Em formação

7.4: Mutações e câncer - Biologia


O que aconteceria se este ciclo prosseguisse à vontade?

Suas células podem crescer e se dividir sem realizar suas funções necessárias, ou sem replicar totalmente seu DNA, ou sem copiar suas organelas. Portanto, o ciclo celular precisa ser altamente regulado e rigidamente controlado. E isso é.

Controle do ciclo celular

Como a célula sabe quando se dividir? Como a célula sabe quando replicar seu DNA? Como a célula sabe quando entrar em mitose ou citocinese? As respostas a essas perguntas têm a ver com o controle do ciclo celular. Mas como o ciclo celular é controlado ou regulado? A regulação do ciclo celular envolve processos cruciais para a sobrevivência de uma célula. Isso inclui a detecção e reparo de danos ao DNA, bem como a prevenção da divisão celular descontrolada. A divisão celular descontrolada pode ser mortal para um organismo; sua prevenção é crítica para a sobrevivência.

Ciclinas e quinases

O ciclo celular é controlado por vários processos de feedback controlados por proteínas. Dois tipos de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular são quinases e ciclinas. As ciclinas ativam quinases ligando-se a elas, especificamente elas ativam quinases dependentes de ciclina (CDK). Quinases são enzimas que catalisam a transferência de um grupo fosfato de ATP para outra molécula em uma célula. Eles funcionam como uma chave de controle em muitas funções celulares, ligando ou desligando uma função e regulando outros processos celulares. Muitas vezes, eles estão envolvidos na ativação de uma cascata de reações. As ciclinas compreendem um grupo de proteínas que são produzidas rapidamente em estágios-chave do ciclo celular. Uma vez ativadas por uma ciclina, as enzimas CDK ativam ou inativam outras moléculas alvo por meio da fosforilação. É essa regulação precisa das proteínas que desencadeia o avanço ao longo do ciclo celular. Leland H. Hartwell, R. Timothy Hunt e Paul M. Nurse ganharam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2001 pela descoberta dessas proteínas críticas.

O que torna uma célula cancerosa?

Câncer é uma doença caracterizada por uma população de células que crescem e se dividem sem respeitar os limites normais. Essas células cancerosas invadem e destroem os tecidos adjacentes e podem se espalhar por todo o corpo. O processo pelo qual as células normais são transformadas em células cancerosas é conhecido como carcinogênese. Este processo também é conhecido como oncogênese ou tumorigênese.

Quase todos os cânceres são causados ​​por mutações no DNA de células anormais. Essas mutações podem ser devido aos efeitos de cancerígenos, agentes causadores de câncer, como fumaça de tabaco, radiação, produtos químicos ou agentes infecciosos. Esses carcinógenos podem atuar como um “gatilho” ambiental, estimulando o aparecimento do câncer em certos indivíduos e não em outros. Todas as pessoas que fumam têm câncer? Não. O fumo passivo pode aumentar a chance de uma pessoa não fumante desenvolver câncer de pulmão? sim. Também aumenta a chance de uma pessoa não fumante desenvolver doenças cardíacas.

As interações complexas entre os carcinógenos e o genoma de um indivíduo podem explicar por que apenas algumas pessoas desenvolvem câncer após a exposição a um gatilho ambiental e outras não. Todos os cânceres precisam de um gatilho ambiental para se desenvolver? Não. Mutações causadoras de câncer também podem resultar de erros incorporados ao DNA durante a replicação ou podem ser herdadas. Mutações herdadas estão presentes em todas as células do organismo.

Oncogenes e genes supressores de tumor

Alguns tipos de câncer ocorrem por causa de mutações em genes que controlam o ciclo celular. Mutações que causam câncer ocorrem mais freqüentemente em dois tipos de genes reguladores, chamados proto-oncogenes e genes supressores de tumor.

  • Os proto-oncogenes são genes que normalmente ajudam a divisão das células. Quando um proto-oncogene sofre mutação para se tornar um oncogene, ele está continuamente ativo, mesmo quando não deveria estar. É como o pedal do acelerador de um carro preso na aceleração máxima. O carro continua correndo em alta velocidade. No caso de uma célula, ela continua se dividindo fora de controle, o que pode levar ao câncer.

  • Genes supressores de tumor são genes que normalmente diminuem ou interrompem a divisão celular. Quando ocorre uma mutação em um gene supressor de tumor, ele não pode mais controlar a divisão celular. É como um carro sem freios. O carro não pode ser desacelerado ou parado. No caso de uma célula, ela continua se dividindo fora de controle, o que pode levar ao câncer.

Várias mutações que causam câncer
Oncogenes podem ser fatores de crescimento, proteínas quinases, GTPases ou fatores de transcrição. Fatores de crescimento são substâncias que ocorrem naturalmente, geralmente uma proteína ou hormônio esteróide, capaz de estimular o crescimento, proliferação e diferenciação celular. Eles são importantes para regular uma variedade de processos celulares. Normalmente, eles devem se ligar a um receptor extracelular ou intracelular para iniciar uma reação celular.

Normalmente, uma série de várias mutações que ativam oncogenes constitutivamente e inativam genes supressores de tumor é necessária para transformar uma célula normal em uma célula cancerosa (Figura ( PageIndex {2} )). As células desenvolveram uma série de mecanismos de controle para superar mutações em proto-oncogenes. Portanto, uma célula precisa de múltiplas mutações para se transformar em uma célula cancerosa. Uma mutação em um proto-oncogene não causaria câncer, pois os efeitos da mutação seriam mascarados pelo controle normal do ciclo celular e pelas ações dos genes supressores de tumor. Da mesma forma, uma mutação em um gene supressor de tumor também não causaria câncer, devido à presença de muitos genes "reserva" que duplicam suas funções. Somente quando um número suficiente de proto-oncogenes sofreu mutação em oncogenes e genes supressores de tumor suficientes foram desativados é que a transformação cancerosa pode começar. Os sinais de crescimento celular superam os sinais de regulação do crescimento e a célula rapidamente sai de controle. Freqüentemente, como muitos desses genes regulam os processos que evitam a maioria dos danos aos próprios genes, os danos ao DNA se acumulam com a idade.

