Em formação

O siRNA pode induzir a metilação do DNA em células de mamíferos?


Alguns anos atrás, Hiroaki Kawasaki e Kazunari Taira publicaram um artigo chamado "Indução de metilação de DNA e silenciamento de genes por pequenos RNAs interferentes em células humanas" na Nature:

Em plantas, dsRNAs direcionados a ilhas CpG dentro de um promotor também podem induzir metilação de DNA dirigida por RNA3, 4, 5, 6, 7, 8; no entanto, ainda não está claro se o silenciamento do gene mediado pela metilação do DNA pode ser induzido por dsRNAs em células de mamíferos. Aqui, demonstramos que pequenos RNAs de interferência (siRNAs; moléculas de RNA de 21-25 nucleotídeos) induzem metilação de DNA e metilação de histona H3 em células humanas.

Este artigo parecia mostrar que o siRNA também pode induzir o silenciamento de longo prazo de genes por metilação do DNA em células de mamíferos, o que não foi observado anteriormente. Infelizmente, o artigo foi retirado mais tarde, colocando os resultados em questão.

Achei o trabalho muito empolgante na época, pois sugeria a possibilidade de fazer terapia gênica, para silenciar genes específicos, apenas usando RNA de interferência.

Qual é o consenso científico atual aqui, há alguma evidência convincente de que a metilação do DNA induzida por siRNA é possível em células de mamíferos? Alguém conseguiu reproduzir os resultados de Kawasaki e Taira?


A partir de uma breve pesquisa da literatura, parece que Kawasaki e Taira foram amplamente reivindicados pela comunidade antes e depois de seu artigo. A retratação foi apenas de Taira, Kawasaki recusou-se a co-assinar por manter os dados válidos. Pela retratação, parece que o motivo da retratação foi um livro de laboratório perdido.

Antes do artigo Kawasaki e Taiga, já havia vários outros artigos descrevendo a modificação epigenética induzida por RNAi em mamíferos:

Depois, houve outro artigo da Kawasaki & Taira no ano seguinte, que não foi retirado:

E parece que agora a ideia é geralmente aceita e apoiada por alguns outros estudos, principalmente olhando para células germinativas. Por exemplo:

Não há nenhuma revisão que eu possa encontrar que realmente ligue tudo de forma convincente, mas existem várias revisões sobre histona dirigida por RNAi e modificação da cromatina em geral que mencionam que o fato está agora estabelecido em mamíferos:

  • Joshua-Tor, L. & Hannon, G.J. (2010) Ancestral Roles of Small RNAs: An Ago-Centric Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology.

  • Volpe, T. & Martienssen, R.A. (2011) RNA Interference and Heterochromatin Assembly. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9).


Fundo

A metilação da citosina do DNA é um processo antigo, encontrado tanto em procariotos quanto em eucariotos, e catalisado por uma única família de metiltransferases [1]. Em procariotos, as citosina-5 metiltransferases protegem os locais alvo da clivagem por endonucleases de restrição parceiras, mas em eucariotos, a função da metilação do DNA é menos clara. Em organismos que retêm a metilação do DNA, incluindo plantas, a maioria dos animais e alguns fungos, foi especulado que a metilação do DNA fornece imunidade genômica contra elementos móveis [2, 3]. Esta hipótese tem sido difícil de testar em vertebrados, porque a maioria dos dinucleotídeos CG são fortemente metilados nas regiões gênicas e intergênicas [4]. Em fungos e plantas, no entanto, a natureza localizada da metilação do DNA torna possível identificar as sequências que são direcionadas para a metilação do DNA. Por exemplo, em Neurospora, A metilação do DNA ocorre em sequências repetidas que são direcionadas para mutação pontual [5]. Nas plantas, os elementos transponíveis são fortemente metilados em relação às regiões gênicas, sugerindo que o silenciamento que acompanha a metilação do DNA é um meio de defesa contra a transposição [3, 6, 7]. Uma forma adicional de metilação do DNA é encontrada na planta modelo Arabidopsis, onde aglomerados curtos e densos de metilação de CG são ocasionalmente encontrados em regiões gênicas que, de outra forma, são desprovidas de metilação [8].

Embora muitos alvos de metilação do DNA sejam conhecidos, não está claro como esses locais são reconhecidos pelas metiltransferases de DNA. A subfamília Dnmt3 de DNA metiltransferases, que inclui Arabidopsis DRM1 e DRM2, podem metilar de novo [9], mas não existem sequências conhecidas em comum entre os locais-alvo. Trabalho recente em Arabidopsis implicou a pequena maquinaria de RNA interferente (si) no direcionamento de novo metilação [10-12], e um grande número de siRNAs dirigidos por transposon foram sequenciados [13, 14], no entanto, o mecanismo pelo qual a produção de siRNA leva a de novo A metilação do DNA não é conhecida. Outra questão em aberto é como algumas formas de metilação do DNA são mantidas durante as rodadas de divisão celular. No caso de locais de CG, um membro da subfamília Dnmt1 de metiltransferases de DNA mantém metilação por metilação especificamente de locais hemi-metilados atrás do garfo de replicação [15], mas em casos de metilação não CG, não parece ser comparável reação. Metilação não CG em Neurospora é mantida pela ação de uma histona H3 lisina-9 (H3K9) metiltransferase [5], então a ação sucessiva de uma histona metiltransferase e uma DNA metiltransferase é suficiente para manter a metilação indefinidamente. Um mecanismo de manutenção semelhante ocorre para sites de CNG em Arabidopsis, onde a metiltransferase KRYPTONITE (KYP = SUVH4) H3K9 dirige a metilação pela metiltransferase CROMOMETHYLASE3 (CMT3) CNG [16, 17]. Essas descobertas levaram a um modelo geral em que os siRNAs direcionam de novo metilação por DRM1 e DRM2, sítios CG são mantidos pelo ortólogo Dnmt1, MET1 e sítios CNG são mantidos pela ação sucessiva de KYP e CMT3 [10, 18].

