Em formação

As proteínas desnaturantes levam à perda de epítopos?


Estou fazendo um experimento em que tenho que fazer imunohistoquímica e SDS-PAGE. Estou assumindo que a conformação nativa da proteína é mantida no IHC. Mas durante o blot, aquecemos a proteína (pelo menos em nosso laboratório) a 95oC em mercaptoetanol para desnaturar a proteína quebrando as ligações dissulfeto, destruindo assim a estrutura terciária.

Minha pergunta é quando estamos usando o mesmo anticorpo contra a proteína no tecido (intacto para IHC) e proteína isolada (desnaturada para SDS-PAGE), como pode ligar ambos? Assim, os anticorpos se ligam ao epítopo com base na sequência AA ou na conformação 3D? Não haveria muita reatividade cruzada se ele se ligasse apenas com base na sequência (já que você poderia ter a mesma sequência em muitas proteínas, ter a mesma conformação é muito menos provável)?


Muitos, mas não todos os epítopos de células B, serão destruídos por desnaturação. Aqueles que são conformacionais serão destruídos, mas também existem muitos epítopos de células B que são lineares, baseados apenas na sequência de aminoácidos, sem forte dependência de conformação.

Além disso, dependendo do seu protocolo de IHC, muitas vezes há uma etapa de fixação que envolve uma certa quantidade de desnaturação, embora raramente tão drástica como no immunoblotting. Por outro lado, algumas proteínas são capazes de pelo menos alguma restauração da conformação nativa após se ligarem ao seu substrato de blotting.

Resumindo, é imprevisível, mas funciona com freqüência suficiente para que valha a pena tentar.


Resposta curta - Se o mesmo anticorpo funcionar tanto para IHC quanto para SDS-PAGE, isso significa que é monoclonal contra um epítopo linear de superfície ou um anticorpo policlonal.

Resposta longa -

Para começar, existem basicamente dois tipos de anticorpos com base no tipo de epítopos. O epítopo pode ser linear ou conformacional. Aqui estão algumas fotos que devem esclarecer.

Agora chegando às técnicas, em IHC embora haja pouca desnaturação, pode-se esperar que a conformação esteja intacta. Por outro lado, SDS-PAGE requer a proteína a ser desenhada em estruturas lineares para que possam passar pelo gel.

Quando o fabricante diz que o anticorpo é monoclonal e pode ser usado tanto para IHC quanto para o blot (os fabricantes mencionam a compatibilidade do anticorpo com diferentes técnicas e espécies), é mais provável que seja derivado de um peptídeo linear na superfície da proteína . Isso significa que funcionaria para IHC (uma vez que precisa de um epítopo de superfície) ou SDS-PAGE (que precisa de um epítopo linear). Lembre-se de que um epítopo de superfície pode ser conformacional ou linear. Os Abs monoclonais são produzidos pela técnica de hibridoma.

Por outro lado, se o anticorpo é policlonal, é muito mais provável que este conjunto contém alguns IgGs que ligam epítopos lineares e alguns que ligam epítopos de superfície. Assim, um anticorpo policlonal tem muito mais probabilidade de funcionar em SDS PAGE e IHC. Também é um pouco mais fácil de produzir, uma vez que é essencialmente apenas anti-soros purificados de um animal que foi imunizado com o antígeno de interesse.


Efeitos biológicos de choque elétrico e desnaturação por calor e oxidação de moléculas, membranas e funções celulares

A exposição direta de células em suspensão a pulsos elétricos intensos é conhecida por produzir danos às membranas celulares e organizações supramoleculares das células, e desnaturação de macromoléculas, bem como lesões e rupturas observadas em pacientes com trauma elétrico. Assim, o sistema tem sido usado como um modelo de laboratório para investigar as bases bioquímicas da lesão elétrica. Um pulso elétrico intenso pode produzir dois efeitos principais nas células - um causado pelo campo, ou potencial elétrico, e outro pela corrente, ou energia elétrica. O potencial transmembrana induzido por campo pode produzir mudanças eletroconformacionais de canais iônicos e bombas de íons e, quando o potencial excede a resistência dielétrica da membrana celular (aproximadamente 500 mV para uma largura de pulso de alguns ms), danos eletroconformacionais e eletroporações de proteínas de membrana e bicamadas lipídicas. Esses eventos levam à passagem de corrente elétrica através das células porosas da membrana e ao aquecimento das membranas celulares e do conteúdo citoplasmático. A subseqüente desnaturação das membranas celulares e macromoléculas citoplasmáticas ocasiona muitas reações bioquímicas complexas, incluindo a oxidação de proteínas e lipídios. Os efeitos combinados podem paralisar as células além do reparo. Esta comunicação se concentrará nos efeitos térmicos do choque elétrico. Após uma breve revisão do estado atual do conhecimento sobre desnaturação térmica de enzimas solúveis e proteínas musculares, este artigo descreverá experimentos sobre a desnaturação térmica de componentes e funções celulares, como nucleossomos, e a cadeia de transporte de elétrons e enzimas sintéticas de ATP do membranas internas mitocondriais. Os dados mostrarão que a peroxidação lipídica e a subsequente perda da capacidade de transdução de energia das células podem ocorrer mesmo em temperaturas moderadas entre 40 graus C e 45 graus C. No entanto, a peroxidação lipídica pode ser evitada com reagentes redutores, como mercaptoetanol, ditiotreitol, e ácido ascórbico. A reativação de proteínas celulares desnaturadas e funções também pode ser possível e uma estratégia para fazer isso é discutida.


Introdução

A alergia alimentar é um grande problema de saúde e uma preocupação crescente nos países ocidentais [1–4]. Os mecanismos subjacentes à alergia mediada por IgE são apenas mal resolvidos. A compreensão dos mecanismos moleculares básicos envolvidos na indução da alergia alimentar é baseada no conhecimento dos sítios de ligação dos anticorpos nos alérgenos, os epítopos. Compreender a natureza dos epítopos indutores de IgE irá elucidar como o potencial alergênico se relaciona com a estrutura da proteína. Este é também o “terreno fértil” para o desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas, profiláticas e terapêuticas para a alergia alimentar. Os epítopos de anticorpos são divididos em epítopos lineares e conformacionais, com base na proximidade dos aminoácidos na sequência primária da proteína que está envolvida na ligação do anticorpo. Os epítopos constituídos por um trecho contínuo de aminoácidos são designados epítopos lineares, enquanto os epítopos constituídos por aminoácidos distantes uns dos outros na estrutura primária, mas reunidos pelo dobramento secundário, terciário ou quaternário da proteína, são designados epítopos conformacionais [5, 6 ] Os epítopos de ligação de anticorpos são geralmente considerados de natureza conformacional [7–10]. No entanto, para alérgenos alimentares, de longe a maioria dos epítopos lineares foram identificados e uma importância particular para este tipo de epítopos foi sugerida na doença alérgica alimentar mediada por IgE [11].

A estrutura tridimensional (3D) define os resíduos de aminoácidos na superfície de um alérgeno disponíveis para a ligação do anticorpo. Assim, a acessibilidade de um determinado epítopo pode ser grandemente influenciada pelo dobramento estrutural do alérgeno. Os alérgenos alimentares possuem diferentes propriedades químicas de proteínas e, portanto, diferem em sua estabilidade estrutural. O microambiente, como pH, força iônica, ligação a outras moléculas e / ou o estado de degradação, podem afetar essa estabilidade, portanto, em vários graus dependendo do alérgeno. Essas mudanças ambientais ocorrem durante o processo digestivo no trato gastrointestinal (GI) e afetam muito o dobramento do alérgeno e, portanto, a forma em que o alérgeno é apresentado ao sistema imunológico. Desse modo, a passagem pelo trato GI pode ter um grande impacto no número e tipo de epítopos acessíveis para ligação de anticorpos.

