Em formação

38.4E: Proteínas Reguladoras - Biologia


A tropomiosina e a troponina evitam que a miosina se ligue à actina enquanto o músculo está em repouso.

objetivos de aprendizado

  • Descreva como o cálcio, a tropomiosina e o complexo de troponina regulam a ligação da actina pela miosina

Pontos chave

  • A tropomiosina cobre os locais de ligação da actina, evitando que a miosina forme pontes cruzadas durante o estado de repouso.
  • Quando o cálcio se liga à troponina, a troponina muda de forma, removendo a tropomiosina dos locais de ligação.
  • O retículo sarcoplasmático armazena íons de cálcio, que ele libera quando uma célula muscular é estimulada; os íons de cálcio, então, habilitam o ciclo de contração muscular da ponte cruzada.

Termos chave

  • tropomiosina: qualquer um de uma família de proteínas musculares que regulam a interação de actina e miosina
  • acetilcolina: um neurotransmissor em humanos e outros animais, que é um éster de ácido acético e colina
  • Retículo sarcoplamático: s retículo endoplasmático liso encontrado no músculo liso e estriado; contém grandes reservas de cálcio, que sequestra e depois libera quando a célula muscular é estimulada

Proteínas Reguladoras

A ligação das cabeças da miosina à actina muscular é um processo altamente regulado. Quando um músculo está em estado de repouso, a actina e a miosina são separadas. Para evitar que a actina se ligue ao sítio ativo da miosina, as proteínas reguladoras bloqueiam os sítios de ligação molecular. A tropomiosina bloqueia os locais de ligação da miosina nas moléculas de actina, evitando a formação de pontes cruzadas, o que impede a contração de um músculo sem estímulo nervoso. O complexo proteico troponina liga-se à tropomiosina, ajudando a posicioná-la na molécula de actina.

Regulação da troponina e tropomiosina

Para permitir a contração muscular, a tropomiosina deve alterar a conformação e revelar o local de ligação da miosina em uma molécula de actina, permitindo assim a formação de pontes cruzadas. A troponina, que regula a tropomiosina, é ativada pelo cálcio, que é mantido em concentrações extremamente baixas no sarcoplasma. Se presentes, os íons de cálcio se ligam à troponina, causando alterações conformacionais na troponina que permitem que a tropomiosina se mova para longe dos locais de ligação da miosina na actina. Uma vez que a tropomiosina é removida, uma ponte cruzada pode se formar entre a actina e a miosina, desencadeando a contração. O ciclo da ponte cruzada continua até Ca2+ íons e ATP não estão mais disponíveis; a tropomiosina cobre novamente os locais de ligação da actina.

Liberação de cálcio induzida por cálcio

A concentração de cálcio dentro das células musculares é controlada pelo retículo sarcoplasmático, uma forma única de retículo endoplasmático no sarcoplasma. A contração muscular termina quando os íons de cálcio são bombeados de volta para o retículo sarcoplasmático, permitindo que a célula muscular relaxe. Durante a estimulação da célula muscular, o neurônio motor libera o neurotransmissor acetilcolina, que então se liga a um receptor nicotínico pós-sináptico de acetilcolina.

Uma mudança na conformação do receptor causa um potencial de ação, ativando canais de cálcio do tipo L dependentes de voltagem, que estão presentes na membrana plasmática. O fluxo interno de cálcio dos canais de cálcio do tipo L ativa os receptores de rianodina para liberar íons de cálcio do retículo sarcoplasmático. Este mecanismo é denominado liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR). Não está claro se a abertura física dos canais de cálcio do tipo L ou a presença de cálcio faz com que os receptores de rianodina se abram. O fluxo de saída do cálcio permite que as cabeças da miosina acessem os locais de ligação da ponte cruzada de actina, permitindo a contração muscular.


Pesquisadores investigam o papel regulador da proteína na biologia celular para entender como ela pode combater o câncer

Pesquisadores da University of Virginia, Lehigh University e do Massachusetts Institute of Technology estão reunindo a experiência de seus respectivos laboratórios para desvendar os mistérios de uma proteína que desempenha um papel regulador crítico na saúde e nas doenças humanas. Saber como a proteína funciona pode levar a melhores terapias para câncer e outras doenças.

O professor associado de engenharia química da UVA, Matthew Lazzara, e o professor associado de química da Lehigh University, Damien Thévenin, são os investigadores principais do projeto. Forest White, professor de engenharia biológica do MIT, também é um investigador colaborador. O projeto, "Promovendo a atividade da proteína tirosina fosfatase do receptor por meio de interações do domínio transmembrana", é financiado por um projeto de pesquisa Grant (R01) de US $ 1,6 milhão do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde.

A proteína no centro do projeto é conhecida como receptor de proteína tirosina fosfatase tipo J (PTPRJ), também às vezes referida como fosfatase-1 com densidade aumentada (DEP-1). PTPRJ é um membro da família das proteínas tirosina fosfatases do tipo receptor (RPTP), que têm como alvo e desfosforilam, ou desativam, proteínas envolvidas na proliferação e sobrevivência celular. A equipe antecipa que seu trabalho com a proteína PTPRJ pode gerar percepções relevantes para a família da proteína tirosina fosfatase semelhante ao receptor.

“A importância dos RPTPs na função celular normal é clara, mas ainda não sabemos muito sobre as relações estrutura-função que sustentam a regulação de sua atividade”, disse Lazzara. “Se soubéssemos mais, poderíamos ser capazes de projetar maneiras de aumentar sua atividade em ambientes, como o câncer, onde substratos de RPTP precisam ser desligados.”

Matthew J. Lazzara é professor associado de engenharia química na UVA. Ele também tem um cargo de cortesia em engenharia biomédica e é membro do UVA Cancer Center.

Um dos objetivos do projeto é entender como promover a atividade do PTPRJ - e eventualmente de outros RPTPs - interferindo na capacidade da fosfatase de se ligar a si mesma, processo denominado homodimerização em que duas proteínas idênticas formam uma estrutura.

“Nossos colaboradores em Lehigh desenvolveram pequenos ligantes de peptídeo que interrompem a homodimerização do PTPRJ como uma forma de promover a atividade da fosfatase”, disse Lazzara. “Como a fosfatase atua e desliga efetivamente certos receptores que podem promover o crescimento do tumor, achamos que isso poderia levar a um novo método para interferir na sinalização nas células cancerosas de uma forma que não seria contornada pelas formas comuns de resistência aos medicamentos que vemos repetidamente na oncologia ”.

“Nossa abordagem tem todos os tipos de consequências interessantes no comportamento celular e nas aplicações terapêuticas”, disse Thévenin.

“De fato, um dos principais substratos dos RPTPs são os receptores tirosina quinases, que são superativados ou fosforilados em muitos cânceres”, disse Thévenin. “Os métodos existentes para direcionar as quinases promotoras de tumor são limitados a inibidores farmacológicos e anticorpos. Embora alguns tratamentos com drogas possam ser altamente eficazes, pelo menos inicialmente, a resistência a esses inibidores quase sempre surge por meio de mutações ou sinalização de desvio por meio de tirosina quinases receptoras alternativas. Promover a atividade de RPTPs pode ser uma abordagem alternativa eficaz para superar os mecanismos de resistência adquiridos comuns, pois deve ser imune aos efeitos das mutações do gatekeeper. ”

Um segundo objetivo do projeto é identificar as circunstâncias em que interferir com a dimerização do PTPRJ pode ser mais eficaz para alterar o funcionamento das células.

“Na biologia celular, tudo gira em torno do contexto”, disse Lazzara, que tem um cargo de cortesia em engenharia biomédica e é membro do UVA Cancer Center. “A função de uma proteína em um ambiente celular pode ser diferente do que em outro. Isso pode acontecer por vários motivos, incluindo diferenças na expressão de proteínas em interação. A principal função do meu laboratório no projeto é executar um conjunto de experimentos projetados para capturar essa complexidade e, em seguida, usar abordagens de modelagem computacional de biologia de sistemas para interpretar os dados. ”

White, um ex-pesquisador de pós-doutorado na UVA, contribuirá com o uso de espectrometria de massa para quantificar eventos de fosforilação de proteínas que mudam em resposta à função de modulação do PTPRJ no laboratório. O uso de espectrometria de massa para quantificar a fosforilação de proteínas de sinalização é uma área de especialização pela qual White é bem conhecido, disse Lazzara.

