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11.11: Oligodeoxinucleotídeos antisense e seu potencial terapêutico - Biologia


Os oligonucleotídeos anti-sentido são polímeros sintéticos. Os monômeros são quimicamente modificados desoxinucleotídeos como aqueles no DNA ou ribonucleotídeos como aqueles no RNA. Normalmente existem apenas 15-20 deles, portanto, "oligo". Sua sequência (3 ′ → 5 ′) é anti-sentido; isto é, complementar à sequência de sentido de uma molécula de mRNA.

Os oligonucleotídeos anti-sentido são sintetizados na esperança de que possam ser usados ​​como agentes terapêuticos - bloqueando processos de doenças ao alterar a síntese de uma proteína específica. Isto seria conseguido pela ligação do oligonucleotídeo antisense ao mRNA a partir do qual essa proteína é normalmente sintetizada. Vinculação dos dois pode

  • bloquear fisicamente a capacidade dos ribossomos de se moverem ao longo do RNA mensageiro, impedindo a síntese da proteína;
  • acelerar a taxa na qual o mRNA é degradado dentro do citosol;
  • evitar erros de splicing que, de outra forma, produziriam uma proteína defeituosa.

Para serem úteis na terapia humana, os oligonucleotídeos antisense devem ser capazes de entrar nas células alvo; evitar a digestão por nucleases; e não causar efeitos colaterais perigosos. Para atingir esses objetivos, os oligonucleotídeos antisense são geralmente modificados quimicamente para resistir à digestão por nucleases e ligados a um dispositivo de direcionamento, como o ligante para o tipo de receptores encontrados nas células-alvo desejadas ou anticorpos direcionados contra moléculas na superfície das células-alvo desejadas.

Usos de oligonucleotídeos anti-sentido

Uma variedade de oligonucleotídeos antisense estão sendo testados como possíveis armas contra:

  • Vírus da hepatite C (HCV). A infecção bem-sucedida do fígado por esse vírus requer que o fígado produza um microRNA específico (miRNA-122). As injeções de humanos infectados com HCV com um ODN ("miravirsen") complementar ao miRNA-122 suprime o vírus.
  • HIV-1, a causa mais frequente de AUXILIA nos Estados Unidos
  • Vírus Ebola, a causa da febre hemorrágica Ebola, muitas vezes fatal
  • citomegalovírus humano (HCMV); que freqüentemente causa complicações sérias em pacientes com AIDS
  • asma; a inalação de um oligonucleotídeo antisense direcionado ao mRNA de GATA3 (um fator de transcrição que promove respostas Th2) fornece alívio para pacientes com asma alérgica.
  • certo cânceres, por exemplo, leucemia mielóide crônica (CML)
  • certos tipos de inflamação causado por reações imunes mediadas por células
  • Distrofia muscular de Duchenne (DMD)
  • hipercolesterolemia familiar - direciona o mRNA para a apolipoproteína B-100. Em 31 de janeiro de 2013, o antisense ODN mipomersen (Kynamro®) recebeu aprovação regulatória para uso em humanos com hipercolesterolemia familiar.

Terapia anti-gene e anti-sentido (com diagrama)

Em geral, a terapia gênica é realizada pela introdução de um gene terapêutico para produzir a proteína defeituosa ou ausente. Mas existem certos distúrbios (câncer, infecções virais e parasitárias e doenças inflamatórias) que resultam em uma superprodução de certas proteínas normais. É possível tratar essas doenças bloqueando a transcrição usando uma sequência de nucleotídeos de fita simples (oligonucleotídeo anti-gene) que hibridiza com o gene específico, e isso é chamado de terapia anti-gene.

A terapia antisense refere-se à inibição da tradução usando um nucleotídeo de fita simples (oligonucleotídeo antisense). Além disso, também é possível inibir a transcrição e a tradução bloqueando (com oligonucleotídeos) o fator de transcrição responsável pela expressão do gene específico.

