Em formação

Alguém com uma mutação dupla nos alossomos será normal?


Normalmente, uma mulher tem um alossomo X de seu pai e um alossomo X de sua mãe. O que aconteceria se uma mutação dupla acontecesse, fazendo com que alguém tivesse dois alossomos X de sua mãe e nenhum alossomo de seu pai? Essa pessoa será uma mulher normal?

Observe que é possível que não haja alossomos do pai ou da mãe (conhecido como síndrome de Turners, (45, X)) e que haja dois alossomos X da mãe (conhecido como (47, XXX) e (47, XXY) respectivamente).

Como a síndrome de Turner ocorre em 1 em 5.000 nascimentos e a síndrome do Triplo X ocorre em 1 em 1.000 nascimentos, estimo que isso ocorreria uma vez em 5 milhões de nascimentos.


Estante

Estante de livros do NCBI. Um serviço da National Library of Medicine, National Institutes of Health.

Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, et al. Uma introdução à análise genética. 7ª edição. Nova York: W. H. Freeman 2000.

  • Por acordo com a editora, este livro pode ser acessado pelo recurso de pesquisa, mas não pode ser navegado.


Terapia de reposição hormonal e a mutação do fator V Leiden

Do Veterans ’Affairs Boston Healthcare System e Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School Boston, Massachusetts.

Em 1993, foram identificados indivíduos com predisposição hereditária ao tromboembolismo venoso cujos plasmas exibiram uma resposta pobre à proteína C ativada (APC) em um ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada. 1 A base molecular para esse fenótipo laboratorial de resistência a APC foi uma mutação de guanina para adenina no nucleotídeo 1691 no gene do fator V. 2 Isso resulta na substituição da arginina (R) na posição 506 pela glutamina na proteína resultante, um defeito que foi denominado fator V de Leiden. R506 é o primeiro dos três locais nos quais APC normalmente cliva e inativa o fator pró-coagulante Va. A substituição Q506 faz com que o fator Va seja inativado aproximadamente 10 vezes mais lentamente do que o normal, tornando o cofator relativamente resistente à ação anticoagulante de APC. 3 Isso permite maior disponibilidade do fator Va dentro do complexo da protrombinase, aumentando assim a geração de trombina e o desenvolvimento de um estado hipercoagulável.

O fator V de Leiden é o fator de risco hereditário mais comum para tromboembolismo venoso, aumentando o risco de trombose venosa em 4 a 10 vezes em heterozigotos e 50 a 100 vezes em homozigotos. 4,5 A heterozigosidade pode ser identificada em 12% a 20% dos pacientes brancos não selecionados que apresentam trombose venosa e em 40% a 50% dos pacientes com uma forte história familiar positiva. Aproximadamente 3% a 7% dos pacientes brancos normais são portadores heterozigotos do fator V de Leiden, mas a mutação é rara nas populações nativas africanas e asiáticas.

Logo após a identificação do fator V Leiden, foi reconhecido que a presença da mutação aumenta muito o risco de trombose venosa associada ao uso de anticoncepcional oral (revisado por Vandenbroucke e cols. 6). Entre as mulheres que tomam anticoncepcionais orais, o risco aumenta 35 vezes entre os portadores heterozigotos da mutação, em comparação com um aumento de 4 vezes entre os não portadores. Isso indica que a combinação desses dois fatores de risco tem um efeito supra-aditivo, em vez de meramente aditivo, no risco trombótico geral. O risco de trombose venosa é maior no primeiro ano de uso de anticoncepcional oral. Progestágenos de terceira geração, como desogestrel e gestodeno, em anticoncepcionais orais de baixo estrogênio estão associados a maior trombogenicidade. 6,7

O mecanismo pelo qual os anticoncepcionais orais são pró-trombóticos é complexo. Os efeitos protrombóticos incluem aumentos modestos nos níveis de fatores pró-coagulantes (fator VII, fator VIII, fator X, protrombina, fibrinogênio) e diminuições nos níveis de proteínas anticoagulantes (antitrombina, proteína S). Com um ensaio de geração de trombina, foi demonstrado que mulheres que tomam anticoncepcionais orais desenvolvem resistência adquirida a APC. Embora a base molecular para esse fenômeno seja desconhecida, ele fornece uma explicação plausível para o risco trombótico muito aumentado entre usuárias de anticoncepcionais orais que são portadoras da mutação do fator V Leiden (revisado por Vandenbroucke e cols. 6 e Rosendaal e cols. 8).

A trombogenicidade dos contraceptivos orais foi reconhecida logo após sua introdução na década de 1960, 6 mas evidências convincentes de que a dose mais baixa de estrogênio usada para terapia de reposição hormonal está associada a um risco aumentado de tromboembolismo venoso só foram relatadas de forma conclusiva em 1996. 8 Os estrogênios comumente prescritos para reposição hormonal são quimicamente diferentes dos anticoncepcionais orais, mas são considerados como tendo potência biológica substancialmente mais baixa. O risco trombótico venoso associado à terapia de reposição hormonal é aumentado em 2 a 4 vezes, um efeito que é semelhante em magnitude aos anticoncepcionais orais. No entanto, o uso de terapia de reposição hormonal leva a um número consideravelmente maior de casos excessivos como resultado de um aumento geral relacionado à idade na incidência de trombose.

Com base nas interações entre os anticoncepcionais orais e o fator V Leiden, foi antecipado que os portadores da mutação recebendo terapia de reposição hormonal teriam um risco significativamente aumentado de tromboembolismo venoso. Nesta edição de Arteriosclerose, trombose e biologia vascular, Herrington e cols. 9 relatam um estudo de caso-controle aninhado de mulheres inscritas no Heart and Estrogen Replacement Study (HERS) e no Estrogen Replacement and Atherosclerosis Trial. Ambos foram ensaios clínicos randomizados de terapia de reposição hormonal versus placebo em mulheres com evidência clínica de doença arterial coronariana. A mutação do fator V Leiden foi encontrada em 17% dos casos de tromboembolismo venoso e 6% dos controles, resultando em uma razão de chances de 3,3. A terapia de reposição hormonal apresentou uma razão de chances de 4,5, mas os usuários com fator V de Leiden tiveram uma razão de chances de 14,1 em comparação com os não portadores que receberam placebo. Com base nos dados de incidência dos ensaios, os autores estimam que o risco de trombose venosa em portadores heterozigotos e não portadores do fator V de Leiden seja de 15,2 e 5,8 por 1000 pacientes-ano em mulheres em reposição hormonal, respectivamente, em comparação com 2,0 por 1000 pacientes -anos em não portadores que tomam placebo. Eles estimam que o número de mulheres com doença coronariana necessárias para a triagem para prevenir um episódio de tromboembolismo venoso é de 374.

Os resultados de Herrington e cols. 9 são muito semelhantes aos de um estudo publicado recentemente no Reino Unido. 10 Este estudo caso-controle de mulheres de 45 a 64 anos com um primeiro episódio de tromboembolismo venoso encontrou um risco 15 vezes maior de tromboembolismo venoso em mulheres em reposição hormonal com a mutação do fator V Leiden. De forma análoga aos dados em mulheres com a mutação do fator V Leiden em anticoncepcionais orais, essa razão de chances foi maior do que a razão de chances esperada para a combinação dos dois fatores de risco, e o risco foi maior no primeiro ano de uso.

