Em formação

Auto emparelhamento no DNA


Eu sei que a molécula de ssRNA pode se dobrar (por exemplo, em t-RNA). O DNA pode fazer o mesmo? Existe algum exemplo disso na natureza?

Por que esse fenômeno é mais comum no RNA do que no DNA?


O DNA pode adotar estruturas secundárias como o RNA, a principal diferença é que o DNA geralmente está presente como DNA de fita dupla, enquanto o RNA, na maioria dos casos, está presente como RNA de fita simples. O DNA de fita dupla não adota facilmente qualquer outra conformação do que a bem conhecida hélice dupla, já que esta é mais estável do que as estruturas possíveis que cada fita simples poderia adotar sozinha.

Um exemplo que ocorre na natureza são os G-quadruplexes que, por exemplo, ocorrem em telômeros.

Existem também enzimas de DNA criadas artificialmente (também chamadas de DNAzimas ou desoxirribozimas) que adotam estruturas terciárias como as ribozimas. Mas não existem enzimas de DNA conhecidas que ocorram na natureza, até onde eu sei.


Auto-pareamento em DNA - Biologia

Faça a distinção entre genes únicos ou de cópia única e sequências altamente repetitivas no DNA nuclear.

Sequências altamente repetitivas (DNA satélite) constituem de 5 a 45% do genoma. As sequências têm normalmente entre 5 e 300 pares de bases por repetição e podem ser duplicadas até 105 vezes por genoma.

TOK: Sequências altamente repetitivas já foram classificadas como “DNA lixo”, mostrando um grau de confiança de que não tinham função. Isso aborda a questão: em que medida os rótulos e categorias usados ​​na busca do conhecimento afetam o conhecimento que obtemos?

Afirmar que os genes eucarióticos podem conter exons e íntrons.

Os genes eucarióticos contêm fragmentos codificantes conhecidos como exons e fragmentos não codificantes conhecidos como íntrons. Os exons são sequências de bases que são transcritas e traduzidas, e os íntrons são sequências que são transcritas, mas não traduzidas.

Cite todas as fontes usando o método CSE (ou ISO 690 Numérico no Word). Destaque todos os termos de comando do objetivo 1 em amarelo e preencha-os antes da aula. Destaque todos os termos de comando dos objetivos 2 e 3 em verde - eles farão parte das discussões em aula. Depois da aula, volte e revise-os.

Complete a rubrica de autoavaliação antes de enviar para o Moodle. Evite imprimir isso, se possível.


Resumo

Embora a montagem em solução de copolímeros anfifílicos tenha sido estudada extensivamente, a montagem de copolímeros contendo DNA só está emergindo recentemente como uma nova área promissora. O DNA, um biopolímero hidrofílico natural que é altamente previsível em suas características de hibridização, traz para o campo várias propriedades úteis e exclusivas, incluindo monodispersidade, a capacidade de funcionalizar de uma maneira específica do local e programabilidade com emparelhamento de bases Watson-Crick. A inclusão de DNA como um segmento no copolímero não apenas adiciona à base de conhecimento atual na montagem do copolímero em bloco, mas também cria novas modalidades de montagem que já levaram a estruturas novas e tecnologicamente úteis. Nesta revisão, discutimos o progresso recente na automontagem de copolímeros contendo DNA, incluindo montagens conduzidas por hidrofobicidade via construções anfifílicas, montagens programadas mediadas por hibridização de DNA e montagens envolvendo ambas essas interações.


Resumo

Algumas proteínas possuem a propriedade de automontagem, conhecida por ser um importante mecanismo na construção de arquiteturas supramoleculares para funções celulares. No entanto, até o momento, a capacidade das moléculas de DNA de fita dupla (ds) de se automontar não foi estabelecida. Aqui, relatamos que as moléculas de dsDNA também têm uma propriedade de automontagem em soluções aquosas contendo concentrações fisiológicas de Mg 2+. Mostramos que as moléculas de DNA interagem preferencialmente com moléculas com sequência e comprimento idênticos, mesmo em uma solução composta por espécies heterogêneas de DNA. O DNA curvo e o DNA com conformação e propriedades incomuns também exibem esse fenômeno, indicando que não é específico para o DNA da forma B usual. A microscopia de força atômica (AFM) revela diretamente as moléculas de DNA montadas formadas em concentrações de 10 nM, mas raramente a 1 nM. A automontagem depende da concentração. Sugerimos que a força atrativa que causa a automontagem do DNA pode funcionar em processos biológicos, como dobramento de DNA repetitivo, recombinação entre sequências homólogas e sinapses na meiose.

Este estudo foi financiado em parte por bolsas de pesquisa JSPS e MEXT para T.O.

Instituto Nacional de Pesquisa de Alimentos.

Laboratório de Biologia Molecular do MRC.

Para quem a correspondência deve ser endereçada. E-mail: [email & # 160protegido] waseda.jp. Telefone: +81 3 5286 1520. Fax: +81 3 3207 9694.

Faculdade de Educação e Artes e Ciências Integradas e Escola de Pós-Graduação em Ciências e Engenharia da Universidade Waseda.


DNA: Tipos, Estrutura e Função do DNA

Os ácidos nucléicos foram isolados pela primeira vez por Friedrich Miescher (1869) a partir de células de pus.

Eles foram chamados de nucleína. Hertwig (1884) propôs a nucleína como portadora de traços hereditários. Por causa de sua natureza ácida, eles foram chamados de ácidos nucléicos e depois ácidos nucléicos (Altmann, 1899).

Fisher (1880) descobriu a presença de bases de purina e pirimidina em ácidos nucléicos. Levene (1910) descobriu que o ácido nucleico desoxirribose contém ácido fosfórico, bem como açúcar desoxirribose.

Ele caracterizou quatro tipos de nucleotídeos presentes no DNA. Em 1950, Chargaff descobriu que o conteúdo de purina e pirimidina no DNA era igual. Nessa época, W.T. Astbury descobriu, por meio de difração de raios-X, que o DNA é um polinucleotídeo com nucleotídeos dispostos perpendicularmente ao longo eixo da molécula e separados uns dos outros por uma distância de 0,34 nm.