Esses insights sobre os mecanismos de metilação do DNA foram obtidos usando sistemas repórter sensíveis escolhidos porque eles exibem fenótipos de silenciamento epigenético marcantes [18]. Como resultado, eles não foram projetados para revelar o espectro de locais-alvo atuados por essas várias vias de metilação do DNA. Uma abordagem alternativa é olhar para um grande número de locais para mudanças nos níveis de metilação quando mutações em vários componentes do silenciamento epigenético são introduzidas. Em trabalhos anteriores, usamos um método baseado em microarray para criar perfis de padrões de metilação para detectar mudanças que ocorrem em um cmt3 linha mutante [7]. Esta análise revelou hipometilação de um subconjunto de locais escolhidos aleatoriamente. Este subconjunto foi enriquecido em sequências derivadas de transposon, consistentes com a metilação do DNA desempenhando um papel na defesa do genoma contra elementos transponíveis [7, 19]. A pequena escala da análise não nos permitiu, no entanto, determinar se há preferências por diferentes tipos ou localizações de elementos, como foi sugerido para CMT3 [20].

Aqui, apresentamos uma análise em grande escala dos padrões de metilação em mutantes que estão envolvidos na metilação do CNG. Descobrimos que os alvos CMT3 e KYP são transposons de todos os tipos e mostram uma distribuição ao longo dos cromossomos que é semelhante à da maioria dos elementos do genoma. Em contraste, encontramos relativamente poucos alvos DRM e AGO4 espalhados pelos cromossomos, e estes são significativamente enriquecidos em pequenas sequências derivadas de transposon isoladas. Nossos resultados sugerem um papel especial para a metilação do DNA dirigida por RNA no silenciamento de elementos móveis que estão espalhados ao longo dos braços dos cromossomos.


Metilação e mutação de DNA

A 5-metilcitosina (5mC) no DNA é produzida por modificação pós-sintética de resíduos de citosina e ocorre principalmente em dupletos CpG no genoma de mamíferos. 5mC é um sítio mutável, pois pode sofrer desaminação espontânea em timina. Existe um mecanismo de reparo que reconhece especificamente os pares errados de G.T e substitui a timina pela citosina. No entanto, esse reparo não é totalmente eficiente, porque a mutação de transição 5mC - & gtT ocorre cerca de 10 vezes mais frequentemente do que outras transições. Essas mutações são frequentemente vistas em doenças hereditárias, e as mutações no gene p53 em tumores também são muito comuns em dupletos 5mCpG. Assim como as mutações, também pode haver alterações hereditárias na metilação do DNA, conhecidas como epimutações, que podem ter um significado particular nas células somáticas. Enquanto o padrão de metilação do DNA é muito constante para qualquer tipo de célula, o padrão se torna muito variável nas células tumorais. A quebra dos controles normais de metilação do DNA na tumorigênese pode levar ao aumento da expressão do gene ou ao silenciamento do gene. O dano ao DNA aumenta não apenas a mutação, mas também as mudanças hereditárias na metilação. Atualmente, pouco se sabe sobre a capacidade de reparo do DNA em preservar o padrão normal de metilação em células somáticas.


3. miRNAs em TGS

Os miRNAs são uma classe bem caracterizada de moléculas curtas de RNA envolvidas na regulação de alvos de mRNA no nível pós-transcricional [11]. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de que os miRNAs também regulem seus alvos no nível transcricional. Na verdade, Kim et al. [47] descreveu esse papel para miR-320, que é codificado dentro da região promotora de seu gene proximal POLR3D. A inibição deste miRNA em cultura de tecido levou à regulação positiva do gene POLR3D, e o silenciamento de POLR3D pelo miR-320 provavelmente ocorreu no nível transcricional [47].

Um estudo mais convincente investigou o papel de AGO2 e miRNAs em TGS durante a senescência celular [48]. Os autores compararam a localização da cromatina em todo o genoma das proteínas Argonaute em células pré-senescentes e senescentes. As regiões genômicas ligadas por proteínas Argonaute em células senescentes corresponderam aos promotores de genes regulados negativamente pelo complexo de retinoblastoma durante a senescência celular [48]. Foi demonstrado que durante a senescência celular AGO2 foi localizado no núcleo e sua ligação a alguns promotores reprimidos por retinoblastoma correlacionada com um aumento nos níveis de H3K9me e H3K27me e uma redução na metilação da lisina 4 na histona H3 (H3K4me) nestes promotores [48 ] Por outro lado, após o knock-down de AGO2, foi observada uma redução nos níveis de H3K27me e a reativação dos genes alvo [48]. Curiosamente, a superexpressão de AGO2 em células pré-senescentes induziu uma parada proliferativa com características de senescência [48]. Notavelmente, o sequenciamento profundo de miRNAs associados ao Argonaute durante a senescência celular revelou alguns miRNAs candidatos que podem atuar no recrutamento de AGO2 para os promotores dos genes alvo [48]. Um gene alvo de AGO2 parece ser reprimido por let-7 Família de miRNAs direcionados à sequência do promotor, o que abre a possibilidade de que outros miRNAs possam regular genes alvo no nível transcricional em condições fisiológicas específicas [48]. Por último, um artigo recente demonstrou que um parálogo humano das proteínas GW182, que desempenham um papel importante no silenciamento gênico mediado por miRNA, pode se translocar para o núcleo, onde pode interagir com AGO2 e miRNAs [49]. Portanto, há uma crescente validação experimental para a possibilidade de miRNA funcionar no núcleo.