Para estudar a formação de anticorpos dirigidos contra alérgenos alimentares em um ambiente controlado, são necessários modelos animais. Existem vários modelos animais para alergia alimentar, diferindo na escolha da via de administração, uso de adjuvante e se o alérgeno é administrado sozinho ou como parte de um alimento completo. O impacto de tais escolhas nas especificidades dos anticorpos produzidos não está totalmente resolvido.

A alergia ao leite de vaca (CMA) é o tipo mais comum de alergia alimentar mediada por IgE em crianças pequenas, afetando cerca de 2,5% das crianças com menos de 3 anos [12, 13]. O leite de vaca contém cerca de 20 proteínas capazes de induzir alergia mediada por IgE [14], das quais 10 são relatadas no banco de dados oficial de nomenclatura de alergênicos da Organização Mundial de Saúde e União Internacional de Sociedades Imunológicas (OMS / IUIS) (http: // www .allergen.org). β-lactoglobulina (BLG) oficialmente designada como Bos d 5, α-lactalbumina (ALA) oficialmente designada como Bos d 4 e as caseínas, oficialmente designadas como Bos d 8, são os mais importantes e principais alérgenos do leite de vaca [15]. Esses alérgenos possuem diferentes características químicas de proteínas, algumas das quais podem influenciar sua capacidade de indução de alergia em quantidade e também na qualidade, como estabilidade estrutural ao processamento, incluindo a digestão [15-18].

O objetivo deste estudo foi investigar a importância relativa dos epítopos de anticorpos lineares versus conformacionais dos três alérgenos do leite de vaca BLG, ALA e β-caseína. A desnaturação das proteínas resultará no desdobramento da estrutura do alérgeno nativo. Assim, os epítopos lineares são mantidos, mas há uma perda consequente de epítopos conformacionais [16]. Portanto, a razão relativa de epítopos de ligação de anticorpo linear e conformacional pode ser identificada medindo a diminuição (ou aumento) na ligação de anticorpo após a perda da estrutura 3D nativa devido ao processo de desnaturação [6]. Aproveitamos as vantagens desta abordagem para comparar a capacidade de ligação com BLG nativa e desnaturada, ALA e β-caseína de anticorpos IgG1 e IgE produzidos em ratos Brown Norway (BN) doseados i.p. ou por via oral. Além disso, objetivamos estudar a influência da co-administração com outras proteínas na quantidade de anticorpos produzidos em ratos BN.


RESULTADOS

Condições de estimulação para indução de fosfoproteína

Para avaliar várias técnicas quanto à sua capacidade de medir de forma eficiente e reprodutível eventos de fosforilação de proteínas dentro das células, as condições de estimulação que produziram a indução de cascatas de quinase tiveram que ser determinadas. As células T Jurkat e as células monocíticas U937 foram testadas quanto à sua resposta a vários estímulos, incluindo PMA, PMA e ionomicina, anisomicina, IFN-γ, IL-4 e GM-CSF (Fig. 1). Após a estimulação, as células foram divididas por Western blotting ou análise de fluxo de fosfo-proteína com mAbs pERK, pp38, pJNK, pStat1, pStat5 e pStat6. A Figura 1 mostra os resultados da análise de citometria de fluxo com o protocolo otimizado delineado neste trabalho, a fim de determinar a validade dos estímulos utilizados. As células foram estimuladas, fixadas com 1,5% de formaldeído (PFA), permeabilizadas com metanol gelado e, em seguida, coradas à temperatura ambiente com os mAbs específicos de fosfo marcados com fluorescência indicados.

A análise de citometria de fluxo dos níveis de fosfo-epítopo correlaciona-se com as técnicas de Western blotting.UMA: As células Jurkat foram não estimuladas ou tratadas com PMA (50 nM) ou PMA (50 nM) e ionomicina (IO, 1 μM) ou anisomicina (2 μg / ml) por 10 min a 37 ° C. As células foram então divididas e lisadas para análise de Western blot ou fixadas com formaldeído e permeabilizadas com metanol para análise de citometria de fluxo (usando técnicas ótimas, conforme discutido no texto) com pERK1 / 2 Alexa (Ax) 488, pp38 Ax647 ou pJNK Ax647. Os mAbs não conjugados foram usados ​​para Western blots. As amostras não estimuladas aparecem como traços abertos nos gráficos FACS. B: As células U937 foram deixadas sem estimulação ou tratadas com IFN-γ (50 ng / ml), IL-4 (10 ng / ml) ou GM-CSF (10 ng / ml) durante 10 min a 37 ° C. As células foram divididas como acima e analisadas com pStat1 Ax488, pStat5 Ax488 e pStat6 Ax647. Observe que há uma forte correlação entre Western blotting e análise de citometria de fluxo com níveis intermediários de pp38 e pStat5 discerníveis por ambos os métodos.

Como pode ser visto na Figura 1, a análise de fosfo-proteína por citometria de fluxo se correlaciona bem com Western blotting. Em células Jurkat, PMA (com ou sem ionomicina) estimula PKC, que é conhecido por estar a montante da ativação de ERK de ERK foi confirmado por análise Western e FACS. JNK e p38 respondem a vários estresses celulares e são ambos ativados em resposta à anisomicina, um inibidor da tradução de proteínas. Os níveis intermediários de pp38 são evidentes com estimulação de PMA e PMA / ionomicina por ambos os métodos experimentais. Em células U937, as vias de sinalização cognatas esperadas foram ativadas por meio das citocinas aplicadas. Em particular, IFN-γ e IL-4 sinalizados seletivamente por meio de pStat1 e pStat6, respectivamente. Stat5 foi ativado mais fortemente por GM-CSF, mas níveis intermediários foram observados após estímulos de IFN-γ e IL-4. Assim, está claro que a análise de citometria de fluxo de fosfo-proteínas é capaz de medir os estados on-off, bem como níveis graduais de ativação.

Análise de técnicas de fixação e permeabilização para análise de fosfo-proteína

Depois de encontrar estímulos que induziam de forma consistente fosfoepítopos nas duas linhas celulares testadas, passamos a testar um painel de métodos de fixação e permeabilização quanto à sua capacidade de mostrar a maior razão de fluorescência de células tratadas para não tratadas (Fig. 2A). Duas técnicas gerais foram empregadas. Os métodos 1-3 usaram solventes orgânicos para desidratar as células e simultaneamente fixá-las e permeabilizá-las. Os métodos 4-10 empregaram primeiro uma etapa de fixação com formaldeído (10 min) antes da permeabilização com solventes orgânicos, Triton X-100 ou saponina. O glutaraldeído também foi testado como fixador, mas devido ao aumento de fundo e à ligação não específica do mAb, não incluímos esses resultados aqui (dados não mostrados). Ao usar Triton como um reagente de permeabilização, as células foram tratadas com este agente, então lavadas com meio de coloração e coradas na ausência de Triton. Esta técnica diminuiu o número de células perdidas para a lise do detergente ao longo do protocolo e melhorou a intensidade do sinal. Quando a saponina foi usada, ela foi mantida em uma concentração constante em tampões de coloração em todos os momentos, e também estava presente em tampões de lavagem.

As diferenças nas técnicas de fixação e permeabilização sugerem um protocolo ideal. UMA: Dez métodos de fixação / permeabilização (métodos de perm) foram testados quanto à sua capacidade de mostrar o deslocamento máximo na coloração de fosfo-epítopo em resposta à estimulação das linhas celulares modelo. Os histogramas FACS mostram um experimento representativo no qual as células U937 foram tratadas com IFN-γ (50 ng / ml) por 10 min, depois fixadas com formaldeído a 1,5% (PFA) (métodos 4-10), permeabilizado com vários reagentes por 10 min , e corado com pStat1 Ax488 por 30 min. Os histogramas abertos representam gráficos preenchidos de células não estimuladas indicam células tratadas. Observe que houve grandes diferenças para a coloração de pStat1 entre solventes orgânicos (métodos 4-6) e reagentes de permeabilização típicos, como saponina e Triton X-100 (métodos 7-10). B: Resumo das alterações de dobra medidas com fosfo-mAbs pelos 10 métodos de permeabilização. As células U937 foram estimuladas com IFN-γ (50 ng / ml) e GMCSF (10 ng / ml) durante 10 min, e coradas com pStat1 Ax488 e pStat5 Ax647. As células Jurkat foram expostas a PMA (50 nM) e ionomicina (1 μM) por 10 min e analisadas quanto aos níveis de pERK1 / 2 (Ax488) e pp38 (Ax647). Os dados representam a média de três experimentos independentes, nos quais as tendências mostradas foram extremamente consistentes. O eixo direito representa a mudança de dobra de pStat1. Mudança de dobra = MFIestímulo/ MFIdesestimular.