“A abordagem de Forest pode medir centenas a milhares de eventos de fosforilação únicos por vez nas células, o que é uma largura de banda substancialmente maior do que você pode fazer com muitas outras técnicas”, disse Lazzara. “Existem algumas outras técnicas que podem medir centenas de sites, mas são muito menos quantitativas do que sua abordagem. Forest usou este método para estudar muitos processos de sinalização diferentes no câncer. ”

Lazzara, conhecido por sua pesquisa prolífica e muitas vezes colaborativa em sinalização celular e tomada de decisão celular, recebeu inúmeras bolsas da National Science Foundation, do National Cancer Institute, do National Institute of General Medical Sciences e da American Cancer Society. Seu trabalho contribui significativamente para os programas de pesquisa da engenharia química UVA, também proporcionando aos pesquisadores graduados oportunidades de se envolver na ciência fundamental e potencialmente inovadora.

“Este projeto é um grande exemplo de como os pesquisadores biológicos estão cada vez mais trabalhando de forma colaborativa e integrando várias áreas de especialização para fazer avanços”, disse Lazzara. “Espero que continuemos a ver isso principalmente na pesquisa do câncer”.


Exame final de biologia molecular

▪ Os locais de splice são definidos por motivos de sequência curta: os locais de splice 5 ′ e 3 ′ e um nucleotídeo de ponto de ramificação dentro do íntron e uma região de polipirimidina antes do local de splice 3 ′
- Normalmente, os íntrons têm GU e AG em suas extremidades

A extremidade 5 'é modificada com uma 7-metil guanosina e também sofre poliadenilação na qual um longo trecho de nucleotídeos de adenosina é adicionado à extremidade 3'

EJC marca a transcrição como processada e interage com proteínas de exportação e tradução

▪ A maioria dos exons são constitutivos (devem ser incluídos), mas alguns são exons regulados (podem ser incluídos ou não)

▪ As proteínas são feitas de 20 aminoácidos diferentes

▪ A informação no mRNA (ácido nucleico) é traduzida em proteína (aminoácidos) por meio de moléculas de RNA de transferência (tRNA)
-tRNAs lêem o mRNA por emparelhamento de base de 3 nucleotídeos
- a região no tRNA é o anticódon, e no mRNA é o códon
-tRNAs cada um carrega um aminoácido específico na extremidade 3 '

▪ Um código tripleto é o mais simples que pode especificar todos os 20 aminoácidos (um código duplo poderia especificar apenas 42 (ex. 16)
▪ Todos os códons possíveis são usados, então alguns aminoácidos são codificados por mais de um códon
- Em muitos casos, os primeiros dois nucleotídeos são iguais e apenas o terceiro difere (por exemplo, CU-x para leucina e GC-x para alanina)

▪ A iniciação precoce envolve a pequena subunidade ribossômica e, em seguida, a grande subunidade se junta ao complexo

Cada tRNA é específico para um determinado aminoácido

As duas primeiras posições no mRNA (leitura 5 ′ a 3 ′) são lidas por comparação de base estrita de Watson-Crick com as posições 2 e 3 do anticódon

Permite algumas interações não Watson Crick, como G-U
▪ Às vezes, a inosina está presente no anticódon, e isso pode emparelhar com U, C ou A

▪ Códons de parada sinalizam o fim da região de codificação da proteína do mRNA

▪ Um código tripleto é o mais simples que pode especificar todos os 20 aminoácidos (um código duplo poderia especificar apenas 42 (ex. 16)

▪ Todos os códons possíveis são usados, então alguns aminoácidos são codificados por mais de um códon. Em muitos casos, os primeiros dois nucleotídeos são iguais e apenas o terceiro difere (por exemplo, CU-x para leucina e GC-x para alanina)

1 em 10 ^ 4 taxa de erro ribossomo NÃO tem capacidade de revisão
- uma vez que você faz uma mutação em uma proteína, isso é para a proteína
-Há outras maneiras de degradar proteínas mutadas

▪ Primeiro, o aminoácido é ativado pela anexação de AMP
- libera pirofosfato e fornece energia

▪ O aminoacil-adenilato ativado permanece ligado à enzima
▪ AA + ATP → Aminoacil-AMP + PP

▪ Em segundo lugar, a enzima então transfere o aminoácido para o 2 ′ ou 3 ′ OH da ribose da adenosina terminal na cauda do tRNA 3 ′ CCA

▪ Aminoacil-AMP + tRNA → aminoacil tRNA + AMP AMINOACIL-TRNA TRANSFERASES

2/3 dos quais é RNA ribossomal (rRNA) e 1/3 proteína ribossômica

• Grande: catalisa a formação da ligação peptídica e tem um túnel de saída através do qual o polipeptídeo crescente emerge
• Pequeno: centro de decodificação (tRNA decodifica o códon do mRNA)

Procariontes: grande: 50S pequeno: 30S combinados: 70S

▪Bacterial RF1 reconhece UAA e UGA e RF2 reconhece UAA e UGA
▪ O eRF1 eucariótico reconhece todos os três códons de parada
-interação promove a liberação do polipeptídeo do ribossomo

▪ IF1 e IF3 ligam-se nos locais A e E na pequena subunidade ribossômica na ausência de mRNA ou f-Met-tRNAMet
- direciona o tRNA iniciador para o local P e interrompe a ligação inicial da grande subunidade ribossômica

▪ IF2 é um GTPase & amp hidrolisa GTP para fornecer energia para unir as subunidades ribossômicas grandes e pequenas

Monocistrônico: mRNAs codificam apenas uma proteína

O cap é ligado por eIF4E e a cauda por PABP (Poly-A Binding Protein)
- forma um complexo de loop fechado e funciona como um controle de qualidade para eliminar mRNAs inacabados ou danificados

Fatores de liberação (RFs) promovem a liberação hidrolítica do peptídeo acabado

2. RF3-GTP associa-se ao complexo de terminação, ocorre a hidrólise de GTP

3. Fator de liberação e dissociação RF3-GDP
• O complexo de ribossomo remanescente contém um mRNA e um tRNA ligado em um estado híbrido

2. ABCE1 envolve o ribossomo em um estado ligado a ATP e promove a reação de liberação de peptídeo, a hidrólise de ATP NÃO É NECESSÁRIA

▪ Erros de decodificação são mais prováveis ​​durante condições estressantes, quando pode haver uma escassez de alguns dos aminoacil-tRNAs

▪ A incompatibilidade na hélice do códon / anti-códon no local P desencadeia mudanças conformacionais que diminuem a fidelidade no local A
- leva a muitos erros e provavelmente rescisão antecipada

▪ O substrato de reciclagem é um complexo de ribossomo, mRNA e tRNA

▪ Em bactérias, o fator de reciclagem de ribossomo (RRF) atua com EFG e promove a desmontagem via hidrólise de GTP

▪ A dissociação depende da hidrólise de ATP por ABCE1

Em eucariotos mais complexos, os códons de parada são geralmente encontrados no exon final, então os códons de parada encontrados em outros lugares são marcados como prematuros

O erro pode ter resultado de transcrição, splicing ou produto normal de um evento celular (rearranjo)

▪ A supressão sem sentido ocorre quando um códon de parada é lido incorretamente e a terminação não ocorre

▪ Um motivo hexanucleotídico 3 ′ do códon de parada em alguns mRNAs virais desencadeia um aumento na leitura

Os códons de parada podem incorporar aminoácidos não padrão

Incorporado em várias enzimas em sítios catalíticos, onde pode atuar como um forte agente redutor

▪ Selenocisteína-tRNA é gerado carregando tRNASec com serina e, em seguida, convertendo a serina em selenocisteína. tRNASec tem um anticódon que combina com UGA

▪ Em E. coli, a Sequência de Inserção de SelenoCisteína (SECIS) é encontrada 3 ′ do UGA que será recodificado

▪ A pirolisina é incorporada no códon de parada UGA de uma forma semelhante à selenocisteína