Materiais e métodos

Nomenclatura

Na nomenclatura recentemente atualizada (Wierzbicki et al, 2008), Pol IVa e Pol IVb são renomeados como Pol IV e Pol V, respectivamente. As maiores subunidades de Pol IV e Pol V, anteriormente denominadas NRPD1a e NRPD1b, foram renomeadas NRPD1 e NRPE1, respectivamente. A segunda maior subunidade compartilhada, anteriormente NRPD2a, tem o nome sinônimo NRPD2a / NRPE2a.

Mutantes

Usamos o seguinte Arabidopsis thaliana mutantes neste estudo: rdr2-1 (SAIL_1277H08 Xie et al, 2004 ), rdr6-1 (Elmayan et al, 1998 ), nrpd1-7 (anteriormente nrpd1a-7) (Smith et al, 2007 ), atrás4-1 (Zilberman et al, 2003) e dcl3-1 (SALK_005512 Xie et al, 2004). Todos os mutantes estão no ecótipo Columbia (Col-0), com exceção de atrás4-1, que está na linha Landsberg erecta. Os mutantes foram genotipados usando primers listados na Tabela Suplementar 2. Genótipos de rdr2 e rdr6 as plantas foram confirmadas testando a presença de siRNA02 e tasiRNA255, respectivamente (Figura 2). Além disso, o nrpd1-7 e atrás4-1 as mutações foram confirmadas pelo sequenciamento do respectivo gene no DNA isolado das plantas genotipadas.

Isolamento de RNA pequeno e análise de Northern blot

RNAs pequenos foram isolados de mudas ou inflorescências agrupadas de 21 dias de idade usando o kit de isolamento mirVana miRNA (Ambion) e analisados ​​por hibridização Northern blot de acordo com procedimentos publicados (Kanno et al, 2005 Huettel et al, 2006). Para obter plantas suficientes do genótipo adequado para rdr2, rdr6 e nrpd1 mutantes e seus irmãos do tipo selvagem, usamos plantas da geração F3. Para o atrás4-1 mutante, usamos plantas da geração F2. Usamos oligonucleotídeos marcados nas extremidades para detectar siRNA1003 (de repetições de 5S rDNA), siRNAs de repetições de rDNA 45S, tasiRNA 255 e siRNA02. Usamos oligonucleotídeos LNA (ácido nucleico bloqueado) marcados na extremidade para detectar siRNAs de Marcação2 e SENTADO5. Uma ribossonda foi usada para detectar siRNAs do LTR solo (Huettel et al, 2006). As informações do primer para sondas específicas são mostradas na Tabela Suplementar 2.

Análise de RNA nascente

Para detectar RNAs nascentes, o RNA total foi isolado de inflorescências florais misturadas usando Trizol (Invitrogen). Um cDNA foi sintetizado de acordo com as instruções do fabricante usando um kit First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) usando um oligonucleotídeo d (T) primer e 1 μg de RNA total. Os primers são mostrados na Tabela Suplementar 2. Esses primers detectam uma porção do transcrito nascente começando diretamente a jusante da região intensificadora alvo e se estendendo até o final do GFP região de codificação (ver o conjunto 'iniciador verde' na Figura Suplementar 1 de Kanno et al, 2008 ).

Seqüenciamento de bissulfito

Isolamos DNA genômico de folhas de roseta usando um kit DNeasy Plant Maxi (Qiagen). O tratamento do DNA com bissulfito foi conduzido usando um kit EpiTect Bisulphite (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante com várias modificações como segue. O DNA genômico foi pré-digerido com HindIII e 500 ng do DNA foram tratados na solução de reação contendo 35 μl do tampão de proteção do DNA. Após incubação por 2 min a 95 ° C, oito ciclos dessas condições de termociclador foram realizados: por 1 min a 95 ° C e por 2 h a 75 ° C. Os primers são mostrados na Tabela Suplementar 2. Como um controle para a conversão completa do bissulfito, o exon 15 do PHAVOLUTA locus que carece de citosinas metiladas no tipo selvagem foi usado (Bao et al, 2004 Reinders et al, 2008). Pelo menos cinco clones foram sequenciados de cada controle mutante e de tipo selvagem. Conversão bissulfito do PHAVOLUTA a sequência variou em todos os casos entre 99 e 100%. Dados originais do potenciador de alvo nos vários mutantes e o Tag2 seqüência em dcl3-5 são mostrados na Figura Suplementar 4.

Dados suplementares

Dados suplementares estão disponíveis em The EMBO Journal Online (http://www.embojournal.org).


4. DISCUSSÃO

O processo de subclonagem e a espera resultante para que as células individuais se expandam o suficiente para serem transferidas para recipientes de cultura maiores é uma das etapas de limitação de velocidade e tempo no desenvolvimento da linha celular que é difícil de acelerar. A subclonagem é estressante, conforme documentado pelo baixo número de colônias em crescimento e, em muitos casos, pela necessidade de suplementar proteínas de suporte, hormônios e fatores de crescimento. Um estudo recente revelou que um dos principais contribuintes para esse estresse é a ausência de comunicação célula a célula e, possivelmente, a falta de proteínas e outros sinais celulares no ambiente de cultura. [59] As células CHO vêm de um organismo onde estão acostumadas a estar em contato e comunicação constantes com outras células e tecidos, e onde uma rede contínua de sinais está sendo transmitida para estimulá-los e apoiá-los. [50] No ambiente usual de cultura em suspensão, onde as células estão presentes em grande número, essa rede de comunicação é gerada pelas próprias células que secretam proteínas e outras ferramentas de comunicação, como exossomos. Durante a subclonagem, tudo isso está faltando, o que possivelmente coloca as células sob estresse.