Normalmente, os oncogenes são alelos dominantes, pois contêm mutações de ganho de função. As ações do produto do gene do alelo mutante, muitas vezes resultando em uma proteína ativada constitutivamente, são dominantes para o produto do gene produzido pelo alelo "normal". Enquanto isso, os supressores de tumor com mutação são geralmente alelos recessivos, pois contêm mutações de perda de função. Um proto-oncogene precisa apenas de uma mutação em uma cópia do gene para gerar um oncogene; um gene supressor de tumor precisa de uma mutação em ambas as cópias do gene para tornar ambos os produtos defeituosos. Há casos em que, no entanto, um alelo mutado de um gene supressor de tumor pode tornar a outra cópia não funcional. Essas instâncias resultam no que é conhecido como efeito negativo dominante.

Análise

  1. Defina câncer.
  2. O que são quinases dependentes de ciclina? Qual é o seu papel?
  3. Discuta o papel dos oncogenes e genes supressores de tumor na carcinogênese.
  4. Por que várias mutações são necessárias para a transformação em uma célula cancerosa?
  5. Identifique todas as categorias de oncogenes e descreva duas categorias.

Mutação

O câncer é o resultado da quebra dos controles que regulam as células. As causas da quebra sempre incluem mudanças em genes importantes. Essas mudanças são frequentemente o resultado de mutações, mudanças na sequência de DNA dos cromossomos. As mutações podem ser alterações muito pequenas, afetando apenas alguns nucleotídeos, ou podem ser muito grandes, levando a grandes alterações na estrutura dos cromossomos.

Tanto pequenas como grandes mutações podem afetar o comportamento das células. Combinações de mutações em genes importantes podem levar ao desenvolvimento de câncer. O material coberto nesta página descreve a relação entre mutação e câncer, os diferentes tipos de mutações e suas causas. Mais informações sobre os tópicos desta página também podem ser encontradas na maioria dos livros introdutórios de Biologia, recomendamos Campbell Biology, 11ª edição.


Fundo

Drogas citotóxicas têm sido usadas para a terapia do câncer desde 1950 e continuam sendo o tratamento de primeira linha para a maioria dos cânceres hoje. Essas drogas inibem a proliferação celular por meio de uma variedade de mecanismos diferentes, incluindo danos diretos ao DNA, interferindo no metabolismo do DNA e interferindo na maquinaria mitótica. Os tratamentos bem-sucedidos matam as células tumorais, mas também exercem efeitos colaterais atribuíveis a uma série de fatores, incluindo a inibição da proliferação celular em tecidos saudáveis. Os tratamentos também podem ter consequências negativas de longo prazo por meio da indução de alterações genômicas. Em células somáticas normais, as mutações induzidas pela quimioterapia podem acelerar os processos tumorigênicos. O desenvolvimento de doenças malignas secundárias é uma questão especialmente significativa após cânceres infantis e estudos epidemiológicos associaram o tratamento com agentes alquilantes e inibidores da topoisomerase ao desenvolvimento posterior de leucemia mioblástica aguda (LMA) e outros tipos de tumor [1]. Além disso, as mutações induzidas pelo tratamento em células cancerosas sobreviventes aumentam a heterogeneidade genética do tumor e podem contribuir para o desenvolvimento de resistência ao tratamento posterior.

Os quimioterápicos são testados quanto à genotoxicidade, a capacidade da droga de causar danos ao DNA. Os testes mais importantes atualmente aprovados são o ensaio do cometa para detecção de quebras de DNA, o ensaio de aberração cromossômica e o teste de formação de micronúcleos [2]. Esses ensaios fornecem previsões indiretas e imprecisas do potencial carcinogênico [3], pois um achado de genotoxicidade apenas revela que um composto tem potencial para causar mutações genômicas, sem medir o resultado em uma célula sobrevivente. A própria mutagenicidade foi avaliada principalmente usando genes repórter, incluindo o ensaio de mutação reversa de Ames em bactérias [4] e HPRT mutagênese em linhagens de células de mamíferos [5]. No entanto, a detecção abrangente de todas as alterações genômicas de todos os tipos só se tornou disponível com o sequenciamento do genoma completo.

Os efeitos mutagênicos foram atribuídos a uma grande proporção de agentes quimioterápicos contra o câncer. Agentes alquilantes induzem adutos de DNA diretos e mostardas de nitrogênio, como a ciclofosfamida, mostraram induzir mutações de substituição de base em repórteres de mutação, bem como rearranjos cromossômicos [6]. Os agentes de reticulação contendo platina funcionam por um mecanismo semelhante aos agentes alquilantes. Foi demonstrado que adutos de cisplatina causam substituições de bases in vitro e em genes repórter [7], que também foram detectados em tratados com cisplatina C. elegans genomas de vermes [8]. Os inibidores da topoisomerase II, como o etoposídeo e a doxorrubicina, causam quebras no DNA, que são as prováveis ​​causas de translocações cromossômicas em cânceres secundários induzidos por essas drogas [9, 10]. Drogas da família diversa de antimetabólitos interferem na replicação do DNA, levando a quebras de fita dupla e aberrações cromossômicas [11–13]. Não se espera que a classe de quimioterápicos do câncer direcionados aos microtúbulos tenha um impacto direto na mutagênese, embora o paclitaxel tenha sido descrito por afetar o reparo do DNA por meio da interrupção do tráfego de proteínas de reparo do DNA [14].