▪ Se o quadro for alterado, diferentes códons são lidos pelo ribossomo e um peptídeo diferente é produzido
- Ocorre na maioria das vezes +1 ou -1 nucleotídeos do original

Quando há muito RF2 na célula, ela reconhece o códon de parada (UGA)

▪ A maioria dos ribossomos termina no final do gene gag, mas cerca de 10% sofrem uma mudança -1, resultando em uma proteína de fusão Gag-Pol

▪ Acredita-se que a mudança ocorra devido ao escorregamento facilitado por um pseudo nó a jusante

▪ Pequenas diferenças na tradução entre bactérias e eucariotos significam que alguns bons antibióticos são aqueles que têm como alvo o ribossomo e outras proteínas de tradução

▪ tRNAs são normalmente carregados imediatamente

▪ Quando ligado ao tRNA, um domínio quinase em Gcn2 fosforila o fator de iniciação eIF2

▪eIF2 normalmente guia o Met-tRNAi Met inicial para o local P

▪ O eIF2 fosforilado se liga fortemente ao eIF2B e não pode ser usado para iniciação, então a tradução é encerrada

▪ A iniciação eucariótica é estimulada pela formação de uma alça, envolvendo eIF4E no cap 5 ′ e PABP na cauda poli (A), ligada por interações com eIF4G

▪ eIF4E é regulado no nível transcricional e pela fosforilação da proteína

▪eIF4E pode ser sequestrado por uma gama de 4E-BPs (eIF4E - Proteínas de Ligação) em resposta às condições celulares
- isso diminui a atividade geral de tradução

▪ Pode ser controlado por 5 'ou 3' UTR

▪A resposta mais rápida é através da regulação da tradução de mRNA já disponível

▪ Um exemplo é a expressão de PrfA, que é necessária para a infecção de animais de sangue quente por Listeria monocytogenes

▪ Em baixas temperaturas, o emparelhamento de bases torna a sequência Shine-Dalgarno inacessível

▪ Um exemplo de riboswitch em procariontes é o controle da síntese de tiamina (vitamina B1)

▪ Muito ferro livre é tóxico, então o ferro está fortemente ligado à ferritina - quanto maior a concentração de ferro, mais ferritina é necessária

▪ A regulação translacional de proteínas no desenvolvimento de C. elegan pode ser seguida por GFP rotulando os 3 ′ UTRs

▪ Diversos padrões de expressão de GFP podem ser observados devido a 3'UTR que difere entre cada gene repórter
-refletindo as propriedades inerentes deste elemento 3'UTR

▪ Os vírus de flu interrompem a formação de loop fechado clivando o cap 5 ′ (a)

▪ As interações de emparelhamento de base podem ter uma variedade de efeitos, como:
-Disrupção da ligação às proteínas
-Alteração da estrutura do RNA
-Recrutamento de proteínas

▪Quando os níveis de ferro estão altos:

As transcrições para os produtos não essenciais são traduzidas, estáveis ​​ou a tradução interrompida (se o produto for necessário apenas em condições de baixo teor de ferro) por ex., Estrutura secundária do mRNA

Por fim, uma pequena região contínua de emparelhamento de bases é crítica
- este é de fita simples e é frequentemente conservado

Ajuda os sRNAs a encontrar seus alvos entre os milhares de transcritos em uma célula

▪Hfq é uma proteína hexamérica

20-30 nt de comprimento e amp derivado de transcrições mais longas

▪ SRNAs eucarióticos associados a proteínas da família Argonaute, que facilitam as interações com os alvos

Uma das principais classes de sRNA Eucariótico
-regulatório

▪ As extensões 5 ′ e 3 ′ são removidas do pri-miRNA por Drosha
-produz um grampo de cabelo 60-70 nt (pré-miRNA)

▪ O grampo de cabelo é exportado do núcleo

Uma das principais classes de sRNA Eucariótico
-regulatório

Enzimas da família RNAse III estão envolvidas

Não derivado de transcrições específicas

Envolvido na defesa celular (interferência de RNA) contra RNAs exógenos

▪ O locus CRISPR contém muitas repetições de 20-50 nucleotídeos ▪ DNA estranho clivado é integrado a este locus

▪ O locus CRISPR é transcrito e processado por proteínas Cas para dar crRNAs curtos

▪ O dobramento de proteínas pode começar quando o N-terminal emerge do ribossomo, onde o peptídeo encontra chaperones

▪ Em bactérias, os peptídeos interagem com o fator desencadeante, então:
- Dobre sem ajuda
-Ou ligar-se às proteínas de choque térmico Hsp70 (DnaK) ou chaperonas Hsp60 (GroES + GroEL)

▪ Hsp: reconhece e se liga a regiões hidrofóbicas no novo polipeptídeo e utiliza ATP para conduzir mudanças conformacionais e liberação de proteínas

Secundário
▪ fitas beta e alfa-hélices

Terciário
▪ estrutura dobrada final de um único polipeptídeo

▪ As cisteínas podem existir como uma forma reduzida (tiol -SH) ou como uma forma oxidada (ligações dissulfeto, -S-S-)

▪ As ligações dissulfeto se formam com mais frequência em um ambiente oxidativo, como dentro do retículo endoplasmático

▪ Motivos de classificação específicos dentro das proteínas são fundamentais para direcionar a localização (mostrado abaixo)

▪ Os motivos de classificação podem ser nos terminais N e / ou C.

▪ Sequências N-terminais são frequentemente clivadas depois que seu trabalho é concluído

▪ As proteínas podem ter vários motivos de classificação que ajustam a localização
▪ A classificação em compartimentos celulares requer:
- Seleção de reconhecimento de motivo
- Transporte
- Movimento para dentro ou através de uma membrana


Introdução

Formular modelos preditivos conectando informações genéticas a fenótipos constitui um objetivo abrangente em genômica e biologia de sistemas (Ostrov et al, 2019 Shendure et al, 2019 Lopatkin & Collins, 2020). Em micróbios unicelulares, a relação entre genótipo e fenótipo pode ser conceitualmente decomposta em dois mapas distintos: o primeiro, relacionando a sequência do genoma à expressão do gene e o segundo, conectando a expressão do gene às propriedades da célula inteira, como a proliferação. Progresso rápido na caracterização de cis- elementos reguladores, estimulados pela integração de ensaios repórter maciçamente paralelos (Patwardhan et al, 2009, 2012 Sharon et al, 2012) com novos frameworks computacionais (Rosenberg et al, 2015 Jaganathan et al, 2019 Bogard et al, 2019 de Boer et al, 2020), conseguiu avanços na previsão de características de expressão da sequência de DNA (Cambray et al, Amostra 2018 et al, 2019 Agarwal e Shendure, pré-impressão de 2020: Urtecho et al, 2020). Em contraste, os cenários de aptidão de expressão, definidos como as relações distintas entre o nível de expressão de genes individuais e a aptidão da célula, permanecem pouco estudados, apesar de serem a base de pressões seletivas sobre a abundância de proteínas. Essa lacuna de informações limita tanto a engenharia de funções biológicas complexas quanto a interpretabilidade da variação genética.

Prever a forma de paisagens de aptidão de expressão requer caracterização quantitativa do estado celular em vários níveis. Embora várias paisagens de aptidão de expressão tenham sido mapeadas anteriormente, por exemplo, (Tubulekas & Hughes, 1993 Dekel & Alon, 2005 Chou et al, 2014 Li et al, Keren 2014 et al, Knöppel 2016 et al, Duveau 2016 et al, Palmer 2017 et al, 2018 Schober et al, 2019 Hawkins et al, 2020 Jost et al, 2020 Kavčič et al, 2020 Parker et al, Pré-impressão de 2020: Arita et al, 2021 Mathis et al, 2021), essas medições raramente incluem avaliação concomitante do estado interno da célula após perturbações (mas veja Jost et al, 2020 Parker et al, 2020). Com informações limitadas ligando as escalas moleculares às celulares, as causas básicas dos defeitos de aptidão observados são difíceis de identificar (Fig. 1A). Em particular, as mudanças nos níveis de enzimas não afetam apenas diretamente o fluxo e o crescimento (Fig 1A, inserção i para o caso de fatores de tradução) (Ehrenberg & Kurland, 1984 Klumpp et al, 2013 Li et al, 2014), mas também pode ter efeitos pleiotrópicos indiretos que assumem a forma de propagação de danos em três níveis conectados de organização biológica (Fig 1A, inserção ii). Em primeiro lugar, um fluxo enzimático reduzido pode afetar a expressão de outros genes por meio de mecanismos moleculares específicos (nível mecanístico). Em segundo lugar, essas mudanças proximais na expressão podem ondular através da rede regulatória, levando a outras mudanças na expressão em todo o genoma (nível regulatório). Terceiro, cada mudança de expressão terminal a jusante pode ter um impacto na aptidão (nível sistêmico). Se as pressões seletivas sobre a abundância de proteínas se relacionam predominantemente a impactos diretos no fluxo ou se são dominadas por respostas celulares indiretas permanece não resolvido.

