Em formação

Laboratório 3: simples, negativa e coloração de Gram - biologia


PREPARANDO UMA EMULSÃO:

1. Trabalhando em pares, etiquete cada lâmina e desenhe um círculo no centro da lâmina com um lápis de cera que é fornecido em sua mesa. NÃO use um estilete, isso manterá as bactérias concentradas em uma área da lâmina.

2. Prepare uma emulsão em cada lâmina:

  • Se você estiver retirando uma bactéria de um prato, coloque uma pequena gota de água em uma lâmina e adicione bactérias assepticamente.
  • Se você estiver retirando uma bactéria de um caldo, coloque 3-6 alças cheias de bactérias em uma lâmina sem adição de água.

3. Você e seu parceiro de laboratório precisarão preparar os seguintes slides:

  • 3 lâminas de Staphylococcus epidermidis (uma para coloração simples, uma para coloração de Gram, uma como back-up)
  • 3 lâminas de Pseudomonas aeruginosa (uma para coloração simples, uma para coloração de Gram, uma como back-up)
  • 2 lâminas de S. epidermidis e P. aeruginosa misturadas (uma para a coloração de Gram, uma como back-up)

4. Misture delicadamente até obter uma mistura turva uniforme (deve se parecer com leite desnatado)

Observação

Se você misturar muito agressivamente, perderá a morfologia bacteriana.

5. Deixe as lâminas secarem ao ar no aquecedor de lâminas. Enquanto as lâminas estão secando, comece a coloração negativa.

6. Uma vez que o líquido tenha evaporado completamente, fixe com o calor passando a lâmina através de uma chama três vezes.

Observação

Se você aquecer, consertar muito pouco, as bactérias irão sair da lâmina. Se você aquecer demais, irá cozinhar as bactérias e desnaturá-las.

7. Deixe a lâmina esfriar e continue com o protocolo de coloração.

MANCHA NEGATIVA:

Definição

Nigrosina é uma coloração simples e indireta usada para determinar a morfologia bacteriana. As formas e tamanhos dos organismos são vistos como contornos sem cor contra o fundo escuro. Uma vantagem de usar este método é que a fixação prévia por calor não é necessária, então os organismos são vistos em formas mais realistas. Nigrosin é uma mancha ácida que se torna carregada negativamente. Uma vez que a superfície da maioria das células bacterianas é carregada negativamente, a superfície da célula repele a mancha. O vidro da lâmina irá manchar, mas as células bacterianas não.

8. Se precisar, saia e assista a este vídeo para ter certeza de entender como fazer o procedimento: www.youtube.com/watch?v=avveXgPWVJ8 (você também pode pesquisar no Google “vídeo de mancha negativa”)

9. Adicione uma pequena gota de nigrosina à lâmina.

10. Transfira assepticamente uma alça cheia de bactérias NEGATIVE STAIN MIX para a gota de nigrosina e misture delicadamente.

11. Use um segundo slide, mantido em um ângulo de 45 graus para espalhar o seu slide.

12. Deixe as lâminas secarem naturalmente na bancada. Não use aquecedor de slides!

13. Repita este procedimento para fazer um slide de S. epidermidis e um slide de P. aeruginosa 14. Examine todos os três slides sob imersão em óleo e registre seus resultados em sua planilha.

MANCHA SIMPLES:

Definição

O azul de metileno é uma coloração simples e direta usada para determinar a morfologia bacteriana (forma e arranjo). É um corante catiônico (carga positiva) que mancha a célula com uma cor azul. A presença de moléculas carregadas negativamente na célula (como DNA e RNA) faz com que a célula fique azul.

15. Use os slides que você já preparou.

16. Adicione a coloração de azul de metileno à lâmina fixada a quente e deixe por 2 minutos.

17. Segure a lâmina em um ângulo e enxágue suavemente com água da garrafa de esguicho.

18. Seque suavemente com papel absorvente para se livrar do excesso de água.

19. Examine sob imersão em óleo e registre seus resultados em sua planilha.

GRAM STAIN:

Definição

A coloração de Gram é a técnica de coloração mais importante e universalmente usada no laboratório de bacteriologia. É usado para distinguir entre bactérias gram (+) e gram (-). A diferença entre bactérias gram (+) e gram (-) está na capacidade da parede celular do organismo de reter o cristal violeta.