Em resumo, embora os efeitos genotóxicos tenham sido medidos indiretamente para a maioria dos medicamentos citotóxicos, os dados baseados em sequência para mutagenicidade estão disponíveis apenas para a cisplatina, a partir de um modelo de invertebrado [8]. Para adquirir dados confiáveis ​​sobre mutagenicidade genômica, realizamos o sequenciamento do genoma completo em células cultivadas tratadas com representantes de cada categoria principal de quimioterápicos contra o câncer. Foi relatado que cada um dos agentes citotóxicos escolhidos (Tabela 1) deu um resultado positivo no teste de Ames ou no teste de umu bacteriano relacionado [15–19]. HPRT mutagênese foi relatada para cisplatina, ciclofosfamida, doxorrubicina e etoposídeo [20-23], mas ausente para hidroxiureia [24]. Nós nos propusemos a determinar a relevância dessas descobertas para a mutagênese genômica em células de vertebrados. Esses estudos não foram realizados anteriormente, mas uma prova de conceito é fornecida por um relatório recente sobre o efeito genômico de três mutágenos ambientais em clones de fibroblastos embrionários de camundongo sequenciados únicos [25], bem como estudos anteriores que usaram sequenciamento de exoma inteiro [ 26–28]. O principal benefício dos dados do espectro mutagênico obtido será a capacidade de usar sequências do genoma do câncer para determinar se as drogas mutagênicas contribuíram para o desenvolvimento do tumor, e damos um exemplo importante disso na reversão de mutações de genes oncogênicos. A linha de células de linfoblastoma de frango DT40 foi escolhida para tratamentos pelas seguintes razões: (1) o tamanho do genoma é cerca de um terço em comparação com o genoma humano (2) esta linha de células tem sido usada extensivamente para estudos de reparo de DNA e modela mamíferos O reparo do DNA bem [29] e (3) a disponibilidade de uma ampla gama de linhas de células mutantes de reparo de DNA isogênicas permitirá futuras comparações sobre a influência de fatores de reparo individuais na mutagênese. Esta análise genômica detalhada de múltiplos clones de células pós-tratamento fornece a pesquisa mais abrangente do potencial mutagênico de citotóxicos comumente usados ​​na medicina do câncer.


Resultados

Níveis de expressão de mRNA ER, PR e HER2 preveem subtipos de câncer de mama

Nós caracterizamos alterações genéticas em 51 tumores de mama e 46 linhas de células de câncer de mama. Procuramos estudar os três subtipos principais definidos pela prática clínica atual: Amostras com HER2 amplificado ou superexpresso foram atribuídas ao subtipo HER2 +; amostras negativas de HER2 expressando ER ou PR foram atribuídas ao subtipo ER + / PR + e outras amostras foram atribuídas para o subtipo triplo-negativo. Esses subtipos são determinados usando um algoritmo simples com uma base biológica clara e sua relevância para o prognóstico e o tratamento está bem estabelecida.

O status ER, PR e HER2 é geralmente determinado na prática clínica por imunohistoquímica ou fluorescência no local hibridização, mas os resultados dessas abordagens estavam disponíveis para apenas uma fração das amostras de tumor neste estudo (ver Materiais e Métodos e Tabela Suplementar S1). Portanto, desenvolvemos classificadores de regressão logística para o status ER e PR usando dados de microarray para o ESR1 e PGR genes. Os dados de microarray para esses genes previram muito bem o status do marcador determinado pelo patologista (Fig. Suplementar S1) com taxas de erro no conjunto de dados de treinamento de 12 de 143 para ER e 32 de 142 para PR. Para inferir o status de HER2, identificamos amostras com ganhos de cópia no locus ERBB2 ou superexpressão de mRNA (ver Materiais e Métodos e Suplementar Fig. S1). Esses procedimentos foram usados ​​para atribuir 51 tumores de mama a três subtipos (8 HER2 +, 26 ER + / PR +, 17 triplo negativo). A atribuição dos tumores aos cinco subtipos principais definidos pelos dados de expressão gênica (26) deu resultados semelhantes (Tabela Suplementar S1). Nenhuma de nossas amostras foi atribuída ao subtipo de expressão gênica normal e apenas uma foi atribuída ao subtipo B luminal. Nosso conjunto de amostra é, portanto, insuficiente para investigar esses subtipos adicionais.

A aplicação dos classificadores baseados em mRNA e número de cópias a linhas de células de câncer de mama designadas 15 linhas como HER2 +, 12 como ER + / PR + e 19 como triplo negativo. Nossas atribuições estão de acordo com o estudo recente de Neve et al. (27), que classificou todas as nossas linhas celulares triplo-negativas como basais e todas, exceto uma das nossas linhas celulares ER + / PR + como luminais. Os resultados de ambos os tumores de mama e linhas celulares indicaram que os níveis de expressão de ESR1 e PGR são bons substitutos para o status de ER e PR.

Tumores mamários HER2 + e triplo-negativo exibem maior instabilidade do número de cópias

Para entender se a instabilidade genômica geral difere entre os subtipos de câncer de mama, primeiro examinamos as frequências gerais de alterações no número de cópias em tumores (Fig. 1A). As frações do genoma exibindo ganhos de cópia diferem significativamente entre os subtipos (P & lt 0,05, quando qualquer limite para ganho de número de cópias ≥2,8 cópias é considerado). Os tumores triplo-negativos têm as frequências mais altas de ganhos modestos. No entanto, os tumores HER2 + têm as frequências mais altas de ganhos de alto nível, que incluem amplificações focais. Esta tendência não é explicada simplesmente pelo ERBB2 amplicon no cromossomo 17 porque as mesmas diferenças entre os subtipos são observadas quando o cromossomo 17 é excluído da consideração (Fig. 1B). As mesmas diferenças de subtipo foram observadas nas linhas de células (dados não mostrados). Não encontramos uma diferença estatisticamente significativa nas frequências de perda do número de cópias entre os subtipos.