Em 1953, Wilkins e Franklin obtiveram excelentes fotografias de raios-X de DNA. As fotografias mostraram que o DNA era uma hélice com largura de 2,0 nm. Uma volta da hélice era de 3,4 nm com 10 camadas de bases empilhadas nela. Watson e Crick (1953) elaboraram o primeiro modelo de dupla hélice correto a partir das fotografias de raios X de Wilkins e Franklin. Wilkins, Watson e Crick receberam o Prêmio Nobel pelo mesmo em 1962.

Watson e Crick (1953) construíram um modelo 3D molecular de DNA que satisfez todos os detalhes obtidos a partir de fotografias de raios-X. Eles propuseram que o DNA consistia em uma dupla hélice com duas cadeias tendo fosfato de açúcar no lado externo e bases de nitrogênio no lado interno.

As bases de nitrogênio das duas cadeias formaram pares complementares com a purina de uma e a pirimidina da outra unidas por pontes de hidrogênio (A-T, C-G). O emparelhamento de bases complementares entre as duas cadeias polinucleotídicas é considerado um marco de sua proposição. É claro que é baseado na descoberta inicial de Chargaff que A = T e С = G Sua segunda grande proposta era que as duas cadeias são antiparalelas com 5 & # 8217 → 3 & # 8242 orientação de uma e У → 5 & # 8217orientação da outra.

As duas correntes são torcidas helicoidalmente como uma escada de corda com degraus rígidos torcidos em espiral. Cada volta da espiral contém 10 nucleotídeos. Este modelo de dupla hélice ou duplex de DNA com cadeias polinucleotídicas antiparalelas tendo bases complementares tem um mecanismo implícito de sua replicação e cópia.

Aqui, ambas as cadeias polinucleotídicas funcionam como moldes formando duas hélices duplas, cada uma com uma cadeia parental e uma fita nova, mas complementar. O fenômeno é chamado de replicação semiconservativa. A síntese in vitro de DNA foi realizada por Kornberg em 1959.

Tipos de DNA:

O modelo duplex de DNA proposto por Watson e Crick é espiral destro e é chamado de B-DNA (DNA balanceado). No modelo, os pares de bases estão quase em ângulos retos com o eixo da hélice (Fig. 6.5 D). Outro modelo duplex destro é A-DNA (DNA alternativo). Aqui, uma única volta da hélice tem 11 pares de bases.

Os pares de bases ficam a 20 ° de distância da perpendicular ao eixo. O C-DNA tem 9 pares de bases por volta da espiral, enquanto no D-DNA o número é de apenas 8 pares de bases. Ambos são destros. Z-DNA (Zigzag DNA) é uma dupla hélice canhota com espinha dorsal em zigue-zague, bases alternadas de purina e pirimidina, volta única de 45 A de comprimento com 12 pares de bases e um único sulco.

O B-DNA é mais hidratado e o DNA mais freqüentemente encontrado em células vivas. É uma forma fisiológica e biologicamente ativa. No entanto, ele pode ser alterado para outras formas. O DNA destro é conhecido por mudar temporariamente para a forma canhota, pelo menos por uma curta distância. Essas mudanças podem causar mudanças na expressão gênica.

Circular e DNA linear:

Em muitos procariotos, as duas extremidades de um duplex de DNA são covalentemente ligadas para formar DNA circular. O DNA circular está nu, isto é, sem associação com proteínas histonas, embora poliaminas ocorram. No DNA linear, as duas extremidades são livres. É encontrada em núcleos eucarióticos, onde está associada a proteínas histonas.

O DNA linear, sem associação com proteínas histonas, também ocorre em alguns procariotos, por exemplo, Mycoplasma. Em organelas celulares semi-autônomas (mitocôndrias, plastídios), o DNA é circular, menos comumente linear. Está sempre nu.

Regras de Chargaff:

Chargaff (1950) fez observações sobre as bases e outros componentes do DNA. Essas observações ou generalizações são chamadas de regra de equivalência de base de Chargaff.

(i) Os pares de bases de purina e pirimidina são iguais, isto é, adenina + guanina = timina + citosina. [A + G] = [T + C], ou seja, [A + G] / [T + C] = 1

(ii) A quantidade molar de adenina é sempre igual à quantidade molar de timina. Da mesma forma, a concentração molar de guanina é igualada pela concentração molar de citosina.

[A] = [T], ou seja, [A] / [T] = 1 [G] = [C], ou seja, [G] / [C] = 1

(iii) Açúcar desoxirribose e fosfato ocorrem em proporções equimolares.

(iv) Os pares de bases A-T raramente são iguais a С — G pares de bases.

(v) A razão de [A + T] / [G + C] é variável, mas constante para uma espécie (Tabela 6.2). Ele pode ser usado para identificar a origem do DNA. A proporção é baixa em organismos primitivos e maior em organismos avançados.

Tabela 6.2. Composição de base de DNA de várias fontes:

Espécies UMA G С T A + T / C + G
1. Homem 30.4 19.0 19.9 30.1 1.55
2. Bezerro 29.0 21.2 21.2 28.5 1.35
3. Germe de trigo 28.1 21.8 22.7 27.4 1.25
4. Ervilha 30.8 19.2 18.5 30.5 1.62
5. Euglena 22.6 27.7 25.8 24.4 0.88
6 Escherichia coli 24.7 26.0 25.7 23.6 0.93

Estrutura do DNA:

O DNA ou ácido desoxirribonucleico é uma macromolécula de polidesoxirribonucleotídeo de cadeia dupla torcida helicoidalmente que constitui o material genético de todos os organismos, com exceção dos rinovírus. Em procariotos, ocorre em nucleóides e plasmídeos. Esse DNA geralmente é circular. Nos eucariotos, a maior parte do DNA é encontrada na cromatina do núcleo.

É linear. Quantidades menores de DNA circular de fita dupla são encontradas em mitocôndrias e plastídios (DNA de organela). Os DNAs de tamanho pequeno ocorrem em vírus, o bacteriófago ф x 174 tem 5386 nucleotídeos. O bacteriófago lambda (Fago X) possui 48.502 pares de bases (bp), enquanto o número de pares de bases em Escherichia coli é 4,6 x 10 6. Um único genoma (conjunto haplóide de 23 cromossomos) tem cerca de 3,3 x 10 9 bp em seres humanos. O DNA de fita simples ocorre como um material genético em alguns vírus (por exemplo, fago ф x 174, colifago fd, M13) O DNA é a maior macromolécula com um diâmetro de 2 nm (20Å ou 2 x 10 -9 m) e geralmente tem 3 comprimentos em milímetros.