O estrogênio na terapia de reposição hormonal tem efeitos no sistema hemostático semelhantes aos dos anticoncepcionais orais. A terapia de reposição hormonal leva a um aumento dependente da dose nos marcadores de ativação da protrombina e geração de fibrina, enquanto aumenta a fibrinólise e diminui os níveis plasmáticos do inibidor I do ativador do plasminogênio. 11-13

É claro que a terapia de reposição hormonal raramente deve ser prescrita para mulheres que já tiveram um evento trombótico venoso anterior. 14 Para mulheres com doença coronariana e mutação do fator V Leiden sem história pessoal de trombose venosa, Herrington e colegas 9 apontam que o risco de tromboembolismo venoso excederá em muito qualquer benefício potencial da reposição hormonal. 9 Isso é especialmente verdadeiro dado que a terapia de reposição hormonal não demonstrou retardar a progressão das lesões ateroscleróticas e pode estar associada a um aumento nos eventos coronários em vários estudos de prevenção secundária, incluindo HERS. 15,16 A administração de anticoncepcionais orais ou terapia de reposição hormonal a mulheres com mutações pró-trombóticas e um fator de risco cardíaco estabelecido pode estar associada a um risco aumentado de infarto do miocárdio. 17-19

A terapia de reposição hormonal é prescrita a milhões de mulheres, que pode estar associada a efeitos colaterais graves. O tromboembolismo venoso não é de forma alguma restrito àqueles com defeitos protrombóticos identificáveis. Como os estudos prospectivos ainda não demonstraram que a terapia de reposição hormonal reduz o risco de complicações trombóticas arteriais, pode-se argumentar fortemente que os médicos devem se abster de prescrever o medicamento para este propósito, em vez de rastrear mulheres quanto a mutações como o fator V Leiden para eliminar mulheres em alto risco de complicações trombóticas venosas.

Apoiado em parte pelo Serviço de Pesquisa Médica do Departamento de Assuntos de Veteranos.


Falando para AJUSTE em outro artigo, o Dr. Shahid Jameel também falou sobre como as variantes e mutações são um processo natural que ocorre nos vírus e não são motivo de preocupação na maioria dos casos.

"Os vírus costumam sofrer mutação sem qualquer consequência. Mas as mutações que são capazes de infectar as pessoas de maneira igual ou mais eficiente são aquelas que destacamos como variantes específicas", diz o Dr. Mishra.

As variantes tornam-se 'variantes de preocupação' em duas circunstâncias,

  • Quando se espalha mais rápido e começa a representar mais de 5% ou 10% das infecções.
  • Se houver mutações que achamos que podem criar problemas em termos de sintomas ou vacinas.

Ele diz, "no caso de variantes que estão se espalhando mais rapidamente, mas não têm nenhuma outra consequência diferente, elas são conhecidas como 'variantes de interesse' e continuarão a ser monitoradas para quaisquer outras alterações."

Quando se trata das variantes de preocupação, diz o Dr. Mishra,


Um processo normal de reparo de DNA pode se tornar uma importante fonte de mutações no câncer

A hipermutação é uma ocorrência incomum que pode levar a muitas mutações próximas de uma só vez, danificando gravemente nosso material genético e potencialmente causando câncer. O tipo mais conhecido de hipermutação local, denominado chuva de mutação ou tempestade, é bastante incomum e leva a muitas mutações acumuladas em uma pequena área, por ex. um único gene.

Pesquisadores do Laboratório de Ciência de Dados do Genoma do IRB Barcelona, ​​liderados pelo pesquisador do ICREA Fran Supek, descobriram um novo tipo de hipermutação chamado névoa de mutação, que pode gerar centenas de mutações em cada célula. Essas mutações são amplamente distribuídas, mas se acumulam nas regiões mais importantes do genoma, onde residem os genes (a chamada eucromatina). O fato de essas mutações estarem espalhadas explica por que não foram detectadas até agora.

Surpreendentemente, os cientistas também identificaram que o tipo de hipermutação recém-descoberto está relacionado a um processo normal de reparo do DNA. Quando as células detectam uma incompatibilidade em seu DNA, elas passam por uma reação de reparo do DNA, a fim de preservar a informação genética. Notavelmente, essa reação pode se tornar acoplada à enzima APOBEC - normalmente usada por células humanas para se defender contra vírus e ter um papel importante no combate à hepatite e ao HIV. O trabalho do Genome Data Science Lab indica que, em alguns casos, quando as enzimas APOBEC e o processo de reparo do DNA estão ativos ao mesmo tempo, o APOBEC sequestra o reparo do DNA, gerando a névoa da mutação.

"Achamos que esta névoa de mutação impulsionada pela APOBEC tem um potencial mutagênico que iguala ou até mesmo excede o de carcinógenos fortes bem conhecidos, como fumaça de tabaco ou radiação ultravioleta", explica Fran Supek. Trabalhos recentes de outros grupos de pesquisa sugerem que o processo parece ser mais ativo em cânceres metastáticos em estágio avançado: ajuda o câncer a evoluir, permitindo-lhe resistir a medicamentos e à radiação. "Esta descoberta torna a APOBEC um alvo atraente para o tratamento do câncer, removendo sua capacidade de evoluir e se tornar mais agressiva", acrescenta Supek.

A origem de metade das mutações em alguns cânceres de pulmão e mama

Uma análise completa de mais de 6.000 genomas de câncer humano, incluindo tumores de pulmão, tumores de mama e melanomas, entre outros, levou à descoberta de que a névoa de mutação é um fenômeno comum. "Mais da metade de todas as mutações APOBEC em alguns cânceres de pulmão ou de mama são geradas pelo mecanismo de hipermutação que encontramos", disse David Mas-Ponte, primeiro autor do estudo e aluno de doutorado no Laboratório de Dados do Genoma.

Sabe-se que alguns tipos de câncer, como câncer cervical ou de cabeça e pescoço, são causados ​​por vírus. No entanto, este estudo encontrou mutações causadas por este sistema APOBEC não apenas nesses tumores, mas também em cânceres que atualmente não são conhecidos por serem relacionados a vírus. Trabalhos adicionais devem esclarecer o que aciona o sistema APOBEC. "Compreender melhor a APOBEC pode ter amplas implicações para o tratamento do câncer", acrescenta Mas-Ponte.

O método estatístico HyperClust

Mas-Ponte e Supek desenvolveram um método estatístico, chamado HyperClust, que pode analisar rapidamente grandes quantidades de dados genômicos humanos para encontrar processos mutacionais incomuns que podem levar a mutações simultâneas, como esses casos de névoa de mutação. Este método estatístico é descrito no artigo, que foi publicado em Nature Genetics, e também está disponível como um software de código aberto em um repositório Github.

Este trabalho foi financiado pela bolsa inicial ERC "HYPER-INSIGHT" concedida a Fran Supek ICREA reaearcher e EMBO Young Investigator e pela bolsa Severo Ochoa concedida ao IRB Barcelona. David Mas-Ponte recebeu uma bolsa FPI-SO.


Decodificando mutações e variantes do vírus COVID-19 em evolução

De cinzas a cinzas: uma cremação em massa de pessoas morreu de Covid-19 na aldeia de Channenahalli perto de Bengaluru | Bhanu Prakash Chandra

Mea culpa, rues Anurag Agarwal. Chefe do CSIR-Instituto de Genômica e Biologia Integrativa (CSIR-IGIB) em Nova Delhi, Agarwal cunhou o termo "duplo mutante", que se tornou a palavra da moda na Índia agora. Mas ele diz que nunca teve a intenção de fazer parte da linguagem comum.

“Estávamos escrevendo uma nota científica, em que descrevíamos uma nova Variante de Preocupação (VoC) que havia sido encontrada”, diz Agarwal. Essa variante do vírus SARS-CoV-2, que eles identificaram pela primeira vez em Maharashtra, tinha várias mutações, como é o caso normal com as novas gerações de vírus. No entanto, entre essas mutações, duas foram de particular interesse, por apresentarem “escape imunológico” in vitro. Isso significa que, quando os geneticistas cultivaram genomas de vírus em laboratório e os submeteram a uma pressão extrema de anticorpos, que deveria neutralizar efetivamente o vírus, algumas mutações ainda sobreviveram.

Usando um método de nomenclatura chamado Pango (existem vários métodos de nomenclatura, que causam muita confusão até mesmo entre a comunidade científica, esqueça os leigos), eles identificaram esta variante por um nome que soa muito desinteressante chamado B.1.617, sinalizando duas das várias mutações. Essas mutações são E484Q e L452R, que são simplesmente códigos para o ponto no genoma em que um determinado aminoácido (indicado pela letra) é substituído por outro. “Enquanto escrevíamos o artigo, tivemos que falar várias vezes sobre a variante e, em algum momento, me referi a ela como o mutante duplo”, explica Agarwal.

Esta palavra cativante foi ouvida pela primeira vez em público em 24 de março, quando o secretário de saúde da União, Rajesh Bhushan, a usou em seu briefing. E antes que eles percebessem, o termo foi cogitado por quase todo mundo. Isso também causou certa preocupação, com as pessoas começando a acreditar erroneamente que a dupla mutação tornava o vírus um inimigo pior do que a linha ancestral de Wuhan.