A Figura 2B mostra os resultados obtidos pelas várias técnicas com pERK, pp38, pStat1 e pStat5. Mudanças de dobra (MFIestímulo/ MFIdesestimular) foram calculados para que os dados FACS pudessem ser visualizados em formato gráfico para comparação. O método 4, que empregou uma fixação de formaldeído de 10 min à temperatura ambiente, seguida de permeabilização de metanol por 10 min a 4 ° C, mostrou os melhores resultados para pERK, pStat5 e pStat1 e foi comparável aos métodos 3, 5 e 6 para pp38. A combinação de formaldeído com solventes orgânicos (metanol, etanol ou acetona) foi significativamente melhor do que solventes orgânicos isoladamente ou combinações de formaldeído-detergente para pErk, pStat1 e pStat5 (P & lt 0,05). Para pStat1, o formaldeído em combinação com metanol forneceu uma alteração maior do que o formaldeído com etanol ou acetona (P & lt 0,05). A análise de pp38 foi aproximadamente equivalente entre os métodos de solvente de formaldeído ou solvente apenas. Triton e saponina foram amplamente ineficazes como reagentes de permeabilização no contexto desses mAbs, exceto para pp38, em que forneceram intensidades de coloração aceitáveis. Pareceu, entretanto, que a saponina, um produto natural isolado por extração, diferia em eficácia devido às variações de lote do fabricante e era inconsistente em nossas condições de teste. Nestes experimentos, a fixação de formaldeído seguida de permeabilização de metanol foi robusta e consistente entre os experimentos.

Para pERK, pp38 e pStat5, o uso de solventes orgânicos sozinhos (métodos 1-3) proporcionou uma boa coloração. A aplicação de um protocolo de fixação / permeabilização em uma etapa é atraente devido à sua facilidade técnica, no entanto, existem duas vantagens principais na fixação com formaldeído antes da permeabilização. Primeiro, o formaldeído parece estabilizar a estrutura celular geral ao tratar posteriormente com metanol (Fig. 3). Quando as linhas de células são o alvo da análise, isso pode não ser motivo de preocupação. No entanto, em populações complexas, como esplenócitos murinos, as propriedades de dispersão podem ser uma ferramenta de diagnóstico útil na análise e, portanto, devem ser feitos esforços para manter as propriedades de dispersão. Conforme mostrado na Figura 3, o metanol sozinho levou a um grande aumento na dispersão lateral que foi amplamente eliminada pelo tratamento anterior com formaldeído. O formaldeído em si não altera significativamente as propriedades de dispersão. O tratamento com tritão ou saponina após a fixação causou uma pequena diminuição na dispersão lateral. O trabalho está em andamento para estabelecer os efeitos nos marcadores de superfície - na maioria dos casos, não observamos alterações na ligação de anticorpos aos epítopos de superfície, mas em certos casos observamos a perda completa de ligação que é dependente do clone e do epítopo (dados não mostrados). A segunda vantagem de usar formaldeído antes do tratamento com solvente orgânico é a fixação de formaldeído técnico evita a aglutinação que normalmente é observada quando as células são imediatamente expostas aos álcoois.

O formaldeído mantém as propriedades de dispersão das células permeabilizadas. Esplenócitos murinos foram tratados com tampão de lise de glóbulos vermelhos e, em seguida, colocados em RPMI suplementado com FBS a 10% por 1 h. As células foram então deixadas sem tratamento, permeabilizadas diretamente com metanol ou fixadas com formaldeído (PFA) e então permeabilizadas com vários reagentes. Uma porta foi desenhada em torno dos linfócitos na amostra não fixada para servir como uma referência para os efeitos na dispersão causada pela fixação / permeabilização. Os números indicam a porcentagem de células na porta dos linfócitos.

Otimização da porcentagem de fixação, tempo e temperatura

O método formaldeído / metanol (método 4) foi posteriormente testado e otimizado para determinar os parâmetros que são críticos para o sucesso experimental. O primeiro aspecto examinado foi a etapa de fixação do PFA. Os experimentos iniciais usaram PFA em uma concentração de 1,5% por 10 min a 37 ° C (5). Concentrações de PFA de 0,5% a 3% (por 10 min) foram testadas, com 0,5% mostrando níveis de coloração ligeiramente inferiores a 1,5% e 3%, respectivamente (dados não mostrados). A fixação foi realizada adicionando PFA diretamente ao meio de cultura, para garantir o congelamento rápido dos níveis de fosforilação dentro das células. Como as células devem ser removidas das incubadoras para adicionar PFA, testamos se a fixação à temperatura ambiente é diferente de 37 ° C (Fig. 4B). Novamente, nenhuma diferença foi aparente, portanto, a fixação RT foi adotada devido à sua simplicidade. Finalmente, o tempo de fixação foi testado. Ao comparar as alterações de dobra usando MFIs das populações, curtos tempos de fixação, como 1 min produziram aproximadamente 30% de coloração mais fraca do que a fixação por 30 min para pp38 (Fig. 4A). No entanto, a fixação por 30 min diminuiu a alteração da dobra da coloração de pStat1 em aproximadamente 35%. Essas diferenças não parecem grandes em uma escala logarítmica (na verdade, são quase imperceptíveis), mas, não obstante, são significativas. Para o trabalho qualitativo, parece que pequenas alterações na concentração de formaldeído e no tempo de fixação têm apenas efeitos menores nas intensidades de coloração. No entanto, para trabalho quantitativo, deve-se tomar cuidado para manter esses parâmetros constantes, pois pequenas diferenças no resultado podem levar à variabilidade experimental. A fixação por 10 min geralmente parece funcionar de forma robusta e foi adotada como o tempo padrão de fixação.

Os tempos de fixação, permeabilização e coloração são flexíveis. UMA: As células Jurkat foram estimuladas com PMA (50 nM) e ionomicina (1 μM) (histogramas preenchidos) ou deixadas sem tratamento (histogramas abertos) e coradas para pp38 após fixação com formaldeído a 1,5% por 1, 10 ou 30 min e permeabilização em metanol por 10 min. As células U937 foram tratadas com IFN-γ (50 ng / ml), em seguida, fixadas como acima e coradas para pStat1. B: As células U937 foram estimuladas com IFN-γ ou GM-CSF (10 ng / ml) e depois fixadas com formaldeído a 1,5% à temperatura ambiente (20 ° C) ou 37 ° C durante 10 min e permeabilizadas em metanol durante 10 min. As células foram subsequentemente coradas com mAbs pStat1 e pStat5. C: As células Jurkat e U937 foram deixadas sem tratamento ou estimuladas com PMA e anisomicina (1 μg / ml) ou com IFN-γ e IL-4, respectivamente. No estágio de permeabilização do metanol, as células foram armazenadas por 10 min, 1 semana ou 5 semanas a -20 ° C antes da coloração com os mAbs indicados por 30 min em RT. As amostras não estimuladas (histogramas abertos) são mostradas acima das amostras estimuladas (histogramas preenchidos). D: As células Jurkat e U937 foram tratadas como em C, depois fixadas com formaldeído, permeabilizadas por 10 min com metanol e coradas por 15, 30 ou 60 min à TA com os mAbs indicados. Os gráficos mostrados são representativos de pelo menos dois experimentos independentes.

