Em formação

Produto de sequenciamento rtPCR


Portanto, tenho um conjunto validado de primers para rtPCR da Biorad que contém SYBR green. Se eu fizer o rtPCR, posso usar o produto rtPCR depois de purificá-lo com um kit de purificação de PCR da Qiagen? Além disso, tenho a impressão de que a empresa de sequenciamento precisa de primers para fazer o sequenciamento. Devo usar apenas o primer de PCR ou um dos primers "universais" que a empresa possui?


Você pode usar o kit de purificação PCR para limpar o DNA.

Você pode usar os primers que usou para RTPCR para sequenciamento. Os primers universais funcionariam apenas se a sequência complementar a eles estivesse na extremidade 3 'do seu amplicon.


Produto de sequenciamento de RT-PCR - (14 / mar / 2013)

Portanto, tenho um conjunto validado de primers para rtPCR da Biorad que contém SYBR green. Se eu fizer o rtPCR, posso usar o produto rtPCR depois de purificá-lo com um kit de purificação de PCR da Qiagen? Além disso, tenho a impressão de que a empresa de sequenciamento precisa de primers para fazer o sequenciamento. Devo usar apenas o primer de PCR ou um dos primers "universais" que a empresa possui?

Por rtPCR você quer dizer PCR em tempo real ou de transcrição reversa? No primeiro caso, para evitar confusão, é melhor usar PCR quantitativo (qPCR).

Pelo que eu sei, os primers não contêm sybr green, o agente sybr é muito parecido com o brometo de etídio, pois depende da intercalação entre as fitas de DNA em uma densidade específica por bp e, como tal, o sybr é adicionado como parte do mastermix de PCR. É possível, no entanto, obter primers que são marcados com fluorescência (fl), como os primers de ensaio Taqman.

Na prática, não deve importar se os primers são marcados para uso em sequenciamento, embora eu nunca tenha experimentado isso. Posso imaginar que um primer com tag Fl pode obscurecer o sinal de algumas das chamadas de base iniciais, se usado.

Para sequenciamento, sim, a empresa exige primers, você precisa configurar um tubo que contenha o DNA alvo e apenas UM primer - se você tiver ambos os primers no mesmo tubo, obterá um sinal misto conforme as regiões direta e reversa são sequenciadas simultaneamente (pense em como o DNA é replicado e a orientação das duas fitas).

Os primers universais são apenas para sequenciamento de plasmídeos (e mesmo assim, apenas para alguns plasmídeos) se o seu produto não estiver contido em um plasmídeo, você precisará fornecer o primer correto.

bob1 na sexta-feira, 15 de março, 04:11:59 de 2013, disse:

Por rtPCR você quer dizer PCR em tempo real ou de transcrição reversa? No primeiro caso, para evitar confusão, é melhor usar PCR quantitativo (qPCR).

Pelo que eu sei, os primers não contêm sybr green, o agente sybr é muito parecido com o brometo de etídio, pois depende da intercalação entre as fitas de DNA em uma densidade específica por bp e, como tal, o sybr é adicionado como parte do mastermix de PCR. É possível, no entanto, obter primers que são marcados com fluorescência (fl), como os primers de ensaio Taqman.

Na prática, não deve importar se os primers são marcados para uso em sequenciamento, embora eu nunca tenha experimentado isso. Posso imaginar que um primer com tag Fl pode obscurecer o sinal de algumas das chamadas de base iniciais, se usado.

Para sequenciamento, sim, a empresa exige primers, você precisa configurar um tubo que contenha o DNA alvo e apenas UM primer - se você tiver ambos os primers no mesmo tubo, obterá um sinal misto conforme as regiões direta e reversa são sequenciadas simultaneamente (pense em como o DNA é replicado e a orientação das duas fitas).

Os primers universais são apenas para sequenciamento de plasmídeos (e mesmo assim, apenas para alguns plasmídeos) se o seu produto não estiver contido em um plasmídeo, você precisará fornecer o primer correto.


Obrigado por limpar isso para mim. Sim, eu quis dizer qPCR. E não, os primers não contêm SYBR green, que faz parte do mix master, você está certo. Cometi alguns erros ao descrever o que quero fazer porque esta é a primeira vez que experimento o PCR.