Algumas semanas depois, dois acontecimentos aconteceram. Alguns cientistas notaram que havia outra mutação, P681R, na variante B.1.617 que era “interessante” porque essa mutação “provavelmente ajuda o vírus a entrar na célula hospedeira mais facilmente”, nas palavras da virologista Saumitra Das, que dirige o National Instituto de Genômica Biomédica (NIBMG), Kalyani, West Bengal. Então, as pessoas começaram a falar sobre o mutante duplo, na verdade, um “mutante triplo” e, portanto, ainda mais temível. “É a mesma variante - B.1.617”, diz Agarwal. “Estávamos estudando para escape imunológico, então sinalizamos as duas mutações que conectamos a essa característica. Também tínhamos notado o P681R, mas em nossa história, foi apenas um ajudante - os protagonistas foram os dois primeiros. Para outra pessoa, que buscava outra característica, P681R se tornou a estrela da narrativa ”.

Mas antes mesmo que essa confusão pudesse ser esclarecida, o NIBMG sinalizou outra variante, B.1.618, que prevalece em Bengala Ocidental. Como ele identificou três mutações aqui, este também foi referido como o mutante triplo, novamente, atribuindo a ele o triplo do poder de destruição. E então, agora existem dois mutantes triplos circulando pelo país, o duplo Maharashtra, que é um triplo, e o triplo de Bengala! 618, como é melhor chamar essa variante, ainda está em estudo. Não é nem classificado como VoC, diz Das. Não mostrou nenhum potencial para se espalhar de forma mais virulenta ou atacar de forma mais letal.

A confusão que prevalece é natural, dado o sistema complicado, e não padronizado, de nomear os vírus e suas variantes. “O público em geral não se interessa pelos nomes dos vírus, e o sistema existente de números e letras funciona bem para a comunidade científica, já que todos conhecemos os códigos e podemos identificar imediatamente as mutações por seus nomes”, diz Agarwal em defesa. Desde o genoma ancestral (o genoma de Adão ou Eva), a árvore filogenética de um vírus pode ser um alfabeto alucinante e uma sopa numérica, à medida que as gerações subsequentes são agrupadas em clados, linhagens e variantes. Sem surpresa, termos como duplo mutante ou cepa do Reino Unido entram em nosso vocabulário, todos muito enganosos.

A linhagem B.1.1.7, conhecida como variante do Reino Unido, recebeu esse nome porque foi identificada pela primeira vez no Reino Unido, não significa que tenha se originado no Reino Unido. Apesar do estigma que esses nomes atribuem a um lugar, eles se tornam comuns. Vimos isso com os vírus da Gripe Espanhola, Ebola, Nipha e Zika e uma série de doenças. Apesar dos esforços da comunidade científica para não associar a pandemia à China, a conexão Wuhan permanece indelével. A Organização Mundial da Saúde está elaborando um sistema de nomenclatura padronizado, mas embora isso possa facilitar a confusão entre os cientistas, para os leigos, ainda será principalmente gobbledygook.

618 também foi referido inicialmente como a variante indiana, embora Bhushan tenha insistido que esse termo não existe. Embora sua tentativa fosse garantir que a Índia não fosse estigmatizada, o fato é que, dada a extensão da Índia, não pode haver uma única variante indiana. Já 617 está sendo chamada de variante Maharashtra, enquanto 618 é a variante de Bengala. Mas se outra variante for relatada a partir desses estados, como isso será chamado, pergunta Agarwal. “No momento, devido ao grande número de casos, a Índia deve ter o maior conjunto de variantes também”, observa Rakesh Mishra, chefe do Centro de Biologia Celular e Molecular com sede em Hyderabad, acrescentando que a mutação é a natureza dos vírus. Somente se uma mutação estiver associada a uma infecção mais grave ou resistência a anticorpos, ela se tornará um motivo de preocupação.

Na verdade, no ano passado, o mapa de vírus do país mudou dinamicamente. Nas primeiras semanas, o filamento Wuhan chegou à Índia, mas rapidamente, uma variante chamada D614G se estabeleceu em toda a Índia, diz Mishra. Permaneceu dominante até o inverno, quando a variante do Reino Unido veio por meio de voos. Esta variante é conhecida por sua maior infecciosidade ou disseminação, mas não necessariamente por maior morbidade em pacientes.

Perda incomensurável: Umar Farooq de Srinagar mede uma sepultura cavada para sua mãe, que morreu de Covid-19 | AFP

Em dezembro, o mapa variante da Índia começou a mudar notavelmente. A variante do Reino Unido, apesar de ser um VoC, não foi contida adequadamente, especialmente no norte da Índia. Em Punjab, agora é responsável por 90 por cento dos casos em Delhi, pela metade dos casos da amostra, seguido pela variante 617. Por outro lado, apesar dos voos internacionais para Mumbai e Hyderabad, a identificação e quarentena de passageiros internacionais portadores desta infecção significa que a variante do Reino Unido está menos estabelecida na península. Enquanto em Maharashtra, 617 é a variante mais comum, em outras partes do sul, N440K é mais comumente visto. “Não tem nenhuma conseqüência real, pois não está levando a qualquer infecciosidade maior '', diz Mishra. As variantes do Brasil e da África do Sul também são vistas na Índia, mas em títulos muito baixos.

Em West Bengal, 618 e 617 estão competindo pela supremacia, e os cientistas acham que o 617, mais móvel, pode se tornar dominante e até superar o 618. O aumento de Uttar Pradesh ainda está em andamento. Embora seja possível que, devido à proximidade, Uttar Pradesh possa ter um padrão variante semelhante ao de Delhi, Sujeet Singh, chefe do Centro Nacional de Controle de Doenças, que está analisando amostras do norte da Índia, diz que a imagem ficará clara assim que a análise for concluída . O aumento de Bengaluru, dizem os geneticistas, não é dominado por nenhuma variante particular. No geral, no país, a variante do Reino Unido é a dominante, em grande parte por causa do aumento repentino no norte da Índia.

O que a compreensão dessas variantes significa para as pessoas? Nada, dizem os cientistas. A propagação do vírus permanece a mesma, independentemente da variante. Até agora, assim é o tratamento. Assim, funciona o protocolo de prevenção existente. “No Punjab, por exemplo, a variante do Reino Unido é dominante, mas qualquer variante teria feito o mesmo trabalho, quando as pessoas estavam se reunindo em massa para protestos e festas”, aponta Mishra.

Esses estudos genômicos são mais para a compreensão de pesquisadores em estudos epidemiológicos. Um mapa de variante dinâmico mostrará como a infecção está se espalhando e, portanto, pode ser usado efetivamente no manejo epidemiológico, cortando fisicamente a região de onde está se espalhando. A identificação de 617 no Reino Unido e Canadá mostrou o caminho de sua viagem.

Os estudos genômicos também ajudam na criação de medicamentos e vacinas-alvo. Até o momento, não há medicamento comprovado para o tratamento de Covid-19. Mas estudos mostram que o protocolo de tratamento e as vacinas existentes funcionam de forma tão eficaz contra todas as variantes existentes. Isso ocorre porque as mutações ocorrem apenas em um ponto específico, mas a vacina tem como alvo vários pontos do vírus. Assim, mesmo se um determinado local mostrar uma “fuga imunológica” em condições de laboratório, a vacina ainda seria capaz de atingir o vírus como um todo. Por enquanto, pelo menos. Novamente, nenhuma das mutações mudou a forma como o vírus se espalhou, então a máscara, a distância social e a higiene das mãos funcionam contra todos. Isso é para o presente. Quanto ao futuro da infecção, que sera sera (o que será, será).

As variantes de interesse mostram alterações na ligação ao receptor. Eles podem ter potencial de neutralização reduzida por anticorpos gerados por um ataque anterior de infecção ou vacinação, potencial impacto diagnóstico ou aumento previsto na transmissibilidade ou gravidade da doença. B.1.617 é geralmente considerado um VoI, B.1.618 pode nem mesmo se qualificar como um VoI.