Terapia de ácido nucleico refere-se ao uso de moléculas de DNA ou RNA para fins terapêuticos, como indicado acima. As sequências de DNA e RNA de ocorrência natural (com modificações adequadas) ou as sintéticas podem ser empregadas na terapia de ácido nucleico. Teoricamente, existe um grande potencial para o uso de ácidos nucléicos como agentes terapêuticos. Mas a maior parte do trabalho que está sendo realizado está relacionado ao uso de RNA na terapia antisense.

Alguns deles são descritos abaixo:

Terapia anti-sentido para o câncer:

Oncogenes são os genes responsáveis ​​pela causa do câncer. Os oncogenes de ação dominante podem ser direcionados na tecnologia antisense usando transgenes ou oligonucleotídeos antisense. Os oligonucleotídeos anti-sentido são usados ​​para o tratamento de leucemia mieloide já em 1991.

As moléculas de RNA anti-sentido são mais frequentemente usadas na terapia do câncer. Esta abordagem é eficaz apenas se o oligonucleotídeo antisense (mRNA antisense) se liga especificamente ao mRNA alvo e bloqueia a biossíntese de proteínas (tradução). Isso pode ser alcançado de duas maneiras, conforme ilustrado na Fig. 13.9.

O cDNA antisense pode ser clonado e transfectado em células. O mRNA anti-sentido é sintetizado por transcrição. Isso pode se ligar prontamente ao mRNA específico e bloquear a tradução (Fig. 13.9A). O mRNA é, na verdade, formado por um gene contendo exons e íntrons por meio da transcrição, seguida de processamento. A outra maneira de bloquear a tradução é introduzir diretamente o RNA antisense nas células. Isto hibridiza com o mRNA alvo e bloqueia a tradução (Fig. 13.9B).

A terapia antisense de mRNA foi tentada para o tratamento de um tumor cerebral, nomeadamente glioma maligno e câncer de próstata. No caso do glioma maligno, a proteína do fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I) é superproduzida, enquanto no câncer de próstata, a proteína do receptor do fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-IR) é mais sintetizada. Para ambos os tipos de câncer, o. os respectivos cDNAs antisense podem ser usados ​​para sintetizar moléculas de mRNA antisense. Estes, por sua vez, são usados ​​para bloquear a translação, conforme descrito brevemente acima e ilustrado na Fig. 13.9.

Terapia anti-sentido para aids:

Também estão sendo feitas tentativas para prevenir a infecção pelo HIV por meio da terapia antisense. O princípio básico é descrito resumidamente (Fig. 13.10).

As células-alvo da infecção pelo HIV são geneticamente modificadas para conter um gene que pode expressar uma cópia complementar do genoma do HIV. Este gene produz RNA antisense. Quando as células contendo RNA antisense são infectadas pelo HIV, ele se liga ao RNA viral formando moléculas híbridas de RNA-RNA de fita dupla. Esta molécula de fita dupla não pode ser usada pela enzima transcriptase reversa. Consequentemente, uma cópia do DNA do genoma do HIV não pode ser feita e incorporada ao genoma.

Oligonucleotídeos anti-sentido como agentes terapêuticos:

Verificou-se que os oligodesoxinucleotídeos (com cerca de 15-20 unidades) podem hibridizar com mRNA específico e bloquear a tradução com um efeito final de redução da proteína específica. Os oligonucleotídeos podem hibridizar com diferentes tipos de transcritos de RNA-mRNAs, íntrons-exons, RNAs de fita dupla. A principal limitação do uso de oligonucleotídeos de ocorrência natural é que eles são degradados por nucleases intracelulares.

Certas modificações nos nucleotídeos (bases ou açúcares, fosfato) sem afetar sua capacidade de hibridização foram preparadas. No entanto, esses oligonucleotídeos modificados são resistentes à degradação por nucleases. O oligonucleotídeo antisense mais amplamente usado tem um grupo de enxofre no lugar do oxigênio livre na ligação fosfodiéster. A ligação modificada é referida como ligação fosforotioato.

Esses oligonucleotídeos antisense fosforotioato são resistentes à degradação por nucleases, além de serem solúveis em água. Algumas outras modificações de oligo e shinucleotídeos são com ligação fosforamidita e 2-0-metil ribose (Fig. 13.11). Os oligonucleotídeos antisense modificados são de fato usados ​​como agentes terapêuticos nos ensaios clínicos para o tratamento de certos cânceres, doenças intestinais, AIDS, malária e infecções virais.

