are the results for GLUT3.
00:16:06.14 As you can see, indeed,
00:16:08.13 this protein has kind of a stringent selectivity,
00:16:14.13 and one.
00:16:15.16 wherever you see these lower,
00:16:17.09 these shorter bars,
00:16:19.02 that means these sugars
00:16:21.09 can inhibit the uptake of glucose,
00:16:23.27 meaning that they can be recognized by GLUT3,
00:16:25.23 to compete for glucose binding.
00:16:28.19 And when we examined these chemicals,
00:16:31.06 very interestingly
00:16:33.09 we found one common feature,
00:16:34.23 that is, their C3 hydroxyl group
00:16:37.22 all points to one orientation,
00:16:39.23 so that means that C3 hydroxyl group is important.
00:16:43.02 That's the conclusion from biochemistry,
00:16:46.29 from our biochemical characterizations.
00:16:49.20 Then, how is one sugar molecule
00:16:52.29 recognized by the protein?
00:16:55.00 So, the answer is from the
00:16:56.24 very high resolution structure of GLUT3.
00:16:59.06 So, we determined GLUT3
00:17:02.10 in complex with its substrate, D-glucose,
00:17:04.10 at 1.5 Angstrom resolution,
00:17:08.13 and shown here is the omit electron density map.
00:17:10.19 As you can see, it's beautiful.
00:17:12.21 To our surprise, we identified.
00:17:15.11 although we just, you know,
00:17:17.20 add glucose to the protein
00:17:19.11 and we identified two different
00:17:22.05 anomeric forms of glucose,
00:17:26.01 simply by the electron density map.
00:17:27.23 As you can see, both alpha and beta glucose
00:17:31.20 are present in the structure.
00:17:33.26 I mean, I have to clarify.
00:17:35.15 so, one protein can only bind to one glucose,
00:17:39.03 but for crystallography, you know,
00:17:41.15 this is the average of many billions of molecules,
00:17:44.18 so you know some proteins bind to the alpha form,
00:17:47.16 some bind to the beta form.
00:17:49.16 And this observation,
00:17:51.07 this structural observation
00:17:53.02 actually settled down one long-term controversy,
00:17:55.13 that is, whether glucose transporters
00:17:58.19 can recognize the alpha form of glucose,
00:18:01.26 because we know the beta form is the prevailing one,
00:18:04.18 the dominant form in solution.
00:18:05.22 And this observation shows, yes,
00:18:07.28 GLUT1 or GLUT3,
00:18:09.20 they can bind and transport
00:18:12.15 both anomeric forms of D-glucose.
00:18:16.05 Alright.
00:18:17.28 Another interesting discovery is that,
00:18:19.20 as I told you,
00:18:21.04 glucose transporters have two distinct domains,
00:18:24.08 N-domain and C-domain.
00:18:26.08 However, in the structure of GLUT3
00:18:28.19 in complex with glucose,
00:18:31.17 as well as in the structure of GLUT1
00:18:34.03 in the presence of this detergent molecule NG.
00:18:37.27 what is NG?
00:18:39.04 It is actually a derivative of glucose,
00:18:41.21 so that's why NG is important for us
00:18:44.09 to capture the structure of GLUT1
00:18:46.09 -- it mimics the substrate binding.
00:18:48.13 And if you compare these two structures,
00:18:50.11 a common feature is
00:18:52.08 the C-domain provides
00:18:54.08 the primary accommodation site for glucose,
00:18:58.22 so the C-domain
00:19:01.09 is the primary substrate binding site.
00:19:04.04 Then, what does the N-domain do?
00:19:07.08 Alright.
00:19:08.14 So, before that, you know,
00:19:10.10 we tried to complete the alternating access cycle
00:19:13.09 by, you know.
00:19:16.11 in the attempt to capturing another conformation,
00:19:19.09 that is, the outward-open,
00:19:20.28 because now we have GLUT3
00:19:23.01 in complex with glucose
00:19:25.01 in the occluded conformation,
00:19:26.10 that is, the substrate is trapped
00:19:28.10 in the center of the transporter
00:19:31.20 and isolated from either side of the membrane.