Variant of Concern é uma variante para a qual há evidências de aumento da transmissibilidade e gravidade da doença, redução significativa na neutralização por anticorpos de infecção ou vacinação anterior, redução da eficácia do tratamento e falhas no diagnóstico. A variante do Reino Unido é um VoC.


DNA Double Take

Da aula de biologia ao “C.S.I.”, repetidamente nos é dito que nosso genoma está no cerne de nossa identidade. Leia as sequências nos cromossomos de uma única célula e aprenda tudo sobre as informações genéticas de uma pessoa - ou, como a 23andme, uma importante empresa de testes genéticos, diz em seu site: “Quanto mais você sabe sobre o seu DNA, mais você sabe sobre si mesmo."

Mas os cientistas estão descobrindo que - em um grau surpreendente - nós contemos multidões genéticas. Não muito tempo atrás, os pesquisadores pensavam que era raro as células de uma única pessoa saudável diferirem geneticamente de maneira significativa. Mas os cientistas estão descobrindo que é bastante comum um indivíduo ter vários genomas. Algumas pessoas, por exemplo, têm grupos de células com mutações que não são encontradas no resto do corpo. Alguns têm genomas que vieram de outras pessoas.

“Há rumores na matriz sobre isso há anos, até décadas, mas apenas em um sentido muito hipotético”, disse Alexander Urban, geneticista da Universidade de Stanford. Mesmo três anos atrás, sugerir que havia uma variação genética generalizada em um único corpo seria recebido com ceticismo, disse ele. "Você teria apenas corrido contra a parede."

Mas uma série de artigos recentes do Dr. Urban e outros demonstrou que esses sussurros não eram apenas hipotéticos. A variação nos genomas encontrados em uma única pessoa é muito grande para ser ignorada. “Agora sabemos que está lá”, disse Urban. “Agora estamos mapeando este novo continente.”

O Dr. James R. Lupski, um dos principais especialistas em genoma humano do Baylor College of Medicine, escreveu em uma revisão recente na revista Science que a existência de múltiplos genomas em um indivíduo pode ter um tremendo impacto na prática da medicina. “Mudou minha maneira de pensar”, disse ele em uma entrevista.

Os cientistas estão encontrando ligações de vários genomas para certas doenças raras e agora estão começando a investigar variações genéticas para lançar luz sobre doenças mais comuns.

A mudança de visão da ciência também está levantando questões sobre como os cientistas forenses devem usar evidências de DNA para identificar pessoas. Também representa desafios para os conselheiros genéticos, que não podem presumir que a informação genética de uma célula pode dizer-lhes sobre o DNA em todo o corpo de uma pessoa.

Projeto Humano

Quando um óvulo e um espermatozóide combinam seu DNA, o genoma que eles produzem contém todas as informações necessárias para a construção de um novo ser humano. À medida que o ovo se divide para formar um embrião, ele produz novas cópias do genoma original.

Durante décadas, os geneticistas exploraram como um embrião pode usar as instruções de um único genoma para desenvolver músculos, nervos e muitas outras partes do corpo humano. Eles também usam o sequenciamento para compreender as variações genéticas que podem aumentar o risco de certas doenças. Os conselheiros genéticos podem observar os resultados dos exames genéticos para ajudar os pacientes e suas famílias a lidar com essas doenças - alterando sua dieta, por exemplo, se lhes faltar um gene para uma enzima crucial.

O custo de sequenciar um genoma inteiro caiu tão drasticamente nos últimos 20 anos - agora alguns milhares de dólares, abaixo dos estimados US $ 3 bilhões para a parceria público-privada que sequenciou o primeiro genoma humano - que os médicos estão começando a sequenciar todo o genomas de alguns pacientes. (O sequenciamento pode ser feito em apenas 50 horas.) E eles estão identificando ligações entre mutações e doenças que nunca foram vistas antes.

No entanto, todos esses testes poderosos baseiam-se na suposição de que, dentro do nosso corpo, um genoma é um genoma. Os cientistas acreditavam que poderiam observar o genoma de células colhidas em um cotonete e aprender sobre os genomas das células no cérebro, no fígado ou em qualquer outra parte do corpo.

Em meados dos anos 1900, os cientistas começaram a obter indícios de que isso nem sempre era verdade. Em 1953, por exemplo, uma mulher britânica doou meio litro de sangue. Descobriu-se que parte de seu sangue era do Tipo O e parte do Tipo A. Os cientistas que a estudaram concluíram que ela adquiriu parte do sangue de seu irmão gêmeo no útero, incluindo seus genomas nas células sanguíneas.

O quimerismo, como essas condições passaram a ser conhecidas, pareceu por muitos anos uma raridade. Mas "pode ​​ser mais comum do que imaginávamos", disse a Dra. Linda Randolph, pediatra do Hospital Infantil de Los Angeles e autora de uma revisão sobre quimerismo publicada no The American Journal of Medical Genetics em julho.

Os gêmeos podem acabar com um suprimento misto de sangue quando obtêm nutrientes no útero por meio do mesmo conjunto de vasos sanguíneos. Em outros casos, dois ovos fertilizados podem se fundir. Essas chamadas quimeras embrionárias podem passar pela vida alegremente sem saber de suas origens.

Uma mulher descobriu que era uma quimera aos 52 anos. Precisando de um transplante de rim, ela foi testada para encontrar uma correspondência. Os resultados indicaram que ela não era mãe de dois de seus três filhos biológicos. Descobriu-se que ela se originou de dois genomas. Um genoma deu origem ao seu sangue e alguns de seus óvulos, outros óvulos, carregavam um genoma separado.

As mulheres também podem obter genomas de seus filhos. Depois que um bebê nasce, ele pode deixar algumas células fetais no corpo da mãe, de onde podem viajar para diferentes órgãos e serem absorvidas por esses tecidos. “É muito provável que qualquer mulher grávida seja uma quimera”, disse Randolph.

Onde você olha

À medida que os cientistas começam a procurar quimeras sistematicamente - em vez de esperar que apareçam em testes médicos intrigantes - eles as encontram em uma fração notavelmente alta de pessoas. Em 2012, cientistas canadenses realizaram autópsias no cérebro de 59 mulheres. Eles encontraram neurônios com cromossomos Y em 63% deles. Os neurônios provavelmente se desenvolveram a partir de células originadas de seus filhos.

No The International Journal of Cancer, em agosto, Eugen Dhimolea, do Dana-Farber Cancer Institute, em Boston, e colegas relataram que as células masculinas também podem se infiltrar no tecido mamário. Quando eles procuraram por cromossomos Y em amostras de tecido mamário, eles o encontraram em 56% das mulheres que investigaram.

Um século atrás, os geneticistas descobriram uma maneira pela qual as pessoas podem adquirir novos genomas. Eles estavam estudando “animais em mosaico”, criaturas raras com manchas de pêlo de cores estranhas. Os animais não herdaram os genes para essas manchas de seus pais. Em vez disso, enquanto embriões, eles adquiriram uma mutação em uma célula da pele que se dividiu para produzir uma mancha colorida.

O mosaicismo, como essa condição veio a ser conhecida, era difícil de estudar em humanos antes da era do sequenciamento de DNA. Os cientistas só puderam descobrir casos em que as mutações e os efeitos foram grandes.

Em 1960, os pesquisadores descobriram que uma forma de leucemia é resultado do mosaicismo. Uma célula sanguínea sofre mutação espontânea à medida que se divide, movendo um grande pedaço de um cromossomo para outro.

Estudos posteriores deram suporte à ideia de que o câncer é resultado de mutações em células específicas. Mas os cientistas tinham pouca ideia de como os casos comuns de mosaicismo iam além do câncer.

“Não tínhamos tecnologia para pensar sistematicamente sobre eles”, disse o Dr. Christopher Walsh, geneticista do Hospital Infantil de Boston que publicou recentemente uma revisão sobre mosaicismo e doenças na Science. “Agora estamos no meio de uma revolução.”

Diferenças Benignas

As últimas descobertas deixam claro que o mosaicismo é bastante comum - mesmo em células saudáveis.

Dr. Urban and his colleagues, for example, investigated mutations in cells called fibroblasts, which are found in connective tissue. They searched in particular for cases in which a segment of DNA was accidentally duplicated or deleted. As they reported last year, 30 percent of the fibroblasts carried at least one such mutation.