O efeito da permeabilização de metanol / tempo de armazenamento e coloração

A etapa de permeabilização de metanol foi examinada quanto aos seus efeitos na coloração de fosfo-epítopo geral por FACS. A permeabilização por 10-30 min foi encontrada para ser idêntica em vários experimentos realizados, portanto, tempos de permeabilização mais longos foram testados. As amostras foram coradas com quantidades idênticas de mAbs após vários períodos de tempo em metanol. Quando as amostras foram armazenadas a 4 ° C, a coloração de pERK, pp38, pStat1 e pStat6 diminuiu até 50% durante a noite e continuou a decair lentamente ao longo de 1 semana (dados não mostrados). No entanto, quando armazenado em temperaturas mais baixas (−20 ° C ou −80 °), o sinal diminuiu 10-20% durante a noite, mas depois permaneceu quase constante por 1-5 semanas, diminuindo 1-5% por semana (Fig. 4C) . Novamente, é preciso manter essas diminuições em mente para o trabalho quantitativo. A coloração de pStat6 foi particularmente interessante, uma vez que as amostras estimuladas e não estimuladas mostraram uma diminuição da intensidade de coloração ao longo do tempo. Portanto, parece que o tratamento de 10 min com metanol é ideal, mas as amostras podem ser facilmente armazenadas a -20 ° para armazenamento de longo prazo e análise posterior (pelo menos por 5 semanas).

A coloração com mAbs específicos para fosfo foi realizada durante 30 min à temperatura ambiente em todas as experiências iniciais. A variação do tempo de coloração levou a resultados diferentes, dependendo do anticorpo usado (Fig. 4D). Quando coradas por 15 min, as amostras tendiam a ter um nível mais baixo de coloração, tanto em amostras estimuladas como não estimuladas, de modo que a mudança de dobra era aproximadamente a mesma que quando coradas por 30 min. Tempos de coloração mais longos tendem a aumentar o nível de ligação inespecífica, especialmente para pStat6, onde a mudança de dobra diminuiu de 9,3 (quando tingido por 15 min) para 6,5 ​​(quando tingido por 1 h). Para pStat1, no entanto, a coloração por 1 h aumentou a alteração observada em aproximadamente 50%, de 11 a 16 vezes. O tempo de coloração não afetou de forma apreciável os níveis de coloração pp38 e pERK. Estes dados mostram que os vários epítopos podem ser diferencialmente acessíveis por mAbs e que existem variações entre os mAbs para a cinética de ligação. Geralmente, no entanto, 30 min forneceram bons níveis de coloração para todos os mAbs testados e, portanto, foi adotado para coloração padrão (incluindo pJNK e pStat5, dados não mostrados).

Estabilidade de fosfoepítopos antes e depois da coloração

Como mostrado acima, as amostras podem ser armazenadas em metanol por até um mês com pequena perda de coloração de fosfo-epítopo. Portanto, examinamos o quão estáveis ​​os fosfoepítopos eram no meio de coloração (PBS com BSA a 1%) (Fig. 5A). Surpreendentemente, mesmo depois de ser armazenado durante a noite a 4 ° C em meio de coloração (após tratamento com PFA / metanol), os níveis de pERK e pp38 permaneceram altos, embora os sinais tenham diminuído 10-30%. Esta experiência mostra que as fosfo-proteínas são relativamente estáveis ​​mesmo no meio de coloração usado, e que a combinação de PFA e metanol evita de forma eficiente a ação das fosfatases celulares.

Os fosfoepítopos são amplamente estáveis ​​antes e depois da coloração. UMA: As células Jurkat foram tratadas com PMA ou anisomicina (gráficos preenchidos) ou deixadas sem estimulação (gráficos abertos). Eles foram fixados e permeabilizados com metanol, então corados imediatamente com pERK Ax488 ou pp38 PE, ou incubados em meio de coloração (PBS + 1% BSA) durante a noite a 4 ° C, antes da coloração subsequente. B: As células U937 foram estimuladas com IFN-γ ou GM-CSF (gráficos preenchidos), depois fixadas, permeabilizadas e coradas com pStat1 Ax488 e pStat5 Ax647. As células foram incubadas em meio de coloração a 4 ° C por 4-16 h antes da análise FACS.

A Figura 5B mostra as amostras analisadas imediatamente após a coloração e 4-16 h após a coloração. Mais uma vez, a intensidade da fluorescência permaneceu alta mesmo na ausência de fixação adicional com PFA, porque as alterações de dobra variaram menos de 5% entre os diferentes tempos de aquisição. Isso sugere que esses mAbs, conforme usados ​​aqui, têm taxas de desativação extremamente lentas. Os níveis de pERK e pp38 também eram estáveis ​​após incubação durante a noite (dados não mostrados). Quando as amostras armazenadas durante a noite na mídia antes da coloração são comparadas com as amostras armazenadas durante a noite na mídia após a coloração, pode-se observar que a coloração com mAbs leva à estabilização dos epítopos, ou seja, a ligação de mAbs ao seu antígeno protege o antígeno da decomposição (25). Assim, os dados sugerem que se pode armazenar com segurança as amostras coradas durante a noite a 4 ° C antes da análise.

Marcação de fluoróforo e titulação de mAbs específicos para fosfo

Para testar a eficácia relativa de dois fluoróforos diferentes, os mAbs foram marcados com Alexa Fluor 488 ou 647, dois fluoróforos de molécula pequena. Essas moléculas têm a vantagem de serem extremamente brilhantes e fotoestáveis, além de possuírem propriedades espectrais adequadas para citometria de fluxo. Além disso, eles podem ser usados ​​sem compensação devido às grandes diferenças em seus espectros de emissão. Como a fixação de formaldeído muitas vezes leva a aumentos na autofluorescência celular na região verde do espectro (isto é, perto da emissão de Alexa 488), testamos se um dos fluoróforos era superior para a coloração de fosfo-epítopo por citometria de fluxo (Tabela 1). Os dados resumem pelo menos três experiências independentes usando mAbs marcados com Alexa 488 ou 647 em diferentes alíquotas das mesmas amostras tratadas. A alteração de dobra foi calculada como na Figura 2. Os conjugados de Alexa 647 produziram alterações de dobra maiores para todos os cinco mAbs testados, com diferenças significativas vistas para pp38 e pStat1 (P & lt 0,05). No entanto, ambos os fluoróforos trabalharam satisfatoriamente com todos os mAbs, proporcionando a possibilidade de realizar experimentos multicoloridos nos quais mais de um fosfo-epítopo é medido de cada vez (ver abaixo).

Mudança de dobra - uma mudança de dobra, MFIestímulo/ MFIdesestimular. As condições de estimulação foram como nas figuras acima.
Alexa 488 Alexa 647
pERK 4,6 ± 0,9b b SD obtido a partir de pelo menos 3 experiências independentes.
5.5 ± 1.2
pp38 8.1 ± 1.3 17,1 ± 3,0c c P & lt 0,05 em par t-teste.
pStat1 12.4 ± 2.5 42 ± 7,8c c P & lt 0,05 em par t-teste.
pStat5 3.3 ± 0.2 5.7 ± 1.5
pStat6 4.7 ± 0.6 6.8 ± 0.4
  • uma mudança de Fold, MFIestímulo/ MFIdesestimular. As condições de estimulação foram como nas figuras acima.
  • b SD obtido a partir de pelo menos 3 experiências independentes.
  • c P & lt 0,05 em par t-teste.

De interesse é o grau de marcação, ou a razão fluoróforo para proteína (FTP). Os conjugados Alexa 647 usados ​​tinham razões de FTP de 2-3, enquanto os conjugados Alexa 488 foram usados ​​em FTPs de 2-4. Razões de FTP mais altas (por exemplo, & gt5), especialmente para Alexa 647, levaram a um ruído de fundo mais alto e sinais gerais ruins (dados não mostrados). Portanto, parece que com esses reagentes, a marcação de mAbs fosfo-específicos com baixas razões de FTP garantiu relações de sinal para ruído mais ideais e evitou a desnaturação de mAb ou ligação não específica.