Apesar desse estresse e dos longos prazos exigidos para a subclonagem, ela tem sido uma parte padrão de todas as plataformas de desenvolvimento de linha celular nos últimos 30 anos. Inventado para a tecnologia de hibridoma, [25] onde era uma parte essencial da geração de linhas celulares que produzem anticorpos com sítios de ligação únicos, mais tarde foi usado também para tecnologia de linha celular recombinante, onde a singularidade do produto foi dada em qualquer caso pelo usou o plasmídeo que foi transfectado. No entanto, a técnica teve sua vantagem, pois durante a transfecção e seleção, uma ampla gama de produtividades foi gerada nas células dentro de uma população, onde os grandes produtores podem ter uma desvantagem de crescimento significativa e, portanto, poderiam ser superados por não ou baixos produtores. . [67] Nos anos posteriores, o foco principal de garantir a monoclonalidade era manter a estabilidade e a qualidade reproduzível do produto. Isso foi baseado na suposição de que um subclone é genomicamente mais homogêneo do que um pool de células, [60] embora vários estudos tenham mostrado que os subclones de um subclone são tão genomicamente diversos quanto os subclones do pai. [3, 9, 11, 55] Com relação aos fenótipos, já estava bem estabelecido que há alta diversidade com relação à taxa de crescimento e produtividade específica em subclones gerados a partir de uma linha celular já subclonada. [24, 42, 49, 53]

Com base nos resultados aqui apresentados, parece que, sem o conhecimento, mas empiricamente bem-sucedido, o próprio processo de subclonagem fez uma contribuição significativa para nossa capacidade de isolar células raras com propriedades excelentes ao longo dos milhares de programas de triagem de células realizados durante os últimos 30 anos. Se o isolamento das células e o consequente estresse induzido por este isolamento, iniciar um programa celular que altera ativamente o padrão de metilação do DNA das células, aleatoriamente, mas possivelmente com uma preferência por regiões regulatórias que causarão mudanças sutis nos padrões de expressão gênica, então estes mudanças sutis, além de permitir que as células sobrevivam e se expandam durante a subclonagem, também podem ter efeitos adventícios que alteram outras características fenotípicas, como crescimento e produtividade, conforme observado nos estudos mencionados acima. Os dados apresentados aqui apoiariam tal hipótese, embora a prova definitiva exigirá uma compreensão detalhada dos mecanismos que as células usam para atingir tais mudanças em seu padrão de metilação. Tem sido freqüentemente proposto que dentro de cada população de células CHO diferentes variantes estão presentes e que durante a subclonagem alguém simplesmente isola uma dessas variantes já existentes. No entanto, nossos resultados indicam que, em vez disso, o epigenoma é alterado ativamente pelas próprias células. Com foco em citosinas completamente metiladas nas linhas parentais, cada um dos seis subclones sequenciados tinha um conjunto único de citosinas que foram diferencialmente metiladas após a subclonagem. Dada a cobertura na linha parental (35x), se houvesse alguma célula presente na população parental com um estado de metilação diferente, ela deveria estar presente em menos de 3% da população. Como esse padrão foi encontrado em um grande número de sites, muitos deles exclusivos para subclones individuais, é altamente improvável que precisamente essas combinações exclusivas já estivessem presentes na população original como variantes raras. Se apenas essas células tivessem sido capazes de crescer fora da população principal, a eficiência de subclonagem também teria que ser inferior a 3%, onde na realidade está normalmente na faixa de 30% a 70%. Portanto, sugerimos que nossos resultados suportam a hipótese de que esses novos padrões de metilação foram ativamente gerados pelas células em resposta ao estresse causado pelo isolamento durante o próprio processo de subclonagem. [59]

Uma questão importante neste contexto é em que estágio esse processo de remetilação ocorre e por quanto tempo ele dura. Nos novos subclones, uma parte notável do novo padrão de metilação foi novamente uniforme em toda a população, com 3% -9% totalmente metilado ou não metilado. Além disso, 8% a 15% dos Cs foram metilados em 50% das leituras. O status de 50% de metilação pode ser causado por um alelo sendo homogeneamente metilado e um alelo sendo desmetilado em cada célula individual, ou pela presença na população de 50% de células que têm ambos os alelos metilados e 50% com ambos os alelos desmetilados, ou qualquer mistura dos mesmos que estatisticamente resulta em 50% das leituras sendo metiladas ou não. No primeiro caso, junto com todos os sítios C que mudaram seu estado de metilação em 100% da população, é provável que a mudança tenha ocorrido no estado de uma única célula durante a subclonagem, antes que a primeira divisão da célula no poço ocorresse , resultando assim em um resultado homogêneo.

Seria, portanto, uma resposta imediata ao processo de subclonagem e ao estresse concomitante de não haver comunicação com outras células. Também pode ser o primeiro passo necessário para colocar as células em forma para a divisão. É provável, no entanto, que a busca por um novo padrão de transcriptoma adequado que permita o crescimento em condições solitárias continuou pelo menos por algum tempo durante as divisões subsequentes, já que os Cs diferencialmente metilados restantes não são uniformemente metilados, mas têm níveis relativos de metilação que variam de 0,1 a 0,9 (Figura 5).

Um olhar mais atento sobre o transcriptoma diferencial dos 6 clones fornece indicações de quais células precisam para permitir que cresçam mais do que colônias de células únicas. Embora a maioria dos genes DE e também as vias enriquecidas sejam únicos (como seria de se esperar se as mudanças acima mencionadas na epigenética fossem aleatórias), também há alguns que se sobrepõem entre todos os subclones. Isso inclui o crescimento celular, a progressão do ciclo celular e as interações célula-célula e, portanto, são vias plausíveis que permitem o crescimento em novos clones. Eles também se alinham bem com as vias identificadas em um estudo recente para apoiar o crescimento clonal mais eficiente em linhas de células selecionadas para esta propriedade. [59] De interesse, em vista do conhecido efeito da subclonagem para estabilizar e "rejuvenescer" as células, é a regulação diferencial de vias e genes relacionados ao reparo do DNA.