Michael Snyder of Stanford University and his colleagues searched for mosaicism by performing autopsies on six people who had died of causes other than cancer. In five of the six people they autopsied, the scientists reported last October, they found cells in different organs with stretches of DNA that had accidentally been duplicated or deleted.

Now that scientists are beginning to appreciate how common chimerism and mosaicism are, they’re investigating the effects of these conditions on our health. “That’s still open really, because these are still early days,” Dr. Urban said.

Nevertheless, said Dr. Walsh, “it’s safe to say that a large proportion of those mutations will be benign.” Recent studies on chimeras suggest that these extra genomes can even be beneficial. Chimeric cells from fetuses appear to seek out damaged tissue and help heal it, for example.

But scientists are also starting to find cases in which mutations in specific cells help give rise to diseases other than cancer. Dr. Walsh, for example, studies a childhood disorder of the brain called hemimegalencephaly, in which one side of the brain grows larger than the other, leading to devastating seizures.

“The kids have no chance for a normal life without desperate surgery to take out half of their brain,” he said.

Dr. Walsh has studied the genomes of neurons removed during those surgeries. He and his colleagues discovered that some neurons in the overgrown hemisphere have mutations to one gene. Two other teams of scientists have identified mutations on other genes, all of which help to control the growth of neurons. “We can get our hands on the mechanism of the disease,” said Dr. Walsh.

Other researchers are now investigating whether mosaicism is a factor in more common diseases, like schizophrenia. “This will play itself out over the next 5 or 10 years,” said Dr. Urban, who with his colleagues is studying it.

Moving Cautiously

Medical researchers aren’t the only scientists interested in our multitudes of personal genomes. So are forensic scientists. When they attempt to identify criminals or murder victims by matching DNA, they want to avoid being misled by the variety of genomes inside a single person.

Last year, for example, forensic scientists at the Washington State Patrol Crime Laboratory Division described how a saliva sample and a sperm sample from the same suspect in a sexual assault case didn’t match.

Bone marrow transplants can also confound forensic scientists. Researchers at Innsbruck Medical University in Austria took cheek swabs from 77 people who had received transplants up to nine years earlier. In 74 percent of the samples, they found a mix of genomes — both their own and those from the marrow donors, the scientists reported this year. The transplanted stem cells hadn’t just replaced blood cells, but had also become cells lining the cheek.

While the risk of confusion is real, it is manageable, experts said. “This should not be much of a concern for forensics,” said Manfred Kayser, a professor of Forensic Molecular Biology at Erasmus University in Rotterdam. In the cases where mosaicism or chimerism causes confusion, forensic scientists can clear it up by other means. In the Austrian study, for example, the scientists found no marrow donor genomes in the hair of the recipients.

For genetic counselors helping clients make sense of DNA tests, our many genomes pose more serious challenges. A DNA test that uses blood cells may miss disease-causing mutations in the cells of other organs. “We can’t tell you what else is going on,” said Nancy B. Spinner, a geneticist at the University of Pennsylvania, who published a review about the implications of mosaicism for genetic counseling in the May issue of Nature Reviews Genetics.

That may change as scientists develop more powerful ways to investigate our different genomes and learn more about their links to diseases. “It’s not tomorrow that you’re going to walk into your doctor’s office and they’re going to think this way,” said Dr. Lupski. “It’s going to take time.”


Project Report on DNA

An exclusive project report on DNA. This project report will help you to learn about: 1. Introduction to DNA 2. Constituents of DNA 3. Molecular Structure 4. Forms 5. DNA as the Genetic Material 6. DNA Content 7. Unique and Repetitive DNA.

  1. Project Report on Introduction to DNA
  2. Project Report on the Constituents of DNA
  3. Project Report on the Molecular Structure of DNA
  4. Project Report on the Forms of DNA
  5. Project Report on DNA as the Genetic Material
  6. Project Report on DNA Content
  7. Project Report on Unique and Repetitive DNA

Project Report # 1. Introduction to DNA:

The chromosomes are made up of two types of macromolecules — proteins and nucleic acids. The nucleic acids are of two types, viz. deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA). DNA and RNA are chain-like macro-molecules that function in the storage and trans­fer of genetic information.

They are major com­ponents of all cells. DNA is found predominant­ly in the nucleus while RNA is predominant in cytoplasm. DNA is the genetic material of most organisms including many viruses. Some viruses,’ however, have RNA as their genetic material.

Deoxyribonucleic acid (DNA) is found in the cells of living organisms except plant viruses. DNA is double stranded but in some cases like bacteriophages (e.g., φ x 174) the DNA is single stranded and remains coiled and enclosed in a protein coat. DNA may be circular in bacteria, spirally coiled and un-branched threads in mito­chondria and plastids of eukaryotic cells.

Project Report # 2. Constituents of DNA:

Deoxyribonucleic acid is a long chain poly­mer (polynucleotide) composed of monomeric units, called nucleotides. Each nucleotide is composed of a nucleoside (a sugar and a base) and a phosphate group.

Chemical analysis of highly purified DNA have shown that it is made of four kinds of monomeric building blocks each of which con­tains three types of molecules :

The phosphoric acid (H3PO4) in the nucleic acid is called phosphate (Fig 4.1). Phosphoric acid has three reactive hydroxyl (-OH) groups of which two are involved in forming sugar phosphate backbone of DNA. The phosphate makes a nucleotide negatively charged.

DNA contains a five carbon sugar, hence it is a pentose sugar (Fig. 4.1). Since one oxygen atom at the 2′ carbon is missing, hence it gets its name 2′-deoxyribose. Four of the five carbon atoms plus a single oxy­gen atom forms a five-membered ring. The fifth carbon atom is outside the ring and forms a part of a -CH2 group.

Different types of hetero­cyclic nitrogen containing ring compounds are found in the structure of DNA. They are called simply as bases because they can combine with H^ in acidic solution. They are also referred to as nitrogenous bases due to presence of nitrogen.

The bases are of two types mainly — Pyrimidine and Purine.

Pyrimidine bases are made up of a six-membered pyrimidine ring which is similar to the benzene ring except that it contains nitrogen in place of carbon at the positions 1 and 3. Pyrimidine bases are of 2 types — thymine and cytosine (Fig. 4.1), commonly abbreviated as T and C respectively.

Purine is a derivative of pyrimidine. It consists of a pyrimidine ring and a five- membered imidazole ring (having nitrogen at 7 and 9 positions) which are fused together at 5 and 4 positions. There are two purine com­pounds namely – adenine (A) and guanine (G) (Fig. 4.1).

In addition to the four common bases (A, T, G, C), certain other unusual bases of purine and pyrimidine derivatives, called rare or minor bases, occur in small amounts in DNA of some organisms.

In some viruses, uracil occurs in place of thymine in DNA. The T-even phages contain 5-hydroxy- methyl-cytosine in place of cytosine. These modifications protect the viral DNA from degra­dation by the host cell endonuclease. Other rare bases in DNA are 5-methyl-cytosine, N 6 -methyl- adenine, N 2 -methyl-guanine, etc.

Molar Ratio of Nitrogenous Bases in DNA (Chargaff Rules, 1955):

(i) The purine and pyrimidine components occur in equal amounts in a DNA molecule.

(ii) The amounts of adenine (A) is equivalent to the amount of thymine (T) and the amount of cytosine is equivalent to that of guanine (G).

(iii) In DNA, A + G / T + C value is always one or nearly one.

(iv) The base ratio A +T/G + C may vary in the DNA of different groups of organisms but is constant for particular species. Therefore, this ratio has been used to identify the DNA from a particular species.

Project Report # 3. Molecular Structure of DNA (Watson and Crick’s Model):

In 1953 Watson and Crick postulated a three dimensional working model of DNA, i.e., double helix structure of DNA based on the X-ray data of Wilkins and base-equivalence observed by Chargaff.

A base combined with a sugar molecule is called a nucleoside. When deoxy­ribose sugar binds with base, it makes deoxyribonucleoside. Obviously, in DNA four different nucleosides are found.

A nucleotide is derived from a nucleoside by addition of a molecule of phosphoric acid. The phosphate molecule is linked with sugar molecule at carbon number 5 or at carbon number 3 (Fig. 4.2).