A fim de otimizar os níveis de coloração, mAbs fosfo-específicos foram titulados em amostras não estimuladas e estimuladas para encontrar a concentração que maximizasse a alteração de dobra. Quantidades muito pequenas de mAb são necessárias para atingir intensidades de coloração ideais, normalmente 50 ng por milhão de células. Na maioria dos casos, a alteração de dobra mais elevada foi obtida quando a amostra não induzida tinha um nível de coloração muito próximo ao das células não coradas ou células coradas com isotipo. Aumentos ou diluições de duas vezes na concentração de mAb não afetam a alteração significativa de vezes, embora as intensidades absolutas mudem quase linearmente com a concentração de mAb (dados não mostrados).

Aplicação da citometria de fluxo fosfo-específica

Para ilustrar o poder de resolução da coloração simultânea para fosfoepítopos, estimulamos as células sob condições que seriam esperadas para levar à fosforilação de um epítopo ou de dois epítopos (Fig. 6). Na Figura 6A, uma titulação de IFN-γ foi realizada em células U937. Como mostrado anteriormente, IFN-γ produz uma forte indução de pStat1. Esta indução pode ser medida por métodos tradicionais de Western blotting ou por citometria de fluxo. A curva de titulação foi gerada normalizando os pontos de dados para a amostra estimulada ao máximo (1.000 pg / ml), definindo o MFI ou RLU dessa amostra para 100% (consulte Materiais e Métodos). Como visto na Figura 1, a análise de citometria de fluxo se correlacionou intimamente com a análise de Western blot em uma ampla gama de condições de indução, desta vez em um sentido mais quantitativo. A Figura 6B e C mostra experimentos de cor dupla em que dois fosfo-epítopos foram corados simultaneamente em células. As células U937 mostram induções claras de pStat1 e pStat6 quando estimuladas por IFN-γ e IL-4, respectivamente. Em células Jurkat, PMA / ionomicina induziu a fosforilação de pERK e pp38, enquanto a anisomicina mostrou apenas indução de pp38. Esses resultados indicam que a análise simultânea de quinases usando esses reagentes e por este protocolo de coloração pode fornecer uma alternativa útil para métodos de análise mais clássicos.

Aplicações multiparâmetros de citometria de fluxo fosfo-específica. UMA: As células U937 foram tratadas com quantidades crescentes de IFN-γ (de 4-1.000 pg / mL) durante 10 min a 37 ° C. As células foram então divididas e lisadas para análise de Western blot ou fixadas e permeabilizadas para citometria de fluxo. O blot foi testado com pStat1 não marcado, enquanto pStat1 Ax488 ou Ax647 foram usados ​​para análise de fluxo. Observe a grande faixa dinâmica (10.000 vezes) coberta pelos gráficos FACS. Percent of maximum (using 1,000 pg/ml as maximum induction) was calculated for all three analyses, and plotted versus IFN-γ concentration. MFIs were used for flow cytometric data, while integrated band intensities were used for the Western blot. B: Multiparameter flow cytometric analysis of U937 cells. Cells were left unstimulated or treated with IFN-γ (50 ng/ml) or IL-4 (10 ng/ml) and stained for pStat1 and pStat6. C: Jurkat cells were left unstimulated or treated with PMA (50 nM) and ionomycin (IO 1 μM) or anisomycin (2 μg/ml) and analyzed for pERK and pp38 levels. PMA/IO shows a strong pERK induction, as well as intermediate pp38 levels, while anisomycin leads to exclusive activation of pp38.


Supersaturation: The barrier between protein folding and misfolding

Correct, or native, protein folding is essential for correct protein function. Protein misfolding can lead to the formation of amyloid fibrils, and amyloidosis, which is implicated in various human neurodegenerative diseases, including Parkinson's, Alzheimer's, and Huntington's diseases. In this study Yuji Goto and colleagues describe, for the first time, a dynamic link between protein folding and misfolding, and the threshold that must be overcome for the formation of amyloid fibrils.

Technological advances are at the forefront of many scientific discoveries. The atomic structures of some amyloid fibrils were recently revealed as a result of advances in solid-state nuclear magnetic resonance and cryogenic electron microscopy. While an important step forward for the field, this development does not fully explain the determining factors of protein misfolding. How are folding and misfolding related? Can folding/unfolding and amyloid polymerization/depolymerization be explained by a single mechanism, and if so what might this look like? These are the questions that researchers at Osaka University sought to answer.

Summarizing their motivation for this work, senior author Masahiro Noji explains: "The thermodynamic hypothesis of protein folding, known as the 'Anfinsen's dogma' describes that the native structure of a protein represents a free energy minimum determined by the amino acid sequence. However, this is not consistent with the misfolding of globular proteins to form amyloid fibrils." Therefore, Yuji Goto and colleagues set out to explore the link between protein folding and misfolding.

Although proteins perform their functions by folding to their native structures, as represented by Anfinsen's dogma, proteins often misfold to form amyloid fibrils, leading to amyloidosis. In their paper, the research team from Osaka University describe a general concept for the link between protein folding and misfolding.

"The supersaturation barrier of a denatured protein separates protein folding and amyloid formation, and misfolding occurs when this barrier breaks down" corresponding author Yuji Goto says. "Our results show a clear link between correct protein folding, as defined by Anfinsen's dogma, and protein misfolding."

Supersaturation can be observed throughout nature in the formation of crystals, including those involved in ice formation. Here, the team at Osaka University show that supersaturation is fundamental to correct protein folding. The supersaturation barrier represents a novel concept that will advance the field of protein folding and contribute to the development of therapeutic strategies to prevent and treat amyloidosis, including those involved in neurodegenerative diseases.


Discussão

Currently established protocols in clinical practice for the diagnosis and follow-up of NAFLD have certain limitations for instance, they may not be sufficiently sensitive at early disease stages. MS-based proteomics technology holds great potential in generating novel insights into disease mechanism and discovering new biomarkers. To identify novel proteins associated with NAFLD and to understand the effect of liver cirrhosis on the plasma proteome, we here analyzed plasma samples of 48 participants with our streamlined plasma proteomics workflow, enhanced with a novel MS-acquisition method featuring high sensitivity.

Our results revealed clinically interesting proteome changes in NAFLD and in cirrhosis, where we found dysregulation of proteins associated with thrombosis and homeostasis. These findings are the proteomic reflection of the hemostatic complications of liver disease, in particular increased risk of bleeding and venous thromboembolism in patients with cirrhosis (Yang et al, 2014 ). Vitamin A and D deficiency is a common feature in chronic liver disease. We found proteins involved in hormone and vitamin transportation to be altered in patients with cirrhosis, for example, retinol-binding protein (RBP4) and transthyretin (TTR). Reduced RBP4 levels are in concordance with a previous study (Bahr et al, 2009). Both RBP4 and TTR are primarily produced in hepatocytes and transport retinol to peripheral tissues. In the liver, hepatocytes secret RBP4, to enable retinoid storage in the hepatic stellate cells (HSC), accounting for as much as 50–60% of the total retinoid present in the body. The insufficient levels of RBP4 observed by proteomics might therefore contribute to vitamin A deficiency.

Among the interesting similarities between patients with cirrhosis and patients with NAFLD was PIGR, a little studied protein produced in the GI tract and endothelial cells but also in the liver. Strikingly, PIGR increased in abundance in all our three cohorts in line with the severity of liver damage and the up-regulation is most dramatic in cirrhosis. We further validated this novel finding in a mouse model of NAFLD induced by high-fat diet. PIGR is a receptor, which mediates transcytosis of immunoglobulins from the basolateral to the apical surface of the epithelia, facilitating the secretion of IgA and IgM. PIGR levels also co-varied with AST, ALT, ALP, and GGT, four clinical liver markers. The inter-individual variation in plasma PIGR levels in controls was relatively small, much lower than that in the NAFLD and cirrhosis cohorts. This finding was also observed in patients with T2D with no liver damage, thus making PIGR an interesting biomarker candidate for the inclusion in liver damage tests.