Um olhar detalhado sobre onde no genoma essas mudanças ocorreram revela um forte enriquecimento para regiões que estão sendo transcritas ativamente (conforme definido pelas anotações de estado da cromatina que são baseadas em marcas de histonas encontradas) - aparentemente, essas regiões estão sendo isentas de mudanças em metilação. Outras regiões, como estados de cromatina quiescente ou silenciada, e também, surpreendentemente, regiões promotoras, não são afetadas, embora haja um forte enriquecimento para metilação diferencial em regiões em torno do local de início da transcrição e em estados reguladores e potenciadores. A ausência de mudanças na metilação do promotor explica a pouca sobreposição observada entre genes expressos diferencialmente e promotores metilados diferencialmente. Juntos, isso indicaria que os fenótipos são controlados principalmente pela regulação da força de expressão de um determinado painel de genes, ao invés do desligamento completo de genes ou ativação de outros que foram previamente silenciados. No entanto, para além da função conhecida da metilação do promotor como um interruptor ON / OFF para a expressão do gene, os mecanismos exatos e dependências entre a metilação do DNA, a regulação do gene e o seu contexto local, em particular no que diz respeito às regiões potenciadoras, permanecem na sua maioria não esclarecidos. [1, 47]

A ressalva sobre esses resultados é que os estados de cromatina usados ​​foram determinados para células CHO de linhagem diferente da usada neste estudo, embora cultivadas nas mesmas condições e no mesmo meio, de modo que a cromatina está presente na linha celular atual. pode ser diferente em algumas regiões genômicas. Uma pesquisa recentemente realizada internamente de transcriptomas publicados para uma variedade de células CHO revelou, no entanto, que as diferenças entre a maioria das linhas celulares e subclones ou pontos de tempo estão nos níveis de expressão individuais dos genes. A lista de genes que são expressos em diferentes tipos de células é bastante comparável, com apenas alguns genes expressos exclusivamente em algumas linhagens ou estados, e esses normalmente encontrados em contagens de leitura baixas (resultados não publicados). Assim, esperamos que a maioria dos estados de cromatina usados ​​sejam atribuídos corretamente também para a linha celular usada neste estudo.

Em conclusão, apresentamos aqui dados que mostram que, durante o processo de subclonagem, o padrão de metilação do DNA de células em crescimento é alterado de forma aleatória para gerar novos epigenomas e transcriptomas nos subclones resultantes. Este processo parece ser causado pelas células ativando um mecanismo ainda desconhecido para alterar ativa e aleatoriamente seu padrão de metilação do DNA, resultando em padrões novos e únicos que não estavam presentes na população parental. Essas alterações contribuem para a geração de novos e diversos fenótipos nos subclones obtidos e, dessa forma, também apóiam a triagem de clones de produção com melhor desempenho em bioprocessamento. Devido ao fato de que os padrões de metilação do DNA são copiados durante a divisão e, portanto, passados ​​para as células-filhas, os novos padrões assim obtidos e fenótipos associados são então estáveis ​​dentro da nova população de subclones, pelo menos por um tempo, possivelmente até que sejam novamente modificados devido ao surgimento de alguma outra situação de estresse que requer novamente uma modificação do transcriptoma.


Proteínas PcG, metilação de DNA e repressão gênica por looping de cromatina

Muitos genes hipermetilados e silenciados epigeneticamente em cânceres adultos são do grupo Polycomb (PcG) marcados em células-tronco embrionárias (ES). Mostramos que uma grande região a montante (aproximadamente 30 kb) e estendendo-se por aproximadamente 60 kb em torno de um tal gene, GATA-4, é organizada em células de carcinoma embrionário indiferenciado (EC) Tera-2 em uma conformação multi-loop topologicamente complexa que é formada por várias regiões de contato interno de longo alcance perto de áreas enriquecidas para EZH2, outras proteínas PcG e a marca de histona PcG de assinatura, H3K27me3. A depleção de EZH2 mediada por RNA interferente pequeno (siRNA) em células Tera-2 indiferenciadas leva a uma redução significativa na frequência de associações de longo alcance no locus GATA-4, aparentemente dependente de afetar os enriquecimentos H3K27me3 em torno dessas regiões da cromatina, acompanhada por um aumento modesto na transcrição de GATA-4. As alças de cromatina se dissolvem completamente, acompanhadas pela perda de proteínas PcG e marcas H3K27me3, quando as células Tera-2 recebem sinais de diferenciação que induzem um aumento de aproximadamente 60 vezes na expressão de GATA-4. Em células de câncer de cólon, no entanto, a frequência das interações de longo alcance são aumentadas em um cenário onde GATA-4 não tem transcrição basal e as alças abrangem várias ilhas CpG anormalmente hipermetiladas de DNA e a proteína de ligação de metil-citosina MBD2 está localizada a essas ilhas CpG, incluindo aquelas próximas ao promotor do gene. A remoção da metilação do DNA por meio do rompimento genético das metiltransferases de DNA (células DKO) leva à perda de ocupação de MBD2 e a uma diminuição na frequência de contatos de longo alcance, de forma que agora estes se assemelham mais aos de células Tera-2 indiferenciadas. Nossos resultados revelam semelhanças inesperadas na conformação da cromatina de ordem superior entre células-tronco / precursoras e cânceres adultos. Também fornecemos uma nova visão de que as regiões ocupadas com PcG e enriquecidas com H3K27me3 podem formar laços de cromatina e interagir fisicamente em cis em torno de um único gene em células de mamíferos. As alças se associam a um estado de baixa transcrição estável nas células EC e, com a adição de metilação do DNA, a transcrição completamente reprimida em células cancerosas adultas.