The nucleotides in DNA are of 4 types:

(iv) Deoxyguanylic acid (Fig. 4.3, Table 4.1).

A number of deoxyribonucleotides are covalently linked one by one to form a polynucleotide chain, i.e., deoxyribonucleotide monomer units are united through the formation of phosphodiester bonds (a diester bond is one which involves two ester bonds). Fig. 4.4.

Watson and Crick suggested that in a DNA molecule, there are two such polynucleotide chains which are coiled about one another in a spiral.

The two polynucleotide strands are held together in their helical configu­ration by hydrogen bonding between bases in opposing strands, the resulting base pairs being stacked between the two chains perpendicular to the axis of the molecule like the steps of a spiral stair case (Fig. 4.5).

The base-pairing is specific adenine is always paired with thymine, and guanine is always paired with cytosine (Fig. 4.6). Thus, all base-pairs consist of one purine and one pyrimidine.

The specificity of base-pairing results from the hydrogen-bonding capacities of the bases in their normal configurations. In their most common structural configurations, adenine and thymine form two hydrogen bonds, guanine and cytosine form three hydrogen bonds (Fig. 4.7).

The two strands of DNA double helix are thus said to be complementary (not identical). This property, that is complementarity of the two strands, makes DNA uniquely suited to store and transmit genetic information. The base-pairs in DNA are stacked 3.4 Å apart with 10 base-pairs per turn (360°) of the double-helix.

The sugar- phosphate backbones of the two complementary strands are antiparallel, that is, they have oppo­site chemical polarity.

As one moves unidirectionally along a DNA double helix, the phos­phodiester bonds in one strand go from a 3′ car­bon of one nucleotide to a 5′ carbon of the adjacent nucleotide, whereas those in complemen­tary strand go from a 5′ carbon to a 3′ carbon. This opposite polarity of the complementary strand is very important in considering the mechanism of replication of DNA.

The high degree of stability of DNA double helices results in part from the large number of hydrogen bonds between the base-pairs and in part from the hydrophobic bonding between the stacked base-pairs. The planar sides of them are relatively nonpolar and thus tend to be water insoluble (hydrophobic).

This hydrophobic core of stacked base-pairs con- tributes considerable stability to DNA molecules present in the aqueous protoplasm’s of living cells.

Project Report # 4. Forms of DNA:

The DNA molecules exhibit a considerable amount of conformational flexi­bility. It can exist in A, B, C, D and Z forms (Table 4.2). B form (B-DNA) is the structure proposed by Watson & Crick and is the native conformation of DNA in solution.

It consists of a right-handed antiparallel double helix of sugar-phosphate backbone, with purine-pyrimidine base-pairs roughly perpendicular to the axis of the helix. The tilt of base-pairs of the helix is 6.3°. One turn of the helix consists of 10 base-pairs. The rise of the helix per base pair is 3.37 Å.

A form (A-DNA) has 11 base pairs. The base pairs are considerably tilted from the axis of the helix. The axial rise is 2.56Å. The helix observed under conditions of dehydration and high con­centrations of salt is wider and shorter than B- helix, the distinction between the major and minor grooves are reduced.

C form (C-DNA) results by reduction of hydration of the B form below 66% with excess of salt still present. The size of helix of C form DNA is greater than Å type of DNA but is sma­ller than B-DNA. It is about 31 Å. There are 9.33 base pairs per turn. The axial rise of base pairs is 3.32 Å with a tilting of about 7.8°.

D form (D-DNA) and E form (E-DNA) are found rarely as extreme variants. In case of D- form there are 8 base pairs per turn of helix. An axial rise of base pairs is 3.03 Å with tilting of about 16.7°.

In case of E-form, there are 7.5 base pairs per turn of helix. Z form (Z-DNA) is an unique left-handed (Fig. 4.8) double helical form with a zig-zag (Fig. 4.9) sugar-phosphate backbone in antiparallel organization. This DNA has been called Z-DNA.

Project Report # 5. DNA as the Genetic Material:

Transformation Experiment:

Transformation experiment was initially conducted by F. Griffith in 1928 (Fig. 4.21). The injected a mixture of two strains of Pneumococcus (Diplococcus pneumo­niae) into mice. One of these two strains, S III was virulent and other strain R II was non-virulent (causing no infection).

Heat-killed virulent S III strain when injected, showed that infectivity after heat killing is lost. The mice injected with a mixture of R II (living) and S III (heat killed) died and virulent Pneumococcus could be isolated from these mice. This phenomenon was described as transformation.

O. T. Avery, C. M. Macleod and M. McCarthy repeated Griffith’s experiment in an in vitro system in order to identify the transforming prin­ciple responsible for converting non-virulent into virulent type and reported their results in 1944 (Fig. 4.22). Virulence in Pneumococcus depends on a polysaccharide capsule which is present in viru­lent strain S III and is absent in non-virulent strain R II.

The cells of non-capsulated type – Rll were treated with an extract of DNA from capsulated strain S III. A few cells of S III type could be iso­lated from the mixture.

This phenomenon of transferring characters of one strain to another by using a DNA extract of the former is called transformation. When the extract was treated with DNAse (an enzyme which destroys DNA) this transforming ability was lost. Proteases (enzymes which destroy pro­teins) did not affect the transforming ability. These experiments thus indicated that DNA and not the protein, is the genetic material.

Hershey-Chase Experiment:

Additional direct evidence indicating that DNA is the gene­tic material was published in 1952 by A. D. Hershey and M. Chase. The experiment showed that genetic information of a particular bacterial virus (bacteriophage T2) was present in DNA. Bacteriophage T2 infects the common colon bacillus E. coli (Fig. 4.23).

The basis for Hershey-Chase experiment is that DNA contains phosphorus but no sulphur, whereas proteins contain sulphur but no phos­phorus.

Thus, Hershey and Chase were able to specifically label either (1) the phage DNA by growth in a medium containing radioactive iso­tope of phosphorus 32 P, in place of the normal isotope 31 P, or (2) phage protein coats by growth in a medium containing radioactive sulphur 35 S, in place of the normal isotope 35 S (Fig. 4.24).

When T2 phage particles labelled with 35 S were mixed with E. coli cells for a few minutes and were then subjected to shearing forces by placing the infected cells in a warring blender, it was found that most of the radioactivity (and thus the proteins) could be removed from the cells without affecting progeny phage production.

When T2 phage in which DNA was labelled with 32 P were used, essentially all radioactivity was found inside the cells, that is, it was not subjec­ted to removal by shearing in a blender (Fig. 4.25).

The sheared off phage-coats were separated from the infected cells by low-speed centrifugation which pellets (sediments) cells while leaving phage particles suspended. The results indicated that DNA of the virus enters the host cell, where­as protein coat remains outside the cell.

Since progeny viruses are produced inside the cell, Flershy and Chase’s results indicated that the genetic information directing the synthesis of both the DNA molecules and protein coats of the progeny viruses must be present in the parental DNA. Moreover, progeny particles were shown to contain some of the 32 P, but none 35 S.

Project Report # 6. DNA Content:

Large variation in DNA content among species of the same genus as well as among genera of the same family has been observed. This wide range of variation in the nuclear DNA contents among species within a genus may be partly attributed to differences in chromosome numbers.

However, species at the same ploidy level and with the same chromosome number may either show little or ‘no variation (e.g., Hordeum, Avena, etc.) or may exhibit many-fold differences (e.g., Lathyrus, Vicia, Helianthus, Crepis, Allium, etc.). This inter specific variation may be continuous or discontinuous.

Intra- specific variation in DNA content has also been reported in recent years, so that the variation of DNA among genotypes is a rule rather than an exception. This variation has sometimes been used to explain mechanism of evolution of spe­cific groups.

In general, the huge difference in DNA amount not necessarily correlated with the nature and status of the organism, is principally due to the repetitive DNA sequences present in higher amount. In the plant system, nearly 70- 80% of the DNA in the cereals is repetitive and only a fraction of the DNA controls the structural genes for qualitative characters.

In fact, the com­parison of the genomes of different plant species ranging from algae to angiosperms show marked variation in the C value.

The haploid un-replicated DNA content of an individual is described as its C value. C value is nearly of 600-fold difference within the angiosperms alone, ranging from 0.2 pg in the crucifer – Arabidopsis thaliana to 127pg in Fritillaria assavrica, a liliaceous species. This paradoxical situation in C value termed as C value paradox is principally attri­buted to repetitive DNA content.