Associações entre subtipos e frequências de alterações genéticas em todo o genoma. UMA e B. A fração média do genoma exibindo ganhos, incluindo e excluindo o cromossomo 17, respectivamente, já que diferentes limiares para ganho de cópia são considerados em triplo-negativo (vermelho), HER2 + (verde), e ER + / PR + (azul) amostras. C. Gráfico de caixa da assinatura de instabilidade cromossômica (CIN25) por subtipo. Carter et al. (28) estimaram a aneuploidia de amostras individuais de câncer quantificando a extensão em que genes na mesma região cromossômica têm níveis de expressão de mRNA coordenados. A assinatura CIN25 é composta por genes cuja expressão está correlacionada com esta medida de aneuploidia. Valores elevados de CIN25 estão associados a resultados ruins em vários tipos de tumor.

Para caracterizar ainda mais as diferenças na instabilidade genômica entre os subtipos de tumor, usamos uma assinatura de expressão gênica que reflete a instabilidade cromossômica e está associada a resultados ruins em vários tipos de câncer (28). Testamos se a assinatura é a mesma em todos os três subtipos. Descobrimos que os tumores triplo-negativos e HER2 + têm maior expressão da assinatura de instabilidade do que os tumores ER + / PR + (P = 0,005 Fig. 1C). Isso é consistente com as diferenças de subtipo nas frequências de ganhos de número de cópias e também com o pior prognóstico associado a HER2 + e cânceres triplo-negativos (8-10).

Copiar alterações de número associadas a subtipos de câncer de mama

Além dos padrões globais de alteração do número de cópias, buscamos identificar regiões específicas de alteração do número de cópias associadas a subtipos e genes funcionalmente importantes dentro dessas regiões. A Figura 2 mostra as frequências de ganhos e perdas para os diferentes subtipos, conforme medido em tumores com matrizes de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) Affymetrix 500k. Observamos algumas diferenças nas frequências entre subtipos semelhantes aos descritos em estudos recentes (por exemplo, perdas em 5q em triplo negativo, ganhos em 10p em triplo negativo e HER2 +, ganhos em 11q13 em ER + / PR + refs. 22-24) . Também observamos algumas diferenças adicionais (por exemplo, perdas em 6q em ER + / PR +, ganhos em 17q21 e 17q23 em ER + / PR + e HER2 +, perdas em 15p em triplo negativo).

Ganhos e perdas em todo o genoma de tumores de mama por subtipo. Os gráficos mostram ganhos acima do x eixo (frequência vezes magnitude) e perdas abaixo do x eixo (frequência) em triplo negativo (UMA), HER2 + (B), e ER + / PR + (C) subtipos. Setas, regiões de asteriscos de ganhos associados ao subtipo, regiões de perdas associadas ao subtipo. Estas regiões foram selecionadas com base nos dados do tumor apenas, sem levar em conta a replicação nas linhas de células.

Diferentes frequências de alteração do número de cópias dentro de uma região podem ocorrer por acaso e podem ser características de um conjunto de amostras, mas não observadas em outros. Procuramos identificar regiões que estivessem estatisticamente significativamente associadas a subtipos e observadas em dois conjuntos de amostras independentes. Primeiro identificamos as regiões cromossômicas com ganhos ou perdas recorrentes (& gt2.5 cópias ou & lt1.6 cópias em pelo menos 10% das amostras de tumor) com diferenças na frequência de ganho ou perda entre subtipos em tumores. Em seguida, validamos essas regiões em dados de um conjunto independente de 47 linhas de células de câncer de mama. Um total de sete regiões cromossômicas mostraram associação consistente em ambos os conjuntos de amostras (Tabela 1 Fig. 3).

Regiões de alteração do número de cópias associadas ao subtipo em dois conjuntos de amostras independentes

Copie o número nas regiões associadas ao subtipo. Azul, perdas vermelhas, ganhos. Os intervalos genômicos consistentemente associados ao subtipo em ambos os tumores e linhas celulares foram identificados. Os intervalos fisicamente adjacentes com o mesmo padrão de associação de subtipo foram mesclados para formar as sete regiões mostradas. O número médio de cópias dos intervalos mesclados é indicado pela cor: azul, perdas vermelhas, ganhos.

Candidatos a genes motoristas para regiões associadas a subtipos

Uma região recorrente de alteração do número de cópias normalmente se estende por vários genes. Identificar os genes condutores (genes funcionalmente envolvidos na tumorigênese) com confiança geralmente requer extensa experimentação. Portanto, desenvolvemos uma estratégia computacional para identificar genes condutores candidatos para acompanhamento experimental com base em três hipóteses: primeiro, que os genes condutores são encontrados na parte de uma região de alteração recorrente do número de cópias que é mais frequentemente e mais significativamente ganha ou perdida em segundo lugar , que os genes drivers sofrem alterações marcantes na expressão gênica como consequência da mudança no número de cópias e, terceiro, que as mudanças na expressão dos genes drivers podem estar associadas a um resultado clínico ruim. Nem todas essas três hipóteses podem ser válidas para todos os genes controladores, mas a combinação das evidências das três pode identificar os candidatos.