É 15 negativamente carregado devido aos grupos fosfato. É um polímero de cadeia longa de geralmente várias centenas de milhares de desoxirribonucleotídeos. Uma molécula de DNA possui duas fitas complementares não ramificadas. Eles são enrolados em espiral. As duas fitas espirais de DNA são chamadas coletivamente de duplex de DNA (Fig. 6.5).

As duas fitas não estão enroladas uma na outra, mas a fita dupla inteira (duplex de DNA) é enrolada sobre si mesma em torno de um eixo comum, como uma escada de corda com degraus sólidos torcidos em espiral. Devido à torção em espiral, o duplex de DNA passa a ter dois tipos de sulcos alternados, maiores (22 Å) e menores (12 Å).

No B-DNA, uma volta da espiral tem cerca de 10 nucleotídeos em cada fita de DNA. Ocupa uma distância de cerca de 3,4 nm (34 Å ou 3,4 & # 21510 -9 m) de modo que os nucleotídeos adjacentes ou suas bases são separados por um espaço de cerca de 0,34 nm (0,34 & # 21510 -9 m ou 3,4 Å).

Um desoxirribonucleotídeo de DNA é formado por ligação cruzada de três substâncias químicas ácido orto-fosfórico (H3PO4), açúcar desoxirribose (C5H10O4) e uma base de nitrogênio. Quatro tipos de bases de nitrogênio ocorrem no DNA. Eles pertencem a dois grupos, purinas (anéis duplos de 9 membros com nitrogênio nas posições 1,3,7 e 9) e pirimidinas (anéis de seis membros com nitrogênio nas posições 1 e 3). O DNA possui dois tipos de purinas (adenina ou A e guanina ou G) e dois tipos de pirimidinas (citosina ou С e timina ou T).

Dependendo do tipo de base de nitrogênio, o DNA tem quatro tipos de desoxirribonucleotídeos - desoxi adenosina 5-monofosfato (d AMP), desoxi guaninosina 5-monofosfato (d GMP), desoxi timidina 5-monofosfato (d TMP) e desoxi citidina 5-monofosfato (d CMP).

A espinha dorsal de uma cadeia ou filamento de DNA é formada por grupos alternativos de açúcar desoxirribose e ácido fosfórico. O grupo fosfato está conectado ao carbono 5 & # 8242 do resíduo de açúcar de seu próprio nucleotídeo e ao carbono У do resíduo de açúcar do próximo nucleotídeo por (3 & # 8216-5 & # 8217) ligações fosfodiéster. -H de fosfato e -OH de açúcar são eliminados como H20 durante cada formação de éster.

O grupo fosfato fornece acidez aos ácidos nucléicos porque pelo menos um de seu grupo lateral está livre para se dissociar. As bases do nitrogênio estão em ângulos retos com o eixo longitudinal das cadeias de DNA. Eles estão ligados ao átomo de carbono 1 dos açúcares por ligações N-glicosídicas. A pirimidina (C ou T) está ligada à desoxirribose por seu átomo N na posição 1, enquanto uma purina (A ou G) o faz pelo átomo N na posição 9.

As duas cadeias de DNA são antiparalelas, ou seja, elas correm paralelas, mas em direções opostas. Em uma cadeia, a direção é 5 & # 8217 → У enquanto na outra é 3 & # 8242 → 5 & # 8242 (Fig. 6.5). As duas cadeias são mantidas juntas por ligações de hidrogênio entre suas bases. Adenina (A), uma purina de uma cadeia fica exatamente oposta à timina (T), uma piramidina da outra cadeia. Da mesma forma, a citosina (C, uma pirimidina) fica em oposição à guanina (G a purina). Isso permite uma espécie de arranjo de fechadura e chave entre a purina de grande porte e a pirimidina de pequeno porte.

É fortalecido pelo aparecimento de ligações de hidrogênio entre os dois. Três ligações de hidrogênio ocorrem entre a citosina e a guanina (C = G) nas posições 1'-1 ', 2 & # 8242- 6 & # 8242 e 6 & # 8242-2 & # 8242. Existem duas dessas ligações de hidrogênio entre a adenina e a timina (A = T) que são formadas nas posições 1'-3 & # 8242 e 6 & # 8242-4 & # 8242. As ligações de hidrogênio ocorrem entre o hidrogênio de uma base e o oxigênio ou nitrogênio da outra base. Uma vez que bases de nitrogênio específicas e diferentes ocorrem nas duas cadeias de DNA, as últimas são complementares.

Assim, a sequência de, digamos, AAGCTCAG de uma cadeia teria uma sequência complementar de TTCGAGTC na outra cadeia. Em outras palavras, as duas cadeias de DNA não são idênticas, mas complementares uma à outra. É devido ao emparelhamento específico de uma base com uma purina oposta a uma pirimidina. Isso torna as duas cadeias com 2 nm de espessura.

Um par de bases purina-purina irá torná-lo mais espesso, enquanto um par de bases pirimidina-pirimidina irá torná-lo mais estreito do que 2 nm. Além disso, A e С ou G e T não formam pares porque não formam ligações de hidrogênio entre eles. A extremidade 5 & # 8242 de cada cadeia contém o radical fosfato, enquanto a extremidade 3 & # 8242 possui um resíduo de açúcar (З & # 8217-ОН).

Características salientes do modelo В de DNA de Watson e Crick:

1. O DNA é a maior biomolécula da célula.

2. O DNA tem carga negativa e é dextrógiro.

3. A configuração molecular do DNA é 3D.

4. O DNA possui duas cadeias polinucleotídicas.

5. As duas cadeias de DNA têm polaridade antiparalela, 5 & # 8242 - & gt 3 & # 8242 em uma e 3 & # 8242 - & gt 5 & # 8242 em outra.