In human, of the 3 billion base pairs which constitute the entire genome, only about 50000 genes are supposed to be present. More than 40% of the DNA is highly repetitive. In general, only a fraction of the total amount of DNA codes for structural proteins and enzymes, the rest are repeats – noncoding or coding for non-specific-effect.

Project Report # 7. Unique and Repetitive DNA:

The chromo­somes of prokaryotes contain DNA molecule with unique (non-repeated) base-pair sequences, i.e., each gene which is a linear sequence of few thousand base-pairs, present only once in the genome. If prokaryotic chromosomes are broken into many short fragments, each fragment will contain a different sequence of base-pairs.

In higher organisms on the other hand, the unique DNA sequences which are principally responsible for qualitative characters are present in much lower amount than that of the repetitive sequences. Such unique sequences are present in the chromosomes of higher organism in between repetitive sequences, controlling enzyme-protein.

The chromosomes of eukaryotes in general are very complex. Certain base sequences are repeated many times in the haploid chromosome complement, sometimes as many as million times. DNA containing such repeated sequences, called repetitive DNA, often representing a major component of the eukaryotic genome.

Types of Repetitive DN / D:

The discovery of multiple copies of similar DNA sequences in chromosomes noted by Crick is a major event in the study of chro­mosome research. These repeats may be highly homogeneous, as in satellite DNA sequences in Xenopus, or may be moderate or minor in nature.

These sequences may also be inverted as in palindromes. In the chromosome structure, the highly homogeneous repeats may be tandem located in one locus in cluster form, whereas minor or moderate repeats may be interspersed located in intercalary positions or terminal. In tandem repeats, each sequence arranged adja­cent to the other forming monomeric unit.

Tandem repeats are of two types — similar repeats and complex combinations of different repeats, interspersed repeats are highly scattered, i.e., dispersed throughout the genome along with other sequences. Dispersed repeats include mobile elements such as long interspersed nucleotide element (LINE), short interspersed nucleotide element (SINE), long terminal repeats (LTR).

Repeats may be microsatellites (simple sequence repeats), minisatellites, satellites.

Size of Repetitive DN / D:

The length of repetitive sequences may vary from simple sequence repeats of di-, tri-, tetra- or hexanucleotides to nucleosome repeats of 180 bp and up to 10000 bp or more in rDNA repeats.

Amount of Repetitive DN / D:

The demonstration of the repeated sequences accounts, to a great extent, for the huge amount of DNA, noted in the different organisms. In higher organisms only little amount of the DNA represents structural genes contai­ning unique, the rest being amplification of non-coding sequences or repeats.

In the biologi­cal system, as a whole, the nuclear DNA content varies amongst the organisms without any con­comitant increase in the number and structure of genes.

The importance of repetitive DNA sequences can be judged from the very fact that in the human system almost 40% of DNA is repetitive in nature. In several plant species, as a rule 72-75% of DNA is repetitive whereas in Drosophila only 50% constitutes the sequences.

Location of Repetitive DN / D:

Repetitive DNA sequences are present throughout the chromosomes including in centromere and telomeres (also may be pericentromeric and sub-telomeric), introns, nucleo­lar organizing regions, segments of heterochro­matin.

In general, in the entire chromosome structure, normally highly repeated or homo­geneous repeats are located in one locus, e.g., secondary constriction or centromere and mode­rate, minor repeats are interspersed throughout. Highly homogeneous repeats have been located in ribosomal RNA (5S, 18S, 5.8S, 25S) gene loci and are mostly AT-rich.

A characteristic repeat (GGGGATT) found at the telomeres. Accessory (B) chromosomes which are heterochromatic in nature, rich in highly repeated sequences. Large portion of cereal genome is with interspersion of short repeats. Presence of repetitive sequence in introns, in transposons and in flanking regions of replicon has been noted.

Origin of Repetitive DN / D:

The mechanisms suggested for origin of repeated sequences include salutatory replication, unequal crossing over, transposition including insertion. Repeated sequences are sus­ceptible to change resulting from amplification, translocation, deletion and mutation leading to novel genomic configuration. Sequences in new environments may undergo patterning and amplification, leading to new repeat families.

Functions of Repetitive DN / D:

Several non-specific functions involving cell-nuclear size and volume, chromo­some cycle, generation time, duration of meiosis, chromatin folding have often been attributed to repeated sequences.

Role of interspersed repeats has been sug­gested for repair synthesis, regulation of chromo­some structure in folding during pairing, acting as initiation points in replication, gene expre­ssion through methylation, gene conversion and compression.

Function attributed to palindromic repeats at different levels of protein synthesis includes recognition systems, both at DNA and RNA levels, involving deletion and translocation, cleavage sites, termination of transcription, bind­ing of regulatory proteins and attachment of chromosomes with each other for information transfer.

Intron repeats facilitates alternate splicing or reshuffling of exons and inter-genic conversion, permit dispersion and promote genetic diversity through mobility. Accessory chromosome repeats in plants are associated with adaptation in different environmental set up.

Significance of Repetitive DN / D:

Some of the simple sequence repeats can serve as good markers. Certain tandem repeated sequences may be unique to a particular species. Their distribution and copy number help in differentiating various linkage groups in the chromosome complement.

DNA fingerprinting and molecular hybridization involving repeats have immense potential in documentation and analysis of biodiversity, and tracing the trends in evolution. The sequence, location and frequency of short tandem repeats (STR), which is common in plants’ genome, have role in determining phylogenetic status of species.

Detection of Repeats Tm and Cot Value:

For detection of repetitive DNA, the double stranded DNA is first denatured by heating into single stranded DNA which is accompanied with increase in optical density (hyperchromicity).

The single stranded DNA is then allowed to cool slowly to cause re-association between the com­plementary sequences into double stranded DNA which accompanies decrease in optical density (hypochromicity). Tm is the temperature at which 50% re-association is achieved.

The formation of double stranded DNA is actually measured over different values of a parameter which is described as Cot value (conc. x time). If solution of different DNA concentrations is to be compared, same Cot value can be achieved by altering the time allowed for re-association.

For DNA sample with high proportion of repeti­tive DNA, re-association will be faster and higher degree of re-association achieved at lower Cot values.

Localization of Repeats:

For localization of repetitive DNA, chromosome banding and molecular in situ hybridization (ISH) techniques are being applied.

Differential banding patterns of chromosomes, usually observed at specific regions on particular levels, were initially developed for the analysis of human chromo­some segments.

These bands are made visible through low and high intensity regions under the fluorescence microscope or as differentially stained areas under the light microscope. The methods were then extended first to different ani­mals and later to plant chromosomes.

The protocol for molecular hybridization, that is, denaturation at the cytological level, if followed by renaturation and staining with diffe­rent dyes, particularly Giemsa, gives intensely positive reaction at similar segments of chromo­somes which otherwise show repetitive DNA.

Obviously such treatment is capable of revealing repetitive segments in chromosomes. This ban­ding, following denaturation-renaturation and Giemsa staining, is termed G-banding.

Earlier, Caspersson and his colleagues had recorded differential fluorescence of different chromosome segments following staining with various fluorochromes (quinacrine) and observa­tion under the ultraviolet microscope and had successfully employed it in formulating a band­ing pattern analysis of the human karyotype.

Such bands were referred to as Q-bands. Other fluorochromes produce banding patterns as well, e.g., Hoechst 33258 similar to Q and ethidium bromide the reverse.

These banding patterns are unique for each chromosome like fingerprints. The bands are generally consistent for a taxon except for minor variations. A number of other chemicals can also produce bands either identical with or different from the fluorescent ones, based on different principles.

Such differential banding patterns, usually observed at specific regions on particular chromosomes, are being increasingly used for the identification of chromosomes.

The chromosome band nomenclature, adopted at the Paris Conference in 1971, recog­nized the following types of banding in human chromosomes (Fig. 4.26A):

By quinacrine staining and fluores­cence.

By staining techniques using Giemsa and related stains after appropriate pre- treatment.

R-bands or banding reverse to Q-bands:

By staining with Giemsa after heating to 87°C.