No amplicon HER2, por exemplo, ERBB2 é encontrado no ponto mais amplificado, é superexpresso na amplificação e está associado ao aumento da ocorrência de metástases à distância no estudo de van't Veer et al. (ref. 29 Fig. 4A). Um outro gene no amplicon, GRB7, também atende a esses critérios. Isso pode ser simplesmente devido à sua proximidade com ERBB2, mas estudos de interferência de RNA sugerem que GRB7 também pode contribuir para a proliferação de células do câncer de mama (30).

Identificação de genes condutores candidatos. UMA. Região de 35 Mbp do cromossomo 17. B. Região de 45 Mb do cromossomo 17. C. Região de 55 Mb do cromossomo 17. D. Região de 70 Mb do cromossomo 11. Principal ganho de cópia resumido (vermelho) e as localizações de genes associados a metástases distantes em P & lt 0,05 (azul) As linhas pontilhadas definem a região focal dentro da qual o número de cópias foi associado ao subtipo e dentro da qual os genes controladores foram procurados. Fundo, −log10 transformado P valores que refletem o aumento da expressão gênica na amplificação. Genes passando pelo P limite de valor (0,05) são rotulados.

Aplicar o mesmo procedimento a outras regiões de ganho de cópia identifica outros oncogenes candidatos. No amplicon em torno de 45 Mbp no cromossomo 17q21 (Fig. 4B), que está associado aos subtipos ER + / PR + e HER2 +, há um único gene que atende a todos os três critérios: MYST2, que codifica uma histona acetiltransferase (HBO1) que tem sido implicada na regulação da síntese de DNA e na sinalização do receptor do hormônio esteróide (31-34). No amplicon em torno de 55 Mbp (17q23), PPM1D é o único gene que atende a todos os três critérios, embora não seja fortemente apoiado por nenhuma linha individual de evidência. Os genes TMEM49 e RPS6KB1 (que codifica a quinase S6 ribossômica p70) também estão localizados sob o pico desta amplificação, e seus níveis de expressão estão fortemente associados com a alteração do número de cópias na região (Fig. 4C). O pico de amplificação em torno de 70 Mbp no cromossomo 11q13, também associado aos subtipos ER + / PR + e HER2 +, não contém genes associados à recorrência (Fig. 4D). O status do gene driver é frequentemente atribuído a CCND1 (que codifica a ciclina D1), que aumentou significativamente a expressão em amostras amplificadas, juntamente com os genes vizinhos ORAOV1, FADD, e PPFIA1. Na região em torno de 35 Mbp no cromossomo 14q13, que está associado ao subtipo ER + / PR +, apenas FOXA1 tem expressão elevada em tumores com número de cópias aumentado (Fig. S2A suplementar).

Para regiões de deleção / perda, a amplitude ou a frequência da alteração não fornece tanta informação quanto nas regiões de ganho de cópia porque há no máximo dois cromossomos a serem perdidos e as deleções geralmente são amplas. A identificação de candidatos, portanto, depende principalmente da associação da expressão gênica com a perda do número de cópias e o resultado clínico (Fig. Suplementar S2B e C). Ambas as linhas de evidência apóiam os candidatos ARHGAP18, HDAC2, e NCOA7 em deleções em torno de 116 Mbp no cromossomo 6q (associado ao subtipo ER + / PR +). A deleção localizada em torno de 80 Mb no cromossomo 5q13-14 (associado aos subtipos HER2 + e triplo-negativo) contém um único gene apoiado por duas linhas de evidência: RASA1, que codifica a proteína ativadora de RAS GTPase p120GAP.

MYST2 Impulsiona o crescimento das células cancerosas da mama

Selecionamos o gene condutor candidato MYST2 (também conhecido como HBO1) para um estudo mais aprofundado porque tem evidências de apoio particularmente fortes em nossa análise. MYST2 é necessário para o crescimento em células 293T (31), mas não é um oncogene estabelecido. Superexpressão de MYST2 (Suplementar Fig. S4) aumentou dramaticamente o crescimento independente de ancoragem de ambas as células MCF7 (Fig. 5A e B) e SKBR3 de câncer de mama (Fig. 5C e D). Estudos anteriores em células MCF7, que têm um ganho modesto de número de cópias nesta região, também mostraram que o knockdown mediado por siRNA de MYST2 prejudica substancialmente a proliferação celular e bloqueia a progressão através da fase S do ciclo celular em comparação com o tratamento de controle com siRNA (31). Juntas, as observações que MYST2 knockdown bloqueia a proliferação e que MYST2 a superexpressão pode mudar as linhas celulares para um estado mais transformado, apoiando a hipótese de que é o oncogene que conduz a amplificação em torno de 45 Mbp no cromossomo 17.

MYST2 a superexpressão aumenta a formação de colônias em ágar mole. UMA. Colônias MCF7. Linha superior, células transfectadas com vetor de expressão MYST2 linha inferior, células transfectadas com vetor de controle. C. Colônias SKBR3. Colunas da esquerda e do centro, células transfectadas com vetor de expressão MYST2, coluna da direita, células transfectadas com vetor de controle. B e D. Boxplots representando o número de colônias em MCF7 e SKBR3, respectivamente.

Associação de perda de PTEN e mutações somáticas com subtipos de câncer de mama

Sequenciamos um painel de genes com mutações causadoras de câncer bem caracterizadas na coleção de linha celular e avaliamos as mutações que encontramos e publicamos dados de mutação para associação com subtipos de câncer de mama (Tabela 2). Observamos as seguintes frequências gerais de mutação: 73% (TP53), 34% (PIK3CA), 11%(RB1), 9% (PTEN), 7% (CDKN2A), 5% (BRAF), 2% (KRAS), e 2% (HRAS) Geralmente, são muito semelhantes aos relatados no banco de dados COSMIC (35). TP53, no entanto, tem uma taxa de mutação mais baixa no COSMIC (54%), portanto, nossa coleção de linha de células pode ter características diferentes das 80 amostras de carcinoma de mama que atualmente possuem dados no COSMIC. Não vimos evidências de que mutações em TP53, PTEN, ou CDKN2A estão associados a subtipos específicos de câncer de mama. PIK3CA as mutações foram enriquecidas nos subtipos ER + / PR + e HER2 +, o que é consistente com relatórios anteriores (17), embora esse enriquecimento não tenha sido estatisticamente significativo.