Declaração de conflito de interesse

Interesses competitivos. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Bonecos

Figura 1. As interações da cromatina de longo alcance em ...

Figura 1. As interações da cromatina de longo alcance no GATA- 4 Locus em células EC indiferenciadas, ...

Figura 2. A frequência da cromatina de longo alcance ...

Figura 2. A frequência das interações da cromatina de longo alcance no GATA- 4 Locus Correlaciona com ...

Figura 3. Proteínas PcG e H3K27 Associado ...

Figura 3. Proteínas PcG e marcas H3K27 associadas ocupam amplos domínios de cromatina em todo o GATA-…

Figura 4. Knockdown mediado por siRNA de EZH2 em ...

Figura 4. Knockdown mediado por siRNA de EZH2 em células Tera-2 indiferenciadas prejudica associações de longo alcance no ...

Figura 5. Várias ilhas CpG espalhadas ao longo de ...

Figura 5. Várias ilhas CpG espalhadas ao longo do GATA- 4 locus são metilados em HCT116 ...

Figura 6. Um modelo de como ...

Figura 6. Um modelo de como as conformações de cromatina espacial observadas podem ser visualizadas ao redor de ...


Biologia Celular Capítulo 20

A) RNA envolvido na inativação do cromossomo X
B) genes que são transcritos e traduzidos continuamente em uma célula
C) RNA que direciona proteínas Cas para DNA complementar
D) RNA que se combina com o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC)
E) sequências que, quando metiladas, podem silenciar a expressão gênica
F) mecanismo de controle transcricional comum para vias biossintéticas procarióticas
G) elementos de controle distal envolvidos na regulação da transcrição
H) Sequências de RNA que ligam pequenas moléculas
I) elementos de controle proximal envolvidos na regulação da transcrição
J) fatores de transcrição que controlam a transcrição de genes importantes para o desenvolvimento

2) proteínas homeóticas - J) fatores de transcrição que controlam a transcrição de genes importantes para o desenvolvimento

3) RNA Xist - A) RNA envolvido na inativação do cromossomo X

4) repressão do produto final - F) mecanismo de controle transcricional comum para vias biossintéticas procarióticas

5) silenciadores e intensificadores - G) elementos de controle distal envolvidos na regulação da transcrição

6) riboswitches - H) Sequências de RNA que ligam pequenas moléculas

7) crRNA-C) RNA que direciona proteínas Cas para DNA complementar

8) genes constitutivos - B) genes que são transcritos e traduzidos continuamente em uma célula

9) Ilhas CpG - E) sequências que, quando metiladas, podem silenciar a expressão gênica

10) Caixas GC e CAAT - I) elementos de controle proximal envolvidos na regulação da transcrição


Waddington, C. H. (1942). O epigenótipo. Empreendimento, 1, 18–20.

Tost, J. (2008). Epigenética. Norwich: Horizon Scientific Press.

Bassett, A., et al. (2009). O dobramento e desdobramento da cromatina eucariótica. Opinião Atual em Genética e Desenvolvimento, 19, 159–165.

Kouzarides, T. (2007). Modificações da cromatina e sua função. Célula, 128, 693–705.

Nightingale, K. P., O’Neill, L. P., & amp Turner, B. M. (2006). Modificações de histonas: Receptores de sinalização e elementos potenciais de um código epigenético hereditário. Opinião Atual em Genética e Desenvolvimento, 16, 125–136.

Munshi, A., et al. (2009). As modificações das histonas ditam leituras biológicas específicas. Journal of Genetics & amp Genomics, 36, 75–88.

Cedar, H., & amp Bergman, Y. (2009). Ligando metilação de DNA e modificação de histonas: padrões e paradigmas. Nature Reviews Genetics, 10, 295–304.

Bird, A. (2002). Padrões de metilação do DNA e memória epigenética. Genes e desenvolvimento, 16, 6–21.

Illingworth, R. S., & amp Bird, A. P. (2009). Ilhas CpG - "um guia aproximado". FEBS Letters, 583, 1713–1720.

Shen, L., et al. (2007). O perfil de metilação do DNA em todo o genoma revela uma classe de promotores de ilha CpG normalmente metilados. PLoS Genetics, 3, 2023–2036.

Illingworth, R., et al. (2008). Um novo conjunto de ilhas CpG identifica metilação específica de tecido em loci de genes de desenvolvimento. PLoS Biology, 6, e22.

Gardiner-Garden, M., & amp Frommer, M. (1987). Ilhas CpG em genomas de vertebrados. Journal of Molecular Biology, 196, 261–282.

Takai, D., & amp Jones, P. A. (2002). Análise abrangente das ilhas CpG nos cromossomos 21 e 22 humanos. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 99, 3740–3745.

Feltus, F. A., et al. (2006). DNA motifs associated with aberrant CpG island methylation. Genomics, 87, 572–579.

Bock, C., et al. (2006). CpG island methylation in human lymphocytes is highly correlated with DNA sequence, repeats, and predicted DNA structure. PLoS Genetics, 2, e26.

Jia, D., et al. (2007). Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature, 449, 248–251.

Ulrey, C. L., et al. (2005). The impact of metabolism on DNA methylation. Human Molecular Genetics, 14(Spec No 1), R139–147.

Klose, R. J., & Bird, A. P. (2006). Genomic DNA methylation: The mark and its mediators. Trends in Biochemical Sciences, 31, 89–97.