Figura 1. Mapeando os determinantes subjacentes dos cenários de aptidão de expressão de fator de liberação

  1. As paisagens de aptidão de expressão, que conectam a expressão da enzima (variável microscópica) à taxa de crescimento (fenótipo celular), podem ser ditadas por efeitos diretos ou indiretos. Inserção (i): os efeitos diretos correspondem à redução no fluxo cognato para a enzima perturbada (taxa de síntese de proteínas no caso de fatores de tradução). Inserção (ii): efeitos indiretos resultam da propagação pleiotrópica através dos níveis mecanístico, regulatório e sistêmico.
  2. Como um estudo de caso, a expressão de fatores de liberação de cadeia peptídica (RFs: RF1, RF2 e metiltransferase PrmC associada), envolvidos na primeira etapa da terminação da tradução do mRNA, foi ajustada em torno dos níveis endógenos.
  3. As cepas com cópias induzíveis de RFs e genes endógenos deletados foram usadas para variar sistematicamente a expressão de RF. Os impactos resultantes no estado interno da célula (RNA-seq, perfil de ribossomo) e taxa de crescimento relativa s (experimentos de competição) foram medidos, levando a um mapeamento preciso de paisagens de expressão-aptidão.

Informação de dados: Veja também as Figs EV1 e EV2 para detalhes sobre deformações e plataforma de medição.

Aqui, como um estudo de caso, variamos sistematicamente a expressão de enzimas envolvidas no processo central de terminação da tradução do mRNA (Fig. 1B) em bactérias Gram-positivas Bacillus subtilis. Nós nos concentramos em fatores de liberação de cadeia de peptídeo, RF1, RF2 e sua metiltransferase PrmC (doravante denominados coletivamente como fatores de liberação, RFs). RF1 e RF2 catalisam a primeira etapa de terminação da tradução (Bertram et al, 2001), reconhecendo códons de parada e liberando peptídeos completos do ribossomo (Fig. 1B). RF1 e RF2 interagem diretamente com o ribossomo (Scolnick et al, Petry 1968 et al, 2005) e têm especificidades parcialmente sobrepostas (Scolnick et al, 1968) (RF1 reconhece para UAA / UAG e RF2 para UAA / UGA). O PrmC modifica pós-tradução RF1 e RF2, aumentando assim sua atividade catalítica (Heurgué-Hamard et al, Nakahigashi 2002 et al, Mora 2002 et al, 2007). Nós almejamos a terminação da tradução porque as mudanças a jusante resultantes na expressão eram esperadas para serem modestas: dado que a tradução é limitada pela iniciação na maioria dos mRNAs (Laursen & Sørensen, 2005), a taxa de terminação levemente decrescente era esperada para reduzir a disponibilidade global de ribossomos sem alterar a produção de proteínas gene por gene. Uma melhor compreensão da fisiologia do estresse de terminação de tradução tem relevância na biologia sintética, por exemplo, no contexto de redesignação de códon de parada de todo o genoma (Johnson et al, 2011, 2012 Lajoie et al, 2013 Wannier et al, 2018 Fredens et al, 2019 ).

Por meio de medições precisas de transcriptomas, respostas translacionais globais e aptidão celular (definida aqui como a taxa de crescimento da população na fase exponencial), elucidamos os determinantes subjacentes das paisagens de aptidão de expressão de RF (Fig. 1C). Descobrimos que as induções idiossincráticas e indiretas de programas regulatórios estão associadas a diminuições na taxa de crescimento em várias direções do subespaço de expressão de RF. Chamamos tal situação de “entrincheiramento regulatório”, pelo qual o defeito de adequação causado pela perturbação da expressão de uma proteína é forte e espúriamente agravado pela rede reguladora do gene. Além disso, reconstruímos links que conectam a perturbação microscópica inicial aos efeitos de todo o sistema. No nível mecanístico, descobrimos que a oclusão dos locais de ligação ao ribossomo durante a depleção de RF é um fenômeno comum que leva a mudanças na estequiometrias de expressão entre genes adjacentes co-transcritos. Em particular, identificamos o códon de parada de um único regulador como um calcanhar de Aquiles molecular, sensibilizando toda a célula a perturbações de RF específicas. No nível regulatório, mostramos que a remoção de um gene pode silenciar as mudanças pleiotrópicas e liberar o RF do entrincheiramento regulatório. Finalmente, no nível sistêmico, relatamos a compressão passiva do proteoma como uma causa quantitativamente tratável de defeitos de crescimento após a ativação massiva de um regulon.

Nossa caracterização multiescala fornece um exemplo concreto de como eventos distais, embora focais, acionados por perturbações moleculares direcionadas podem ter impactos em todo o sistema. Aqui, a suscetibilidade das células às perturbações de expressão de enzimas específicas não está simplesmente relacionada à magnitude das mudanças no fluxo cognato associado, mas, em vez disso, é ditada e amplificada por nós sensíveis na rede regulatória. Esses resultados reforçam o ponto de vista de que uma compreensão quantitativa do sistema completo (Karr et al, Boyle 2012 et al, 2017 Liu et al, 2019) pode ser necessário prever até qualitativamente a forma de paisagens de aptidão de expressão.


Os 3Rs do genoma: Leitura, escrita e regulação

Um esforço massivo para mapear os locais de ligação precisos de mais de 400 tipos diferentes de proteínas no genoma da levedura produziu o mapa mais completo e de alta resolução da arquitetura cromossômica e da regulação gênica até hoje. O estudo revela duas arquiteturas regulatórias de genes distintas, expandindo o modelo tradicional de regulação gênica. Os chamados genes constitutivos, aqueles que executam funções básicas de 'manutenção' e quase sempre estão ativos em níveis baixos, requerem apenas um conjunto básico de controles regulatórios, enquanto aqueles que são ativados por sinais ambientais, conhecidos como genes induzíveis, têm uma arquitetura mais especializada . Essa descoberta na levedura pode abrir a porta para um melhor entendimento da arquitetura regulatória do genoma humano.

Um artigo descrevendo a pesquisa dos cientistas da Penn State e da Cornell University foi publicado em 10 de março de 2021 no jornal Natureza.

"Quando aprendi sobre o DNA, fui ensinado a pensar no genoma como uma biblioteca contendo todos os livros já escritos", disse Matthew J. Rossi, professor assistente de pesquisa na Penn State e o primeiro autor do artigo. “O genoma é armazenado como parte de um complexo de DNA, RNA e proteínas, chamado 'cromatina'. As interações das proteínas e do DNA regulam quando e onde os genes são expressos para produzir RNA (ou seja, ler um livro para aprender ou fazer algo específico). Mas o que sempre me perguntei foi com toda aquela complexidade, como encontrar o livro certo quando precisa? Essa é a pergunta que estamos tentando responder neste estudo. "

Como uma célula escolhe o livro certo depende das proteínas regulatórias e de sua interação com o DNA na cromatina, o que pode ser referido como a arquitetura regulatória do genoma. As células de levedura podem responder às mudanças em seu ambiente, alterando essa arquitetura regulatória para ligar ou desligar diferentes genes. Em organismos multicelulares, como os humanos, a diferença entre células musculares, neurônios e todos os outros tipos de células é determinada pela regulação do conjunto de genes que essas células expressam. Decifrar os mecanismos que controlam essa expressão diferencial do gene é, portanto, vital para a compreensão das respostas ao ambiente, ao desenvolvimento do organismo e à evolução.