Mutações de aminoácidos e perda de proteína PTEN em linhas celulares de câncer de mama

Todas as quatro mutações em BRAF, KRAS, e HRAS estavam em amostras triplo-negativas. Isso sugere uma associação entre as mutações no RAS / RAF / proteína quinase ativada por mitogênio / quinase quinase regulada por sinal extracelular / via de quinase regulada por sinal extracelular e o subtipo triplo-negativo (P = 0,05). Uma linha celular adicional triplo-negativa (CAL-51) também foi relatada por abrigar uma mutação oncogênica de ativação em um membro da família RAS (36, 37).

A perda de PTEN foi relatada anteriormente como estando associada ao status negativo de ER e PR (15, 17, 38). Mutação e deleção no PTEN locus são substitutos imperfeitos para a perda da proteína PTEN (15, 27), então avaliamos a associação entre PTEN e subtipos em linhas celulares por Western blot. Observamos perda de PTEN em 59% (10 de 17) das amostras triplo-negativas, mas apenas em 17% (2 de 12) das amostras ER + / PR + e 8% (1 de 13) das amostras HER2 + (P = 0,002). A assinatura de instabilidade cromossômica foi maior nas amostras com perda de PTEN do que naquelas sem, embora essa diferença não tenha sido estatisticamente significativa (P & gt 0,05 dados não mostrados).

Todas as quatro mutações em RB1 foram encontrados em amostras triplo-negativas, e descobrimos que a perda da função da proteína do retinoblastoma (RB) está associada ao subtipo triplo-negativo (P = 0,006). A inativação de RB foi examinada em 51 amostras de tumor de mama usando uma assinatura de expressão de 59 genes refletindo a desregulação de RB (39, 40). Esta assinatura foi significativamente maior no subtipo triplo-negativo do que nos subtipos HER2 + e ER + / PR + (P = 0,002, Fig. 6). Além disso, a assinatura de instabilidade cromossômica foi maior nas amostras com mutação RB1 do que naquelas sem (P = 0,01 dados não mostrados).

A desregulação da via RB está associada ao subtipo triplo-negativo. A pontuação da assinatura RB, refletindo a desregulação da via, é resumida em um gráfico de caixa por subtipo.


Rotas de metástase

Existem três maneiras principais de os tumores se espalharem para órgãos distantes:

  1. Através do sistema circulatório (sangue) (hematogênico)
  2. Através do sistema linfático
  3. Através da parede corporal nas cavidades abdominal e torácica (transcoelômica).

O sistema circulatório é a principal via de disseminação para órgãos distantes, enquanto os vasos linfáticos fornecem uma rota para os linfonodos locais, após o qual as metástases geralmente viajam através do sangue 4 Embora o sistema circulatório pareça ser a rota mais comum, a extensão do linfático versus A disseminação hematogênica parece depender da origem e localização do tumor primário.6 Por exemplo, tumores ósseos e de tecidos moles (sarcomas) se espalham principalmente pelo sangue, enquanto melanoma, mama, pulmão e tumores gastrointestinais se espalham pelo sistema linfático.7 Transcoelômico a disseminação é bastante incomum e parece estar restrita a mesoteliomas e carcinomas ovarianos.8

Para que as células tumorais tenham acesso aos vasos linfáticos ou sanguíneos, os tumores precisam promover o crescimento desses vasos dentro e ao redor do tumor. O crescimento dos vasos sanguíneos é denominado angiogênese e o crescimento dos vasos linfáticos é a linfangiogênese.

O Sistema Linfático
O sistema linfático desempenha um papel importante no controle do movimento dos fluidos por todo o corpo. Especificamente, o sistema linfático controla o fluxo da linfa, um fluido incolor que contém oxigênio, proteínas, açúcar (glicose) e linfócitos (cito = célula). Existem algumas semelhanças e diferenças entre o (mais conhecido) sistema circulatório e o sistema linfático.

Os vasos linfáticos pequenos fundem-se em vasos maiores e esses vasos grandes eventualmente desaguam nos nódulos linfáticos. Os gânglios linfáticos são tecidos em forma de feijão que são encontrados em cachos semelhantes a uvas em vários locais ao redor do corpo. Os gânglios linfáticos são locais de ativação do sistema imunológico e proliferação (crescimento) de células imunológicas. O fluido nesta extensa rede flui por todo o corpo, de maneira muito semelhante ao suprimento de sangue. É o movimento das células cancerosas para o sistema linfático, especificamente os gânglios linfáticos, que é usado na detecção da doença metastática. O estadiamento do câncer é discutido com mais detalhes na seção Diagnóstico e Detecção.

O modelo anatômico
No modelo anatômico da metastose, os tumores secundários ocorrem nos órgãos que encontram primeiro durante a disseminação do tumor primário. This scenario appears to occur in regional metastases, where tumor cells gain access to nearby tissue or lymph nodes through the blood or lymphatic circulation. 9 For example, liver metastasis is a major occurrence in patients with colorectal cancer. In this case, the capillary bed of the liver is the first encountered by the tumor cells after leaving the colon, and the liver seems to provide a suitable environment for the growth of these secondary tumors. 3 However, metastasis to distant organs occurs through a different mechanism (see next section).