6. A espinha dorsal de cada cadeia polinucleotídica é feita de grupos alternativos de açúcar-fosfato. As bases de nitrogênio projetam-se para dentro.

7. As bases de nitrogênio de duas cadeias polinucleotídicas formam pares complementares, A oposto a T e С oposto a G.

8. Uma purina de grande porte sempre vem em oposição a uma pirimidina de pequeno porte. Isso gera uma distância uniforme entre duas vertentes da hélice.

9. A adenina (A) de uma cadeia polinucleotídica é mantida na timina (T) da cadeia oposta por duas ligações de hidrogênio. A citosina (C) de uma cadeia é semelhante à guanina da outra cadeia por três ligações de hidrogênio.

10. A corrente dupla é enrolada de forma helicoidal. O enrolamento é destro. Este enrolamento produz ranhuras menores e maiores alternadamente.

11. O passo da hélice é 3,4 nm (34 A) com aproximadamente 10 pares de bases em cada volta. A distância média entre dois pares de bases adjacentes chega a cerca de 0,34 nm (0,34 x 10 -9 m ou 3,4 A).

12. Planos de pares de bases adjacentes são empilhados uns sobre os outros. Junto com a ligação de hidrogênio, o empilhamento confere estabilidade à estrutura helicoidal.

13. O DNA é ácido. Para sua compactação, requer proteínas básicas (histonas). As proteínas histonas são fortemente carregadas e ocupam as principais ranhuras do DNA em um ângulo de 30 ° com o eixo da hélice.

Fios Sense e Antisense:

Ambas as fitas de DNA não participam do controle da hereditariedade e do metabolismo. Apenas um deles faz isso. A fita de DNA que funciona como molde para a síntese de RNA é conhecida como fita modelo, fita menos (-) ou fita anti-sentido.

Sua fita complementar é denominada fita não-modelo, fita positiva (+), fita de sentido e codificação. O último nome é dado porque, por convenção, o código genético do DNA é escrito de acordo com sua sequência.

DNA Nontemplate, Sense (+) ou Coding Strand

Modelo de DNA, antisense ou não codificador ou (-) cadeia

O RNA é transcrito na fita 3 & # 8217 → 5 & # 8242 (-) (molde / anti-fita) do DNA na direção 5 → 3.

O termo antisense também é usado em uma perspectiva mais ampla para qualquer sequência ou fita de DNA (ou RNA) que é complementar ao mRNA.

Desnaturação e Renaturação:

As ligações H entre as bases de nitrogênio de duas fitas de DNA podem quebrar devido à alta temperatura (82-90 ° C) ou pH baixo ou alto, de modo que as duas fitas se separam uma da outra. É chamado de desnaturação ou fusão. Uma vez que o par de bases A-T tem apenas ligações 2H, a área rica em pares de bases A-T pode sofrer desnaturação fácil (fusão). Essas áreas são chamadas de áreas de baixo ponto de fusão porque desnaturam a temperaturas comparativamente baixas. A área rica em pares de bases G-C (chamada área de fusão alta) é comparativamente mais estável e densa porque três ligações de hidrogênio conectam as bases G-C.

Essas áreas apresentam alta temperatura de fusão (Tm). Ao derreter, a viscosidade do DNA diminui. O DNA desnaturado tem a tendência de se reassociar, isto é, os filamentos de DNA separados por fusão a 82-90 ° C podem se reassociar e formar duplex no resfriamento à temperatura de 65 ° C. É denominado renaturação ou recozimento.

As fitas de DNA desnaturadas ou separadas absorvem mais energia luminosa do que a fita dupla de DNA intacta. O aumento da absorção de energia luminosa por fitas de DNA separadas ou desnaturadas é chamado de efeito hipercromático. O efeito é usado para saber se o DNA é de fita simples ou dupla.

O duplex de DNA possui áreas onde a sequência de nucleotídeos é a mesma, mas oposta nas duas fitas. Essas sequências são reconhecidas por endonucleases de restrição e são utilizadas em engenharia genética. Dada a seguir, a sequência de bases em uma fita (3 & # 8242 → 5 & # 8242) é GAATTC. É o mesmo na outra vertente quando lido na direção 5 & # 8242 → 3 & # 8242. É semelhante a palavras de palíndromo com as mesmas palavras na direção para frente e para trás, por exemplo, NITIN, MALAYALAM.

É o DNA que possui múltiplas cópias de sequências idênticas de bases de nitrogênio. O número de cópias da mesma sequência de base varia de alguns a milhões. O DNA que possui uma única cópia de sequências de bases é denominado DNA único. É feito de genes funcionais. Os genes de rRNA são, no entanto, repetidos várias vezes. O DNA repetitivo pode ocorrer em conjunto ou intercalado com sequências únicas.

É de dois tipos, altamente repetitivo e moderadamente repetitivo. O DNA altamente repetitivo consiste em sequências curtas de menos de 10 pares de bases que são repetidas milhões de vezes. Eles ocorrem em regiões pré-entroméricas, regiões heterocromáticas dos cromossomos Y e regiões satélites. O DNA moderadamente repetitivo consiste em algumas centenas de pares de bases repetidos pelo menos 1000 vezes. Ocorre em telômeros, centrômeros e transposons.

Sequências repetidas em tandem são especialmente sujeitas a desalinhamentos durante o emparelhamento de cromossomos e, portanto, o tamanho dos agrupamentos tandem tende a ser altamente polimórfico, com grandes variações entre os indivíduos. Aglomerados menores de tais sequências podem ser usados ​​para caracterizar genomas individuais na técnica de “impressão digital de DNA”.

É aquela parte do DNA repetitivo que tem longas sequências de nucleotídeos repetitivas em tandem que forma uma fração separada na ultracentrifugação de densidade. Dependendo do número de pares de bases envolvidos nas regiões de repetição, o DNA do satélite é de dois tipos, sequências de microssatélites (unidades de repetição de 1-6 bp flanqueadas por sequências conservadas) e sequências de minissatélites (11-60 bp flanqueadas por locais de restrição conservados). Estes últimos são hipervariáveis ​​e específicos para cada indivíduo. Eles estão sendo usados ​​para correspondência de DNA ou impressão digital, conforme descoberto pela primeira vez por Jeffreys et al (1985).