Os oligonucleotídeos livres não entram prontamente nas células. Portanto, eles são encapsulados em lipossomas para entrega eficiente para inibir a tradução do mRNA.

Possível inibição da proliferação de células musculares lisas:

A proliferação de células musculares lisas (junto com a secreção de matriz extracelular) tem sido implicada na hipertensão, falha dos enxertos de ponte de safena, hipertensão e aterosclerose. Existe a possibilidade de controlar a proliferação de células musculares lisas usando terapia antisense.

Oligonucleotídeos quiméricos na correção de genes:

Muitas doenças genéticas são devidas a mutações de um único par de bases. Uma estratégia foi concebida para corrigir tais defeitos usando oligonucleotídeos quiméricos compostos de oligonucleotídeo RNA-DNA com 68 unidades. Este oligonucleotídeo quimérico tem tampas em gancho e açúcares ribose metilados (no segundo carbono). As tampas em grampo protegem a molécula da degradação por exonucleases, enquanto a ribose metilada impede a digestão pela RNase.

A correção de uma mutação de par de bases único usando um oligonucleotídeo quimérico é ilustrada na Fig. 13.12. As moléculas de RNA-DNA (oligonucleotídeos quiméricos) se ligam mais facilmente ao DNA duplex e trazem a correção no par de bases mutado.

Aptâmeros como agentes terapêuticos:

Um tipo especial de oligonucleotídeos que podem se ligar especificamente a proteínas alvo e não a ácidos nucleicos é referido como aptâmeros. Os aptâmeros são úteis como agentes terapêuticos. Por exemplo, um aptâmero que pode se ligar à trombina inibe a coagulação do sangue. Esses oligonucleotídeos podem ser usados ​​em procedimentos cirúrgicos.

Ribozimas como agentes terapêuticos:

As moléculas de RNA que podem servir como enzimas (biocatalisadores) são chamadas de ribozimas. As ribozimas de ocorrência natural devem ser modificadas de modo que possam hibridizar especificamente com sequências de mRNA e bloquear a biossíntese de proteínas (tradução).

Há uma limitação, entretanto, em inserir ribozimas diretamente nas células-alvo, pois elas são facilmente degradadas. Isso pode ser superado ligando a ribozima a um oligodesoxinucleotídeo. Existe a possibilidade de tratar certos cânceres e doenças virais por ribozimas geneticamente modificadas.


Estratégias para identificar potenciais locais-alvo terapêuticos no RNA

Os agentes antisense são ferramentas poderosas para inibir a expressão do gene de uma maneira específica para a sequência. Eles são usados ​​para genômica funcional, como ferramentas de diagnóstico e para fins terapêuticos. Três classes de agentes antisense podem ser distinguidas por seu modo de ação: oligodesoxinucleotídeos antisense de fita simples catalítico de RNA / DNA ativo, como ribozimas, zimas de DNA ou ácido nucleico bloqueado (LNA) e pequenas moléculas de RNA interferentes conhecidas como siRNA. A seleção de locais-alvo em moléculas de RNA altamente estruturadas é crucial para sua aplicação bem-sucedida. Esta é uma tarefa difícil, uma vez que o RNA é montado em complexos de nucleoproteínas e forma estruturas secundárias estáveis ​​in vivo, tornando a maior parte da molécula inacessível ao par de bases intermoleculares com ácidos nucleicos complementares. Nesta revisão, discutimos várias estratégias de seleção para identificar potenciais locais-alvo em moléculas de RNA. Em particular, nos concentramos em abordagens de biblioteca combinatória que permitem a triagem de alto rendimento de sequências para o projeto de agentes antisense.


