Em formação

As Acyl Carrier Proteins e a Conenzyme A têm reatividade semelhante?


Em termos das reações que eles sofrem, eles são grupos aproximadamente equivalentes?


Os grupos acila ligados a CoA e a proteínas transportadoras de acila estão na verdade ligados ao mesmo grupo (um grupo fosfopanteteína) como mostrado abaixo e, portanto, têm reatividades muito semelhantes (isto é, potenciais de transferência de grupo).


Habilidade de Streptomyces spp. proteínas transportadoras de arila e análogos da coenzima A para servir como substratos em vitro para E. coli sintase holo-ACP

Introdução: Os produtos naturais de policetídeo são montados por uma série de reações de descarboxilação / condensação de ácidos carboxílicos simples catalisados ​​por complexos de policetídeo sintase (PKS). A cadeia de crescimento é montada na proteína transportadora de acila (ACP), um componente essencial do PKS. ACP requer modificação pós-tradução em um resíduo de serina conservado por ligação covalente de um cofator 4'-fosfopanteteína (P-pant) para produzir holo-ACP ativo. Quando ACPs de Streptomyces PKS aromáticos tipo II são produzidos em excesso em E. coli, no entanto, normalmente pouco ou nenhum holo-ACP ativo é produzido, e o ACP permanece na forma apo inativa.

Resultados: Nós demonstramos que E. coli holo-ACP sintase (ACPS), uma enzima de biossíntese de ácido graxo, pode catalisar a transferência de P-pant em vitro ao Streptomyces PKS ACPs necessários para a biossíntese dos antibióticos policetídeos granaticina, frenolicina, oxitetraciclina e tetracenomicina. A eficiência catalítica desta reação de transferência P-pant correlaciona-se com a carga negativa geral do substrato ACP. Vários análogos da coenzima A, modificados na porção P-pant da molécula, são igualmente capazes de servir como substratos em vitro para ACPS.

Conclusões:E. coli ACPS pode servir como um reagente útil para a preparação de holoformas de Streptomyces ACPs, bem como holo-ACPs com frações fosfopanteteína alteradas. Tais ACPs modificados devem ser úteis para estudar o papel de ACPs particulares e do cofator fosfopanteteína nas reações subsequentes de policetídeo e biossíntese de ácidos graxos.


O nome sistemático desta classe de enzimas é malonil-CoA: [acil-proteína transportadora] S-maloniltransferase. Outros nomes de uso comum incluem malonil coenzima A-acil proteína transportadora transacilase,

  • [proteína carreadora de acila] maloniltransferase,
  • FabD,
  • malonil transacilase,
  • malonil transferase,
  • malonil-CoA-acil transacilase de proteína transportadora,
  • malonil-CoA: ACP transacilase,
  • malonil-CoA: transacilase AcpM,
  • malonil-CoA: transacilase de proteína transportadora de acila,
  • MAT, e
  • MCAT.

Estruturas de Cristal de FabD de E.coli [1] e Streptomyces coelicolor [2] são conhecidos e fornecem uma grande visão sobre o mecanismo catalítico do FabD. No E.Coli, FabD principalmente envolvido na via FAS. No entanto, em Streptomyces coelicolor, FabD está envolvido nas vias de FAS e da policetídeo sintase. Em ambos os casos, as estruturas e locais ativos são muito semelhantes.

A proteína tem uma arquitetura do tipo α / β, mas a dobra é única. o sítio ativo inferido da localização do Ser92 catalítico contém um cotovelo nucleofílico típico, conforme observado nas hidrolases α / β. [1] A serina 92 ​​é ligada por hidrogênio a His 201 de uma forma semelhante a várias serina hyrdolases. no entanto, em vez do ácido carboxílico tipicamente encontrado em tríades catalíticas, o carbonil da cadeia principal de Gln 250 serve como um aceitador de ligação de hidrogênio em uma interação com His 201. [1] Dois outros resíduos, Arg-117 e Glu-11 também estão localizados no site ativo, mas sua função não é clara.

A via de síntese de ácidos graxos é a principal via para a produção de cadeias acil fosfolipídicas de membrana em bactérias e plantas. [3] A sequência de reação é realizada por uma série de proteínas solúveis individuais, cada uma codificada por um gene discreto, e os intermediários da via são transportados entre as enzimas. [3] Malony-CoA: ACP Transacylase (FabD) é uma dessas proteínas solúveis individuais e catalisa a seguinte reação:

malonil-CoA + proteína transportadora de acila ⇌ CoA + malonil- [proteína transportadora de acila]

A transferência de malonato para proteína transportadora de acila (ACP) converte os grupos acila em formas tioéster que são características de intermediários acila na síntese de ácidos graxos e que são estritamente necessárias para as reações de condensação catalisadas pela β-cetoacil-ACP sintetase. [4]

Edição de mecanismo

Malonyl-CoA: ACP Transacylase usa um mecanismo cinético ping-pong com um éster de malônio ligado como o intermediário acil ligado a um resíduo de serina que reside dentro de um pentapeptídeo GHSLG. [5] O FabD primeiro se liga ao malonil-CoA, a porção malonil é então transferida para o sítio ativoSer 92 e o CoA é liberado da enzima. O ACP liga-se então e a porção malonilo é transferida para o sulfidrilo terminal do grupo protético ACP. Esta reação é facilmente reversível. [3] [6]

Entre todas as vias metabólicas conhecidas em sistemas vivos, a biossíntese de ácidos graxos produz os produtos mais densos em energia. [7] Como resultado, os derivados de ácidos graxos microbianos estão emergindo como uma alternativa promissora de energia renovável aos combustíveis de transporte derivados de combustíveis fósseis. Recentemente, Khosla et al. [7] desenvolveram um procedimento para reconstituir a síntese de ácidos graxos de E. coli usando componentes proteicos purificados (incluindo FabD) e relataram uma análise cinética detalhada deste sistema reconstituído in vitro. [8] Sua descoberta fornece uma nova base para avaliar o escopo e as limitações do uso de E.Coli como biocatalisador para a produção de combustíveis diesel.

FabD como um alvo para a descoberta de drogas antibacterianas: um próximo campo Editar

A biossíntese de ácidos graxos é realizada pela onipresente ácido graxo Sintase. [9] As vias da sintase do ácido graxo são divididas em duas formas moleculares distintas: Tipo I e Tipo II. [10] No tipo I, a síntese de ácidos graxos (encontrada em humanos e outros mamíferos) é um único polipeptídeo grande composto por vários domínios distintos. [11] Por outro lado, cada atividade enzimática (reação de condensação, reação de redução, reação de desidratação) é encontrada como uma proteína discreta em sistemas do tipo II. [12] A diferença na organização do sítio ativo e a predominância dos sistemas FAS do tipo II em bactérias tornam as enzimas dessa via alvos atraentes para os antibacterianos. [9] [12]

FabD (Acyl-Carrier-Protein S-Malonyltransferase) é um alvo razoável, dado que está disponível uma estrutura de cristal de alta resolução. [9] No entanto, nenhum inibidor de FabD foi relatado na literatura e em artigos de revisão sobre esse tópico. [9] A estrutura simples e a acidez do malonato parecem permitir poucas abordagens para sintetizar derivados (atuando como inibidores potenciais) que retêm o caráter da molécula.