"As proteínas precisam ser recrutadas e montadas nos genes para que sejam ativadas", disse B. Franklin Pugh, professor de biologia molecular e genética da Universidade Cornell e líder do projeto de pesquisa iniciado quando ele era professor na Penn State. "Reunimos o mapa mais completo e de alta resolução dessas proteínas, mostrando os locais em que elas se ligam ao genoma da levedura e revelando aspectos de como elas interagem entre si para regular a expressão do gene."

A equipe usou uma técnica chamada ChIP-exo, uma versão de alta resolução do ChIP-seq, para mapear de forma precisa e reproduzível os locais de ligação de cerca de 400 proteínas diferentes que interagem com o genoma da levedura, alguns em alguns locais e outros em milhares de Localizações. No ChIP-exo, as proteínas são quimicamente reticuladas com o DNA dentro das células vivas, travando-as na posição. Os cromossomos são então removidos das células e fragmentados em pedaços menores. Os anticorpos são usados ​​para capturar proteínas específicas e o pedaço de DNA ao qual estão ligados. A localização da interação proteína-DNA pode então ser encontrada sequenciando o DNA ligado à proteína e mapeando a sequência de volta ao genoma.

"No ChIP-seq tradicional, os pedaços de DNA ligados às proteínas ainda são bastante grandes e variáveis ​​em comprimento - variando de 100 a 500 pares de bases além do local de ligação real da proteína", disse William K.M. Lai, professor assistente de pesquisa na Cornell University e autor do artigo. "No ChIP-exo, adicionamos uma etapa adicional de aparar o DNA com uma enzima chamada exonuclease. Isso remove qualquer excesso de DNA que não esteja protegido pela proteína reticulada, permitindo-nos obter uma localização muito mais precisa para a ligação evento e para melhor visualizar as interações entre as proteínas. "

A equipe realizou mais de 1.200 experimentos ChIP-exo individuais, produzindo bilhões de pontos individuais de dados. A análise dos dados massivos alavancou os clusters de supercomputação da Penn State e exigiu o desenvolvimento de várias novas ferramentas de bioinformática, incluindo um fluxo de trabalho computacional multifacetado projetado para identificar padrões e revelar a organização de proteínas regulatórias no genoma da levedura.

A análise, que é semelhante a escolher tipos repetidos de características no solo de centenas de imagens de satélite, revelou um número surpreendentemente pequeno de montagens de proteínas únicas que são usadas repetidamente em todo o genoma da levedura.

"A resolução e integridade dos dados nos permitiu identificar 21 assembléias de proteínas e também identificar a ausência de sinais de controle regulatório específicos em genes de manutenção", disse Shaun Mahony, professor assistente de bioquímica e biologia molecular da Penn State e autor do papel. "Os métodos computacionais que desenvolvemos para analisar esses dados podem servir como um ponto de partida para o desenvolvimento de estudos regulatórios de genes em organismos mais complexos."

O modelo tradicional de regulação gênica envolve proteínas chamadas 'fatores de transcrição' que se ligam a sequências de DNA específicas para controlar a expressão de um gene próximo. No entanto, os pesquisadores descobriram que a maioria dos genes da levedura não adere a esse modelo.

"Ficamos surpresos ao descobrir que os genes de manutenção careciam de uma arquitetura de proteína-DNA que permitisse a ligação de fatores de transcrição específicos, que é a marca registrada dos genes indutíveis", disse Pugh. "Esses genes parecem precisar apenas de um conjunto geral de proteínas que permitem o acesso ao DNA e sua transcrição sem muita necessidade de regulação. Se esse padrão se mantém ou não em organismos multicelulares como os humanos, ainda não foi descoberto. É muito mais complexo proposição, mas como o sequenciamento do genoma da levedura precedeu o sequenciamento do genoma humano, tenho certeza que eventualmente seremos capazes de ver a arquitetura regulatória do genoma humano em alta resolução. "


Mastering Biology Chp. 15 HW

Você pode combinar os termos relacionados aos operons com suas definições?

Os operons trp e lac são regulados de várias maneiras. Como as bactérias regulam a transcrição desses operons?

operon é transcrito, mas não acelerado por meio do controle positivo
operon -lac: lactose presente,
glicose presente
operon -trp: triptofano ausente

operon é transcrito rapidamente por meio do controle positivo
operon -lac: lactose presente,
glicose ausente

[O operon trp é regulado apenas por meio de controle negativo. Quando o triptofano está presente, os genes do operon não são transcritos.
O operon lac é regulado tanto pelo controle negativo quanto pelo controle positivo.

Você está estudando uma bactéria que utiliza um açúcar chamado athelose. Este açúcar pode ser usado como fonte de energia quando necessário.
O metabolismo da athelose é controlado pelo operon ath. Os genes do operon ath codificam as enzimas necessárias para usar a athelose como fonte de energia.

Você encontrou o seguinte:

-Os genes do operon ath são expressos apenas quando a concentração de athelose na bactéria é alta.
-Quando a glicose está ausente, a bactéria precisa metabolizar a athelose como fonte de energia, tanto quanto possível.
-A mesma proteína ativadora catabólica (CAP) envolvida com o operon lac interage com o operon ath.


Regulação do relógio da secreção de proteínas

O relógio molecular regula a transcrição rítmica de uma miríade de genes, levando a um padrão circadiano de expressão das proteínas codificadas. Um estudo demonstra a regulação circadiana da expressão de componentes da via secretora de proteínas, fornecendo um mecanismo para gerar padrões circadianos de expressão de proteínas secretadas.

As fibrilas de colágeno constituem até um terço da massa dos vertebrados e desempenham um papel crítico na fisiologia normal 4. A homeostase das fibras de colágeno está sob rígido controle, ilustrado pelo estado patológico de fibrose que se caracteriza pelo acúmulo anormal de fibrilas 5. Similarmente a uma fração substancial de proteínas eucarióticas, o colágeno atravessa a via secretora e é considerado a proteína secretada mais abundante em vertebrados. As fibrilas de colágeno são extraordinariamente estáveis, e as fibrilas dentro dos tendões e da cartilagem podem durar por toda a vida de um organismo 4. No entanto, as fibrilas de colágeno são conhecidas por falharem sob carga fisiológica normal, como durante o exercício, e está claro que o novo colágeno é sintetizado em resposta a estímulos mecânicos ou hormonais 6. Chang et al. 3 observaram dois pools de colágeno, um que é estável ou "persistente" e um segundo pool inesperado de colágeno recém-sintetizado ou "sacrificial" que parece estar sob o controle de um relógio circadiano. Examinando a rede de fibrilas de colágeno em tendões de camundongos, eles observaram uma distribuição trimodal de fibrilas com base no diâmetro da fibra (D1 = pequeno, D2 = médio e D3 = diâmetro grande). Usando microscopia eletrônica de transmissão, eles observaram um padrão circadiano de mudanças na distribuição trimodal das fibrilas. Embora o tendão tenha demonstrado ter um relógio molecular periférico operacional 7, e o rompimento do relógio seja conhecido por estar associado a anormalidades da matriz extracelular (MEC), incluindo o desenvolvimento de tendões espessados ​​/ calcificados em ClockΔ19 mutantes que levam à imobilização 7, a expressão dos genes do colágeno I (Col1a1 e Col1a2) faltou ritmicidade nas análises transcriptômicas realizadas neste estudo. No entanto, Chang et al. 3 confirmou a ritmicidade circadiana dos genes do relógio central, incluindo Npas2, Per1 / 2/3, Bmal1 e Cry1 nos tendões, levando-os a explorar outros mecanismos potenciais responsáveis ​​pelos ritmos das fibrilas de colágeno. Previous studies demonstrated circadian clock regulation of ribosome binding to Col1a1 mRNA transcripts 8 , and the authors took this observation one step further and were able to observe that packing of ribosomes along the endoplasmic reticulum (ER) in the tendon fibroblasts followed a clear circadian pattern with greater occupancy at ZT15 than at ZT2.Transcriptomic analysis performed in the tendons revealed prominent circadian patterns of expression of mRNAs encoding key secretory pathway proteins, leading the authors to hypothesise that secreted protein translation (including collagen I) was under circadian regulation via the molecular clock.