18. Use as lâminas que você já preparou (1) S. epidermidis (2) P. aeruginosa (3) S. aeruginosa misturadas.

19. Core com violeta cristal por 1 minuto e enxágue suavemente com água.

20. Trate com a mistura de iodo por 1 minuto e depois enxágue delicadamente com água.

21. Enxágue com ~ 3-6 gotas de álcool 95% para descolorir e depois enxágue suavemente com água.

22. Faça uma contracoloração com safranina por 30 segundos e depois enxágue com água.

Observação

As manchas de grama adequadas da cultura mista valem 2 pontos de crédito extra!


Neste laboratório, o objetivo principal deste experimento é identificar as características bioquímicas de uma bactéria desconhecida usando primeiro a coloração de Gram e a base.

Procedimento de coloração de Gram Os médicos geralmente desejam determinar que tipo de bactéria está presente em um paciente com infecção. Além de outros testes, os especialistas u.

Os protocolos de coloração bacteriana permitem a visualização da morfologia das células e a identificação das características. Neste experimento, Klebsiella Pneumoniae w.

Para o teste hidrolítico, a placa de amido apresentou destaques ao redor do crescimento bacteriano indicando hidrólise do amido. No prato contendo gordura não havia d.

Resumo: O objetivo desta série de experimentos era identificar duas bactérias desconhecidas. A cultura de caldo # 20 foi selecionada e submetida a te qualitativa.

Esses reagentes reagem com o indol para produzir um composto de cor vermelha. Sem indol presente, não há mudança de cor mesmo após a adição do apropriado.

O Composto 7 também formou duas camadas, mas ambas eram amarelas. O Composto 8 formou uma cor vermelha muito escura. O Composto 9 também tornou a solução vermelha. Composto 10 di.

Após cerca de um minuto, devemos ser capazes de dizer se uma corda se formou ou não. Não tínhamos uma forma de string, então tínhamos bactérias gram-positivas e.

O antibiótico do Beta Lactamase fornece os únicos resultados do experimento. O disco de ampicilina superior tem um diâmetro de 2,7 centímetros. O meio Ampic.

Ao combinar o composto desconhecido com um ácido, uma base e dois sais, sua reatividade foi determinada. Reagir o composto desconhecido com ácido sulfúrico (H2SO4.


Laboratório 3: simples, negativa e coloração de Gram - biologia

Se você não consegue serrar com uma lima ou lima com uma serra, então você não será um bom experimentalista. Augustin Jean Fresnel, 1788-1827

Manchas

Como você observou em montagens úmidas no laboratório anterior, a maioria das bactérias é difícil de ver no microscópio de campo claro. As bactérias são quase incolores (lembre-se de que todas as células são compostas principalmente de água) e, portanto, apresentam pouco contraste com o caldo em que estão suspensas. Para visualizar as bactérias, são usados ​​corantes ou manchas, ou uma fonte alternativa de iluminação (contraste de fase ou contraste de interferência diferencial). Como a coloração de células bacterianas é relativamente rápida, barata e simples, é a técnica mais comumente usada para visualizar células bacterianas. A coloração não só torna as bactérias mais facilmente vistas, mas permite que sua morfologia (por exemplo, tamanho e forma) seja visualizada mais facilmente. Em alguns casos, manchas específicas podem ser usadas para visualizar certas estruturas (flagelos, cápsulas, endosporos, etc). de células bacterianas.

Existem vários métodos de coloração usados ​​rotineiramente com bactérias. Esses métodos podem ser classificados como 1) simples (não específico) e 2) diferencial (específico). As manchas simples reagirão com todos os micróbios de maneira idêntica. Eles são úteis apenas para aumentar o contraste, de modo que a morfologia, o tamanho e a disposição dos organismos possam ser determinados. As colorações diferenciais fornecem resultados variados, dependendo do organismo a ser tratado. Esses resultados costumam ser úteis na identificação do micróbio.

As manchas (tinturas) são produtos químicos que contêm cromóforos, grupos que conferem cor. Sua especificidade é determinada por sua estrutura química. As manchas são geralmente sais nos quais um dos íons é colorido. (Um sal é um composto composto por um íon carregado positivamente e um íon carregado negativamente.) Por exemplo, o corante azul de metileno é na verdade o sal cloreto de azul de metileno que se dissociará em água em um íon azul de metileno carregado positivamente que é de cor azul e um íon cloreto com carga negativa que é incolor. As manchas microbiológicas comumente usadas geralmente se enquadram em uma de duas categorias - manchas básicas ou manchas ácidas (embora haja algumas manchas, como tinta da Índia) que são neutras). Um corante básico é um corante catiônico (com carga positiva) e, portanto, reagirá com o material com carga negativa. O citoplasma de todas as células bacterianas tem uma leve carga negativa quando cresce em um meio de pH quase neutro e, portanto, atrairá e se ligará a corantes básicos. Alguns exemplos de corantes básicos são violeta cristal, safranina, fucsina básica e azul de metileno. Os corantes ácidos possuem cromóforos carregados negativamente e são repelidos pela superfície bacteriana formando um depósito ao redor do organismo. Eles mancham o fundo e deixam o micróbio transparente. Nigrosina e vermelho do Congo são exemplos de corantes ácidos.