Você deve perguntar à empresa se a matriz SYBR interfere com seus sequenciadores. A maneira mais segura de fazer isso seria purificar o produto jogado na coluna (usei uns da Thermo Fisher - kit de purificação de PCR GenJet) - id faz o que diz


Sequenciamento direto de produtos de PCR

Para obter dados de sequenciamento de alta qualidade, é muito importante que a reação de PCR seja específica e forte. Se o produto de PCR for um esfregaço em um gel de agarose, ou mais de uma banda estiver presente, a probabilidade de obter dados de boa sequência é baixa.

Você deve remover todos os primers de PCR e nucleotídeos não incorporados antes que o produto seja sequenciado. O sequenciamento usa apenas um primer em vez dos dois usados ​​na PCR. Se você não remover os dois primers, obterá duas sequências sobrepostas uma à outra que não são legíveis.

É normal usar um primer de PCR para sequenciamento, desde que corresponda às nossas condições. Por favor, veja Diretrizes de Primer Para maiores informações.

Verifique novamente a concentração de PCR usando um gel analítico de agarose. Concentrar demais seu modelo não fornecerá uma sequência melhor e pode interferir potencialmente nas amostras de pesquisadores vizinhos no instrumento.

A Applied Biosystems possui um manual útil para sequenciamento de PCR, que pode ser baixado como um arquivo PDF. Você precisará do Acrobat Reader para concluir o download.

Outro livreto útil é o Guia Qiagen para purificação de modelos e sequenciamento de DNA.

As recomendações para brochuras técnicas fornecidas acima não representam, de forma alguma, um endosso dos produtos ABI ou Qiagen.


Conjunto de iniciadores universais para amplificação e sequenciamento de locais de clivagem HA0 de todos os vírus influenza A

A análise da sequência do local de clivagem endoproteolítica dentro da proteína precursora de hemaglutinina (HA) HA (0) é fundamental para estudos de biologia molecular de vírus influenza A, em particular, para patotipagem molecular de isolados de subtipo H5 e H7. Um problema atual para o diagnóstico de rotina é o surgimento de novas cepas do subtipo H5 ou H7 ou mesmo de outros subtipos que escapam à detecção pelos protocolos comumente usados ​​de transcrição reversa-PCR (RT-PCR). Aqui, é relatado o primeiro ensaio de RT-PCR pan-HA (PanHA) direcionado ao local de clivagem HA (0) dos vírus influenza A de todos os 16 subtipos HA. O ensaio foi avaliado em comparação com RT-PCRs específicos dos subtipos H5 e H7 para o sítio de clivagem HA (0) e um RT-PCR em tempo real detectando o gene M. Um painel de 92 vírus influenza A foi usado para validação. Dados de sequência para vírus influenza A de 32 amostras de fluido alantóico e 11 amostras de esfregaço de diagnóstico de todos os 16 subtipos de HA foram gerados por sequenciamento direto dos produtos PanHA RT-PCR. Os resultados demonstram que o novo ensaio PanHA RT-PCR - seguido de sequenciamento de ciclo - pode complementar os métodos existentes e fortalecer a confiabilidade dos diagnósticos do vírus influenza A, permitindo a patotipagem molecular (H5 e H7) e a subtipagem (não-H5 ou - H7) dentro de uma abordagem única.


RESULTADOS E DISCUSSÃO

Por estratégia computacional RNomics, os alunos identificaram cerca de 80 snoRNAs com características estruturais típicas da família box C / D snoRNA de N. crassa, C. glabrata, D. hansenii, K. lactis, e Y. lipolytica. A análise computacional mostrou que esses snoRNAs existem na forma de um único ou agrupamento de genes e mostram diversas organizações genômicas em diferentes fungos. A maioria dos snoRNAs de C. glabrata e K. lactis snoRNA são transcritos independentemente, enquanto snoRNAs de N. crassa, D. hansenii, e Y. lipolytica foram aninhados nos íntrons dos genes do hospedeiro.

No laboratório, os alunos atuaram individualmente. Cada aluno selecionou um snoRNA ou um cluster snoRNA para completar seu experimento. No início, os alunos isolaram o RNA total desses fungos. Usando o método mencionado acima, todos os alunos obtiveram 250–300 μg de RNA total de 10 ml de cultura de células fúngicas. As proporções de A260 / A280 das preparações de RNA foram de 1,85-1,98, ilustrando o RNA de boa qualidade em relação à pureza. Além disso, a eletroforese em gel desnaturante de agarose formaldeído mostrou três bandas distintas e a banda do rRNA 25S foi significativamente mais intensa do que a banda do rRNA 18S, indicando que os RNAs extraídos dos fungos estavam totalmente intactos e não ocorreu degradação do RNA. Os resultados de dois géis de estudante são mostrados na Fig. 1.