Cheng, X., & Blumenthal, R. M. (2008). Mammalian DNA methyltransferases: A structural perspective. Structure, 16, 341–350.

Sasai, N., & Defossez, P. A. (2009). Many paths to one goal? The proteins that recognize methylated DNA in eukaryotes. International Journal of Developmental Biology, 53, 323–334.

Filion, G. J., et al. (2006). A family of human zinc finger proteins that bind methylated DNA and repress transcription. Molecular and Cellular Biology, 26, 169–181.

Ooi, S. K., & Bestor, T. H. (2008). The colorful history of active DNA demethylation. Cell, 133, 1145–1148.

Barreto, G., et al. (2007). Gadd45a promotes epigenetic gene activation by repair-mediated DNA demethylation. Nature, 445, 671–675.

Morgan, H. D., et al. (2004). Activation-induced cytidine deaminase deaminates 5-methylcytosine in DNA and is expressed in pluripotent tissues: implications for epigenetic reprogramming. The Journal of Biological Chemistry, 279, 52353–52360.

Metivier, R., et al. (2008). Cyclical DNA methylation of a transcriptionally active promoter. Nature, 452, 45–50.

Rai, K., et al. (2008). DNA demethylation in zebrafish involves the coupling of a deaminase, a glycosylase, and gadd45. Cell, 135, 1201–1212.

Jiricny, J., & Menigatti, M. (2008). DNA Cytosine demethylation: Are we getting close? Cell, 135, 1167–1169.

Guibert, S., Forné, T., & Weber, M. (2009). Dynamic regulation of DNA methylation during mammalian development. Epigenomics, 1, 81–98.

Reik, W., Dean, W., & Walter, J. (2001). Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science, 293, 1089–1093.

Lees-Murdock, D. J., & Walsh, C. P. (2008). DNA methylation reprogramming in the germ line. Epigenetics, 3, 5–13.

Fauque, P., et al. (2007). Assisted reproductive technology affects developmental kinetics, H19 imprinting control region methylation and H19 gene expression in individual mouse embryos. BMC Developmental Biology, 7, 116.

Paoloni-Giacobino, A. (2007). Epigenetics in reproductive medicine. Pediatric Research, 61, 51R–57R.

Boissonnas, C. C., et al. (2009). Specific epigenetic alterations of IGF2-H19 locus in spermatozoa from infertile men. European Journal of Human Genetics (no prelo).

Wilkins-Haug, L. (2009). Epigenetics and assisted reproduction. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology, 21, 201–206.

Niemann, H., et al. (2008). Epigenetic reprogramming in embryonic and foetal development upon somatic cell nuclear transfer cloning: Focus on Mammalian Embryogenomics. Reproduction, 135, 151–163.

Fraga, M. F., & Esteller, M. (2007). Epigenetics and aging: The targets and the marks. Trends in Genetics, 23, 413–418.

Geiman, T. M., & Robertson, K. D. (2002). Chromatin remodeling, histone modifications, and DNA methylation-how does it all fit together? Journal of Cellular Biochemistry, 87, 117–125.

Ushijima, T. (2005). Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells. Nature Reviews Cancer, 5, 223–231.

Cameron, E. E., Baylin, S. B., & Herman, J. G. (1999). p15(INK4B) CpG island methylation in primary acute leukemia is heterogeneous and suggests density as a critical factor for transcriptional silencing. Blood, 94, 2445–2451.

Pao, M. M., et al. (2001). The endothelin receptor B (EDNRB) promoter displays heterogeneous, site specific methylation patterns in normal and tumor cells. Human Molecular Genetics, 10, 903–910.

Brinkman, A. B., et al. (2007). DNA methylation immediately adjacent to active histone marking does not silence transcription. Nucleic Acids Research, 35, 801–811.

Yoder, J. A., Walsh, C. P., & Bestor, T. H. (1997). Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends in Genetics, 13, 335–340.

Reik, W., & Walter, J. (2001). Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nature Reviews Genetics, 2, 21–32.

Holmes, R., & Soloway, P. D. (2006). Regulation of imprinted DNA methylation. Cytogenetic and Genome Research, 113, 122–129.

Lewis, A., & Reik, W. (2006). How imprinting centres work. Cytogenetic and Genome Research, 113, 81–89.

Luedi, P. P., et al. (2007). Computational and experimental identification of novel human imprinted genes. Genome Research, 17, 1723–1730.

Kurukuti, S., et al. (2006). CTCF binding at the H19 imprinting control region mediates maternally inherited higher-order chromatin conformation to restrict enhancer access to Igf2. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 103, 10684–10689.

Chow, J., & Heard, E. (2009). X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Current Opinion in Cell Biology, 21, 359–366.

Fraga, M. F., et al. (2005). Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 102, 10604–10609.

Friso, S., et al. (2002). A method to assess genomic DNA methylation using high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry, 74, 4526–4531.

Waterland, R. A., & Jirtle, R. L. (2003). Transposable elements: Targets for early nutritional effects on epigenetic gene regulation. Molecular and Cellular Biology, 23, 5293–5300.

Tang, W. Y., & Ho, S. M. (2007). Epigenetic reprogramming and imprinting in origins of disease. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders, 8, 173–182.

Bollati, V., et al. (2007). Changes in DNA methylation patterns in subjects exposed to low-dose benzene. Cancer Research, 67, 876–880.

Feil, R. (2006). Environmental and nutritional effects on the epigenetic regulation of genes. Mutation Research, 600, 46–57.

Anway, M. D., et al. (2005). Epigenetic transgenerational actions of endocrine disruptors and male fertility. Science, 308, 1466–1469.

Anway, M. D., & Skinner, M. K. (2008). Epigenetic programming of the germ line: Effects of endocrine disruptors on the development of transgenerational disease. Reproductive Bio Medicine Online, 16, 23–25.