O arranjo das bases de nitrogênio do DNA (e seu produto mRNA) determina a sequência de grupos de aminoácidos em polipeptídeos ou proteínas formados sobre os ribossomos. Um aminoácido é especificado pela sequência de três bases de nitrogênio adjacentes. Este último é denominado códon. O segmento de DNA que determina a síntese do polipeptídeo completo é conhecido como cistron.

Em procariotos, um cistron tem uma sequência de codificação contínua do início ao fim. Nos eucariotos, um cistron contém regiões não codificantes que não produzem parte do produto do gene. Eles são chamados de íntrons. Os íntrons costumam ser variáveis. As partes codificantes são conhecidas como exons. Os cistrons com íntrons são chamados de genes divididos.

DNA codificador e não codificador:

Dependendo da capacidade de formar produtos funcionais ou não funcionais, o DNA tem dois tipos de segmentos, codificantes e não codificantes. Nos eucariotos, uma grande parte do DNA não é codificante, pois não forma nenhum produto funcional. Eles geralmente possuem sequências repetidas ou DNA repetitivo. A maioria deles tem posições fixas.

Alguns podem se deslocar de um lugar para outro. As sequências móveis são chamadas de genes saltadores ou transposons. Em procariotos, a quantidade de DNA não codificante ou não funcional é pequena. O DNA codificador consiste em sequências de DNA codificantes. Estes são de 2 tipos - sequências de codificação de proteínas que codificam todas as proteínas, exceto histonas e sequências de codificação não proteicas para tRNA, rRNA e histonas.

Funções do DNA:

1. Informações genéticas (Blue Print):

O DNA é o material genético que carrega todas as informações hereditárias. A informação genética está codificada no arranjo de suas bases de nitrogênio.

O DNA tem propriedade única de replicação ou produção de cópias de carbono (função autocatalítica). Isso é essencial para a transferência de informações genéticas de uma célula para suas filhas e de uma geração para a seguinte.

O DNA ocorre dentro dos cromossomos. Isso é essencial para a distribuição equitativa do DNA durante a divisão celular.

Durante a meiose, o crossing over dá origem a uma nova combinação de genes denominada recombinação.

Mudanças na sequência de bases de nitrogênio devido à adição, deleção ou replicação incorreta dão origem a mutações. As mutações são a fonte de todas as variações e evolução.

O DNA dá origem a RNAs por meio do processo de transcrição. É a atividade heterocatalítica do DNA.

7. Metabolismo celular:

Ele controla as reações metabólicas das células através da ajuda de RNAs específicos, síntese de proteínas, enzimas e hormônios específicos.

Devido ao funcionamento diferencial de algumas regiões específicas do DNA ou genes, diferentes partes dos organismos se diferenciam em forma, tamanho e funções.

O DNA controla o desenvolvimento de um organismo por meio do funcionamento de um relógio genético interno, com ou sem a ajuda de informações extrínsecas.

10. Impressão digital de DNA:

As sequências de microssatélites hipervariáveis ​​de DNA de cada indivíduo são distintas. Eles são usados ​​na identificação de indivíduos e na decifração de seus relacionamentos. O mecanismo é chamado de impressão digital de DNA.

A hereditariedade defeituosa pode ser corrigida pela incorporação de genes corretos no lugar dos defeituosos.

O excesso de disponibilidade de anti-mRNA ou RNAs anti-sentido não permitirá que os genes patogênicos se expressem. Por meio desta técnica, a falha da angioplastia foi verificada. Uma modificação desta técnica é a interferência de RNA (RNAi).


Materiais e métodos

Cepas e cultura celular

Cepas consanguíneas B2086 (tipo de acasalamento II), CU438 (Pmr / Pmr [tipo de acasalamento IV, pm-s]), CU427 (Chx / Chx [tipo de acasalamento VI, cy-s]) e CU428 (Mpr / Mpr [tipo de acasalamento VII, mp-s]) foram obtidos originalmente de Peter Bruns (Cornell University, Ithaca, NY). As cepas testadoras maduras de acasalamento tipo III e acasalamento tipo V foram progênies F1 de CU427 e CU428. TKU80 cepas knockout da linha germinativa homozigótica foram geradas conforme descrito antes [23]. ΔTKU80 cepas que faltaram TKU80 na linha germinativa e no macronúcleo foram gerados pelo acasalamento 2 TKU80 cepas nocaute da linha germinativa homozigótica a 30 ° C. Os pares de acasalamento foram isolados e incubados em meio SPP 5–6 horas após a mistura. TKU70-1, TKU70-2, TKU80, e GFP cepas geradoras de RNA em gancho foram geradas usando CU427 e CU428 como cepas parentais através do método descrito antes [40]. As células foram cultivadas em meio axênico, conforme descrito anteriormente [41].

Exame de selfing

As células subclonadas (aproximadamente 2 x 106 células) foram lavadas e privadas de alimentação em 10 mL de tampão Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) a 30 ° C. Tetrahymena os pares de acasalamento foram fixados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2% de paraformaldeído 6 horas após as células terem morrido de fome. A proporção de pares de acasalamento foi examinada sob um microscópio (Zeiss Axio Imager Z1 Carl Zeiss, Jena, Alemanha). Para o rastreio em massa de selfers, os subclones que cresceram até à saturação em meio Neff foram diluídos 50 vezes em tampão Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) e incubados a 30 ° C. Os pares de acasalamento foram examinados 12–24 horas após a diluição. Os pares de acasalamento foram vistos sob um microscópio de dissecação (Leica MZ 125 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemanha).

MTA/MTB análise

O DNA de células inteiras (aproximadamente 95% era DNA macronuclear) foi isolado para análise de PCR e hibridização Southern blot como descrito anteriormente [42]. Para amplificação de PCR do MTA e MTB Junções C-terminal, usamos 1 primer localizado no MTA (ou MTB) região específica e o outro primer localizado na região constante, conforme descrito antes [10]. Para análise por hibridização Southern, o DNA genômico foi digerido por enzimas de restrição e submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. O DNA foi transferido para uma membrana de náilon (IMMOBILON-NY + Millipore, Bedford, MA) e hibridizado com sondas marcadas com digoxigenina por um DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche). Todos os primers usados ​​para as reações de PCR estão listados na Tabela S5. A membrana foi lavada primeiro em 2 × soro fisiológico - citrato de sódio (SSC) com SDS a 0,1% e depois em 0,5 × SSC com SDS a 0,1% a 65 ° C várias vezes. Os sinais de luminescência foram detectados de acordo com as instruções do fabricante.