Uma segunda abordagem para usar FabD como um alvo de droga é frequentemente identificada na literatura: FabD pode fornecer uma etiqueta útil para localizar genes fab porque o gene FabD é geralmente adjacente a pelo menos um outro gene fab. [13] No entanto (em 2015), nenhuma droga potencial tentou explorar esse recurso.


Biossíntese de ácidos graxos

O autor: Dr. Peter Reilly, Departamento de Engenharia Química e Biológica, Iowa State University, Ames, Iowa 50011, EUA.

Reações do ciclo de síntese de ácidos graxos

A forma padrão para as células sintetizarem ácidos graxos é por meio do ciclo de síntese de ácidos graxos (Figura 1). Este ciclo de oito enzimas (acil-CoA sintase, acil-CoA carboxilase, aciltransferase, cetoacil sintetase, cetoacil redutase, hidroxiacil desidratase, enoil redutase e tioesterase) e proteína transportadora de acila) é iniciado com ácido acético, CoA e ATP para fazer acetil-CoA usando acil-CoA sintase como catalisador. Uma segunda etapa, usando outro íon ATP e bicarbonato catalisado pela acil-CoA carboxilase, produz malonil-CoA. Com a cetoacil sintetase e catálise de aciltransferase, a malonil-CoA é adicionada a uma cadeia acila, geralmente ativada com a proteína transportadora de acila, para fazer uma cadeia acila dois grupos metileno mais longos. Redução, desidratação e redução adicionais com cetoacil sintase, hidroxiacil desidratase e catálise de enoil redutase, respectivamente, levam a uma cadeia de acila saturada e não hidroxilada ativada com proteína transportadora de acila. Se a cadeia tiver o comprimento apropriado, ela é atacada pela tioesterase para liberar a proteína carreadora de acila, produzindo o ácido graxo final.

Figura 1. O ciclo de síntese de ácidos graxos e os grupos de enzimas que fazem parte dele. ACC: acetil-CoA carboxilase ACS: acil-CoA sintase AT: aciltransferase ER: enoil redutase HD: hidroxiacil desidratase KR: cetoacil redutase KS: cetoacil sintase TE: tioesterase. SX: Coenzima A ou proteína transportadora de acila. Reproduzido na forma modificada com permissão da ref. 1. Copyright 2011, Oxford University Press.

Definições de famílias de enzimas e clãs

Talvez não seja totalmente apreciado que esses oito grupos de enzimas e uma proteína transportadora são, na verdade, geralmente assembléias dentro de cada grupo de várias (ou muitas) proteínas diferentes não necessariamente relacionadas entre si por sequência de aminoácidos (estrutura primária) ou mesmo por estrutura tridimensional (estrutura terciária). Em vez disso, proteínas não relacionadas podem ser moldadas por evolução convergente para catalisar a mesma reação geral. Por outro lado, proteínas de estruturas primárias e terciárias relacionadas produzidas por organismos diferentes, mas catalisando a mesma reação, podem fazer parte de famílias cujos membros são geralmente considerados como tendo o mesmo ancestral comum. Membros dessas famílias podem ser identificados por interrogatório automatizado de bancos de dados contendo estruturas primárias de enzimas, onde os membros da família devem passar por um teste de probabilidade de similaridade seguido por alinhamento de sequência múltipla adicional e comparação de estruturas terciárias (se disponível). Em uma etapa posterior, famílias diferentes com estruturas primárias não relacionadas (ou apenas ligeiramente relacionadas), mas estruturas terciárias semelhantes, e catalisando a mesma reação geral pelo mesmo mecanismo, podem ser reunidas em clãs dentro do mesmo grupo. Isso é confirmado pela sobreposição computacional das estruturas terciárias de membros de diferentes famílias para confirmar os desvios quadrados médios da raiz baixa dos resíduos de aminoácidos adjacentes. Membros de famílias diferentes no mesmo clã são considerados como tendo ancestrais comuns mais distantes do que aqueles na mesma família. Uma terceira diversificação, que não será abordada aqui, é a dos membros da família em subfamílias, governada por formulações estatísticas aplicadas às estruturas primárias.

O banco de dados ThYme

As famílias das enzimas que catalisam as reações que levam à síntese de ácidos graxos foram tabuladas no banco de dados do ThYme (Thioester-active enzYme) [1]. No momento, este banco de dados consiste em cinco famílias de acil-CoA sintases, quatro famílias de subgrupos de acil-CoA carboxilase (um de biotina carboxilases, um de biotina carboxil carreadores de proteínas e dois de carboxil transferases) [2], um de aciltransferases, cinco de cetoacil sintases [3], quatro de cetoacil redutases [4], oito de hidroxiacil desidratases [4], cinco de enoil redutases [4], 25 de tioesterases [5] e 16 de proteínas transportadoras de acila [6] (Tabela 1 ) Embora nem todos os grupos de enzimas tenham sido analisados, um clã de cetoacil sintases engloba quatro de suas cinco famílias [3], um clã de cetoacil redutases cobre três de suas quatro famílias [7], um clã de hidroxiacil desidratases compreende duas de suas oito famílias [7], e quatro clãs de tioesterases cobrem quatro, três, três e duas de suas 25 famílias [5].

A maioria das entradas do ThYme resultou de estudos genômicos e não foi submetida a projetos experimentais. Portanto, eles geralmente não têm títulos firmemente estabelecidos, muitas vezes tendo sido caracterizados como "proteínas quancaracterizadas", "proteínas hipotéticas" ou por outros termos indefinidos ou mesmo claramente incorretos. Bases de dados como o ThYme têm sido úteis, pelo uso de estruturas primárias para classificar proteínas, no direcionamento dessas proteínas menos caracterizadas em famílias contendo outras proteínas mais estudadas e claramente descritas.

Vamos agora considerar mais cuidadosamente cada grupo de enzimas do ciclo de síntese de ácidos graxos.

Acil-CoA sintases

As acil-CoA sintases catalisam a primeira etapa na via de síntese de ácidos graxos, ativando o ácido acético com CoA e com o dispêndio de uma molécula de ATP, levando à formação de AMP, pirofosfato e água. (Figura 1). Eles são classificados em cinco famílias (Tabela 1), algumas com muito mais estruturas primárias do que outras. Membros de três famílias têm estruturas terciárias semelhantes (dobras), enquanto duas ainda não têm dobras conhecidas. Como é comum entre os diferentes grupos do ciclo, as diferentes famílias têm diferentes nomes principais e diferentes números da Enzyme Commission (EC) [8]. Em algumas famílias grandes, como na família ACS1 aqui, há tantas funções enzimáticas diferentes percebidas que nenhum número EC único pode ser atribuído à família. Esta divergência de famílias ordenadas por similaridade de estrutura primária, por um lado, e números de EC com base em substratos e produtos enzimáticos e, portanto, nas reações que catalisam, por outro lado, ilustra ainda mais o fenômeno da evolução convergente de estruturas de proteínas para servir ao mesmo propósito.