Cuzin, F., Grandjean, V., & Rassoulzadegan, M. (2008). Inherited variation at the epigenetic level: Paramutation from the plant to the mouse. Current Opinion in Genetics and Development, 18, 193–196.

Rassoulzadegan, M., et al. (2006). RNA-mediated non-Mendelian inheritance of an epigenetic change in the mouse. Nature, 441, 469–474.

Youngson, N. A., & Whitelaw, E. (2008). Transgenerational epigenetic effects. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 9, 233–257.

Robertson, K. D. (2005). DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics, 6, 597–610.

Eggermann, T. (2009). Silver–Russell and Beckwith–Wiedemann syndromes: Opposite (epi)mutations in 11p15 result in opposite clinical pictures. Hormone Research, 71(Suppl 2), 30–35.

Gurrieri, F., & Accadia, M. (2009). Genetic imprinting: The paradigm of Prader–Willi and Angelman syndromes. Endocrine Development, 14, 20–28.

Jones, P. A., & Baylin, S. B. (2007). The epigenomics of cancer. Cell, 128, 683–692.

Laird, P. W. (2005). Cancer epigenetics. Human Molecular Genetics, 14(Spec No 1), R65–76.

Feinberg, A. P., & Vogelstein, B. (1983). Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature, 301, 89–92.

Ehrlich, M. (2002). DNA methylation in cancer: Too much, but also too little. Oncogene, 21, 5400–5413.

Frigola, J., et al. (2006). Epigenetic remodeling in colorectal cancer results in coordinate gene suppression across an entire chromosome band. Nature Genetics, 38, 540–549.

Stransky, N., et al. (2006). Regional copy number-independent deregulation of transcription in cancer. Nature Genetics, 38, 1386–1396.

Hedenfalk, I., et al. (2001). Gene-expression profiles in hereditary breast cancer. New England Journal of Medicine, 344, 539–548.

Knudson, A. G. (2001). Two genetic hits (more or less) to cancer. Nature Reviews Cancer, 1, 157–162.

Balmain, A., Gray, J., & Ponder, B. (2003). The genetics and genomics of cancer. Nature Genetics, 33(Suppl), 238–244.

Costello, J. F., et al. (2000). Aberrant CpG-island methylation has non-random and tumour-type-specific patterns. Nature Genetics, 24, 132–138.

Goelz, S. E., et al. (1985). Hypomethylation of DNA from benign and malignant human colon neoplasms. Science, 228, 187–190.

Issa, J. P., et al. (2001). Accelerated age-related CpG island methylation in ulcerative colitis. Cancer Research, 61, 3573–3577.

Laird, P. W. (2003). Early detection: The power and the promise of DNA methylation markers. Nature Reviews Cancer, 3, 253–266.

Silva, J. M., et al. (1999). Presence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients: Clinicopathological correlations. Cancer Research, 59, 3251–3256.

Fleischhacker, M., & Schmidt, B. (2007). Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer—a survey. Biochimica et Biophysica Acta, 1775, 181–232.

Tost, J. (2007). Analysis of DNA methylation patterns for the early diagnosis, classification and therapy of human cancers. In T. B. Kobayashi (Ed.), DNA methylation research trends (pp. 87–133). Hauppauge, NY: Nova Science Publishers.

Yoo, C. B., & Jones, P. A. (2006). Epigenetic therapy of cancer: Past, present and future. Nature Reviews Drug Discovery, 5, 37–50.

van Vliet, J., Oates, N. A., & Whitelaw, E. (2007). Epigenetic mechanisms in the context of complex diseases. Cellular and Molecular Life Sciences, 64, 1531–1538.

Abdolmaleky, H. M., et al. (2006). Hypomethylation of MB-COMT promoter is a major risk factor for schizophrenia and bipolar disorder. Human Molecular Genetics, 15, 3132–3145.

Nagarajan, R. P., et al. (2006). Reduced MeCP2 expression is frequent in autism frontal cortex and correlates with aberrant MECP2 promoter methylation. Epigenetics, 1, 172–182.

Jones, J. R., et al. (2008). Hypothesis: Dysregulation of methylation of brain-expressed genes on the X chromosome and autism spectrum disorders. American Journal of Medical Genetics A, 146A, 2213–2220.

Graff, J., & Mansuy, I. M. (2009). Epigenetic dysregulation in cognitive disorders. European Journal of Neuroscience, 30, 1–8.

Balada, E., Ordi-Ros, J., & Vilardell-Tarres, M. (2007). DNA methylation and systemic lupus erythematosus. Annals of the New York Academy of Sciences, 1108, 127–136.

Neidhart, M., et al. (2000). Retrotransposable L1 elements expressed in rheumatoid arthritis synovial tissue: association with genomic DNA hypomethylation and influence on gene expression. Arthritis and Rheumatism, 43, 2634–2647.

Prescott, S. L., & Clifton, V. (2009). Asthma and pregnancy: Emerging evidence of epigenetic interactions in utero. Current opinion in Allergy and Clinical Immunology, 9, 417–426.

Junien, C., & Nathanielsz, P. (2007). Report on the IASO stock conference 2006: Early and lifelong environmental epigenomic programming of metabolic syndrome, obesity and type II diabetes. Obesity Reviews, 8, 487–502.

Tufarelli, C., et al. (2003). Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease. Nature Genetics, 34, 157–165.

Issa, J. P. (2004). CpG island methylator phenotype in cancer. Nature Reviews Cancer, 4, 988–993.

Simon, R. (2005). Roadmap for developing and validating therapeutically relevant genomic classifiers. Journal of Clinical Oncology, 23, 7332–7341.


Assista o vídeo: epigenética: metilação parte 4 (Janeiro 2022).