Mecanismo de ação anti-sentido

Os oligonucleotídeos antisense são projetados para se ligarem ao RNA por meio da hibridização Watson-Crick. Em geral, seu tamanho varia de 12 a 25 nucleotídeos de comprimento, com a maioria dos oligonucleotídeos antisense tendo 18-21 nucleotídeos de comprimento. Existem vários mecanismos que podem ser explorados para inibir a função do RNA, uma vez que o oligonucleotídeo se liga ao RNA alvo (Crooke, 1999). O mecanismo antisense mais bem caracterizado resulta na clivagem do RNA alvo por nucleases celulares endógenas, como RNase H ou a nuclease associada ao mecanismo de interferência de RNA. No entanto, os oligonucleotídeos que inibem a expressão do gene alvo por mecanismos não catalíticos, como a modulação de splicing ou interrupção da tradução, também podem ser moduladores potentes e seletivos da função do gene.

RNase H é uma família de enzimas expressas de forma ubíqua que clivam a fita de RNA de um heteroduplex de RNA-DNA, com pelo menos duas formas encontradas em células de mamíferos (Lima et al., 2001). Os oligonucleotídeos antisense que inibem a expressão gênica por um mecanismo de ação dependente de RNase H (Figura 1) contêm um segmento contínuo de pelo menos cinco a sete nucleotídeos semelhantes a DNA para suportar a atividade de RNase H (Monia et al., 1993 Wu et al., 1999). A maioria dos medicamentos antisense atualmente em ensaios clínicos utiliza o mecanismo RNase H (Tabela 1). Assim, os oligonucleotídeos que atuam por meio de um mecanismo de ação da RNase H são bem caracterizados em termos de sua farmacologia, farmacocinética e toxicidade.

Mecanismo anti-sentido dependente de RNase H. Os oligonucleotídeos de fita simples são transportados através da membrana plasmática, por processos naturais mal caracterizados ou pelo uso de facilitadores, como lipídeos catiônicos (etapa 1). Uma vez no citoplasma, os oligonucleotídeos de fita simples se acumulam rapidamente no núcleo da célula (etapas 2 e 3), onde se ligam ao RNA alvo (etapa 4). Uma vez ligado ao RNA, RNase H reconhece o oligonucleotídeo / duplex de RNA como um substrato, clivando a fita de RNA e liberando o oligonucleotídeo antisense (etapa 5). Embora seja demonstrado que a clivagem do RNA por RNase H ocorre no núcleo, a RNase H também está presente no citosol, permitindo que a clivagem ocorra também nesse compartimento celular.

Outro mecanismo antisense dependente de RNase que recentemente recebeu muita atenção é o RNA de interferência ou RNAi (Fire et al., 1998 Zamore, 2002). A introdução de RNA de fita dupla longa (dsRNA) em células eucarióticas leva à degradação específica da sequência de transcritos de genes homólogos (RNAi). As moléculas de RNA maiores são metabolizadas em fragmentos de RNA de fita dupla mais curtos de 20-21 nucleotídeos (siRNA) por uma nuclease endógena. As moléculas de siRNA, por sua vez, se ligam a um complexo de proteínas, denominado complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), que desenrola as duas fitas das moléculas de RNA, permitindo que a fita antisense se ligue à molécula de RNA alvo (Zamore et al., 2000 Zamore , 2002). O RISC também contém uma atividade de endonuclease, que hidrolisa o RNA alvo no local onde a fita antisense está ligada. Recentemente, foi demonstrado que os duplexes de siRNA de 21 nucleotídeos podem ser transfectados diretamente em células de mamíferos, resultando na degradação seletiva do RNA alvo (Figura 2) (Caplen et al., 2001 Elbashir et al., 2001). A interferência de RNA é um mecanismo de ação antisense, pois, em última análise, uma molécula de RNA de fita simples se liga à molécula de RNA alvo pelas regras de pareamento de bases de Watson-Crick e recruta uma ribonuclease que degrada o RNA alvo. O RNAi, em particular o siRNA, ganhou ampla aceitação como metodologia para a funcionalização de genes em células de cultura de mamíferos.