Análise de eletroforese de RNA total de fungos. Pista 1, RNA total de N. crassa. Pista 2, RNA total de D. hansenii. Os rRNAs de 25S, 16S e 5.8S são altamente visíveis no gel.

Em seguida, os alunos realizaram RT-PCR para analisar a expressão de snoRNA. A maioria dos alunos obteve produtos RT-PCR. Para os alunos que não conseguiram obter os produtos RT-PCR, os instrutores tiveram alunos que tiveram sucesso em compartilhar seus produtos para que todos pudessem continuar a progredir no projeto. A Figura 2 mostra os resultados de um aluno. O aluno analisou um cluster de gene snoRNA localizado em uma cepa antisense de um gene de proteína putativo em N. crassa genoma por RT-PCR. Uma vez que o gene contém dois íntrons (Fig. 2uma) de acordo com o software de análise, os produtos RT-PCR devem conter três bandas. Como esperado, os produtos RT-PCR de N. crassa RNA total, com par de iniciadores P1 / P2, eram compostos por três bandas, a maior (511 bp) das quais correspondia às sequências do produto de PCR de N. crassa DNA genômico, o menor produto de RT-PCR (120 bp) correspondeu a um transcrito emendado que carece de duas sequências intrônicas, e o do meio era o intermediário de emenda, no qual um íntron foi removido (Fig. 2b) A clonagem e o sequenciamento dos três produtos de RT-PCR verificaram a ocorrência de transcritos de splicing maduros e intermediários de splicing dos quais os íntrons foram removidos na posição exata prevista (Fig. 3). Os resultados acima mostraram que a análise computacional dos sítios de splicing está correta e o RNA preparado pelo aluno está totalmente intacto com o qual todos os produtos expressos, incluindo precursores, intermediários de splicing e transcrito spliced ​​maduro de um gene, podem ser obtidos.

Sequência de flanqueamento de cluster de gene snoRNA e análises de RT-PCR. (uma) sequência de flanqueamento snR55 e snR61 de N. crassa. As regiões de codificação para snoRNAs estão sombreadas, os exons do RNA não codificador estão em letras maiúsculas, o íntron está em letras minúsculas, os locais de splice e as sequências doador / aceitador (em caixa) são indicadas. Setas marcam os locais dos primers usados ​​para análise de RT-PCR. (b) Análise RT-PCR. Pista 1, RT-PCR, após a transcrição reversa de N. crassa RNA total com o iniciador P1, a PCR foi realizada com o par de iniciadores P1 / P2. O pequeno produto de RT-PCR (120 bp) corresponde ao transcrito emendado, o precursor não emendado do transcrito (511 bp), também é detectável. Pista 2, controle de DNA, PCR de N. crassa DNA genômico com produto de PCR previsto do par de iniciadores P1 / P2 é 511 pb. Pista 3, controle de PCR, PCR de N. crassa RNA total com par de primer P1 / P2.

A sequência do produto RT-PCR corresponde ao transcrito emendado do agrupamento de genes snoRNA. A posição do intron removido é indicada pela ponta da seta. (uma) Detecção de remoção do primeiro íntron de um intermediário de emenda. (b) Detecção de remoção dos segundos íntrons de um intermediário de emenda.

Em resumo, este procedimento de laboratório representa um método eficaz e consistente para preparar alunos avançados para participarem de pesquisas. Este procedimento apresenta aos alunos o conceito de RNomics, RNA não codificador e splicing de RNA, à aplicação de bancos de dados biológicos e ferramentas de bioinformática, e à prática de técnicas moleculares básicas. Acreditamos que o procedimento deve ser aplicável para estudar outro RNA não codificador sem muitas modificações.