38.4E: Regulatory Proteins - Biology

In bacteria and archaea, structural proteins with related functions—such as the genes that encode the enzymes that catalyze the many steps in a single biochemical pathway—are usually encoded together within the genome in a block called an operon and are transcribed together under the control of a single promotor. This forms a polycistronic transcript (Figure 1). The promoter then has simultaneous control over the regulation of the transcription of these structural genes because they will either all be needed at the same time, or none will be needed.

Figure 1. In prokaryotes, structural genes of related function are often organized together on the genome and transcribed together under the control of a single promoter. The operon’s regulatory region includes both the promoter and the operator. If a repressor binds to the operator, then the structural genes will not be transcribed. Alternatively, activators may bind to the regulatory region, enhancing transcription.

French scientists François Jacob (1920–2013) and Jacques Monod at the Pasteur Institute were the first to show the organization of bacterial genes into operons, through their studies on the laca operon do E. coli. They found that in E. coli, all of the structural genes that encode enzymes needed to use lactose as an energy source lie next to each other in the lactose (or laca) operon under the control of a single promoter, the laca promotor. For this work, they won the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1965.

Although eukaryotic genes are not organized into operons, prokaryotic operons are excellent models for learning about gene regulation generally. There are some gene clusters in eukaryotes that function similar to operons. Many of the principles can be applied to eukaryotic systems and contribute to our understanding of changes in gene expression in eukaryotes that can result pathological changes such as cancer.

Each operon includes DNA sequences that influence its own transcription these are located in a region called the regulatory region. The regulatory region includes the promoter and the region surrounding the promoter, to which fatores de transcrição, proteins encoded by regulatory genes, can bind. Transcription factors influence the binding of RNA polimerase to the promoter and allow its progression to transcribe structural genes. UMA repressor is a transcription factor that suppresses transcription of a gene in response to an external stimulus by binding to a DNA sequence within the regulatory region called the operador, which is located between the RNA polymerase binding site of the promoter and the transcriptional start site of the first structural gene. Repressor binding physically blocks RNA polymerase from transcribing structural genes. Conversely, an activator is a transcription factor that increases the transcription of a gene in response to an external stimulus by facilitating RNA polymerase binding to the promoter. Um indutor, a third type of regulatory molecule, is a small molecule that either activates or represses transcription by interacting with a repressor or an activator.

In prokaryotes, there are examples of operons whose gene products are required rather consistently and whose expression, therefore, is unregulated. Such operons are constitutively expressed, meaning they are transcribed and translated continuously to provide the cell with constant intermediate levels of the protein products. Such genes encode enzymes involved in housekeeping functions required for cellular maintenance, including DNA replication, repair, and expression, as well as enzymes involved in core metabolism. In contrast, there are other prokaryotic operons that are expressed only when needed and are regulated by repressors, activators, and inducers.


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The TSC complex Edit

Almost all of the variables required for protein synthesis affect mTORC1 activation by interacting with the TSC1/TSC2 protein complex. TSC2 is a GTPase activating protein (GAP). Its GAP activity interacts with a G protein called Rheb by hydrolyzing the GTP of the active Rheb-GTP complex, converting it to the inactive Rheb-GDP complex. The active Rheb-GTP activates mTORC1 through unelucidated pathways. [7] Thus, many of the pathways that influence mTORC1 activation do so through the activation or inactivation of the TSC1/TSC2 heterodimer. This control is usually performed through phosphorylation of the complex. This phosphorylation can cause the dimer to dissociate and lose its GAP activity, or the phosphorylation can cause the heterodimer to have increased GAP activity, depending on which amino acid residue becomes phosphorylated. [8] Thus, the signals that influence mTORC1 activity do so through activation or inactivation of the TSC1/TSC2 complex, upstream of mTORC1.

The Ragulator-Rag complex Edit

mTORC1 interacts at the Ragulator-Rag complex on the surface of the lysosome in response to amino acid levels in the cell. [9] [10] Even if a cell has the proper energy for protein synthesis, if it does not have the amino acid building blocks for proteins, no protein synthesis will occur. Studies have shown that depriving amino acid levels inhibits mTORC1 signaling to the point where both energy abundance and amino acids are necessary for mTORC1 to function. When amino acids are introduced to a deprived cell, the presence of amino acids causes Rag GTPase heterodimers to switch to their active conformation. [11] Active Rag heterodimers interact with raptor, localizing mTORC1 to the surface of late endosomes and lysosomes where the Rheb-GTP is located. [12] This allows mTORC1 to physically interact with Rheb. Thus the amino acid pathway as well as the growth factor/energy pathway converge on endosomes and lysosomes. Thus the Ragulator-Rag complex recruits mTORC1 to lysosomes to interact with Rheb. [13] [14]

Regulation of the Ragulator-Rag complex Edit

Rag activity is regulated by at least two highly conserved complexes: the "GATOR1" complex containing DEPDC5, NPRL2 and NPRL3 and the ""GATOR2" complex containing Mios, WDR24, WDR59, Seh1L, Sec13. [15] GATOR1 inhibits Rags (it is a GTPase-activating protein for Rag subunits A/B) and GATOR2 activates Rags by inhibiting DEPDC5.

Receptor tyrosine kinases Edit

Akt/PKB pathway Edit

Insulin-like growth factors can activate mTORC1 through the receptor tyrosine kinase (RTK)-Akt/PKB signaling pathway. Ultimately, Akt phosphorylates TSC2 on serine residue 939, serine residue 981, and threonine residue 1462. [16] These phosphorylated sites will recruit the cytosolic anchoring protein 14-3-3 to TSC2, disrupting the TSC1/TSC2 dimer. When TSC2 is not associated with TSC1, TSC2 loses its GAP activity and can no longer hydrolyze Rheb-GTP. This results in continued activation of mTORC1, allowing for protein synthesis via insulin signaling. [17]

Akt will also phosphorylate PRAS40, causing it to fall off of the Raptor protein located on mTORC1. Since PRAS40 prevents Raptor from recruiting mTORC1's substrates 4E-BP1 and S6K1, its removal will allow the two substrates to be recruited to mTORC1 and thereby activated in this way. [18]

Furthermore, since insulin is a factor that is secreted by pancreatic beta cells upon glucose elevation in the blood, its signaling ensures that there is energy for protein synthesis to take place. In a negative feedback loop on mTORC1 signaling, S6K1 is able to phosphorylate the insulin receptor and inhibit its sensitivity to insulin. [16] This has great significance in diabetes mellitus, which is due to insulin resistance. [19]

MAPK/ERK pathway Edit

Mitogens, such as insulin like growth factor 1 (IGF1), can activate the MAPK/ERK pathway, which can inhibit the TSC1/TSC2 complex, activating mTORC1. [17] In this pathway, the G protein Ras is tethered to the plasma membrane via a farnesyl group and is in its inactive GDP state. Upon growth factor binding to the adjacent receptor tyrosine kinase, the adaptor protein GRB2 binds with its SH2 domains. This recruits the GEF called Sos, which activates the Ras G protein. Ras activates Raf (MAPKKK), which activates Mek (MAPKK), which activates Erk (MAPK). [20] Erk can go on to activate RSK. Erk will phosphorylate the serine residue 644 on TSC2, while RSK will phosphorylate serine residue 1798 on TSC2. [21] These phosphorylations will cause the heterodimer to fall apart, and prevent it from deactivating Rheb, which keeps mTORC1 active.