Silenciamento de gene RNAi em gancho (knockdown)

Para gerar TKU70-1, TKU70-2, TKU80, e GFP construtos knockdown, as regiões dentro das respectivas ORFs foram amplificadas por PCR e clonadas no vetor PCRII-I com 2 conjuntos de locais de enzimas de restrição, produzindo 2 cópias na orientação invertida e, em seguida, foram movidas para os vetores pIBF rDNA. A expressão do dímero invertido foi conduzida pelo indutível de cádmio MTT1 promotor [40]. Cada construção foi transformada em acasalamento Tetrahymena por eletroporação usando 10 μg de DNA de vetor em gancho [43]. As células foram transferidas para meio SPP após eletroporação (aproximadamente 10 horas após a mistura) a 30 ° C, seguido por plaqueamento em placas de 96 poços (aproximadamente 16 horas após a mistura). Os transformantes foram selecionados em 120 μg / ml de paromomicina (aproximadamente 28 horas após a mistura). O silenciamento foi induzido com cádmio (1 μg / ml) em aproximadamente 1 fissão (aproximadamente 25 horas após a mistura), aproximadamente 16 fissões e aproximadamente 22 fissões. Para silenciar continuamente TKU70-1hp, TKU70-2hp, e TKU80hp, o silenciamento foi encerrado em 69 fissões quando as células foram subclonadas para análise de autofecundação após a maturação sexual silenciamento contínuo de GFP, o controle adequado para células normais, foi encerrado em 82 fissões quando as células foram subclonadas para análise de autofecundação. O efeito de silenciamento foi analisado por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). O RNA total foi extraído das células usando um kit de isolamento de RNA (Roche). A síntese da primeira cadeia de cDNA foi realizada usando o Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) e oligo (dT) 18 como iniciador. A análise de qRT-PCR foi realizada usando o sistema LightCycler Carousel-Based PCR e LightCycler FastStart DNA Master PLUS SYBR Green I (Roche). Os níveis de expressão relativa foram normalizados usando mRNA de α-tubulina como um controle interno. As sequências de iniciadores estão listadas na Tabela S5.

Ensaio de sortimento

As células individuais foram subclonadas em gotas individuais de meio em placas de Petri e mantidas em uma caixa úmida a 30 ° C. Uma célula que se propaga para a saturação em uma gota requer aproximadamente 13 fissões. Neste momento, uma única célula foi subclonada novamente para uma nova gota, e as células restantes foram replicadas para meio com cicloheximida (25 μg / mL) ou 6-metilpurina (15 μg / mL) para a análise de resistência aos medicamentos [44] . As proporções sensíveis ao fármaco foram examinadas em fissões vegetativas em série e analisadas por regressão linear.

Análise de compatibilidade de acasalamento

Células testadoras de diferentes tipos de acasalamento foram submetidas à fome em meio Dryl (Na citrato-2H2O (2 mM), NaH2PO4· H2O (1 mM), Na2HPO4 (1 mM), e CaCl2 (1,5 mM)) [45] a 30 ° C por 5 horas e rotulado com 40 μg / mL NHS-Rodamina (Thermo Fisher Scientific) em meio Dryl por 2 horas. Para evitar autofecundação, cepas selfer foram privadas de 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) a 30 ° C por 7 horas. Antes de misturar, as células selfer e tester foram lavadas com Tris-HCl 10 mM (pH 7,4). As células foram coletadas 4 horas após a mistura e fixadas em PBS contendo 2% de paraformaldeído, seguido por coloração DAPI (100 ng / mL). As imagens foram capturadas usando um microscópio fluorescente (Zeiss Axio Imager Z1 Carl Zeiss, Jena, Alemanha). Células únicas desemparelhadas que mostraram núcleos meióticos foram consideradas indicações de pares soltos que iniciaram a reação de acasalamento (incluindo meiose), mas se separaram prematuramente. Eles foram contados para determinar a fração de pares soltos.

MTA/MTB análise de expressão por RT-PCR

O RNA total foi extraído de células famintas por 3 horas usando um kit de isolamento de RNA (Roche) e tratado com DNAse seguido por transcrição reversa em cDNA usando transcriptase reversa transcriptor (Roche) com oligo (dT) primers. Para examinar o MTAs e MTBs expressão, usamos primers localizados em exons. As sequências de primers são usadas em RT-PCR estão listadas na Tabela S5.

Eliminação de IES e análise de quebra de cromossomos

O DNA genômico foi purificado de células em conjugação, alimentação após conjugação e crescimento vegetativo. A exclusão de IESs e a quebra de cromossomos foram examinadas por análise de PCR [46-48]. Os primers usados ​​nestes experimentos estão listados (Tabela S5).

PCR ancorado em telômero

O DNA genômico foi extraído de células vegetativas coletadas em diferentes fissões. Dez minicromossomos eliminados foram examinados por análise de PCR usando um iniciador específico na extremidade de 1 minicromossomo com um iniciador de sequência telomérica [22]. The primers used in the experiment are listed in S5 Table.


Nanotechnology Tools for the Study of RNA

2.1.3 Scaffold Design (DNA Origami)

DNA origami takes a much different approach from that of multistranded and SST design. 42 Usually, 7249-nucleotides long single-strand circular genomic DNA of M13mp18 phage is used as scaffold and hundreds of short helper strands called staples are used to fold longer scaffold into specific structure. In the folding process, scaffold DNA acts as a guide or a seed, 51 which increases the efficiency of folding and robustness to the stoichiometry of strands.