Sequenciamento direto de produtos de RT-PCR do vírus da hepatite A e norovírus de ostras contaminadas com o meio ambiente usando primers de cauda M13

O norovírus humano (HuNoV) e a hepatite A (HAV) são reconhecidos como as principais causas de doenças não bacterianas associadas a alimentos nos Estados Unidos. O sequenciamento de DNA é geralmente considerado o padrão para genotipagem viral precisa como suporte para investigações epidemiológicas. Devido à diversidade genética de norovírus (NoV), conjuntos de primers degenerados são frequentemente usados ​​em PCR convencional de transcrição reversa (RT) e PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) para a detecção desses vírus e fragmentos de cDNA são geralmente clonados antes do sequenciamento. Os métodos de detecção de HAV que são sensíveis e específicos para RT-qPCR em tempo real geram fragmentos de tamanhos pequenos de 89-150 bp, que podem ser difíceis de sequenciar. A fim de superar esses obstáculos, os primers de norovírus e HAV foram combinados com os primers M13 forward e reverse. Esta modificação aumenta o tamanho do produto sequenciado e permite o sequenciamento direto dos amplicons utilizando iniciadores M13 complementares. Os produtos de cDNA HuNoV e HAV de ostras contaminadas ambientalmente foram analisados ​​usando este método. Os alinhamentos das amostras sequenciadas revelaram ≥95% de identidades de nucleotídeos. Os primers de cauda NoV e HAV com a sequência M13 aumentam o tamanho do produto de cDNA, oferece uma alternativa à clonagem e permite o sequenciamento rápido, preciso e direto de produtos de cDNA produzidos por ensaios convencionais ou em tempo real RT-qPCR.


Produtos NEBNext e reg ARTIC para sequenciamento de SARS-CoV-2

Especialmente com o surgimento contínuo de variantes do SARS-CoV-2 que afetam a transmissão do vírus e outras métricas significativas para a saúde pública, há uma necessidade crescente de métodos confiáveis, precisos e rápidos para o sequenciamento do SARS-CoV-2. Os kits NEBNext ARTIC são baseados no trabalho original da Rede ARTIC, que rapidamente adaptou seus protocolos ao SARS-CoV-2 (Josh Quick 2020. protocolo de sequenciamento nCoV-2019 v2 (GunIt)).

O método ARTIC é uma abordagem de sequenciamento de genoma viral completo baseado em amplicon multiplexado (Figura 1), e as opções do kit NEBNext ARTIC são compatíveis com as plataformas de sequenciamento Illumina e Oxford Nanopore Technologies. Os dois kits compatíveis com o sequenciamento Illumina geram inserções de biblioteca de

400 bp, para sequenciamento 2 x 75 ou 2 x 250, respectivamente (Figura 2). O Módulo NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 RT-PCR contém apenas os reagentes necessários para a síntese de cDNA e amplificação de cDNA direcionada do RNA genômico SARS-CoV-2.

Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho do NEBNext ARTIC

Para fluxos de trabalho mais detalhados, use os links abaixo:

Figura 2: Opções do kit NEBNext ARTIC



Os kits NEBNext ARTIC incluem pools de primer V3 ARTIC, que foram balanceados usando metodologia desenvolvida no NEB com base em dados empíricos de sequenciamento. Esses primers balanceados fornecem maior uniformidade de cobertura do genoma (Figura 3) de 10 a 10.000 cópias do genoma do SARS-CoV-2. Os reagentes para RT-PCR e preparação da biblioteca são otimizados para o fluxo de trabalho SARS-CoV-2 ARTIC.

Figura 3: Menos leituras são necessárias para cobrir completamente o genoma com o NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies)

Visualização integrativa do Genome Viewer da cobertura de leitura em todo o genoma SARS-CoV-2. Os amplicons foram gerados a partir de 1.000 cópias de entradas de gRNA viral SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 e VR-1991) em 100 ng de RNA de referência humana universal (ThermoFisher QS0639) usando o painel V3 IDT ARTIC nCoV-2019 (& ldquoStandard & rdquo) ou o Conjuntos de primers ARTIC SARS-CoV-2 balanceados NEBNext. As bibliotecas foram construídas usando o NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies) e os kits Oxford Nanopore Technologies Native Barcoding Expansion 1-12 (EXP-NBD104) e 13-24 (EXP-NBD114), Ligation Sequencing Kit ( SQK-LSK109) e Kit de expansão SFB (EXP-SFB001). O sequenciamento foi feito em um instrumento GridION usando células de fluxo R9.4.1. O minimap2 foi usado com 24.500 leituras ou dados 250x para o mapeamento contra SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1.