RSK has also been shown to phosphorylate raptor, which helps it overcome the inhibitory effects of PRAS40. [22]

Wnt pathway Edit

The Wnt pathway is responsible for cellular growth and proliferation during organismal development thus, it could be reasoned that activation of this pathway also activates mTORC1. Activation of the Wnt pathway inhibits glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3B). [23] When the Wnt pathway is not active, GSK3 beta is able to phosphorylate TSC2 on two serine residues of 1341 and 1337 in conjunction with AMPK phosphorylating serine residue 1345. It has been found that the AMPK is required to first phosphorylate residue 1345 before GSK3 beta can phosphorylate its target serine residues. This phosphorylation of TSC2 would activate this complex, if GSK3 beta were active. Since the Wnt pathway inhibits GSK3 signaling, the active Wnt pathway is also involved in the mTORC1 pathway. Thus, mTORC1 can activate protein synthesis for the developing organism. [23]

Cytokines Edit

Cytokines like tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) can induce mTOR activity through IKK beta, also known as IKK2. [24] IKK beta can phosphorylate TSC1 at serine residue 487 and TSC1 at serine residue 511. This causes the heterodimer TSC complex to fall apart, keeping Rheb in its active GTP-bound state.

Energy and oxygen Edit

Energy status Edit

In order for translation to take place, abundant sources of energy, particularly in the form of ATP, need to be present. If these levels of ATP are not present, due to its hydrolysis into other forms like AMP, and the ratio of AMP to ATP molecules gets too high, AMPK will become activated. AMPK will go on to inhibit energy consuming pathways such as protein synthesis. [25]

AMPK can phosphorylate TSC2 on serine residue 1387, which activates the GAP activity of this complex, causing Rheb-GTP to be hydrolyzed into Rheb-GDP. This inactivates mTORC1 and blocks protein synthesis through this pathway. [26]

AMPK can also phosphorylate Raptor on two serine residues. This phosphorylated Raptor recruits 14-3-3 to bind to it and prevents Raptor from being part of the mTORC1 complex. Since mTORC1 cannot recruit its substrates without Raptor, no protein synthesis via mTORC1 occurs. [27]

LKB1, also known as STK11, is a known tumor suppressor that can activate AMPK. More studies on this aspect of mTORC1 may help shed light on its strong link to cancer. [28]

Hypoxic stress Edit

When oxygen levels in the cell are low, it will limit its energy expenditure through the inhibition of protein synthesis. Under hypoxic conditions, hypoxia inducible factor one alpha (HIF1A) will stabilize and activate transcription of REDD1, also known as DDIT4. After translation, this REDD1 protein will bind to TSC2, which prevents 14-3-3 from inhibiting the TSC complex. Thus, TSC retains its GAP activity towards Rheb, causing Rheb to remain bound to GDP and mTORC1 to be inactive. [29] [30]

Due to the lack of synthesis of ATP in the mitochondria under hypoxic stress or hypoxia, AMPK will also become active and thus inhibit mTORC1 through its processes. [31]

mTORC1 activates transcription and translation through its interactions with p70-S6 Kinase 1 (S6K1) and 4E-BP1, the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) binding protein 1. [1] Their signaling will converge at the translation initiation complex on the 5' end of mRNA, and thus activate translation.

4E-BP1 Edit

Activated mTORC1 will phosphorylate translation inhibitor 4E-BP1, releasing it from eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E). [32] eIF4E is now free to join the eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) and the eukaryotic translation initiation factor 4A (eIF4A). [33] This complex then binds to the 5' cap of mRNA and will recruit the helicase eukaryotic translation initiation factor A (eIF4A) and its cofactor eukaryotic translation initiation factor 4B (eIF4B). [34] The helicase is required to remove hairpin loops that arise in the 5' untranslated regions of mRNA, which prevent premature translation of proteins. Once the initiation complex is assembled at the 5' cap of mRNA, it will recruit the 40S small ribosomal subunit that is now capable of scanning for the AUG start codon start site, because the hairpin loop has been eradicated by the eIF4A helicase. [35] Once the ribosome reaches the AUG codon, translation can begin.

S6K Edit

Hypophosphorylated S6K is located on the eIF3 scaffold complex. Active mTORC1 gets recruited to the scaffold, and once there, will phosphorylate S6K to make it active. [16]

mTORC1 phosphorylates S6K1 on at least two residues, with the most critical modification occurring on a threonine residue (T389). [36] [37] This event stimulates the subsequent phosphorylation of S6K1 by PDPK1. [37] [38] Active S6K1 can in turn stimulate the initiation of protein synthesis through activation of S6 Ribosomal protein (a component of the ribosome) and eIF4B, causing them to be recruited to the pre-initiation complex. [39]

Active S6K can bind to the SKAR scaffold protein that can get recruited to exon junction complexes (EJC). Exon junction complexes span the mRNA region where two exons come together after an intron has been spliced out. Once S6K binds to this complex, increased translation on these mRNA regions occurs. [40]

S6K1 can also participate in a positive feedback loop with mTORC1 by phosphorylating mTOR's negative regulatory domain at two sites phosphorylation at these sites appears to stimulate mTOR activity. [41] [42]

S6K also can phosphorylate programmed cell death 4 (PDCD4), which marks it for degradation by ubiquitin ligase Beta-TrCP (BTRC). PDCD4 is a tumor suppressor that binds to eIF4A and prevents it from being incorporated into the initiation complex. [43]

mTOR was found to be related to aging in 2001 when the ortholog of S6K, SCH9, was deleted in S. cerevisiae, doubling its lifespan. [44] This greatly increased the interest in upstream signaling and mTORC1. Studies in inhibiting mTORC1 were thus performed on the model organisms of C. elegans, fruitflies, and mice. Inhibition of mTORC1 showed significantly increased lifespans in all model species. [45] [46]

Based on upstream signaling of mTORC1, a clear relationship between food consumption and mTORC1 activity has been observed. [47] Most specifically, carbohydrate consumption activates mTORC1 through the insulin growth factor pathway. In addition, amino acid consumption will stimulate mTORC1 through the branched chain amino acid/Rag pathway. Thus dietary restriction inhibits mTORC1 signaling through both upstream pathways of mTORC that converge on the lysosome. [48]

Dietary restriction has been shown to significantly increase lifespan in the human model of Rhesus monkeys as well as protect against their age related decline. [49] More specifically, Rhesus monkeys on a calorie restricted diet had significantly less chance of developing cardiovascular disease, diabetes, cancer, and age related cognitive decline than those monkeys who were not placed on the calorie restricted diet. [49]

Autophagy Edit

Autophagy is the major degradation pathway in eukaryotic cells and is essential for the removal of damaged organelles via macroautophagy or proteins and smaller cellular debris via microautophagy from the cytoplasm. [50] Thus, autophagy is a way for the cell to recycle old and damaged materials by breaking them down into their smaller components, allowing for the resynthesis of newer and healthier cellular structures. [50] Autophagy can thus remove protein aggregates and damaged organelles that can lead to cellular dysfunction. [51]

Upon activation, mTORC1 will phosphorylate autophagy-related protein 13 (Atg 13), preventing it from entering the ULK1 kinase complex, which consists of Atg1, Atg17, and Atg101. [52] This prevents the structure from being recruited to the preautophagosomal structure at the plasma membrane, inhibiting autophagy. [53]

mTORC1's ability to inhibit autophagy while at the same time stimulate protein synthesis and cell growth can result in accumulations of damaged proteins and organelles, contributing to damage at the cellular level. [54] Because autophagy appears to decline with age, activation of autophagy may help promote longevity in humans. [55] Problems in proper autophagy processes have been linked to diabetes, cardiovascular disease, neurodegenerative diseases, and cancer. [56]

Lysosomal damage Edit

mTORC1 is positioned on lysosomes and is inhibited when lysosomal membrane is damaged through a protein complex termed GALTOR. [57] GALTOR contains galectin-8, a cytosolic lectin, which recognizes damaged lysosomal membranes by binding to the exposed glycoconjugates normally facing lysosomal lumen. Under homeostatic conditions, Galectin-8 associates with active mTOR. [57] Following membrane damage galectin-8 no longer interacts with mTOR but instead switches to complexes containing SLC38A9, RRAGA/RRAGB, and LAMTOR1 (a component of Ragulator) thus inhibiting mTOR, [57] mTOR inhibition in turn activates autophagy and starts a quality control program that removes damaged lysosomes, [57] referred to as lysophagy, [58]

Reactive oxygen species Edit

Reactive oxygen species can damage the DNA and proteins in cells. [59] A majority of them arise in the mitochondria. [60]