00:19:34.22 And GLUT1 is open to the inside of the cell,
00:19:38.02 so it's called inward-open.
00:19:39.11 Now, we still need this outward-open conformation.
00:19:44.00 In order to capture the outward-open structure,
00:19:46.18 we really had some rational thinking.
00:19:49.04 So, people always say that
00:19:51.01 crystallization is an art,
00:19:52.12 it seems like you have to do a lot of screening,
00:19:54.12 but in this case we really did
00:19:57.10 some rational thinking.
00:19:58.09 That is, when we obtained the structure of GLUT1,
00:20:00.22 I told you NG is important, right?
00:20:04.02 So we introduced several factors,
00:20:05.22 like the mutation E329Q,
00:20:08.28 that is, to lock the inward-open conformation,
00:20:10.19 and then when we see the binding of NG to the protein,
00:20:13.28 as you can see on the tail,
00:20:16.01 the aliphatic tail of this detergent,
00:20:17.29 it actually is
00:20:20.20 lining down the intracellular vestibule,
00:20:24.18 when the sugar moeity is
00:20:27.19 specifically coordinated by the C-terminal domain.
00:20:30.06 So, along.
00:20:31.18 so, basically, the presence of this aliphatic tail
00:20:35.00 precludes the closure of these two domains
00:20:39.00 on the intracellular side,
00:20:40.22 that is, to stabilize this inward-open conformation
00:20:44.08 -- with this aliphatic tail,
00:20:46.19 it cannot close, right?
00:20:48.10 So, along this line of thinking,
00:20:50.27 we thought, if we can find a chemical,
00:20:53.07 a glucose derivative,
00:20:55.07 that has some chemical groups
00:20:57.14 on the other side,
00:20:59.08 on the upper side of the sugar ring,
00:21:01.06 probably that can preclude
00:21:04.12 the closure of the protein on the extracellular side,
00:21:07.01 that is, to capture
00:21:09.24 an outward-open conformation.
00:21:11.02 Do we have these kind of chemicals?
00:21:12.29 Yes, we have a lot of disaccharides
00:21:15.22 that are derivatives of glucose.
00:21:17.28 As shown here, we selected a few
00:21:20.15 and we examined their ability to inhibit glucose uptake.
00:21:24.22 As shown here, it turns out that
00:21:26.27 maltose was a potent inhibitor,
00:21:28.26 and when we checked the literature
00:21:30.22 this was really consistent,
00:21:32.00 because maltose was regarded.
00:21:34.06 was suggested as the exofacial inhibitor,
00:21:37.26 that means it can inhibit glucose uptake
00:21:40.16 from the extracellular side.
00:21:44.10 To cut a long story short,
00:21:45.25 in the presence of maltose
00:21:47.29 we actually crystallized the protein
00:21:50.17 using lipidic cubic phase.
00:21:52.14 It gave us two different structures.
00:21:56.01 One is almost identical to.
00:22:00.17 shown on the left, it's almost identical
00:22:01.28 to the glucose-bound GLUT3,
00:22:04.17 and is occluded from.
00:22:06.19 so, maltose is bound in the center,
00:22:08.16 occluded from either side of the membrane.
00:22:11.01 But the other crystal form
00:22:15.03 gives us this outward-open conformation,
00:22:18.22 so this was really serendipity,
00:22:21.02 I mean, we just mixed them together
00:22:22.15 and it gave us two different crystal structures.
00:22:25.12 So, I will focus on the illustration
00:22:27.25 of this outward-open conformation,
00:22:29.02 with comparison of the inward-open GLUT1
00:22:32.11 and the occluded GLUT3.
00:22:34.10 So, now we have these three conformations
00:22:36.28 I showed before.
00:22:38.06 We could generate a morph
00:22:40.03 that illustrates the whole transport process.
00:22:44.17 As you see here,
00:22:46.25 outward-open, arrival of glucose,
00:22:48.24 and it undergoes this alternating access
00:22:52.00 by the relative rotation of these two domains,
00:22:55.23 and the substrate is released
00:22:57.15 into the inside of the cell.