The Seed and Soil Hypothesis
Early cancer researchers noticed a propensity for certain cancers to metastasize to the same organ. In 1889 Stephen Paget observed that patients with breast cancer often developed secondary tumors in the liver. He considered it unlikely that this occurrence was due primarily to accessibility of the liver by the blood supply, as other organs receiving equivalent blood supply rarely developed metastases. He instead developed the "Seed and Soil" hypothesis, in which certain tumor cells (the seeds) can only successfully colonize selective organs (the soil) that have suitable growth environments 10

The current view of the Seed and Soil Hypothesis consists of three important concepts.

  1. Primary tumors and their metastases consist of genetically diverse tumor and host cells (for more on the role of the host cells in cancer, see the section on Tumor Microenvironment).
  2. Metastasis selects for cells that can succeed in all phases of the metastatic process. In essence, a successful metastatic cell must be a decathalete: good in all the events, and not just one or two.
  3. Metastases generally develop in a site specific way. Because the microenvironments (the soil) of each organ is different, individual cancer cells may be able to colonize one specific organ.9

At the heart of the Seed and Soil hypothesis is the idea that successful metastasis depends on the interaction of the metastasizing tumor cells with the cells of the target organ (the stroma, or tumor microenvironment). Not only must tumor cells must be able to produzir factors that alter the stromal cells in such a way as to better serve the survival and growth of the tumor, but the environment in which the cancer cell finds itself must be capable of responding to those signals. If the cancer cell finds itself in an inhospitable soil (i.e. it cannot subvert the stroma to serve its needs), successful metastsis will be impossible. 4

Recent studies examining the profile of genes expressed in tumors that metastasis to specific organs have identified specific genetic signatures of these tumors. For example, genes that mediate the metastasis of breast cancer to bone are different than those that mediate metastasis to the lung. In essence, different sets of genes allow tumor cells to specifically interact with the stromal cells of the target organ. These findings may lead to therapeutic strategies to target the metastatic properties of tumors.11


Targeting receptor tyrosine kinases

Members of the EGF receptor family have proved important potential targets for anti-cancer drugs, and several inhibitors have been approved or are in clinical trials. They include the monclonal antibody Herceptin (trastuzumab), which targets the receptor Her, and small-molecule inhibitors. Gary Pestano (Ventana Medical Systems, Tucson, USA) discussed the evaluation of tissue-derived diagnostic phosphorylated biomarkers in the EGF receptor pathway and presented the company's experiences with biomarker validation in the context of colorectal cancer progression. Upward and downward trends of various markers were documented as colorectal tumors underwent local and then distal metastasis. He presented a case study in which biomarker levels measured by the company's proprietary technology revealed a poor prognosis phenotype in a colorectal tumor of a Ventana employee, enabling the patient to elect to have adjuvant combination chemotherapy following radiation and colostomy.

Janet Dancey (National Cancer Institute, NIH, Bethesda, USA) described outcomes in clinical trials of EGF receptor inhibitors. Her receptors, which bind the EGF-like growth factor heregulin, were inhibited using either antibodies that target the extracellular portion of the receptor, or small molecules that target one or more kinase domains, or antisense oligonucleotides intended to suppress expression of a specific Her-family gene. Differences were observed in the toxicity and efficacy of antibodies versus small molecules that can be explained, at least in part, in terms of differences in mechanism of action, off-target activity, and pharmacokinetic behavior na Vivo. Single-agent treatment of EGF receptor inhibitors (antibodies or small-molecule inhibitors) gave modest objective responses in lung, brain, head and neck, ovarian, esophageal, liver, and colon cancers. Studies of antibodies or small-molecule inhibitors in combination with cytotoxic chemotherapy or radiation have demonstrated survival benefits in some cases. Many additional randomized controlled trials are under way, and a clearer view of the utility of numerous single-agent and combination approaches to EGF-receptor-targeted therapy should emerge within the next two to three years.

Many cancer patients have mutations of EGF receptor genes, and Daniel Haber (Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Boston, USA) presented analyses of the impact of EGF receptor mutations on individual sensitivity and resistance to tyrosine-kinase inhibitors. Opening with an anecdotal report of a Boston woman apparently cured of lung cancer with gefitinib, a small-molecule tyrosine-kinase inhibitor that has proved of very limited efficacy in most people, his presentation focused on studies of patients and model systems aimed at understanding why some patients respond to therapy with gefitinib and others do not. Most of the patients (40-80%) responding to small-molecule inhibitors of EGF receptor kinase domains exhibit kinase-activating mutations or gene amplification. In contrast, patients lacking mutations or amplification respond only rarely (10-15%). When compared with signaling by wild-type EGF receptors, signaling by mutant EGF receptors increases phosphorylation of the kinase Akt and the transcription factor Stat5 and downregulates Erk. Exposure of cells bearing mutant receptors to clinically achievable concentrations of small-molecule inhibitors of EGF receptors leads to apoptosis. Significantly higher drug concentrations are required to produce apoptosis in the context of the wild-type receptor. Regrettably, approximately half of the patients responding well to the small-molecule inhibitors do so for only a short time (3-6 months), after which relapse occurs, because the kinase domain has developed a drug-resistance mutation - Thr790Met, which is analogous to the imatinib-resistant Thr315Ile mutation in Bcr-Abl.