Archaea produz membros de quatro das cinco famílias, bactérias em todas as cinco e eucariotos em duas das cinco (com alguns membros em uma terceira família). A maioria dos membros eucarióticos é produzida por alguma combinação de fungos, animais e plantas, bem como às vezes por algas e ocasionalmente por outras formas de vida simples.

Acil-CoA carboxilases

A reação catalisada pela acil-CoA carboxilase é superficialmente simples: acetil-CoA sendo carboxilado com CO2 (HCO3 & ndash em condições fisiológicas) e ATP para formar malonil-CoA, com liberação de ADP e fosfato inorgânico (Figura 1). No entanto, a reação é na verdade muito mais complexa, com a biotina ligada a uma proteína carreadora de carboxil biotina sendo carboxilada por um domínio de biotina carboxilase. O grupo carboxila é então transferido para uma molécula de acetil-CoA, catalisada por um domínio de carboxil transferase (Figura 2). Todo o complexo de biotina carboxilase, proteína transportadora de biotina carboxil e carboxil transferase constitui a acil-CoA carboxilase. Uma revisão recente e muito completa deste sistema enzimático foi publicada por Lombard e Moreira [9].

Figura 2. Esquema de uma reação catalisada por acetil-CoA carboxilase produzindo malonil-CoA. Reproduzido com permissão da ref. 2. Copyright 2012, Springer Science + Business Media B.V.

Uma comparação de estruturas primárias mostra que todas as biotina carboxilases e proteínas carreadoras de biotina carboxil formam duas famílias únicas, BC1 e BCCP1, enquanto as carboxil transferases fazem parte de duas famílias, CT1 e CT2 [2] (Tabela 1).

A colocação dos domínios da biotina carboxilase, da proteína transportadora da biotina carboxila e da carboxila transferase é muito complexa. Na maioria dos eucariotos, as acetil-CoA carboxilases ocorrem como cadeias de carboxil transferase de proteína carreadora de biotina carboxilase-biotina. No entanto, em acil-CoA carboxilases bacterianas e eucarióticas mais ativas em propionil-CoA, 3-metilcro e shytonil-CoA e geranil-CoA, a proteína carreadora de biotina carboxila e os domínios de biotina carboxila estão ligados um ao outro, mas estão separados dos fundidos domínios de carboxil transferase. Em carboxilases dependentes de biotina arquea específicas para acetil-CoA e propionil-CoA, a proteína carreadora de carboxil biotina é separada da biotina carboxilase e dos domínios de carboxil transferase fundida [9].

Aciltransferases

As aciltransferases são constituídas por uma família muito grande (Tabela 1), cujos membros são produzidos por bactérias, eucariotos e algumas arquéias. A tarefa específica das aciltransferases é trocar a porção CoA na malonil-CoA que entra no ciclo de síntese de ácidos graxos por uma proteína transportadora de acila (Figura 1).

Cetoacil sintases

O papel geral das cetoacil sintases, junto com as aciltransferases, é adicionar malonil-CoA a uma cadeia de proteína carreadora de acil-acila, com a perda de dióxido de carbono e CoA e com a cadeia de acila aumentando em comprimento por dois grupos metileno [3] ( Figura 1). Existem cinco famílias de cetoacil sintases, três dos quais têm estruturas terciárias semelhantes (Figura 3). Junto com os membros de uma quarta família um tanto relacionada a eles por estrutura primária e por mecanismo catalítico (membros de todas as quatro famílias têm uma tríade catalítica de Cys, His e Asn ou His), eles formam um único clã [3] (Tabela 1). Essas quatro famílias têm funções muito diferentes, sendo os membros de uma delas envolvidos na síntese da chalcona e do estilbeno. A quinta família, sem uma estrutura terciária conhecida, é composta apenas por enzimas eucarióticas envolvidas no alongamento de cadeias de ácidos graxos já muito longas.

Figura 3. Estruturas cristalinas sobrepostas de cetoacil sintase (KS). KS1 Escherichia coli & beta-cetoacil-ACP sintase III (amarelo), KS3 Saccharopolyspora erythraea DEBS 2 (ciano) e KS4 Arachis hypogaea estilbeno sintase (rosa). Reproduzido com permissão da ref. 3. Copyright 2011, The Protein Society.

A via de oxidação & beta

Três enzimas, cetoacil redutase, hidroxiacil desidratase e enoil redutase, são necessárias para remover o grupo 3-ceto adicionado à cadeia de acil crescente pela cetoacil sintase (Figura 1). Todas as três enzimas também estão envolvidas na via de oxidação beta, onde os ácidos graxos são decompostos em vez de serem construídos. Nessa via, as etapas catalisadas por cetoacil redutase-, hidroxiacil desidratase- e enoil redutase operam ao contrário, de modo que essas enzimas recebem nomes característicos das reações reversas. A oxidação de acil-CoA catalisada por acil-CoA desidrogenase (equivalente a enoil redutase) com um grupo protético de flavina adenina dinucleotídeo (FAD) dá 2-enoil-CoA. A hidratação de 2-enoil-CoA produzindo 3-hidroxiacil-CoA é catalisada pela 2-enoil hidratase (equivalente a hidroxiacil desidratase). A terceira etapa, a oxidação de 3-hidroxiacil-CoA para dar 3-cetoacil-CoA por catálise com L-3-hidroxiacil-CoA desidrogenase (equivalente a cetoacil redutase) usando nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD +). Uma etapa final, com a adição de CoA, remove uma molécula de acetil-CoA e deixa uma molécula de acil-CoA com dois átomos de carbono mais curta do que antes. É catalisado pela 3-cetoacil-CoA tiolase, que não faz parte do ciclo padrão de síntese de ácidos graxos.

Síntese de policetídeo

Um pequeno parágrafo pode servir para descrever a diferença entre a síntese de ácidos graxos e a síntese de policetídeos. No último, as etapas catalisadas por cetoacil redutase-, hidroxiacil desidratase e enoil redutase não ocorrem necessariamente durante cada volta do ciclo, de modo que grupos ceto e hidroxi e ligações duplas podem permanecer na cadeia de alongamento. Além disso, a cadeia pode ser alongada por outras substâncias além de malonil-CoA, levando, portanto, a cadeias com números ímpares de átomos de carbono ou diferentes grupos funcionais. Finalmente, se o crescimento da cadeia não for interrompido por água, mas por um grupo hidroxi, a ciclização da cadeia pode ocorrer.