The plasma proteome changed much less in NAFLD than in cirrhosis and globally the plasma proteome profiles had few significant outliers, both in the cohort with normal glucose tolerance and in the T2D cohort. This presumably reflects the resilience and regenerative capacity of the liver and is also in line with the fact that NAFLD or early cirrhosis is often asymptomatic and clinically difficult to detect. Circulating RBP4 levels are among the changes that have been controversially discussed in the literature, with some studies finding higher levels in NAFLD (Terra et al, 2013 ) and some reporting unchanged levels (Zhou et al, 2017). This parallels our plasma proteome data, in which RBP4 was clearly significant in cirrhosis but not in the NAFLD sub-groups.

There is increasing awareness of the importance of screening for the presence of NAFLD, especially in patients with T2D. However, this requires markers or marker panels that are specific to NAFLD and ideally also associated with its progression to fibrosis and cirrhosis. Our plasma proteome profiling experiments of three cohorts provide a step in this direction. We identified a panel of six proteins in the two NAFLD subtypes: three in NAFLD without T2D (PIGR, ALDOB, and VTN) and four in NAFLD with T2D (PIGR, LGALS3BP, AFM, and APOM). Of these, AFM and LGALS3BP have been reported as potential markers for NAFLD (Bell et al, 2010 Wood et al, 2017). AFM has been closely linked to metabolic syndrome, insulin resistance, NAFLD, and alcoholic liver disease (Bell et al, 2010 Liu et al, 2011 Neuman et al, 2014 Kollerits et al, 2017). LGALS3BP has already been used to build multi-component classifiers for the prediction of NAFLD (Wood et al, 2017 ) and fibrosis in patients with hepatitis C infection (Cheung et al, 2010). The elevated levels of LGALS3BP and vitronectin (VTN), another extracellular matrix (ECM) protein, are likely a reflection of remodeling of the ECM in liver disease.

ALDOB is a glycolytic enzyme in the fructose catabolism pathway that also plays a role in gluconeogenesis and lipogenesis. Evidence from both animal studies and human studies suggests that dietary added fructose intake when consumed in excess is a principal driver of NAFLD and its deleterious consequences (DiNicolantonio et al, 2017). We also observed increased plasma ALDOB levels in the mouse NAFLD model. This increase may be a consequence of cell damage, as hepatocytes inflamed due to excessive fat accumulation may leak out ALDOB. Since that is visible already in NAFLD, it may be more sensitive than the usually measured liver enzymes AST and ALT.

In our analysis, we also correlated all proteomics and clinical variables with each other to identify proteins correlating with known markers for liver diseases under pathophysiological conditions. In this global correlation analysis, involving close to 100,000 individual correlation coefficients, proteins that are tightly co-regulated likely share a common origin or (patho)physiological pathway. Remarkably, in this unbiased analysis, four clinical markers used in liver disease—ALT, AST, ALP, and GGT—clustered into a single group together with a panel of five proteins of special interest—PIGR, DPP4, ANPEP, TGFBI, and APOE. Among these proteins are two enzymes involved in degradation of the ECM (ANPEP, DPP4) and an ECM protein (TGFBI). This may again reflect the remodeling of the ECM in the liver, which is part of the progression to liver fibrosis. Even more interesting, DPP4, which proteolytically cleaves GLP-1 and GIP, has been reported to increase in both plasma and liver tissue of NAFLD patients (Miyazaki et al, 2012 Anoop et al, 2017). DPP4 inhibitors are also widely used diabetes drugs worldwide. Interestingly, there are currently clinical trials evaluating the efficacy and safety of DPP4 inhibitor sitagliptin for the treatment of NAFLD (Fukuhara et al, 2014 ) and in steatosis irrespective of diabetes in NASH (Alam et al, 2018). Taken together with our proteomic data, it would be interesting to further investigate the potential of circulating DPP4 levels to serve as prognostic marker for both T2D and NAFLD. The same may apply for the other four proteins in this five-protein panel as they also correlate very well with liver enzymes of hepatic damage. Remarkably, we also observed this close correlation between DPP4 and PIGR in our mouse dataset, where we found that two additional aminopeptidases, Lap3 and Enpep, similarly were increased under NAFLD. Together, our analysis points to an important relationship between aminopeptidases and NAFLD.

In conclusion, in this study we found changes in the plasma proteome of patients with cirrhosis and patients with NAFLD that are clearly linked to the underlying disease manifestations and clinical observations. PIGR and ALDOB are in our panel of six proteins significantly associated with NAFLD and were also validated in a mouse NAFLD cohort making them interesting candidates for follow-up studies. PIGR is a particularly promising protein as its association with NAFLD and liver cirrhosis is novel, and its levels in plasma are highly correlated with DPP4, a widely used drug target in the treatment of T2D. This correlation holds true in both human and mouse cohorts. Blocking the enzymatic function of the other aminopeptidases may have effects on the fibrotic process in NAFLD progression. To evaluate the potential and specificity of the above proteins to be developed or incorporated into liver disease panels, we plan to perform plasma proteome profiling on larger and more fine-grained cohorts.


Resumo do capítulo

Proteins, carbohydrates, nucleic acids, and lipids are the four major classes of biological macromolecules—large molecules necessary for life that are built from smaller organic molecules. As macromoléculas são compostas por unidades únicas que os cientistas chamam de monômeros, que são unidas por ligações covalentes para formar polímeros maiores. O polímero é mais do que a soma de suas partes: adquire novas características e leva a uma pressão osmótica muito inferior à formada por seus ingredientes. Esta é uma vantagem importante na manutenção das condições osmóticas celulares. Um monômero se junta a outro monômero com a liberação da molécula de água, levando à formação de uma ligação covalente. Os cientistas chamam isso de reações de desidratação ou condensação. Quando os polímeros se dividem em unidades menores (monômeros), eles usam uma molécula de água para cada ligação quebrada por essas reações. Essas reações são reações de hidrólise. As reações de desidratação e hidrólise são semelhantes para todas as macromoléculas, mas cada reação de monômero e polímero é específica para sua classe. As reações de desidratação normalmente requerem um investimento de energia para a formação de novas ligações, enquanto as reações de hidrólise normalmente liberam energia quebrando as ligações.

3.2 Carbohydrates

Carbohydrates are a group of macromolecules that are a vital energy source for the cell and provide structural support to plant cells, fungi, and all of the arthropods that include lobsters, crabs, shrimp, insects, and spiders. Scientists classify carbohydrates as monosaccharides, disaccharides, and polysaccharides depending on the number of monomers in the molecule. Monosaccharides are linked by glycosidic bonds that form as a result of dehydration reactions, forming disaccharides and polysaccharides with eliminating a water molecule for each bond formed. Glucose, galactose, and fructose are common monosaccharides whereas, common disaccharides include lactose, maltose, and sucrose. Starch and glycogen, examples of polysaccharides, are the storage forms of glucose in plants and animals, respectively. The long polysaccharide chains may be branched or unbranched. Cellulose is an example of an unbranched polysaccharide whereas, amylopectin, a constituent of starch, is a highly branched molecule. Glucose storage, in the form of polymers like starch of glycogen, makes it slightly less accessible for metabolism however, this prevents it from leaking out of the cell or creating a high osmotic pressure that could cause the cell to uptake excessive water.