Figura 4: Cobertura do genoma em uma ampla gama de quantidades de entrada, com o NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina)

Os amplicons foram gerados a partir de 1.000 cópias de entradas de gRNA viral SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 e VR-1991) em 100 ng de RNA de referência humana universal (ThermoFisher QS0639) usando pools de primer ARTIC SARS-CoV-2 balanceados NEBNext, com ou sem os pares do NEBNext ARTIC Human Control Primer. As bibliotecas foram construídas usando o kit NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep (Illumina) e sequenciadas em um instrumento MiSeq (2x75 bp). A fração do genoma coberto em cada profundidade foi determinada para uma gama de entradas e leituras amostradas para 10.000, 100.000, 500.000 e 1.000.000.

As condições de reação RT são as mesmas para todas as quantidades de entrada e, para aplicações Illumina, uma nova formulação de DNA polimerase para o enriquecimento de bibliotecas de sequenciamento de próxima geração elimina a necessidade de normalizar as concentrações do amplicon antes da preparação da biblioteca.

  • Uniformidade aprimorada de profundidade de cobertura do genoma SARS-CoV-2
  • Protocolos simplificados e de alta eficiência
  • Eficaz com uma ampla gama de entradas do genoma viral (10 a 10.000 cópias)
  • Disponível para plataformas de sequenciamento Illumina e Oxford Nanopore Technologies
  • Condições RT únicas para todos os valores de entrada
  • Sem necessidade de normalização do amplicon antes da preparação da biblioteca (kits compatíveis com Illumina)
  • Uso opcional de primers humanos de controle fornecidos
  • Inclui NEBNext Sample Purification Beads (SPRIselect & reg)
  • Adaptadores de biblioteca e primers disponíveis separadamente

Leia o que os líderes do sequenciamento ARTIC SARS-CoV-2 estão dizendo

O NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies) fornecerá aos pesquisadores a maneira mais conveniente de realizar o sequenciamento nanopore de SARS-CoV-2. Ao desenvolver o protocolo ARTIC, nos concentramos na recuperação de genomas quase completos de amostras clínicas desafiadoras com & ltCt33. Adotamos uma abordagem de amplicon lado a lado de 400 bp porque fornece um desempenho robusto em uma ampla gama de entradas, incluindo Ct alto e amostras de RNA degradadas que são frequentemente encontradas. O fluxo de trabalho de código de barras nativo fornece amplicons de comprimento total compatíveis com as melhores práticas de demultiplexação e construção de consenso baseado em referência, enquanto a preparação de biblioteca sem PCR minimiza o risco de contaminação do amplicon. Trabalhamos em colaboração com o NEB na otimização do protocolo para minimizar os volumes de reagentes, melhorando o desempenho e agora também se beneficia de pools de primers otimizados que melhoram muito a integridade do genoma e reduzem os requisitos de cobertura de leitura. A compatibilidade com o kit de expansão de código de barras nativo de 96 códigos de barras permite a flexibilidade de executar entre 24 e 96 amostras, dependendo de seus requisitos.

- Joshua Quick, Ph.D., da University of Birmingham e da ARTIC Network

Ficamos impressionados com o excelente desempenho do kit NEBNext ARTIC FS em nosso sequenciamento de amostras humanas contendo RNA SARS-CoV-2. Com este kit, temos processado com sucesso amostras de qualidade e quantidade variadas e ficamos maravilhados com sua sensibilidade e notável uniformidade de cobertura do genoma viral. O tempo de resposta rápido do fluxo de trabalho robusto foi realmente benéfico para nós.

- Vladimir Benes, Chefe do Centro de Genômica do Laboratório Europeu de Biologia Molecular

O NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit garante a determinação rápida, precisa e confiável do genoma completo do SARS-CoV-2. Devido à sua facilidade de uso, o NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit permite uma rápida integração no fluxo de trabalho de rotina do NGS. Além disso, o kit ainda funciona robusto com amostras clínicas difíceis (ct & gt30). Eu recomendaria o NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit 100%.