Cetoacil redutases

As cetoacil redutases são divididas em quatro famílias (Tabela 1), com a família KR1 tendo o maior número de estruturas primárias tabuladas no banco de dados ThYme (Tabela 1). Esta família inclui muitas redutases e desidrogenases que não catalisam reações associadas com a síntese de ácidos graxos ou ciclos de síntese de policetídeos ou a via de oxidação beta [4]. Também inclui a antiga família ER1, uma vez que todas as sequências de aminoácidos dessas enoil redutases foram encontradas também na família KR1. Membros das famílias KR1, KR3 e KR4 têm dobras de Rossmann de ligação NAD (P) e resíduos catalíticos de serina, tirosina e lisina, e fazem parte do clã KR-A [4,7]. Aqueles na família KR2 têm resíduos catalíticos de histidina e glutamato, mas também dobras de Rossmann de ligação a NAD (P) juntamente com dobras de 6-fosfogluconato desidrogenase C-terminal. A dobra de Rossmann é composta de até sete fitas beta e paralelas principalmente, com uma hélice alfa entre as duas primeiras fitas beta. Os membros das famílias KR1 e KR2 são independentes, enquanto aqueles das famílias KR3 e KR4 são partes de cadeias de multienzimas que realizam a síntese de ácidos graxos e policetídeos.

Hidroxiacil desidratases

As hidroxiacil desidratases são encontradas em oito famílias, das quais as famílias HD1 e HD3 até HD6 têm membros com estruturas terciárias HotDog, enquanto membros da família HD2 têm dobras ClpP / crotonase [4] (Tabela 1). A dobra do HotDog é composta por uma ou, ocasionalmente, duas hélices alfa encerradas em uma folha beta composta por várias fitas beta, um bom exemplo sendo mostrado na Figura 4. Nenhuma estrutura terciária ainda é conhecida para membros das famílias HD7 e HD8. Embora as estruturas terciárias dos membros das famílias HD1, HD5 e HD6 possam ser estreitamente sobrepostas umas às outras, os resíduos de aspartato e histidina catalítico de HD1 não estão no mesmo local que os resíduos de aspartato e histidina catalítico de HD5 ou os resíduos de glutamato e histidina de HD6 [7]. Os últimos pares de resíduos, por outro lado, se sobrepõem muito intimamente e, portanto, permitem que HD5 e HD6 constituam o clã HD-A (Figura 4). Separadamente, os membros HD3 e HD4 fazem parte de ácidos graxos multi-enzimas e policetídeos sintases.

Figura 4. A) Estruturas terciárias de hidroxiacil desidratase (HD) representativas sobrepostas do clã HD-A: HD5 & beta-hidroxidecanoil tiol éster-ACP desidrase de Escherichia coli (verde) e HD6 ((3R) -hidroxiacil-ACP desidratase (FabZ) de Helicobacter pylori (ciano). B) Cadeias laterais do local ativo sobrepostas dos mesmos representantes da família HD, com cores como em A. Reproduzido com permissão da ref. 7. Copyright 2014, Springer Science + Business Media Dordrecht.

Enoil redutases

Conforme observado anteriormente, a família ER1 foi fundida na família KR1 porque todas as suas entradas também se encontram lá. Além disso, todos os membros de cada família catalisam os mesmos tipos de reações redutivas. As enoil redutases restantes se enquadram em cinco famílias, das quais aquelas nas famílias ER3 e ER4 fazem parte de complexos maiores de ácido graxo e policetídeo sintase [4] (Tabela 1). As famílias ER2 e ER4 têm dobras de Rossmann de ligação NAD (P), enquanto os membros da família ER5 têm estruturas semelhantes a GrosES, e os da família ER6 têm dobras TIM (& beta, & alpha) -barrel.

A sobreposição de uma estrutura terciária ER2 sobre as estruturas de KR1, KR3 e KR4, membros do clã KR-A, é extremamente próxima, sugerindo que os membros ER2 e membros das três famílias da cetoacil redutase têm um ancestral comum distante [7].

Tioesterases

As tioesterases são os mais variados dos oito grupos de enzimas que compõem o ciclo de síntese de ácidos graxos. Eles são organizados em 25 famílias [5] (Tabela 1), a maioria das quais tem membros com estruturas terciárias & alfa / & beta-hidrolase ou HotDog (Figura 5). Doze dessas famílias podem ser reunidas em clãs. As famílias TE5, TE9, TE10 e TE12 com dobras HotDog fazem parte do clã TE-A, enquanto as famílias TE8, TE11 e TE13 com diferentes estruturas terciárias HotDog compõem o clã TE-B. Enquanto isso, as famílias TE16, TE17 e TE18 com dobras & alfa / & beta-hidrolase fazem parte do clã TE-C, e as famílias TE20 e TE21 com diferentes estruturas terciárias & alfa / & beta-hidrolase constituem o clã TE-D. O mecanismo das tioesterases com estruturas terciárias & alfa / & beta-hidrolase é geralmente aceito como baseado nas tríades catalíticas Ser / His / Asp normalmente encontradas com tais dobras. Os mecanismos dessas tioesterases com estruturas terciárias HotDog são muito menos conhecidos [5]. Eles podem muito bem ter mecanismos diferentes uns dos outros, uma vez que seus resíduos catalíticos identificados experimentalmente variam.

Figura 5. Estruturas terciárias de tioesterase (TE) representativas sobrepostas de A) clã TE-A: hidrolases de acil-CoA de TE5 Escherichia coli (verde), TE9 Helicobacter pylori (vermelho), TE10 Pseudomonas sp. (amarelo), e TE12 Prochlorococcus marinus (azul) B) clã TE-B: hidrolases de acil-CoA de TE8 Homo sapiens (azul), TE11 Arthrobacter sp. (vermelho), e TE13 Escherichia coli (amarelo) C) clã TE-C: hidrolases acil-ACP de TE16 Homo sapiens (azul), TE17 Saccharopolyspora erythraea (vermelho), e TE18 Amycolatopsis mediterranei (amarelo) D) clã TE-D: proteína-acil hidrolases de TE20 Bos taurus (azul) e TE21 Homo sapiens (amarelo).

Proteínas transportadoras de acila

Proteínas transportadoras de acila têm estruturas primárias muito variáveis ​​e, portanto, podem ser classificadas nas famílias ACP1 a ACP17 (Figura 6), tendo a família ACP14 sido excluída [6] (Tabela 1). A maioria das proteínas transportadoras de acila tem 70 a 100 resíduos de aminoácidos, mas os membros da família ACP2 têm cadeias mais longas. Comumente encontradas três hélices alfa e paralelas, geralmente, mas nem sempre, acompanhadas por uma hélice alfa cruzada (Figura 7). Membros de algumas famílias são independentes, enquanto outras fazem parte de cadeias mais longas de ácido graxo sintase e policetídeo sintase (Tabela 1). Membros de famílias individuais de proteínas transportadoras de acila têm maior probabilidade do que membros dos oito grupos de enzimas que fazem parte do ciclo de síntese de ácidos graxos de serem produzidos por membros de reinos de vida únicos, geralmente bacterianos, mas às vezes eucarióticos.

Figura 6. Estruturas terciárias de membros únicos de famílias de proteínas transportadoras de acila (ACP). ACP1 Thermus thermophilus, ACP2 Saccharomyces cerevisiae, ACP3 Homo sapiens, ACP5 Streptomyces roseofulvus, ACP8 Aspergillus parasiticus, ACP10 Brevibacillus parabrevis, ACP12 Escherichia coli, ACP13 E. colie ACP17 Lactobacillus casei. Reproduzido com permissão da ref. 6. Copyright 2012, The Protein Society.