00:23:01.06 And, very interestingly,
00:23:02.13 remember this small domain,
00:23:05.12 shown in yellow,
00:23:06.27 is the ICH, intracellular helical domain,
00:23:09.17 and during the conformation change,
00:23:11.13 we can see it also
00:23:14.04 undergoes interdomain rearrangement.
00:23:15.26 In a way, it restrains
00:23:18.07 the N- and the C-domains
00:23:20.01 from opening too much,
00:23:21.17 so this ICH domain,
00:23:23.20 we named it the latch,
00:23:25.17 to secure this intracellular gate.
00:23:31.07 Alright.
00:23:33.03 From the movie you might think, hmm.
00:23:34.21 these two domains undergo a rigid body rotation,
00:23:36.21 but close examination of the structures
00:23:39.27 of the outward-open and occluded GLUT3
00:23:44.21 suggest, no, it's not rigid body.
00:23:46.20 Actually, we can see very sophisticated
00:23:50.06 local rearrangement of the C-domain elements.
00:23:53.27 As shown here, the one shown in cyan
00:23:57.06 is the C-domain
00:24:01.08 and the one in green is the N-domain.
00:24:02.03 Please pay attention to this TM7 motif.
00:24:06.02 You can see it undergoes a bending, a bending.
00:24:10.09 Right? This is TM7.
00:24:13.02 Not only a bending.
00:24:15.07 so, when the sidechains are shown,
00:24:17.06 you will see it actually also undergoes a rotation,
00:24:21.28 so this TM7 undergoes
00:24:24.11 very complicated local rearrangement
00:24:27.20 by bending.
00:24:29.25 the combination of bending and rotation.
00:24:32.03 So, whether this is induced by substrate binding
00:24:34.28 or this is the so-called dynamic equilibrium,
00:24:38.15 remains to be further characterized,
00:24:40.22 and our preliminary MD simulations
00:24:43.06 suggest that this is dynamic equilibrium.
00:24:47.00 even in the absence of substrate,
00:24:49.09 you can see this kind of conformational change of TM7.
00:24:53.00 Now, here's the question.
00:24:55.18 why the C-domain, shown in cyan,
00:24:58.04 is so flexible,
00:24:59.28 whereas the N-domain is just so rigid, as a stone?
00:25:03.25 And when we examine the interior of these two domains,
00:25:08.08 the answer is really clear.
00:25:09.22 So, as shown here,
00:25:12.10 the red dashes represent hydrogen bonds.
00:25:16.07 As you can see,
00:25:18.14 the interior of the N-domain is really hydrophilic,
00:25:22.28 so the high-resolution structure of GLUT3
00:25:25.18 allowed us to identify
00:25:29.02 seven water molecules within the N-domain of GLUT3,
00:25:32.12 and these water molecules, together,
00:25:34.02 interact with a set of groups of many polar residues
00:25:38.10 as a strip of hydrogen bonds,
00:25:40.01 and this stabilizes the N-domain,
00:25:45.12 so it makes it very rigid during conformation change.
00:25:48.04 In contrast, the interior of the C-domain
00:25:51.14 is highly hydrophobic,
00:25:54.12 as shown here,
00:25:55.29 so these hydrophobic residues,
00:25:57.12 they just contact each other
00:26:00.12 through Van der Waals interactions,
00:26:02.07 so they make the interior relatively greasy,
00:26:05.11 and that's easier for bending and rotation.
00:26:08.04 So, the structural analysis
00:26:10.08 really provides a good answer
00:26:12.05 to account for the distinct features
00:26:14.12 of the N-domain and the C-domain
00:26:16.04 during the alternating access cycle.
00:26:19.19 Alright.
00:26:21.06 Now, I'll.
00:26:23.01 shown here is the very simple diagram
00:26:25.03 of alternating access.
00:26:26.14 With our structures, the three structures,
00:26:27.28 we are able to
00:26:30.15 update this model with more sophisticated features.