3.3 Lipids

Lipids are a class of macromolecules that are nonpolar and hydrophobic in nature. Major types include fats and oils, waxes, phospholipids, and steroids. Fats are a stored form of energy and are also known as triacylglycerols or triglycerides. Fats are comprised of fatty acids and either glycerol or sphingosine. Fatty acids may be unsaturated or saturated, depending on the presence or absence of double bonds in the hydrocarbon chain. If only single bonds are present, they are saturated fatty acids. Unsaturated fatty acids may have one or more double bonds in the hydrocarbon chain. Phospholipids comprise the membrane's matrix. They have a glycerol or sphingosine backbone to which two fatty acid chains and a phosphate-containing group are attached. Steroids are another class of lipids. Their basic structure has four fused carbon rings. Cholesterol is a type of steroid and is an important constituent of the plasma membrane, where it helps to maintain the membrane's fluid nature. It is also the precursor of steroid hormones such as testosterone.

3.4 Proteins

Proteins are a class of macromolecules that perform a diverse range of functions for the cell. They help in metabolism by acting as enzymes, carriers, or hormones, and provide structural support. The building blocks of proteins (monomers) are amino acids. Each amino acid has a central carbon that bonds to an amino group, a carboxyl group, a hydrogen atom, and an R group or side chain. There are 20 commonly occurring amino acids, each of which differs in the R group. A peptide bond links each amino acid to its neighbors. A long amino acid chain is a polypeptide.

Proteins are organized at four levels: primary, secondary, tertiary, and (optional) quaternary. The primary structure is the amino acids' unique sequence. The polypeptide's local folding to form structures such as the α-helix and β-pleated sheet constitutes the secondary structure. The overall three-dimensional structure is the tertiary structure. When two or more polypeptides combine to form the complete protein structure, the configuration is the protein's quaternary structure. Protein shape and function are intricately linked. Any change in shape caused by changes in temperature or pH may lead to protein denaturation and a loss in function.

3,5 Ácidos Nucleicos

Nucleic acids are molecules comprised of nucleotides that direct cellular activities such as cell division and protein synthesis. Pentose sugar, a nitrogenous base, and a phosphate group comprise each nucleotide. There are two types of nucleic acids: DNA and RNA. DNA carries the cell's genetic blueprint and passes it on from parents to offspring (in the form of chromosomes). It has a double-helical structure with the two strands running in opposite directions, connected by hydrogen bonds, and complementary to each other. RNA is a single-stranded polymer composed of linked nucleotides made up of a pentose sugar (ribose), a nitrogenous base, and a phosphate group. RNA is involved in protein synthesis and its regulation. Messenger RNA (mRNA) copies from the DNA, exports itself from the nucleus to the cytoplasm, and contains information for constructing proteins. Ribosomal RNA (rRNA) is a part of the ribosomes at the site of protein synthesis whereas, transfer RNA (tRNA) carries the amino acid to the site of protein synthesis. The microRNA regulates using mRNA for protein synthesis.


Stripping and re-probing membranes

When the same membrane is required for testing of several proteins using different antibodies, stripping and re-probing is always possible although it might need to be empirically optimized for a particular assay since each antigen-antibody interaction is always distinct. In general, stripping buffers are reagents that combine low pH, detergents, reducing agents and/or heat in order to remove residual antibodies. Although repeated re-probing can lead to loss of signal, several re-probings are generally possible. Biotin-streptavidin interactions cannot be dissociated by this method but the whole complex can be removed away from the bound protein on the membrane.


Summary of Structural Features & Thermodynamic Forces

There are two important features to note:

  • The net stability of a protein is quite marginal.
  • All three features, the hydrophobic effect, van der Waals, and H-bonds are required to overcome the very favorable change in conformational entropy when a protein unfolds. This delicate balance is illustrated in the following diagram.

Enthalpic (red) contributions from H-bonds and van der Waals interactions, as well as entropy gains (blue) from the hydrophobic effect stabilize the native state. The increase in conformational entropy (blue) during unfolding stabilizes the unfolded state.

The following features of a folded globular protein are a consequence of the thermodynamics forces that stabilize the folded form of the protein, listed in order of significance, from left to right. Conformational entropy has been left off of this chart, remember it is very destabilizing for the folded state.

Feature of Tertiary Structure Hydrophobic Effect van der Waals Interactions H-bonds
Non-polar residues in core. +
Well packed core. +
Hydrogen bonded secondary structures +

Interplay between 2 o structure and 3 o structure.

Use the Jmol protein structure to answer the following questions

Protein G

Alpha-helices and beta-sheets are equally stable from the perspective of the mainchain atoms, why is one favored over another?

How does the sidechain orientation differ for the two structures?

The periodicity of buried non-polar residues in the sequence will determine the secondary structure. An alpha-helix will form if every 3.4 residues are non-polar, as this structure will place all non-polars on the same face of the helix.

to visualize this periodicity on the helix. A beta-strand will form if every second residue is non-polar, as this structure will place all non-polars on the same face of the sheet. to see this periodicity on one of the central beta-strands.


DISCUSSÃO

We show here that lamin B1 declines precipitously when cells are induced to senesce by multiple means. We also show that lamin B1 decline is a hallmark of senescence in multiple human and murine fibroblast cell strains and after acute DNA damage that results in the persistence of senescent cells in vivo (Le et al., 2010). Lamin A, although depleted in cells induced to senesce by oncogenic RAS or MKK6EE expression, was not depleted in cells induced to senesce by DNA damage or replicative exhaustion. Furthermore, neither lamin B2 nor lamin C declined, regardless of the senescence inducer. We conclude that a decline in lamin B1, but not lamin B2, lamin A, or lamin C, may be general biomarker of senescence.

Lamin B1 decline occurred rapidly (2 d) after exposure to a senescence-inducing stimulus and was not a general feature of cell cycle arrest, as quiescent cells retained lamin B1 at levels equal to those of proliferating cells. Of interest, lamin B1 loss was not prevented by inhibition of pathways that control many other aspects of senescence, such as the SASP. Thus lamin B1 decline was independent of the p38 MAPK/NF-κB pathway, the DDR pathway, and ROS signaling. However, lamin B1 decline was strongly induced by either direct p53 activation or direct p16 INK4a expression. Because almost all senescence inducers strongly depend on either the p53 or pRB/p16 INK4a pathways, lamin B1 loss might serve as a general senescence marker in other contexts and cell types. One exception might be oxidative stress, which can induce some features of senescence (e.g., arrested growth, SA-βgal expression) but not all features (e.g., loss of c-FOS inducibility, the SASP Parrinello et al., 2003 Coppe et al., 2010). A recent report (Barascu et al., 2012) showed that oxidative stress induces senescence via an increase in lamin B1 expression, suggesting that some senescent cells do not express the full complement of senescence markers. However, the relationship between lamin B1 and oxidative stress bears further investigation, as another recent report demonstrates that depletion of lamin B1 via shRNAs leads to senescence via decreased ROS (Shimi et al., 2011).

Lamin B1 decline at senescence was distinct from the caspase-mediated lamin degradation seen at apoptosis, as no lamin cleavage products were evident in senescent cells. Furthermore, caspase inhibition did not prevent the senescence-associated decline in lamin B1 protein levels. Instead, lamin B1 loss was due to an early decline in mRNA level. This decline was at least partially mediated by a decrease in lamin B1 mRNA stability. Given that lamin A mRNA stability was unaffected, we hypothesize that lamin B1 mRNA is specifically destabilized as part of the senescence program by an as-yet-unidentified mechanism.