Figura 7. Árvore filogenética de famílias de proteínas transportadoras de acila. Reproduzido com permissão da ref. 6. Copyright 2012, The Protein Society.

A computação estabeleceu que os membros ACP4 têm dobras semelhantes às de outras famílias de proteínas transportadoras de acila cujas dobras foram determinadas experimentalmente [6]. No entanto, os membros das famílias ACP15 e ACP16 parecem, por computação, ter diferentes estruturas terciárias, de acordo com o fato de terem estruturas primárias mais divergentes (Figura 6) e papéis diferentes (estão associados a enzimas que diminuem em vez de aumentar os tamanhos dos substratos e eles não use o mesmo grupo protético 4 & rsquo-fosfopanteteína presente em outras proteínas transportadoras de acila).

Complexos de síntese de ácido graxo e policetídeo

Foi observado acima e na Tabela 1 que os membros de algumas famílias de enzimas de síntese de ácidos graxos são partes covalentemente ligadas de ácidos graxos e complexos de síntese de policetídeos. Mais especificamente, esses complexos, encontrados em algumas bactérias, fungos, animais e fungos viscosos, permitem que as cadeias de ácido graxo em crescimento, ativadas pela proteína carreadora de acila, sejam passadas sequencialmente de uma enzima de síntese de ácido graxo para a próxima, sem se difundir aleatoriamente entre elas.

Das dezesseis famílias de proteínas transportadoras de acila, os membros de ACP1, ACP4, ACP5, ACP15, ACP16 e ACP17 são independentes (Tabela 1) e se engajam no que é conhecido como síntese do Tipo II. As proteínas ACP1 são produzidas por bactérias, fungos, animais e plantas e se envolvem com muitas enzimas de síntese de ácidos graxos. Os membros ACP4 e ACP5 são produzidos por várias bactérias e estão envolvidos na síntese de policetídeos. Os membros do ACP15 e do ACP16 também são produzidos por várias bactérias e estão associados à malonato descarboxilase e à citrato liase, respectivamente. ACP17 é composto por proteínas transportadoras D-alanil.

As demais proteínas transportadoras de acila covalentemente ligadas a enzimas participam da síntese de ácidos graxos do Tipo I e de outras atividades relacionadas (Tabela 1). As proteínas ACP2 e ACP3 auxiliam na produção de ácidos graxos e são produzidas por fungos e animais, respectivamente. Membros de ACP6 a ACP11 estão envolvidos na síntese de policetídeos e são produzidos por micobactérias (ACP6), fungos (ACP7, ACP8 e ACP11) e fungos viscosos (ACP9). O grande número de proteínas ACP10 é produzido por várias bactérias e também por fungos. Os membros ACP12 e ACP13 são feitos por várias bactérias e estão ligados a isocoromatases, peptídeos sintetases, feniloxazolina sintases (ACP12), enterobactina sintases e cromóforos liases (ACP13)

Dos oito grupos de enzimas de síntese de ácidos graxos, seis (aciltransferases, cetoacil sintases, cetoacil redutases, hidroxiacil desidratases, enoil redutases e tioesterases) têm famílias cujos membros fazem parte de ácidos graxos multi-enzimas e policetídeos sintases (Tabela 1). Uma família de aciltransferases (AT1) possui domínios em várias sintases produzidas por bactérias, fungos e animais, bem como por membros independentes. Membros da grande família KS3 são independentes e são partes da policetídeo e das sintases de ácidos graxos produzidas por bactérias, animais, fungos e bolor limoso. Entre as cetoacil redutases, as formas bacterianas e fúngicas de KR3 são encontradas nas sintases de ácidos graxos, enquanto as formas bacterianas, fúngicas e animais de KR4 estão na policetídeo e nas sintases de ácidos graxos. Hidroxiacil desidratases em HD3 são parte das sintases de ácidos graxos produzidas por bactérias, fungos e animais, e aquelas em HD4 são em policetídeo e sintases de ácidos graxos feitas por bactérias e animais. ER3 tem domínios de enoil redutase em ácidos graxos sintases produzidos por bactérias e fungos, enquanto os domínios de enoil redutase em ER4 estão localizados em bactérias, fungos, animais e policetídeos sintases de mofo viscoso. Finalmente, as famílias TE16, TE17 e TE18 entre as 25 famílias de tioesterase contribuem com domínios para as sintases multi-enzima. Os membros TE16 fazem parte das proteínas de adenilação de aminoácidos, policetídeos, ácidos graxos e sintases de peptídeos não-rib e tiossomais, e o componente F da enterobactina sintase produzida por bactérias, fungos e animais. As policetidas sintases bacterianas têm domínios TE17. Os domínios TE18 são encontrados em proteínas de adenilação de aminoácidos bacterianos e sintases de peptídeos tímicos e não-rib e em sintases de ácidos graxos S-acil animais.

Uma nota de passagem

As membranas arqueadas contêm fosfolipídios que possuem cadeias hidrofóbicas ligadas ao L-glicerol com ligações de éter, em vez das cadeias encontradas em bactérias e eucariotos ligadas ao D-glicerol por ligações de éster. Além disso, as cadeias de archaea são ramificadas com grupos metil em intervalos regulares, com base na química isoprenóide, enquanto organismos bacterianos e eucarióticos têm cadeias de aril com ácidos graxos de cadeia linear. Apesar disso, muitas archaea têm uma ou mais das enzimas (ou proteína transportadora de acila) encontradas no ciclo de síntese de ácidos graxos. Chen usou o banco de dados do Tomilho em 2011 para descobrir que das 155 espécies de archaea tabuladas então, 33 tinham um membro do ciclo, 28 tinham dois, 22 tinham três, 17 tinham quatro, 26 tinham cinco, 27 tinham seis, um tinha oito e um tinha todos os nove [10].


Reconhecimentos

Este trabalho é apoiado em parte pelo National Institute of General Medical Sciences Protein Structure Initiative concede GM094585 (A.J.) e GM098248 (G.N.P.) e National Institutes of Health concede GM109456 (G.N.P.) e GM114353 (B.S.). O uso de linhas de luz do Centro de Biologia Estrutural na Fonte Avançada de Fótons foi apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, bolsa de Pesquisa Biológica e Ambiental DE-AC02-06CH11357 (A.J.). N.W. é apoiado em parte pelo Instituto de Ecologia Aplicada, Academia Chinesa de Ciências e uma bolsa de estudos do Conselho de Bolsas de Estudo Chinês (201504910034). J.D.R. é apoiado em parte por uma bolsa de pós-doutorado de Arnold O. Beckman. C.-Y.C. é apoiado em parte pela Fellowship of Academia Sinica – The Scripps Research Institute Postdoctoral Talent Development Program. Este é o manuscrito nº 29600 do The Scripps Research Institute.


PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Condições de tensão e cultura

Phaeodactylum tricornutum Cepa Pt4 (UTEX 646) foi cultivado em água do mar artificial (Instant Ocean, Spectrum Brands, Blacksburg, VA, EUA) suplementada com nutrientes F / 2. As culturas foram cultivadas a 20 ° C sob iluminação constante (100 µmol m −2 seg −1, 4000 K Branco e iluminação LED de 660 nm) e agitadas continuamente a 70 rpm. O crescimento foi monitorado por OD750nm calibrated to cell density measured by an automated cell counter (Cellometer T4, Nexcelom, Lawrence, MA, USA). Lines were maintained on F/4 agar plates grown at 20°C under 50 µmol m −2 sec −1 (3500 K fluorescent tubes).

Construction of acyl-ACP Δ9-desaturase overexpression cassette and transformation

o PAD (Phatr3_J9316) gene was chemically synthesized (Genscript) and codon optimized to remove conflicting restriction sites. The PAD gene was inserted into position 1 in the two-gene cassette transformation vector pPhOS2 (Hamilton et al., 2014 ) behind the EF2 promoter (Seo et al., 2015 ) generating pPhOS2_PAD construct. Construction of the transformation cassette pPhOS2_PAD is described in detail in Data S1. Transformation of P. tricornutum Pt4 via biolistic transformation and screening was carried out as described previously (Hamilton et al., 2014 ).

Generation of acyl-ACP Δ9-desaturase KO lines

A universal KO CRISPR/Cas9 vector was constructed with a dual sgRNA design (Aslan et al., 2015 ) using dual reporter gene selection system (designed by Mark Youles, personal communication). Type IIS LOOP DNA assembly was used for Level 1 and 2 vector constructions, following the method described in Pollak et al. (2019). The design of KO cassettes is explained in detail in Data S1. Transformation of P. tricornutum Pt4 via biolistic transformation and screening was carried as described previously (Hamilton et al., 2014 ).

Cloning of acyl-ACP Δ9-desaturase (Phatr3_J9316) into Synechocystis expression vector and functional characterization in Synechocystis

To generate the Syn_PAD strain, the Synechocystis PCC6803 glucose-tolerant WT (Syn_WT, Himadri Pakrasi, Department of Biology, Washington University, St. Louis, MO, USA) was transformed with the self-replicative vector pUR (Kim et al., 2016 ) expressing the acyl-ACP Δ9-desaturase gene lacking the 5′ putative signal peptide sequence (as predicted by SignalP online software). Generation of the vector, transformation and functional characterization of the Phatr3_J9316 gene is described in detail in Data S1.

RNA extraction and quantitative reverse transcription-PCR

For RNA extraction, 1–1.5 × 10 8 exponential phase cells were pelleted, flash frozen in liquid nitrogen and stored at −80°C. RNA extraction was carried out using the method described in Rengel et al. ( 2018 ). cDNA was synthesized and quantitative PCR analysis was carried out as described detail in Data S1.

Lipid analysis

Whole biomass FAME analysis was carried out as previously reported (Hamilton et al., 2014 ), using pentadecanoic acid and tricosanoic acid internal standards. Further details are described in Data S1.

Glycerolipids were extracted following a method adapted from Bryant et al. ( 2016 ), further details are described in Data S1.

For positional analysis, lipids were fractionated by 1D and 2D TLC (described in detail in Data S1), and then purified classes were characterized by preferential loss analysis under low-energy collision-induced dissociation as described previously (Abida et al., 2015 ). After species characterization, quantification of each species was carried out by liquid chromatography-MS/MS as previously described (Jouhet et al., 2017 ).

Transmission electron microscopy

Transmission electron microscopy imaging was carried out by Rothamsted Bioimaging (Harpenden, Herts, UK). Processing of P. tricornutum cells for transmission electron microscopy imaging is described in detail in the Data S1.

Estatisticas

One-way analysis of variance was applied to data on specific growth, FA, lipid class and lipid species data. Data were transformed by natural log (quantitative data) or logit (relative %). Post-hoc comparison of the means was carried out using LSD at 5%, 1% and 0.1% level of significance. A two-tailed Student’s t-test was carried out in cases where only two strains are compared. Microsoft Excel was used for these analyses.


Acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase modulates the generation of the amyloid β-peptide

The pathogenic event common to all forms of Alzheimer's disease is the abnormal accumulation of the amyloid β-peptide (Aβ). Here we provide strong evidence that intracellular cholesterol compartmentation modulates the generation of Aβ. Using genetic, biochemical and metabolic approaches, we found that cholesteryl-ester levels are directly correlated with Aβ production. Acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase (ACAT), the enzyme that catalyses the formation of cholesteryl esters, modulates the generation of Aβ through the tight control of the equilibrium between free cholesterol and cholesteryl esters. We also show that pharmacological inhibitors of ACAT, developed for the treatment of atherosclerosis, are potent modulators of Aβ generation, indicating their potential for use in the treatment of Alzheimer's disease.


Identification of a chloroplast coenzyme A-binding protein related to the peroxisomal thiolases.

A 30-kD coenzyme A (CoA)-binding protein was isolated from spinach (Spinacea oleracea) chloroplast soluble extracts using affinity chromatography under conditions in which 95% of the total protein was excluded. The 30-kD protein contains an eight-amino-acid sequence, DVRLYYGA, that is identical to a region in a 36-kD protein of unknown function that is encoded by a kiwifruit (Actinidia deliciosa) cDNA. Southern blotting also detected a spinach gene that is related to the kiwifruit cDNA. The kiwifruit 36-kD protein that was synthesized in Escherichia coli was imported into chloroplasts and cleaved to a 30-kD form it was processed to the same size in an organelle-free assay. Furthermore, the kiwifruit protein specifically bound to CoA. The kiwifruit protein contains a single cysteine within a domain that is related to the peroxisomal beta-ketoacyl-CoA thiolases, which catalyze the CoA-dependent degradative step of fatty acid beta-oxidation. Within 50 amino acids surrounding the cysteine, considered to be part of the thiolase active site, the kiwifruit protein shows approximately 26% sequence identity with the mango, cucumber, and rat peroxisomal thiolases. N-terminal alignment with these enzymes, relative to the cysteine, indicates that the 36-kD protein is cleaved after serine-58 during import, agreeing with the estimated size (approximately 6 kD) of a transit peptide. The 30-kD protein is also related to the E. coli and mitochondrial thiolases, as well as to the acetoacetyl-CoA thiolases of prokaryotes. Features distinguish it from members of the thiolase family, suggesting that it carries out a related but novel function. The protein is more distantly related to chloroplast beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III, the initial condensing enzyme of fatty acid synthetase that utilizes acetyl-CoA.


Métodos

Cloning

Genomic DNA from the haploid protease deficient S. cerevisiae BJ2168 plasmid (MATa leu2 trp1 ura3–52 prb1-1122 pep4-3 prc1-407 gal2) was obtained by phenol/chloroform extraction. FAS1 e FAS2 genes were amplified from genomic DNA using primers containing overlaps with the vector backbone for cloning with NEBuilder HiFi DNA Assembly (NEB) (Supplementary Table 1). FAS1 was cloned into NcoI-digested pET-28a(+) with a C-terminal His6 tag (JWL02). FAS2 was cloned into NcoI-digested pET-15b(+) (JWL03). The sequences of the FAS1 e FAS2 genes were verified (Supplemantary Data 1) via whole plasmid sequencing of JWL02 and JWL03 at the Center for Computational & Integrative Biology DNA core facility in Massachusetts General Hospital.