00:26:34.24 As you can see, TM7
00:26:36.27 and also TM10,
00:26:38.18 they undergo local conformational change,
00:26:40.21 and the overall relative rotation
00:26:42.20 of the N- and the C-domains
00:26:44.11 results in the alternating exposure
00:26:48.15 of the substrate to either side of the membrane.
00:26:50.08 And, besides, please pay attention
00:26:52.19 to these yellow bars,
00:26:54.07 they are the intracellular ICH domain,
00:26:56.08 we call them the latch,
00:26:57.16 the intracellular latch.
00:26:59.05 Okay, now with the structure.
00:27:01.23 We were able to map the disease-related mutations.
00:27:06.12 Shown her is an example of the mutations
00:27:08.29 identified in patients
00:27:11.05 with the so-called GLUT-1 deficiency syndrome.
00:27:14.04 So, in total, more than 40 mutations were identified.
00:27:17.10 So, when we mapped them
00:27:19.06 onto the structure of GLUT1,
00:27:20.24 very interestingly we realized that
00:27:24.03 they clustered to three areas,
00:27:26.25 as shown here.
00:27:27.29 So, area 1 is really
00:27:31.11 involved in substrate binding
00:27:34.03 and it's easy to understand how mutations of this cluster
00:27:37.19 would affect substrate recognition or substrate binding,
00:27:40.13 hence compromising the transport activity.
00:27:44.11 And cluster 2, as shown here,
00:27:46.29 highlighted by this cyan circle.
00:27:50.22 the cyan circle.
00:27:53.09 so, basically they mapped to the interface
00:27:58.09 between ICH, N-domain, and C-domain,
00:28:01.14 and they together constitute the intracellular gate.
00:28:03.10 And, not surprisingly,
00:28:05.11 cluster 3 maps to the extracellular gate.
00:28:08.13 So, the structure really provides
00:28:11.01 a beautiful answer to
00:28:13.26 understand most of these disease-associated mutations,
00:28:16.24 so they either affect substrate binding
00:28:19.19 or the two gates,
00:28:21.03 hence affecting the alternating access cycle
00:28:24.06 of the protein.
00:28:25.18 Alright. Now, with these results,
00:28:27.12 we can address the questions
00:28:29.05 asked at the very beginning, right?
00:28:31.22 So, we know the architecture
00:28:33.16 and we provide a basis
00:28:35.20 to see the substrate selection
00:28:38.06 and we revealed three conformations of GLUT1 and GLUT3
00:28:43.08 during the transport cycle, the alternating access cycle,
00:28:48.07 and we provided some answers
00:28:49.29 to the disease-related mutations.
00:28:52.10 And, with regard to the mechanistic difference
00:28:56.10 between symporters and facilitators,
00:28:58.12 we are now doing some MD simulations
00:29:00.03 and biochemical characterizations,
00:29:02.02 and we have some tentative clues,
00:29:04.16 but this really requires further characterizations.
00:29:07.29 And now our focus has shifted to
00:29:11.02 the modulation of the transport activity
00:29:14.07 by lipids, as well as, you know,
00:29:16.09 the kinetic study of transport cycles.
00:29:18.25 And finally, we are very interested in
00:29:21.13 structure-based ligand design,
00:29:23.05 because these proteins are important drug targets.
00:29:27.06 So, with this, I would like to conclude my talk
00:29:29.15 by acknowledging the people
00:29:32.22 who made this work possible.
00:29:34.04 So, Dong, he was my postdoc
00:29:37.17 who has been the primary driver of this project,
00:29:40.17 he was leading this team of Tsinghua undergraduate students
00:29:44.00 and graduate students
00:29:45.13 to elucidate the structures
00:29:47.17 of both GLUT1 and GLUT3,
00:29:49.01 and he's now a professor in Tsinghua University.
00:29:51.23 And this work was in collaboration with many colleagues,
00:29:55.23 in Tsinghua or in the US,
00:29:57.10 as shown here.
00:29:59.21 And I'd like to thank you for watching this online seminar.

  • Part 1: Introduction to Membrane Transport Proteins