Os modelos de DNA de fita dupla desnaturam a uma temperatura que é determinada em parte por seu conteúdo de G + C. Quanto maior for a proporção de G + C, maior será a temperatura necessária para separar as fitas do DNA molde. Quanto mais longas forem as moléculas de DNA, maior será o tempo necessário na temperatura de desnaturação escolhida para separar as duas fitas completamente. Se a temperatura para a desnaturação for muito baixa ou se o tempo for muito curto nas regiões ricas em AT do molde, o DNA será desnaturado. Quando a temperatura é reduzida posteriormente no ciclo de PCR, o DNA molde reanneal em condição totalmente nativa. Nos PCRs catalisados ​​pela Taq polimerase, a desnaturação é realizada a 94-95 o C, que é a temperatura mais alta que a enzima pode suportar por 30 ou mais ciclos sem sofrer danos excessivos. No primeiro ciclo de PCR, a desnaturação às vezes é realizada por 5 minutos para aumentar a probabilidade de que moléculas longas de DNA modelo sejam totalmente desnaturadas. No entanto, este período prolongado de temperatura de desnaturação é desnecessário para moléculas de DNA linear, pois às vezes pode ser deletério. A desnaturação por 45 segundos a 94-95oC é rotineiramente usada para amplificar moléculas de DNA linear cujo conteúdo de GC é & lt55% e temperatura mais alta para DNAs modelo e / ou alvo cujo conteúdo de GC é & gt55%. São preferidas muito mais polimerases tolerantes ao calor em tais casos.

A temperatura usada para a etapa de recozimento é crítica. Se a temperatura de anelamento for muito alta, os oligonucleotídeos iniciadores anelam fracamente, se é que o anelam, ao molde e o rendimento de DNA amplificado é muito baixo. Se a temperatura de anelamento for muito baixa, o anelamento não específico de primers pode ocorrer, resultando na amplificação de segmentos indesejados de DNA. O recozimento é normalmente realizado 3-5o C abaixo da temperatura de fusão calculada na qual os iniciadores oligonucleotídicos se dissociam de seus moldes. Existem muitas fórmulas para determinar a Tm teórica, mas nenhuma delas é precisa para iniciadores de oligonucleotídeos para todos os comprimentos e sequências. É melhor otimizar as condições de emparelhamento realizando uma série de PCRs de ensaio em temperaturas que variam de 2 ° C a 10 ° C abaixo da temperatura de fusão mais baixa calculada para os dois iniciadores de oligonucleotídeo. Alternativamente, o termociclador pode ser programado para usar temperaturas de recozimento progressivamente mais baixas em pares consecutivos de ciclos (PCR "touchdown". Em vez de pesquisar uma variedade de condições de recozimento em PCRs separados, a otimização é alcançada expondo um único PCR a uma série sequencial de temperaturas de recozimento em ciclos sucessivos da reação.

Extensão de iniciadores de oligonucleotídeo é realizada em ou próximo à temperatura ideal para a síntese de DNA catalisada pela polimerase termoestável, que no caso da Taq polimerase é de 72-78 o C. Nos primeiros dois ciclos, a extensão de um iniciador prossegue além da sequência complementar à ligação local da outra cartilha. No ciclo seguinte, são produzidas as primeiras moléculas cujo comprimento é igual ao segmento de DNA delimitado pelos sítios de ligação dos primers. Do terceiro ciclo em diante, esse segmento de DNA é amplificado geometricamente, enquanto produtos de amplificação mais longos se acumulam aritmeticamente. A taxa de polimerização da Taq polimerase é

2.000 nucleotídeos / minuto na temperatura ideal (72-78 o C) e, como regra geral, a extensão é realizada por 1 minuto para cada 1000 bp de produto. Para o último ciclo de PCR, muitos pesquisadores usam um tempo de extensão 3 vezes maior do que os ciclos anteriores, aparentemente para permitir a conclusão de todos os produtos amplificados.