Point mutations were generated by the overlap extension method 24 using a forward primer containing the mutation and a reverse primer 200–2000 bp downstream (Supplementary Table 1). PCR fragments were purified using spin columns and used as megaprimers to amplify the entire plasmid and introduce the point mutation. Mutations were verified by Sanger sequencing using custom sequencing primers (Supplementary Table 1).

Transformation, expression, and protein purification

The JWL02 and JWL03 plasmids were co-transformed into Escherichia coli BL21 cells by electroporation, plated on LB agar plates containing 50 μg/mL kanamycin and 100 μg/mL ampicillin, and grown overnight at 37 °C. One colony was inoculated into 50 mL LB media containing kanamycin and ampicillin and grown overnight at 37 °C, 250 RPM. In all, 10 mL of this starter culture was transferred to 1 L LB media containing kanamycin and ampicillin in a 4-L flask and grown at 37 °C, 180 RPM in an Innova 42 shaker (New Brunswick) until the OD600 nm reached 0.6. The culture was cooled to 15 °C and expression was induced with 0.5 mM IPTG. Expression occurred at 15 °C, 180 RPM overnight.

Cells were harvested by centrifugation at 4000 × g for 15 min and resuspended in lysis buffer (200 mM potassium phosphate pH 7.4, 300 mM KCl, 10 mM imidazole, 5 mM β-mercaptoethanol, 0.5 mM PMSF, 1 mM benzamidine, and 5 mM aminocaproic acid). Resuspended cells were incubated with DNAse I and lysozyme for 10 min. Cells were lysed by sonication (Branson Analog Sonifier S-450A) in an ice-water bath with five cycles of

15 W pulses every 0.5 s for 1 min followed by 2 min rest. The lysate was cleared by centrifugation at 40,000 × g for 1 h. The cleared lysate was filtered using a 0.22-μm filter and loaded onto a pre-equilibrated 5 mL HisTrap column (GE Healthcare). The column was washed with 10 column volumes of wash buffer (200 mM potassium phosphate pH 7.4, 300 mM KCl, 20 mM imidazole, and 5 mM β-mercaptoethanol) before elution with a linear gradient of 0–100% elution buffer (200 mM potassium phosphate pH 7.4, 150 mM KCl, 300 mM imidazole, 5 mM β-mercaptoethanol) over 20 column volumes. Fractions were pooled and concentrated to 1 mL and injected into a Superose6 10/300 GL column (GE Healthcare) pre-equilibrated with TBS (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl). Gel filtration fractions were pooled and concentrated to 2 mg/mL, flash frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C. For cryoEM samples, proteins were used fresh on the day of purification.

Activity assays

Activity assays of purified recombinant FAS were performed as described 14 . Briefly, 20 μg FAS was mixed with 0.2 mM acetyl-CoA, 0.7 mM NADPH, 1 mM DTT, and 100 mM potassium phosphate pH 7.4 in a 100-μL reaction. The level of NADPH was monitored at 340 nm for 3 min and the reaction was started by adding 30 nM malonyl-CoA and monitored for 1 h. The specific activity of wild type recombinant FAS was measured from three independent protein preparations to be 78 ± 32 mU/mg, where one unit is defined as consumption of 1 μmol of malonyl-CoA per minute. Only linear part of the curve (i.e. 2 min post malonyl-CoA addition) was used for calculation of the specific activity 25 .

CryoEM sample preparation and image collection

To prepare samples for CryoEM imaging, 3 μl of freshly purified protein complexes were added at a concentration of 1–2 mg/ml to glow-discharged (25 s in air) holey gold grids 26 mounted in a Vitrobot Mark IV. Blotting was done for 3 s at 4 °C and 100% humidity before plunge freezing in liquid ethane. A total of three grids were prepared per condition reported in Supplementary Table 2 and Supplementary Table 3 from the same purifications. Data reported in Supplementary Table 2 were collected from one grid and data reported in Supplementary Table 3 were collected from three grids.

Electron micrographs were collected with a FEI Tecnai F20 field emission electron microscope equipped with a Gatan K2 summit direct detector device (DDD) camera. Micrographs were acquired as movies in counting mode using DigitalMicrograph® software with 1.45 Å/pixel, 2 frames/s for 15 s, and an exposure rate of 1.2 e − /Å 2 /frame (Supplementary Table 2 and Supplemantary Table 3). Images were converted to mrc format using dm2mrc 27 .

Stock solutions of acetyl-CoA, malonyl-CoA, and NADPH were prepared at a concentration of 10 mM in TBS buffer. For the AT and MPT double mutant FAS construct (S274A - S1808A), 1 μL of either acetyl-CoA or malonyl-CoA stock solutions were diluted with TBS to 5 μL before addition to 10 μg (at 2 mg/ml) of purified FAS, before application onto cryoEM grids.

For KR (Y839A), DH (H1564A), and ER (H740A) mutants, 100 nmol NADPH and 50 nmol malonyl-CoA were added to the pooled and concentrated HisTrap fractions (final volume 0.5 ml) and incubated for 1 h at room temperature. Substrates were removed by gel filtration as described above. In total, 10 μg (at 2 mg/ml) of purified FAS was mixed with a 5-μL solution containing 10 nmol acetyl-CoA, 25 nmol NADPH, and 15 nmol malonyl-CoA. Samples were kept on ice for 30 min before application onto cryo-EM grids.

For the WT FAS, 10 μg of purified FAS at 2 mg/ml was mixed with solutions containing either 5 μL of TBS (for the apo sample), or 5 μL of TBS containing 10 nmol acetyl-CoA, 25 nmol NADPH, and 15 nmol malonyl-CoA (for turn-over conditions) on ice, respectively. Samples were applied onto the cryoEM grids immediately after the addition of TBS plus substrates.

Image processing

Data presented in Supplementary Table 2 were processed with cryoSPARC 2.0 28 . Movies were aligned by alignframe_lmbfgs implemented in cryoSPARC 2.0 29 . CTF estimation was done with CTFFIND4 30 . Particle motion correction was performed with alignpart_lmbfgs implemented in cryoSPARC 2.0 29 . High resolution refinement was done with the homogenous refinement algorithm using particles selected from reference free 2D classification. A 30-Å low-pass filtered cryoEM map was generated from PDB: 2UV8 7 with ACP atoms deleted from the model. This map was used as the initial reference in the homogenous refinement. Model to map conversion was carried out in UCSF Chimera 31 . Low-pass filtering of refined maps was carried out using the ‘relion_image_handler’ command. All one-voxel-thin slices were generated using XIMDISP 32 .

Data presented in Supplementary Table 3 were processed in Relion 3.0 33 . Movies were aligned with the Relion implementation of MotionCor2 and CTF estimation was performed using CTFFIND4. Following 2D classification, all 3D classification was done with C1 symmetry using a 30-Å low-pass filtered cryoEM map generated from PDB 2UV8 with ACP atoms deleted as the initial reference. Particle images were selected from 3D classes and refinement was done with C1 symmetry. The refined maps were aligned to the D3 symmetry axis and a second refinement was carried out with D3 symmetry imposed. The reference was aligned to the symmetry axis using the ‘relion_align_symmetry’ command.