In 2006, “Smiley face” shook the DNA nanotechnology field ( Fig. 3 A). 42 Rothemund changed the rule of the game from assembling short strands motif into a large structure to fold long scaffold into specific structure. 52 The long scaffold of DNA origami is fold and hold by crossover made by staple strands. Typically, the staple strands bind to three adjacent helices, and the length is commonly 32 nucleotides, in which central 16 nucleotides bind to one helix and the remaining two parts of 8-nucleotide ends bind to the adjacent helices ( Fig. 3 B). The helical turn of DNA is usually approximated to be 3–3.5 nm in length and 3.5 nm in width. One helical turn (10.67 nucleotides) is different from that of canonical DNA (10.4 nucleotides/turn), resulting in the slightly twisted structure. Therefore, to relax the strain, usually one nucleotide is omitted every 48 nucleotides. 53 The length (about 3.5 nm) is also slightly different from that of canonical DNA (3.4 nm), which might be due to the interhelix gap presumably induced by electrostatic repulsion. Folded structures with straight edges sometimes stick together due to ππ stacking. To prevent this aggregation, single-strand 4T hairpin loops (four thymidines) are introduced to the staple strands located at the edge and corner part. If the stacking of folded DNA origami cause severe problem, one can design the edge with concavity and convexity.

Figura 3 . Scaffold design (DNA origami). (A) Smiley face structure with DNA origami method. (B) In DNA origami method, long circular single-stranded DNA (black) is folded into the desired shape by many short single-stranded DNAs (termed “Staple”), the latter typically bind to three adjacent helices, and the length is commonly 32 nucleotides, in which the central 16 nucleotides bind to one helix and the remaining two parts of 8-nucleotide ends bind to the adjacent helices. Unit pixel size is with dimensions of 3.6 × 3.5 nm.

Part A, B: adapted from Rothemund (2006), images reproduced with permission from Nature Publishing Group (NPG). 42

Folding of DNA is performed by adding a 5- to 10-fold excess of each staple strand, and by annealing the sample using PCR machine with ramp method (decrease the temperature of the sample with time) or at constant temperature. 54 Folded DNA origami can be purified by column (ultrafiltration, gel filtration), by gel electrophoresis, 55,56 or by PEG precipitation. 57,58 The yield of folding is quite high (90–95%) and the homogeneity is also high. 59

DNA origami also can be folded into 3D objects, 60,61 where the architecture is developed from a six-helix bundle (6HB) DNA nanotube. 62 In this architecture the unit length is 7 nucleotides and not 8 nucleotides. Seven nucleotides correspond exactly to 2/3 of a turn and 14 nucleotides correspond exactly to 4/3 of a turn, therefore, crossover between adjacent helix is allowed in honeycomb 6HB bundle structure, where six helices rotated 120 degrees to each other ( Fig. 4 A). These features allow connecting multiple honeycomb layers, enabling the formation of 3D objects ( Fig. 4 A). Further introduction of twist and curve, more complicated structure of gear, 63 box, 64–66 pot, 67 and sphere 68 were made ( Fig. 4 B). Recently, with the aid of graph theory and relaxation simulation, a general method of folding arbitrary polygonal digital meshes into the structure was reported, in which the design process is highly automated. 69 Thus, various types of structures could be made by scaffold design (DNA origami) methods.

Figura 4. 3D DNA structure of Scaffold design. (A) Basic unit of scaffold designed 3D DNA structure. Cross-section (left) and side view (right) of honeycomb structure composed of six helices with sample staples using caDNAno ( http://cadnano.org/ , bottom). 60,70 See also Section 5.3 for detailed design processes. (B) Representative 3D structures such as gear and pod.

Part B: adapted from Deitz et al. (2009) (left) 63 and Han et al. (2011) (right). 67

Highly assembled structure of DNA origami is also possible. Using pole and joint approach Yin and coworkers made hexagonal prism (60 MDa, Fig. 5 A). 71 With 100-nm edges, the sizes of these structures become comparable to those of bacterial microcompartments such as carboxysomes. The joint pole termed DNA “tripod” is a 5-MDa 3-arm-junction origami tile, in which interarm angles and pole (arm) length can be controlled, so that, with the connector sequence design, many types of structures such as a tetrahedron (–20 MDa), a triangular prism (–30 MDa), a cube (–40 MDa), a pentagonal prism (–50 MDa), and a hexagonal prism (–60 MDa) can be self-assembled. In a tripod, each arm has an equal length (–50 nm) and contains 16 parallel double-helices packed on a honeycomb lattice with twofold rotational symmetry, and “struts” consisting of two double-helices support and control the angle between the two arms. The yields of tripod-assembled structures are highly dependent on the number of vertexes: 45, 24, 20, 4.2, and 0.11% for the tetrahedron, the triangular prism, the cube, the pentagonal prism, and the hexagonal prism, respectively. Dietz and coworkers took another approach to make polymerized structures with dynamic structure change. 72 Inspired by the interaction between an RNA-based enzyme ribonuclease P (RNase P) which cleaves the 5’ leader sequence for tRNA maturation and its substrate pretransfer RNA (tRNA). They used shape complementarity to assemble multiple DNA origami. In RNase P recognition, the acceptor stem and the TΨC loop of tRNA fit to the binding pocket of RNase P by a few nucleobase stacking interactions with the S domain of RNase P ( Fig. 5 B). 73 Similarly, in RNase P-inspired shape recognition method, blunt-ended double-helical DNA protrusions on one motif assume the role of the tRNA acceptor stem and corresponding concave on another motif mimic the RNase P binding pocket, and the nucleobase stacking bonds connect two motifs. 53,74–76 Upon two motifs engage, nucleobase stacking interactions occur at the double helical interface of the shape complementary protrusions and concave, but only when the helices fit correctly. Nucleobase stacking interaction method is sensitive to the concentration of counter ions, such as monovalent and divalent cations in the solution because repulsion between the negatively charged surfaces of DNA affects the equilibrium of the interaction, which allows on-off switching of the interface. All in all, without base pairing, RNase P-inspired method with nucleobase stacking bonds can build up micrometer-scale one- and two-stranded filaments and lattice, and transformable nanorobot. The merit of DNA origami is the design ability and robustness. As mentioned earlier, many types of structures have been made with high yield. In addition, long single-strand DNA scaffold can be a backbone, such that the structural rigidity to be ensured. 77 The limitation is based on the length of long scaffold. However, long scaffolds such as lambda DNA/M13 hybrid DNA scaffold (51,466 nucleotides), 78 PCR amplification-based scaffold [26 kb nucleotide fragment of lambda DNA (48,502 kb)], 79 and double strand form of lambda DNA itself 80 was used instead of M13mp18 scaffold (7,249 nucleotides). Combining these methods with higher order assemble method described previously, the limitation of scaffold may not be a problem from a practical point of view.