Mark Sliwkowski (Genentech, South San Francisco, USA) is examining the EGF receptor family with a view to designing new antibodies that target the receptor Her2, the target Herceptin. High-resolution X-ray crystallographic structures have provided detailed insights into Her2 heterodimerization and Her2-antibody interactions. These structures suggest alternative epitopes for targeting with novel antibodies. The Her2 sheddase (Mmp15, a membrane-linked metalloprotease) is responsible for cleavage of the extracellular component of the receptor, and Sliwkowski also described how resistance to Herceptin may be correlated with Mmp15 cleavage activity, which yields an activated, truncated form of the receptor lacking the epitope recognized by Herceptin. This hypothesis is currently being evaluated. Enzyme-kinetic analyses of Her2 with mutations in the kinase domain have explained the increased sensitivity of tumors bearing these mutant receptors to small-molecule inhibitors compared with tumors bearing a non-mutant receptor. These results suggest that high doses of small-molecule inhibitors will be crucial for treating patients with tumors driven to proliferate by non-mutant Her2.

Flt3 is a receptor tyrosine kinase that is important in leukocyte development and is being targeted as a possible treatment for AML. Donald Small (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, USA) described studies on Flt3 in AML patients. Individuals carrying the internal tandem duplication mutation in FLT3 have considerably poorer responses to conventional induction chemotherapy with cytarabine and daunarubicin (the so-called 7+3 therapy) and correspondingly poor prognoses. Recent advances in preclinical characterization and clinical studies of Flt3 inhibitors were described in detail. The responses of patients with the internal tandem duplication mutation to therapy with a single Flt3 inhibitor are critically dependent on the blood levels of the drug. Current clinical studies on Flt3 inhibitors focus on relapsed AML patients who are receiving either high-dose cytarabine or a combination of mitoxantrone, etoposide and cytarabine. Ultimately, the best prospects for such inhibitors are likely to be in the setting of 7+3 induction chemotherapy for newly diagnosed AML patients with the Flt3 internal tandem duplication mutation.


Conclusions and perspectives

The advent of CRISPR technology has revolutionized the biological sciences and provided cancer biologists with a powerful gene-editing method that can alter the genetic make-up of cells in unprecedented ways. Indeed, promising results have been achieved in diverse disciplines, from basic research to the development of potential therapies against cancer, congenital defects, and other chronic diseases. Many challenges associated with CRISPR technology still exist, mainly in clinical use associated with delivery and safety. 69 Improved strategies will be required to increase the targeting efficiency and to minimize off-target effects. Ensuring that CRISPR/Cas9 has precise genome-editing ability is also important. Following CRISPR/Cas9 mediated DSBs, DNA repair can be achieved by either the “error-prone NHEJ” or “precise repair through HDR” in the genome. In an effort to promote HDR over NHEJ, a study by Maruyama et al. used the NHEJ inhibitor Scr7 and observed that Scr7 treatment did indeed increase the levels of HDR-mediated genome editing over NHEJ. 70 In addition to concerns regarding off-target effects, considerations regarding the immune response to CRISPR-mediated gene-editing must also be considered. The Cas9 protein is bacterial in origin and thus might elicit an immune response, which could in turn affect its gene-editing efficiency. Also, the exogenous sgRNAs may be cleared by immune cells like monocytes and macrophages. 71 The delivery approach for CRISPR/Cas9 thus depends upon the objective as well as the target. Transient expression of the sgRNA and the Cas9 protein through microinjection might be safer than other non-viral or viral delivery methods. Viral delivery has the highest efficiency for the expression of the Cas9 protein and sgRNA, but comes with risks. During one in vivo study, the lentivirus particles elicited a strong immune response in treated animals, which affected the efficacy of the lentiviral vector. 72 Another issue with lentiviral delivery is also the possibility that the lentiviral vector could randomly integrate into the cellular genome. To overcome this issue, integrase-deficient lentiviral vectors, nanoparticle carriers, or an inducible system could be used for delivery of CRISPR/Cas9.

The prohibitively high costs for CAR T-cell therapy have made this treatment unavailable to a large section of society. CAR T-cell therapy offered by Novartis, the first approved by the FDA, costs $475,000 per treatment however, further advances in CRISPR technology might help reduce costs and make CAR T-cell therapy available to more patients. So far, the majority of CRISPR clinical trials are being conducted in China. A recent article in the Wall Street Journal suggested that this may be due to the fact that fewer rules and restrictions exist in China. Indeed, Dr. Shixiu Wu from the Hangzhou Cancer Hospital, who was featured in the article, 73 has been able to use CRISPR technology-based treatments on his cancer patients, without the need for national regulatory approval and has few reporting requirements. Many scientists worry that the technology has the potential to harm patients and that unintended consequences from using CRISPR on patients without sufficient oversight could hinder progress in the whole field. Dr. Wu recognized that he was undertaking risks in using CRISPR-based treatments for his cancer patients, but was considering their limited available survival time. The thought is that being able to live for additional time is better than imminent death. Persistent post-treatment monitoring of patients could help to eliminate or treat any unwanted consequences. Indeed, treatment-related observations could potentially save many lives of those who are on the brink of death.

We need consider the limitation as seriously as the potential benefits of this technology. A new human trial, in which the team took a crash course in bioethics and created CRISPR babies, brought the ethical issues and controversies into the public. One hundred and twenty-two Chinese scientists and many other scientists worldwide have already condemned the trial. How to use this powerful without overstepping the ethical bottom line is a serious question that needs careful consideration. We might expect more positive reports from clinical trials as well as the development of improved approaches that will bring new hope for personalized therapy.


Notas de rodapé

Declaration of Conflicting Interests: The author(s) declared no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article.

Financiamento: The author(s) received the following financial support for the research, authorship, and/or publication of this article: Patrick C. Ma received research support from Daiichi Sankyo Inc. and ArQule Inc. in sponsored clinical trial funding and has received consultant honoraria as an advisory board member.


Assista o vídeo: Biologia - Mutações Gênicas - Origens e Consequências (Janeiro 2022).