Introdução

Visão geral das estratégias de sequenciamento de alto rendimento

A estratégia baseada em espingarda - a técnica de preferência para sequenciar grandes genomas de DNA - tem sido usada para a caracterização completa do genoma de uma variedade de eucariotos e procariotos 1,2,3,4,5,6. O DNA genômico é dividido em fragmentos de 2–50 kbp, as extremidades 2, 3 ′ e 5 ′ são reparadas e clonadas em um vetor bacteriano para produzir uma biblioteca. As regiões terminais de 700 pb destes clones são sequenciadas com primers de vetor independentes de inserção 7, e a sequência completa é reconstruída a partir de fragmentos sobrepostos. Projetos de sequenciamento em grande escala estimularam melhorias técnicas recentes para reduzir o custo e o tempo necessários para obter a resolução de sequência única. Esses avanços consistem principalmente em alternativas à criação de bibliotecas bacterianas e ao sequenciamento da bioquímica Sanger 8. Assim, os procedimentos de sequenciamento integrado que incluem a produção de biblioteca, amplificação de DNA, sequenciamento e montagem de contig foram recentemente desenvolvidos 9,10. Essas tecnologias ainda dependem de cisalhamento aleatório de DNA, mas permitem a separação de moléculas de molde individuais em grânulos e sua amplificação independente em um sistema livre de células por PCR de emulsão 11. O sequenciamento é subsequentemente realizado em cada conta, usando pirosequenciamento 12 ou sequenciamento por ligação 10 em vez do método tradicional de Sanger.

No entanto, o uso de tais pipelines de sequenciamento integrado parece inadequado quando aplicado à genômica de vírus de RNA. Primeiro, os vírus são pequenos parasitas intracelulares para os quais grandes quantidades do material genético direcionado devem ser separadas dos ácidos nucleicos do hospedeiro para construir a biblioteca. Isso requer etapas preliminares de cultura de tecidos e ultracentrifugação antes do cisalhamento e clonagem 13. Além disso, os rendimentos necessários de ácidos nucleicos são difíceis de obter quando se trabalha com vírus de RNA e / ou vírus de baixa replicação. Tal estratégia é demorada, difícil no caso de amostras clínicas e perigosa com patógenos humanos. Em segundo lugar, os genomas de RNA viral são geralmente pequenos e / ou segmentados (moléculas de 1–10 kbp). Terceiro, os genomas de vírus de RNA frequentemente consistem em motivos curtos conservados intercalados com regiões longas exibindo altos níveis de heterogeneidade genética. Portanto, uma estratégia de sequenciamento comum consiste em amplificar e sequenciar produtos de PCR longos obtidos usando primers direcionados às regiões mais conservadas. Por essas razões, a genômica de RNA viral padrão tem se baseado em amplificações RT-PCR de 1–5 kbp seguidas por primer-walking, que envolve de novo síntese de primers específicos para estender o sequenciamento a regiões indeterminadas. A caracterização de uma sequência de 4 kbp por este método requer pelo menos seis rodadas de sequenciamento. O design e a síntese de novos primers tornam essa estratégia cara e demorada.

Os procedimentos alternativos podem ser divididos em três grupos. O primeiro consiste em substituir a bioquímica de sequenciamento Sanger por tecnologias mais baratas e rápidas, como o pirosequenciamento ou sequenciamento por ligação-hibridização. No entanto, seu comprimento de leitura curto, limitado a 100 bp, é mal adaptado ao sequenciamento de alto rendimento de genomas curtos. A segunda alternativa evita de novo síntese de iniciadores utilizando uma biblioteca de oligonucleotídeos pré-fabricada. Os iniciadores podem ser: (i) oligonucleotídeos 5-10mer sintetizados aleatoriamente que são usados ​​sozinhos 14,15,16 ou em uma combinação modular 17,18,19,20,21,22 ou (ii) oligonucleotídeos resultantes da síntese de alto rendimento 23,24. Até à data, o tamanho das bibliotecas de oligonucleótidos necessárias limita a utilização destes métodos. O método indexer walking 25 foi recentemente proposto: o DNA é submetido a ciclos de digestão seguidos de ligação terminal de adaptadores de oligonucleotídeo ('índice'). Uma extremidade do DNA clonado é sequenciada com o iniciador universal M13 e esta primeira sequência é analisada para encontrar locais de restrição de endonuclease específicos próximos à sua extremidade 3 '. O DNA é digerido com a enzima selecionada antes da ligação de um indexador de fita dupla específico, amplificado por PCR e submetido ao sequenciamento Sanger inicializado com o indexador. Essas etapas são repetidas e permitem o progresso unidirecional na sequência desconhecida. Como a biblioteca do indexador é consideravelmente menor do que as propostas anteriormente, o indexer walking pode ser um método atraente em termos de custo, pois evita a síntese sistemática de primer. No entanto, o procedimento continua demorado pelas seguintes razões: (i) a escolha do indexador é uma função da sequência de nucleotídeos determinada no ciclo anterior e (ii) tratamento experimental para um único ciclo de digestão - a ligação envolve amplificação de DNA e Purificação de DNA por purificação de gel, precipitação com etanol e grânulos revestidos com estreptavidina.