Figura 5. Higher assembled DNA structure. (A) Pole and joint approach to construct higher assembled DNA structure. A tripod is composed of one set of DNA origami structure and used as a basic unit that has three arms and binds with each other at the apical point. The structure of the end product is defined by the angle between the arms. (B) Shape-complementarity method to construct higher assembled DNA structure. (Top) DNA structure binds to its paired structure (top right) in a way that RNase P recognizes its substrate tRNA (top left). (Middle) Upon two motifs engagement, nucleobase stacking interactions occur at the double helical interface of the complementary shapes, but only upon correct fit of the helices. (Bottom) Shape-complementary interaction is highly affected by ion concentration, therefore higher assembled DNA structure, for example, nanorobot of 15 MDa, can be reversibly transformed in three different conformation states: disassembled, assembled with open arms, and assembled with closed arms, respectively, by changing the Mg 2+ concentration.

Part A: adapted from Iinuma et al. (2014). 71 Part B: adapted from Gerling et al. (2015). 72


The DNA double helix

DNA is deoxyribonucleic acid, which is the molecule of inheritance that contains all of our genes. The DNA molecule consists of two strands of nucleotides which are joined together by hydrogen bonds which form between the nitrogen bases.

The backbone of the molecule consists of deoxyribose sugars that alternate with and are attached to phosphate groups by covalent phosphodiester bonds.

The monomer of the DNA molecule is a nucleotide which consists of a sugar molecule, a phosphate group, and a nitrogen base. The base is one of four possible molecules, adenine, thymine, cytosine or guanine.

The deoxyribose is a pentose sugar which means it has five carbons present, which are numbered from 1’ to 5’. The nitrogen base links to the 1’ carbon atom of the sugar molecule and the type of bond between the two structures is a glycosidic bond.

Two nucleotides can link together by a bond which forms between the phosphate group of one and the 3’ carbon of the sugar of the second nucleotide. Several nucleotides linked together form a chain known as a polynucleotide.

The entire molecule of DNA twists to form a helical three-dimensional structure and several molecules of the nucleic acid attach to histones and are organized into chromatin material in the nucleus.

The nitrogen bases of the nucleotide

It is the sequence of the bases that make up the genes of a cell. However, some of the bases do not code for particular proteins.

The thymine and cytosine are classified as pyrimidines because they consist of a single ring structure. The purines are the adenine and guanine, which have two rings in each case.

The nitrogen bases only bond in a specific manner, namely adenine with thymine and cytosine with guanine. These are known as Chargaff’s rules, named for the scientist who first discovered that there were equal quantities of the complementary bases.

Three bonds form the connection between the cytosine and the guanine. By comparison, only two bonds form between thymine and adenine bases.

What all these bonds have in common is that they are relatively weak and break easily. This is very important because the two strands of DNA have to be able to separate for such processes as when the DNA is copied in replication, and when the transcription stage of protein synthesis takes place.

DNA repair

The DNA strand can become damaged but often the cell is able to repair the error. In some cases, cells with damaged DNA simply self-destruct through the process of apoptosis.

Damage can be due to environmental factors including UV radiation or chemicals. Various excision repair methods have been discovered that allow cells to correct mismatch errors and replace any nucleotides or bases that may be wrong.

Repair of the DNA by excision involves enzymes actually cutting out the pieces of the strand that are erroneous. Other enzymes such as polymerase can then act to replace the missing pieces, and ligase can function to fill in any other gaps that may remain in the DNA molecule.


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Como funciona o DNA

­DNA carries the information for making all of the cell's proteins. These pro­teins implement all of the functions of a living organism and determine the organism'­s characteristics. When the cell reproduces, it has to pass all of this information on to the daughter cells.

Before a cell can reproduce, it must first replicate, or make a copy of, its DNA. Where DNA replication occurs depends upon whether the cells is a prokaryotic or a eukaryote (see the RNA sidebar on the previous page for more about the types of cells). DNA replication occurs in the cytoplasm of prokaryotes and in the nucleus of eukaryotes. Regardless of where DNA replication occurs, the basic process is the same.

The structure of DNA lends itself easily to DNA replication. Each side of the double helix runs in opposite (anti-parallel) directions. The beauty of this structure is that it can unzip down the middle and each side can serve as a pattern or template for the other side (called semi-conservative replication) However, DNA does not unzip entirely. It unzips in a small area called a replication fork, which then moves down the entire length of the molecule.

  1. Uma enzima chamada DNA gyrase makes a nick in the double helix and each side separates
  2. Uma enzima chamada helicase unwinds the double-stranded DNA
  3. Several small proteins called single strand binding proteins (SSB) temporarily bind to each side and keep them separated
  4. An enzyme complex called DNA polymerase "walks" down the DNA strands and adds new nucleotides to each strand. The nucleotides pair with the complementary nucleotides on the existing stand (A with T, G with C).
  5. A subunit of the DNA polymerase proofreads the new DNA
  6. Uma enzima chamada DNA ligase seals up the fragments into one long continuous strand
  7. The new copies automatically wind up again

Different types of cells replicated their DNA at different rates. Some cells constantly divide, like those in your hair and fingernails and bone marrow cells. Other cells go through several rounds of cell division and stop (including specialized cells, like those in your brain, muscle and heart). Finally, some cells stop dividing, but can be induced to divide to repair injury (such as skin cells and liver cells). In cells that do not constantly divide, the cues for DNA replication/cell division come in the form of chemicals. These chemicals can come from other parts of the body (hormones) or from the environment.

The DNA of all living organisms has the same structure and code, although some viruses use RNA as the information carrier instead of DNA. Most animals have two copies of each chromosome. In contrast, plants may have more than two copies of several chromosomes, which usually arise from errors in the distribution of the chromosomes during cell reproduction. In animals, this type of error usually causes genetic diseases that are usually fatal. For some unknown reasons, this type of error is not as devastating to plants.


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