Deletion of the TOR1 gene in yeast increases cellular respiration in the mitochondria by enhancing the translation of mitochondrial DNA that encodes for the complexes involved in the electron transport chain. [61] When this electron transport chain is not as efficient, the unreduced oxygen molecules in the mitochondrial cortex may accumulate and begin to produce reactive oxygen species. [62] It is important to note that both cancer cells as well as those cells with greater levels of mTORC1 both rely more on glycolysis in the cytosol for ATP production rather than through oxidative phosphorylation in the inner membrane of the mitochondria. [63]

Inhibition of mTORC1 has also been shown to increase transcription of the NFE2L2 (NRF2) gene, which is a transcription factor that is able to regulate the expression of electrophilic response elements as well as antioxidants in response to increased levels of reactive oxygen species. [64]

Though AMPK induced eNOS has been shown to regulate mTORC1 in endothelium. Unlike the other cell type in endothelium eNOS induced mTORC1 and this pathway is required for mitochondrial biogenesis. [65]

Stem cells Edit

Conservation of stem cells in the body has been shown to help prevent against premature aging. [66] mTORC1 activity plays a critical role in the growth and proliferation of stem cells. [67] Knocking out mTORC1 results in embryonic lethality due to lack of trophoblast development. [68] Treating stem cells with rapamycin will also slow their proliferation, conserving the stem cells in their undifferentiated condition. [67]

mTORC1 plays a role in the differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Its upregulation has been shown to cause premature aging in hematopoietic stem cells. Conversely, inhibiting mTOR restores and regenerates the hematopoietic stem cell line. [69] The mechanisms of mTORC1's inhibition on proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells has yet to be fully elucidated. [70]

Rapamycin is used clinically as an immunosuppressant and prevents the proliferation of T cells and B cells. [71] Paradoxically, even though rapamycin is a federally approved immunosuppressant, its inhibition of mTORC1 results in better quantity and quality of functional memory T cells. mTORC1 inhibition with rapamycin improves the ability of naïve T cells to become precursor memory T cells during the expansion phase of T cell development . [72] This inhibition also allows for an increase in quality of these memory T cells that become mature T cells during the contraction phase of their development. [73] mTORC1 inhibition with rapamycin has also been linked to a dramatic increase of B cells in old mice, enhancing their immune systems. [69] This paradox of rapamycin inhibiting the immune system response has been linked to several reasons, including its interaction with regulatory T cells. [73]

Activators Edit

Resistance exercise, the amino acid L -leucine, and beta-hydroxy beta-methylbutyric acid (HMB) are known to induce signaling cascades in skeletal muscle cells that result in mTOR phosphorylation, the activation of mTORC1, and subsequently the initiation of myofibrillar protein synthesis (i.e., the production of proteins such as myosin, titin, and actin), thereby facilitating muscle hypertrophy.

The NMDA receptor antagonist ketamine has been found to activate the mTORC1 pathway in the medial prefrontal cortex (mPFC) of the brain as an essential downstream mechanism in the mediation of its rapid-acting antidepressant effects. [74] NV-5138 is a ligand and modulator of sestrin2, a leucine amino acid sensor and upstream regulatory pathway of mTORC1, and is under development for the treatment of depression. [74] The drug has been found to directly and selectively activate the mTORC1 pathway, including in the mPFC, and to produce rapid-acting antidepressant effects similar to those of ketamine. [74]

Inhibitors Edit

There have been several dietary compounds that have been suggested to inhibit mTORC1 signaling including EGCG, resveratrol, curcumin, caffeine, and alcohol. [75] [76]

First generation drugs Edit

Rapamycin was the first known inhibitor of mTORC1, considering that mTORC1 was discovered as being the target of rapamycin. [77] Rapamycin will bind to cytosolic FKBP12 and act as a scaffold molecule, allowing this protein to dock on the FRB regulatory region (FKBP12-Rapamycin Binding region/domain) on mTORC1. [78] The binding of the FKBP12-rapamycin complex to the FRB regulatory region inhibits mTORC1 through processes not yet known. mTORC2 is also inhibited by rapamycin in some cell culture lines and tissues, particularly those that express high levels of FKBP12 and low levels of FKBP51. [79] [80] [81]

Rapamycin itself is not very water soluble and is not very stable, so scientists developed rapamycin analogs, called rapalogs, to overcome these two problems with rapamycin. [82] These drugs are considered the first generation inhibitors of mTOR. [83] These other inhibitors include everolimus and temsirolimus. Compared with the parent compound rapamycin, everolimus is more selective for the mTORC1 protein complex, with little impact on the mTORC2 complex. [84] mTORC1 inhibition by everolimus has been shown to normalize tumor blood vessels, to increase tumor-infiltrating lymphocytes, and to improve adoptive cell transfer therapy. [85]

Sirolimus, which is the drug name for rapamycin, was approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) in 1999 to prevent against transplant rejection in patients undergoing kidney transplantation. [86] In 2003, it was approved as a stent covering for widening arteries to prevent against future heart attacks. [87] In 2007, mTORC1 inhibitors began being approved for treatments against cancers such as renal cell carcinoma. [88] In 2008 they were approved for treatment of mantle cell lymphoma. [89] mTORC1 inhibitors have recently been approved for treatment of pancreatic cancer. [90] In 2010 they were approved for treatment of tuberous sclerosis. [91]

Second generation drugs Edit

The second generation of inhibitors were created to overcome problems with upstream signaling upon the introduction of first generation inhibitors to the treated cells. [92] One problem with the first generation inhibitors of mTORC1 is that there is a negative feedback loop from phosphorylated S6K, that can inhibit the insulin RTK via phosphorylation. [93] When this negative feedback loop is no longer there, the upstream regulators of mTORC1 become more active than they would otherwise would have been under normal mTORC1 activity. Another problem is that since mTORC2 is resistant to rapamycin, and it too acts upstream of mTORC1 by activating Akt. [82] Thus signaling upstream of mTORC1 still remains very active upon its inhibition via rapamycin and the rapalogs. Rapamycin and its analogues also have procoagulant side effects caused by off-target binding of the activated immunophilin FKBP12, which are not produced by structurally unrelated inhibitors of mTORC such as WYE-687 and XL-388. [94]

Second generation inhibitors are able to bind to the ATP-binding motif on the kinase domain of the mTOR core protein itself and abolish activity of both mTOR complexes. [92] [95] [96] [97] In addition, since the mTOR and the PI3K proteins are both in the same phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase (PIKK) family of kinases, some second generation inhibitors have dual inhibition towards the mTOR complexes as well as PI3K, which acts upstream of mTORC1. [82] As of 2011, these second generation inhibitors were in phase II of clinical trials.

Third generation drugs Edit

The third generation of inhibitors were created following the realization that many of the side effects of rapamycin and rapamycin analogs were mediated not as a result of direct inhibition of mTORC1, but as a consequence of off-target inhibition of mTORC2. [98] [99] Rapamycin analogs such as DL001, that are more selective for mTORC1 than sirolimus, have been developed and in mice have reduced side effects. [100] mTORC1 inhibitors that have novel mechanisms of action, for example peptides like PRAS40 and small molecules like HY-124798 (Rheb inhibitor NR1), which inhibit the interaction of mTORC1 with its endogenous activator Rheb, are also being developed. [101] [102] Some glucose transporter inhibitors such as NV-5440 and NV-6297 are also selective inhibitors of mTORC1 [103]

There have been over 1,300 clinical trials conducted with mTOR inhibitors since 1970. [104]


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The answer is both, the regulatory light chains , regulate myosin by phosphorylation which can be dependent or independent of $ce$.

The activity of the myosin regulatory light chain is in turn regulated through phosphorylation by $ce$ -dependent and $ce$ -independent kinases.

Source claiming calcium is essential for phosphorylation in tarantula skeletal muscle:

Contraction is modulated in many striated muscles by $ce$-calmodulin dependent phosphorylation of the myosin regulatory light chain (RLC) by myosin light chain kinase.

Calcium independent phosphorylation of regulatory protein by MLCK4:

We find that MLCK4 is also expressed abundantly in cardiac muscle, and structural analyses indicate that it is a $ce$/calmodulin (CaM)-independent kinase, in contrast to $ce$/CaM-stimulated cMLCK.