Nota: Os corantes usados ​​para coloração bacteriológica são geralmente corantes de anilina, derivados do alcatrão de carvão, o que significa que são POTENCIALMENTE CARCINOGÊNICOS e devem ser manuseados com cuidado. Evite o contato com eles, mantendo-os longe da pele, roupas e bancos.

À primeira vista, a maneira mais fácil de corar as células bacterianas seria simplesmente misturar a suspensão bacteriana com o corante e fazer uma montagem úmida dessa mistura. Infelizmente, se você tentasse colorir células bacterianas dessa maneira, descobriria que havia muito fundo (corante não ligado) para permitir a visualização das células. Portanto, você precisa remover o corante não ligado. A simples lavagem do corante resultaria na remoção das células junto com o excesso de corante. Portanto, você precisa de um mecanismo para fixar as células na lâmina antes da coloração para permitir a remoção do excesso de corante enquanto mantém as células na lâmina. Um método simples é o de secagem ao ar e fixação por calor. Os organismos são fixados pelo calor passando uma mancha seca ao ar dos organismos através da chama de um queimador de gás. O calor coagula as proteínas dos organismos, fazendo com que as bactérias grudem na lâmina. Tenha muito cuidado para não aquecer demais os organismos ao fixá-los em uma lâmina. Isso distorce a amostra dos organismos. Lembre-se da analogia de um ovo frito. Quando você coloca um ovo cru em uma frigideira fria, ele adquire uma determinada forma. Comece a aquecê-lo e as proteínas (albumina) da superfície inferior do ovo precipitam e fixe o ovo na frigideira. Nesse ponto, houve uma distorção mínima na forma do ovo como um todo, apenas uma pequena porcentagem das proteínas foi precipitada. Se você continuar aplicando calor, a forma do ovo inteiro mudará e, eventualmente, será reduzido a restos carbonizados. Ao fixar uma lâmina com calor, você deseja aplicar calor suficiente para precipitar as proteínas para permitir que as células grudem na lâmina, mas não para alterar drasticamente a forma das células (ou reduzi-las a restos carbonizados).

Preparação de um esfregaço bacteriano e fixação por calor

  1. Limpe a lâmina usando Bon Ami ou outro material de limpeza adequado. Seque suavemente a lâmina com um pano sem fiapos. (alternativamente, é possível comprar lâminas pré-limpas)
  2. Coloque uma pequena gota de água destilada na superfície da lâmina.
  3. Remova assepticamente uma pequena quantidade da cultura da superfície do ágar e apenas toque várias vezes na gota d'água até que fique turva.
  4. Queime as bactérias restantes do loop. (Se muita cultura for adicionada à água, você não verá bactérias individuais claramente manchadas.).
  5. Usando o laço, espalhe a suspensão por toda a lâmina para formar uma película fina.
  6. Deixe esta suspensão fina secar completamente ao ar.
  7. Passe a lâmina (com o lado do filme para cima) através da chama do bico de Bunsen 3 ou 4 vezes para fixar com calor. Cuidado: Muito calor pode distorcer o organismo e, no caso da coloração de Gram, pode fazer com que organismos Gram-positivos corem negativamente. A lâmina deve estar muito quente, mas não muito quente para segurar.
  1. Limpe a lâmina usando Bon Ami ou outro material de limpeza adequado. Seque suavemente a lâmina com um pano sem fiapos. (alternativamente, é possível comprar lâminas pré-limpas)
  2. Coloque assepticamente 2 ou 3 loops da cultura em uma lâmina limpa. Não use água.
  3. Usando o laço, espalhe a suspensão por toda a lâmina para formar uma película fina.
  4. Deixe esta suspensão fina secar completamente ao ar.
  5. Passe a lâmina (com o lado do filme para cima) através da chama do bico de Bunsen 3 ou 4 vezes para fixar com calor.