Focused classification

A mask for focused classification was made by rigid body docking of a model of a β-chain protomer and the ACP domain from an α-chain protomer from the FAS crystal structure (PDB: 2UV8) to an asymmetric unit of the D3 refined map of the DH-stalled FAS. Residues from the ER and DH domains of the β-chain were selected based on proximity to the observed ACP density in the DH-stalled state and the domain boundaries identified in a previous crystallographic study of S. cerevisiae FAS 7,8 . The residues were 601–704 (ER domain, encompassing the ACP binding sites observed in C. albicans e T. thermophilum) and residues 1236–1658 (DH pseudo-dimer). ACP residues 140–302 from the α-chain of FAS (PDB: 2UV8) were rigid body docked into the D3 refined map of DH-stalled FAS in the asymmetric unit with the docked β-chain fragments. This model comprising partial segments of ER and DH domains plus the whole ACP domain docked at the observed ACP density in the DH-stalled state was used to generate the initial reference and was low-pass filtered to 15 Å for the focused classifications described below. To create a mask that covered the partial model and the position of the ACP in the ER binding mode, we expanded the aforementioned partial model of ER-DH -ACP DH by including a second model of the ACP domain docked at the ER binding site based on homology to previously observed ACP bound to ER in fungal FAS (PDB: 6U5V) 14 . A 15-Å resolution mask (i.e. focused mask) comprising the residues mentioned above was generated with UCSF chimera and Relion 3.0. The focused mask was extended by 3 pixels (1.45 Å/pixel) with 3 pixel padding. This mask was subtracted from a mask generated from the D3 refined map of DH-stalled FAS to produce a subtracted mask. The subtracted mask was then multiplied by the map and the ‘modified map’ containing all regions of FAS except for the region defined by the focused mask, was used for subsequent steps.

The rotation matrix for each asymmetric unit of FAS (i.e. α-,β-chain heterodimer) was computed using the original particle images with alignment information from the D3 symmetry refinement (done in Relion 3.0) via the ‘relion_particle_symmetry_expand’ command 20,34 . Different projections from the ‘modified map’ were then generated based on orientation information from the D3 symmetry refinement. These projections were subtracted from the symmetry expanded particle images. Subtracted images were used for focused 3D classification without orientation search in Relion 3.0 with an optimized regularization parameter of 500. The focused refinement was done in cryoSPARC 2.0 by importing the subtracted particle data set from Relion 3.0 belonging to the ACP containing 3D class in Fig. 3 (i.e. Class 1 in Supplementary Fig. 5) low-pass filtered to 20 Å as the initial reference. The mask for the cryoSPARC focused refinement was generated using the initial reference map in Relion 3.0 and low-pass filtered to 15 Å and expanded by 3 pixels with 3 pixels padding. A B factor of 344 was estimated using Guinier plot analysis implemented in cryoSPARC and used for map sharpening. A local resolution estimate of the focused refined map was done using cryoSPARC 2.0.

Model fitting and visualization

Model fitting was done by rigid body docking of the selected regions of ER, DH, and ACP domains, as described in the manuscript text, into the cryoEM maps of the stalled complexes. An atomic model of FAS (PDB: 2UV8 7 ) was used for docking. Maps and models were visualized with UCSF chimera 31 and PyMol 35 . Flexible fitting was done for Fig. 4b and Supplementary Fig. 6d using PHENIX real space refinement with the resolution limited to 6 Å. The Ramachandran statistics were: 83.8% favored, 15.85% allowed, and 0.35% outlier. For the distance measurements reported in Figs. 4b and 5, side chain conformations for residues H740, D1559, and H1564 were from PDB: 2UV8.

Alinhamento de sequência

Non-redundant protein sequences corresponding to the subphylum Saccharomycotina (i.e. true yeast, taxonomy id: 147537) were chosen for alignment using BLASTp 36 . The β-chain sequence of S. cerevisiae FAS was chosen as the search template. A maximum number of 100 sequences was chosen for initial display. Sequences belonging to different strains of S. cerevisiae were excluded from the analysis. The remainder encompassed 58 sequences from other species of Saccharomycotina (Supplementary Data 2). Multiple sequence alignment was done with Clustal Omega 37 . LOGO plots were generated via the WebLogo server 38 with the y-axis set to represent frequency of amino acids plotted against amino acid number (based on S. cerevisiae sequence) on the x-axis.

Resumo do relatório

Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary vinculado a este artigo.


22.4.7. Citrato carrega grupos acetil da mitocôndria para o citosol para síntese de ácidos graxos

The synthesis of palmitate requires the input of 8 molecules of acetyl CoA, 14 molecules of NADPH, and 7 molecules of ATP. Fatty acids are synthesized in the cytosol, whereas acetyl CoA is formed from pyruvate in mitochondria. Hence, acetyl CoA must be transferred from mitochondria to the cytosol. Mitochondria, however, are not readily permeable to acetyl CoA. Recall that carnitine carries only long-chain fatty acids. The barrier to acetyl CoA is bypassed by citrate, which carries acetyl groups across the inner mitochondrial membrane. Citrate is formed in the mitochondrial matrix by the condensation of acetyl CoA with oxaloacetate (Figure 22.25). When present at high levels, citrate is transported to the cytosol, where it is cleaved by ATP-citrate lyase.

Lyases-

Enzymes catalyzing the cleavage of C-C, C-O, or C-N bonds by elimination. A double bond is formed in these reactions.

Figure 22.25

Transfer of Acetyl CoA to the Cytosol. Acetyl CoA is transferred from mitochondria to the cytosol, and the reducing potential NADH is concomitantly converted into that of NADPH by this series of reactions.

Thus, acetyl CoA and oxaloacetate are transferred from mitochondria to the cytosol at the expense of the hydrolysis of a molecule of ATP.


Conclusão

Type II PKSs manufacture many structurally complex and bioactive organic molecules that serve as important antibiotics and anticancer agents. ACPs play a pivotal role in these biosynthetic processes by interacting with virtually all building blocks, intermediates, and enzymes throughout the manufacturing of polyketide products. Engineering strategies, such as hybrid synthase production, precursor-directed biosynthesis, mutagenesis, metabolic engineering, and combinatorial biosynthesis, all rely in some way on the ability of the ACP to function with noncognate enzyme partners and/or molecular substrates. Therefore, understanding the molecular-level structure and function relationships of type II PKS ACPs will be crucial to harnessing the power of nature’s molecular assembly lines. A fully integrated approach to studying type II PKS ACP mechanisms and structures will be important, and we envision that the needle of the field will be moved by merging MD simulations with bioinformatics, mutagenesis work, probe applications, structural characterization techniques, and biochemical assays. With routes to access KSCLF samples that were previously difficult to obtain and recent advances in protein structure prediction software, it is an exciting time to uncover the molecular underpinnings of these remarkable systems.


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