A number of senescence markers have been used to identify senescent cells in vivo, although no single marker is completely specific (Campisi and d'Adda di Fagagna, 2007 Kuilman et al., 2010). For example, growth arrest, although a necessary condition for senescence, is not sufficient to define the state—many cells in vivo are terminally differentiated or quiescent (Kuilman et al., 2010). p16 INK4a is highly correlated with senescence and age (Zindy et al., 1997 Krishnamurthy et al., 2004 Ohtani et al., 2010), although some tumor cells express high levels of p16 INK4a . Moreover, p16 INK4a expression is not necessary for senescence, as some cells senesce after DNA damage via activation of the p53 pathway alone (Beausejour et al., 2003). In addition, the most widely used senescence marker, SA-βgal, is neither necessary nor sufficient for senescence (Dimri et al., 1995 Lee et al., 2006) and is both labile and difficult to detect in vivo. We report here that lamin B1 declines in mouse tissues with persistent senescent cells and therefore may be useful in both research and clinical applications. We found a small but significant decrease in lamin B1 mRNA and protein in mouse tissues that had been irradiated 12 wk previously, consistent with a small population of persistent senescent cells (Le et al., 2010). The radiation regimen to which we subjected the mice is similar to that experienced by human patients undergoing radiotherapy for cancer. Optimization of lamin B1 measurement may generate a robust, single-cell test for senescent cells in vivo, giving researchers and clinicians a tool with which to accurately assess the relative contribution of senescent cells in tissues of patients with a variety of conditions, including cancer, diabetes, chronic inflammation, and age-related disease.


Coagulation Of Proteins

The term denaturation is used more frequently than coagulation by scientific investigators at the present time to denote certain changes in proteins. Definite characteristics of the proteins are changed when they are coagulated, among which is loss of solubility in water and dilute salt solutions. In some instances and under certain conditions the coagulation process may be reversible.

Manner in which denaturation may be brought about. Coagulation of proteins may be brought about by a variety of processes. In cookery one of the principal means of coagulation is heat. But in addition to heat the action of acids, alkalies, salts, alcohol, mechanical agitation, radiation, and ultra-sonic vibrations may denature the protein and convert it from a soluble into an insoluble form.

Some changes in the proteins during denaturation. All investigators agree that denaturation is brought about in two steps. The first step is a preliminary alteration of the protein or denaturation. The second is a physical change which leads to coagulation or aggregation. Clayton in discussing "Foods as Colloid Systems" reviews some of the theories of protein denaturation. "Hydrolysis has been frequently reported as the cause of denaturation, but present views incline to the idea of some structural rearrangement within the molecule. Thus, the refractive index increases during heat denaturation, whilst X-ray diffraction patterns lead to the view that coagulation is accompanied by the elimination of water between NH1 and COOH groups. . . . Cubin holds that denaturation is the distortion or opening up of the protein unit, whilst flocculation is the process following this and rendered possible by it. Interaction of NH1 and COOH groups situated on contiguous colloid units leads to aggregation and, hence, coagulation."

No matter how denaturation is brought about, the denatured product has sulfur atoms, the combination of which differs from those in the native protein. Mirsky and Anson have shown that in native egg albumin no sulfhydryl (SH) and disulfide (S-S) groups are detectable by certain methods. But in completely coagulated protein the number of SH and S-S groups detectable is the same as in hydrolyzed protein. These workers have also shown that in partially coagulated protein when the soluble and insoluble fractions are separated the soluble portion contains no detectable SH or S-S groups, but the insoluble fraction has the number of reactive SH and S-S groups characteristic of the completely denatured protein. In the interfacial coagulation of a protein, i.e., when a film of insoluble protein forms at the surface of a protein solution, SH and S-S groups appear, the number being the same as that found in the hydrolyzed protein. Also when the proteins are denatured by ultra-violet light, by acids, or by other means the SH and S-S groups appear. From these results they conclude that the formation of insoluble proteins and increase in detectable SH and S-S groups are closely linked phenomena that denaturation is a definite chemical reaction and that a given protein molecule is either completely native or completely denaturated.

In a later paper Mirsky and Anson report that the number of detectable SH and S-S groups in different proteins varies with the pH and the temperature. To illustrate, native hemoglobin had no detectable SH groups at pH 6.8. But with increase of pH the SH groups become detectable in increasing numbers up to pH 9.6. But native egg albumin showed no detectable group at pH 6.8 or pH 9.6. However, denatured hemoglobin had detectable groups at pH 6.8 and still more at pH 9.6. They found that intact, unhydrolyzed proteins possess in addition to SH groups other reducing groups which can be oxidized by ferricyanide. The number and activity of these groups vary from protein to protein. They are probably contained in the tyrosine and tryptophane component of proteins. "It can now be seen that the activation of SH and S-S groups in protein denatura-tion is part of a more general process."

Heat coagulation. As has been indicated heat coagulation of proteins is used in preparation of food products, and, fortunately for the mental equilibrium of the cook, heat coagulation of proteins is ordinarily not reversible. Otherwise, many cooked dishes would, with certain treatment, revert to their original uncooked consistency.

Some of the changes occurring during heat coagulation of the proteins have been indicated. But these are not the only factors playing a role in the process. Electrolytes have some role in heat coagulation of proteins. This is shown in the work with distilled water egg custards. It has been shown that, if the mineral content of egg white is lowered through dialysis, coagulation does not occur on heating. The effect of electrolytes in heat coagulation may be brought about either by chemical reaction or by adsorption. If the effect of salts is brought about by adsorption, the salts must be very strongly adsorbed and almost impossible to remove from the aggregated protein by washing the protein, for the process is usually irreversible. Any theory of heat coagulation of the proteins must not only explain how the proteins are rendered insoluble by heat but the effect of other factors. That the heat coagulation of proteins is influenced by electrolytes, sugar, temperature, time, the reaction of the solution, and the presence of water and other factors is evident when the cooking of eggs, custards, salad dressings, cheese and egg dishes, baked products, and meat is observed. The effect of some of these factors can be determined in the laboratory but the understanding of the manner of their action is lacking in many instances and awaits explanation by the colloid chemist or biochemist.

Bancroft and Rutzler have reported that heat-coagulated egg white may be peptized by dextrose and certain salts. They showed that the coagulated and repeptized egg-white sols are identical with the original solution by immuno-biological tests for species specificity and isoelectric point measurements. Because of the similarity of the reversed protein to the original protein they believe that coagulation is a colloidal reaction which is due to a physical rather than a chemical change.

Interfacial denaturation. Proteins are also denatured at interfaces, typical examples being the insoluble portion of beaten egg white, and froth or foam on milk. When egg white or milk foams are allowed to remain undisturbed, they gradually collapse and the wrinkled membranes, skin, or films may be observed through the microscope. Mention has already been made that protein can be recovered from a solution by removing the foam. Denaturation of protein solution occurs by shaking and in some instances spontaneously, an example being the membrane formed at the interface of an air/protein solution when no agitation has occurred.

Neurath and Bull state that both heat and surface denaturation processes involve an unfolding of the peptide chains which in the natural state are curled up in the interior of the molecule and become stretched out when the molecule comes in contact with the surface of the bulk of the solution. The polar groups of the protein molecule, the amino, carboxyl, the OH groups of the hydroxy acids, the sulfur-containing groups, and the peptide linkages, have an affinity for water whereas the non-polar or lyophobic groups, the hydrocarbon residues, tend to be repelled by water. Thinking that an interaction between the amino and carboxyl groups during heat denaturation might diminish the lyophobic or polar properties of natural protein, whereas an unfolding of the peptide chains by surface denaturation might expose lyophobic groups to the surface, which in the native state are buried in the interior, Neurath and Bull measured the volume contraction of native, heat-denatured, and surface-denatured proteins. They found that the native protein had the lowest density, heat-denatured ones were intermediate, and the surface-denatured protein had the highest density.

This membrane-forming property of protein through denaturation is important in food preparation, in all products in which beaten egg white is used, in emulsions, and wherever interfacial reactions occur.

Membranes form readily on the surface of protoplasm and play important parts in cell functions. The presence of calcium has been shown to stiffen the surface membranes in some instances, whereas sodium and potassium in the absence of calcium tend to soften and dissolve the membrane.

This suggests that salts may also have some influence in surface denatura-tion and that the salts of flour, egg, and milk used in cooked products may modify the denaturation at surfaces.

Clayton states that high concentrations of sugar in egg white will prevent surface denaturation, which of course has application in making angel cakes, meringues, and sweetened souffles.


Assista o vídeo: RELAÇÃO ANTÍGENO E ANTICORPO (Novembro 2021).