Coloração simples (direta) com azul de metileno

  1. Prepare um esfregaço fixo com calor da cultura que deseja examinar
  2. Cubra o esfregaço com azul de metileno
  3. Deixe o corante permanecer no esfregaço por aproximadamente 1 minuto. (Observe que o tempo de coloração não é crítico. Em algum lugar entre 30 segundos e 2 minutos deve dar a você uma mancha aceitável. Quanto mais tempo você deixa a tinta, em geral, mais escura é a mancha.)
  4. Lave o excesso de mancha da lâmina. Pegue a lâmina por uma extremidade e segure-a em um ângulo sobre a bandeja de coloração. Usando o frasco de lavagem com água destilada, lave cuidadosamente o excesso de azul de metileno da lâmina direcionando um jato de água suave sobre a superfície da lâmina. Lave também qualquer mancha que tenha surgido no fundo da lâmina.
  5. Remova o excesso de mancha com papel absorvente. NÃO esfregue a lâmina, em vez disso coloque a lâmina entre duas folhas de papel absorvente e pressione suavemente. O papel vai absorver o excesso de tinta.
  6. Examine a lâmina sob o microscópio de campo claro.
  7. Registre a forma, a disposição e o tamanho aproximado dos organismos. Você deve ter dados sobre duas culturas que você corou.
  1. Limpe a lâmina usando Bon Ami ou outro material de limpeza adequado. Seque suavemente a lâmina com um pano sem fiapos. (em alternativa, é possível adquirir lâminas pré-limpas).
  2. Coloque uma pequena gota (uma ou duas voltas) da mancha negativa (tinta nanquim) perto do final da lâmina.
  3. Transfira um loop = cheio da amostra bacteriana para a tinta da Índia e misture os dois togetner.
  4. Segure uma lâmina limpa em um ângulo de cerca de 20 o em relação ao primeiro slide. Toque a borda da lâmina limpa na mistura de bactérias / mancha para que a mistura se espalhe pela borda.
  5. Espalhe a suspensão pela superfície da lâmina puxando a lâmina limpa para longe da mistura. Basicamente, você usará a lâmina limpa para empurrar a mistura pela superfície da lâmina. Quando terminar de espalhar a lâmina, coloque a lâmina "limpa" em um frasco de desinfetante.
  6. Seque a lâmina com ar. NÃO AQUEÇA FIX.
  7. Examine sob o microscópio de campo claro.
  8. Registre a forma, a disposição e o tamanho aproximado dos organismos. Você deve ter dados sobre duas amostras que você corou

Tarefa: Após a conclusão do laboratório, você deve


Laboratórios virtuais e comércio

Este é um software beta. Ainda estamos no processo de teste e construção desses laboratórios. Você provavelmente encontrará bugs, incompatibilidades entre áudio e texto, etc. Isso não refletirá necessariamente a qualidade e o estado da compilação final.
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Reprodução de vídeo com coloração de Gram

Este trabalho foi apoiado pelo USDA CSREES e pelo Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA em dois projetos de Subsídio Desafio ao Ensino Superior: 2008-38411-19055 e 2011-38411-30625. & copy 2008-2021 NMSU Board of Regents. As universidades colaboradoras South Dakota State University, North Dakota State University e New Mexico State University são todas empregadores e educadores de igual oportunidade / ação afirmativa.

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Informações clínicas Discute fisiologia, fisiopatologia e aspectos clínicos gerais, conforme se relacionam a um teste de laboratório

A coloração de Gram é uma coloração geral amplamente utilizada em microbiologia para a diferenciação preliminar de organismos microbiológicos. A coloração de Gram é um dos métodos mais simples, baratos e úteis para identificar e classificar bactérias.

A coloração de Gram é usada para fornecer informações preliminares sobre o tipo de organismos presentes diretamente em amostras clínicas ou de crescimento em placas de cultura. Esta coloração é usada para identificar a presença de microrganismos em fluidos corporais normalmente estéreis (líquido cefalorraquidiano, líquido sinovial, líquido pleural, líquido peritoneal). Também é usado para examinar amostras de escarro para estabelecer a aceitabilidade para cultura bacteriana (& lt25 células epiteliais escamosas por campo é considerada uma amostra aceitável para cultura) e pode revelar o organismo causador da pneumonia bacteriana.


Assista o vídeo: Coloração de Gram - Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas Microbiologia - Bio Aulas (Janeiro 2022).