Visão geral da técnica LoPPS

A terceira alternativa usa a estratégia shotgun para criar, a partir de um produto de PCR, uma biblioteca de fragmentos de DNA curta o suficiente para permitir o sequenciamento completo em uma etapa. Uma grande vantagem da estratégia de espingarda é o potencial de automação de todo o processo. A automação do crescimento bacteriano, a purificação e o sequenciamento do DNA de plasmídeo permitem o sequenciamento rápido de numerosos genomas de DNA grandes para padrões de alta qualidade com perfis de custo atraentes. Desenvolvemos o procedimento de sequenciamento de produto de PCR longo (LoPPS) (ver Fig. 1) com base nesta estratégia shotgun. Produtos de PCR de pares de três a cinco quilobas, gerados por qualquer método padrão de PCR ou RT-PCR, são cortados aleatoriamente por ultrassom em fragmentos de DNA de ∼ 700 pb. Os terminais salientes são reparados para criar extremidades cegas e 3 ′ A-overhangs adicionados para permitir a clonagem de TA e para evitar a concatenação de fragmentos. O número de clones necessários para a reconstrução do contig é previsto a partir do comprimento do produto de PCR inicial (ver Tabela 1 e ref. 36). Os clones são selecionados aleatoriamente e sequenciados com o primer do vetor T7 PROM. Finalmente, a sequência alvo é reconstruída a partir de fragmentos sobrepostos.


Informações de Apoio

S1 Fig. Pré-processamento de dados SCAN-seq e controle de qualidade.

(A) Esquema de pré-tratamentos de dados SCAN-seq (para detalhes, consulte Métodos). (B) A distribuição de comprimento de produtos de cDNA antes da construção da biblioteca. (C, D) Distribuição de comprimento de leituras de comprimento total. Os dados numéricos são listados em S2 Data. SCAN-seq, amplificação de célula única e sequenciamento de RNAs completos pela plataforma Nanopore.

S2 Fig. Qualidade de dados de mESCs usando SCAN-seq.

(A) Curva de saturação de genes detectados e isoformas em mESC. (B) Mapa de calor do valor de correlação (Pearson) entre cada par de mESCs. O valor de correlação de mESCs por SCAN-seq foi ainda melhor do que pelo método SUPeR-seq e Tang 2009. (C) Cobertura de leituras ao longo de todas as transcrições. (A – C) Os dados numéricos são listados em S2 Data. mESC, célula-tronco embrionária de camundongo SCAN-seq, amplificação de célula única e sequenciamento de RNAs de comprimento total pela plataforma Nanopore SUPeR-seq, sequenciamento de RNA independente de poli (A) universal de célula única.

S3 Fig. Curva de saturação de genes detectados e isoformas em células em diferentes estágios de desenvolvimento.

Os dados numéricos são listados em S2 Data.

S4 Fig. Análise de expressão gênica em amostras embrionárias de camundongo.

(A) Número de genes detectados em cada célula individual em cada estágio / tipo de desenvolvimento. Os dados numéricos são listados em S2 Data. (B) Correspondência de genes específicos do estágio detectados usando SCAN-seq e SUPeR-seq. (C) Análise de GO do grupo de 6 genes na Fig. 3D. GO, ontologia genética SCAN-seq, amplificação de célula única e sequenciamento de RNAs de comprimento total pela plataforma Nanopore SUPeR-seq, sequenciamento de RNA independente de poli (A) universal de célula única.

S5 Fig. LncRNAs detectados em embriões de pré-implantação de camundongos.

(A) A proporção de leituras de mESCs e todos os blastômeros em diferentes estágios de desenvolvimento. O centro representa a média e as barras de erro representam o SEM. (B) Mapa de calor mostrando os níveis de expressão de LncRNAs em todas as células. (A, B) Os dados numéricos são listados em S2 Data. lncRNA, mESC de RNA não codificador longo, SEM de célula-tronco embrionária de camundongo, erro padrão da média.


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