For constitutive heterochromatin, demonstrated by the denaturation-re-association technique.

Produced by enzymic digestion, as classified by Lejeune (1973), show woolen and shrunken regions corresponding to the dark and faint regions of G-banding. The same nomenclature can be applied to banding patterns observed in other eukaryotic chromosomes.

Other banding patterns of chromosomes include:

The centromeric and telomeric segments show bands after treatment in barium hydroxide, incubation and staining in ‘Stains All’ (4, 5, 4′, 5′-dibenzo-3, 3′-diethyl-9-methyl-thi- acarbocyanine bromide).

At nucleolus-organizing regions, possibly due to acidic proteins.

With orcein staining, mainly for plant chromosomes both intercalary and centro­meric heterochromatin show bands. All the above methods of banding bring out clearly the differentiation of chromosome seg­ments which can easily be analysed under the microscope. This technique permits identifica­tion of chromosome segments with specific molecular complexity such as repeat sequence.

The comparison of banding pattern between different genotypes, altered and unaltered, can localize the segments which have undergone alterations. The importance of banding can be judged by the very fact that, R-banding that is the reverse banding has been utilized for mapping of gene sequences in human chromosome.

In Situ Hybridization (ISH: FISH & GISH):

Besides the chromosome banding, for localiza­tion and mapping of different segments of chro­mosomes and gene loci at the microscopic level, application of molecular hybridization in situ is now widely adopted (Fig. 4.26B).

In situ hybri­dization (ISH) principally uses probe sequences, tagged with radioisotopes or fluorescent com­pounds (or a chemical reporter). The initial step is denaturation of the target which is followed by hybridization with probe of the complementary sequences to undergo re-annealing or pairing.

The complementary sequences of the probe bind selectively at the target site. The hybridized sites are localized either through autoradiography or immune-fluorescence as well as counter staining with specific stains detected cytologically. The in situ hybridization technique was developed ini­tially by Pardue and Gall and later modified by different authors.

The fluorescent in situ hybridization (FISH) is the most powerful technique at present, through which the target loci at the chromosome is hybridized with complementary probe sequence, tagged with fluorescent compound. There are two approaches, namely direct or indi­rect, of FISH technique in plant chromosome.

In the indirect method, the probes are tagged with reporter molecule, such as biotin, digoxigenin and finally they are located by fluorochrome conjugated antibodies such as avidin.

The main principle of this method is to make the probe- target sequence as antigenic so that, it can be detected through antibody. The common fluo­rochromes are FITC (fluorescein-isothiocyanate) as well as rhodamine. In the direct method, the probe is directly labelled by fluorochrome- labelled antibodies. The direct labelling of fluorochrome with the probe is the rapid method of ensuring good resolution.

Due to lack of karyomorphological markers, metaphase chromosome analysis cannot distin­guish parental genomes in hybrids. If ISH tech­nique is applied with total genomic probes where the plant has multi-genomic constitution, the parental chromosome can be directly identi­fied in the hybrids, such as Triticum and Secale in Triticale.

Thus method of total genome in situ hybridization is otherwise termed as GISH (genomic in situ hybridization) technique.

Since its first demonstration in identification of parental genomes in hybrid between Hordeum chilense and Secale africanum by Schwarzacher et al., the technique has been extensively applied to elucidate ancestry of hybrids and polyploids. GISH remains a very effective tool in genome identification, their orientation and in establishing genomic relationships between species.

The use of GISH in meiosis helps in understanding inter-genomic homologies as well as in elucidating the possible transfer of chromo­some segments through inter-genomic recombi­nation.

The FISH technique, using different colour combinations by different probes, is now being applied to detect simultaneously different genomes, or chromosome segments by extension of the technique – otherwise termed as multi­-colour FISH. This method has been used to dis­tinguish three genomes in hexaploid wheat and to detect several translocation sites and insertions in polyploid species of Triticum and Aegilops.

The multi-colour FISH technique is now regarded as a powerful tool for gene mapping as well as detection of abnormalities, including insertion and breakage points with chromosome specific or genome specific dispersed probes. The term chromosome painting is used in FISH technique where chromosome specific dispersed probes are used to detect the location of comple­mentary target sequences in the complement.

The FISH technique in recent years has further been modified to locate single copy or tandem sequences, utilizing primer mediated extension and amplification in situ by PGR method. The application of this method lies also in confirma­tion of location of foreign gene at the chromo­some level in transgenic individuals.


Author Affiliations

From the Departments of Neuropediatrics (M.S., C.H.), Pediatric Radiology (T.R.), and Neonatology (W.K.), Charité, University Medical Center Berlin, Berlin the Departments of Neurology (K.R.W.) and Molecular Biology and Genetics (S.-J.L.), Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore the Department of Cardiovascular and Metabolic Diseases, Wyeth Research, Cambridge, Mass. (L.E.S., J.F.T.) and the Institute of Physiological Chemistry, Martin Luther University, Halle-Wittenberg, Germany (T.B.).

Address reprint requests to Dr. Schuelke at the Department of Neuropediatrics, Charité, University Medical Center Berlin, Augustenburger Platz 1, D-13353 Berlin, Germany, or at [email protected] .


Scientists find gene mutation linked to exfoliation syndrome, most common cause of glaucoma

A team of researchers from the Agency for Science, Technology and Research's (A*STAR) Genome Institute of Singapore (GIS) and Bioprocessing Technology Institute (BTI), as well as Singapore Eye Research Institute (SERI), have identified a genetic mutation (functionally defective CYP39A1 gene) associated with exfoliation syndrome, the most common cause of glaucoma. The findings could pave the way for future research on the cause of exfoliation syndrome and potential cures. Their research was published in Journal of the American Medical Association (JAMA) on 24 February 2021.

Exfoliation syndrome is a systemic disorder characterised by abnormal protein material that progressively accumulates in the front of the eye. This disorder is the most common cause of glaucoma, and a major cause of irreversible blindness.

In this study, the scientists sequenced all protein encoding genes of more than 20,000 participants from 14 countries across Asia, Europe, and Africa, including more than 1,200 Singaporeans. They observed that people with exfoliation syndrome are twice as likely to carry damaging mutations in the gene encoding for the CYP39A1 protein, an enzyme which plays an important role in the processing of cholesterol. Further extended analyses suggest that defective CYP39A1 function is strongly associated with increased risk of exfoliation syndrome.

Although exfoliation syndrome is the most common cause of glaucoma, its origin is shrouded in mystery because it is not known where the abnormal protein deposits (exfoliative material) originate, and how the disease comes about. Answers to these questions could provide approaches to design and develop an effective treatment. The current findings point to the important role of cholesterol processing in the exfoliation syndrome disease process. As cholesterol is found abundantly in all cells, disruption to how cholesterol is processed due to defective CYP39A1 activity could adversely impact their normal functions. In particular, this study discovered that epithelial cells in the front of the eye responsible for filtering the blood supply to produce the clear fluid known as aqueous humour that bathes and nourishes other cells in the eye, were most affected by the CYP39A1 gene mutation. Disruption to the gene function can compromise the filtering function of epithelial cells and lead to leakage of exfoliative material from the blood into the eye.

Prof Patrick Tan, Executive Director of GIS, said, "This is a ground-breaking study that could facilitate future research efforts aimed at restoring defective CYP39A1 function and inhibiting the formation of exfoliation material in the eye as treatments for exfoliation syndrome and glaucoma."

Prof Aung Tin, Director of SERI and Deputy Medical Director of SNEC, said, "This is a major eye disease, affecting over 70 million people worldwide, which causes a lot of visual morbidity and blindness, not only from glaucoma but also due to complications related to cataract surgery. This study was notable for involving many centres from many different countries around the world, but led from Singapore. The study findings are very exciting as we found a new pathway for the disease which opens up possibilities for new treatments."

Prof David Friedman, the Albert and Diane Kaneb Chair in Ophthalmology at Harvard University and Director of the Glaucoma Service at the Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Boston, commented, "Very exciting work. The researchers have identified rare gene variants that results in disrupted cholesterol homeostasis and transport that will open the door to novel therapeutics. Having studied over 20,000 individuals, the study demonstrates the power of studying rare variants to detect disease-causing genes in complex conditions." Prof Friedman was not involved in the study.


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