mecanismo antisense dependente de siRNA. Os oligonucleotídeos de RNA de fita dupla são transportados através da membrana plasmática, por processos naturais mal caracterizados ou pelo uso de facilitadores, como lipídeos catiônicos (etapa 1). Uma vez no citoplasma, o oligonucleotídeo de RNA de fita dupla é reconhecido e ligado por um complexo de proteína mal definido denominado RISC (etapa 2). A atividade helicase desenrola as duas fitas de RNA (etapa 3) e facilita a ligação da fita antisense ao RNA alvo (etapa 4). Uma vez ligado ao RNA alvo, uma ribonuclease cliva o RNA alvo (etapa 5). Não se sabe se a ribonuclease também hidrolisa a fita anti-sentido

Existem outras RNases presentes nas células que podem ser exploradas de maneira semelhante à RNase H ou à dsRNase associada ao RNAi. Como exemplo, Wu et al. (1998) relataram que os oligoribonucleotídeos modificados com fosforotioato de fita simples podem promover a perda seletiva de mRNA de Ha-ras em células humanas. A atividade da enzima é consistente com uma enzima do tipo RNase III e pode ser semelhante, senão idêntica, à RNase III associada ao RISC (Wu et al., 1998 Martinez et al., 2002). RNase L é outra enzima RNase que tem sido explorada para aplicações antisense (Torrence et al., 1993). RNase L é uma ribonuclease ativada por oligoadenilatos ligados a 2′-5′ gerados em resposta à ativação de interferon. Foi relatado que a ligação do oligoadenilato 2'-5 'a um oligonucleotídeo antisense promove a clivagem seletiva do mRNA direcionado (Torrence et al., 1993 Leaman et al., 2002).

Além de explorar nucleases celulares para clivar o RNA alvo, os oligonucleotídeos podem ser projetados para clivar quimicamente o RNA alvo após a hibridização. O exemplo mais bem caracterizado de tais oligonucleotídeos são ribozimas e DNAzimas (Breaker e Joyce, 1994 Cech e Uhlenbeck, 1994). Atualmente, uma ribozima que visa VEGF está em ensaios clínicos de fase I / II (Weng e Usman, 2001).

Mecanismos anti-sentido que não promovem diretamente a degradação do RNA também foram descritos. A ocupação do RNA (o receptor para o oligonucleotídeo antisense) pelo oligonucleotídeo pode bloquear estericamente a tradução do RNA, ou seja, a interrupção da tradução. Descobrimos que apenas certos locais na região 5 'não traduzida de um mRNA são locais-alvo eficazes para um oligonucleotídeo antisense que funcionam através deste mecanismo. Em particular, o terminal 5 'de um transcrito parece ser um bom local alvo para oligonucleotídeos para alguns alvos moleculares em que a ocupação desta região impede a montagem do ribossomo no RNA (Baker et al., 1997).

A maioria dos RNAs de mamíferos passa por várias etapas de processamento pós ou co-transcricional no núcleo da célula, incluindo a adição de uma estrutura de capa 5 ', splicing e poliadenilação. A regulação do processamento de RNA é outro mecanismo eficiente no qual os oligonucleotídeos podem ser utilizados para regular a expressão gênica. Foram publicados estudos que documentam que os oligonucleotídeos antisense podem ser usados ​​para regular o splicing de RNA em ensaios baseados em células e em tecidos de roedores (Dominski e Kole, 1993 Taylor et al., 1999b Sazani et al., 2001 Mercatante et al., 2002 Sazani et al., 2002). Um número crescente de transcritos com splicing alternativo é reconhecido por codificar proteínas funcionalmente antagonistas e, portanto, isso representa uma abordagem viável para "mudar" reversivelmente a função da proteína. Um exemplo bem documentado é o gene regulador da apoptose Bcl-x. A variante de splice mais comumente expressa (Bcl-xL) é conhecida por ser antiapoptótica, no entanto, uma variante do gene sem uma porção do exon II é pró-apoptótica (Bcl-xS).Ao projetar oligonucleotídeos para regiões ao redor do local de splice apropriado, conseguimos trocar a variante de splice produzida, de Bcl-xL para Bcl-xS e, como consequência, sensibilizamos as células para agentes quimioterápicos (Taylor et al., 1999b Mercatante et al., 2002). A ligação do oligonucleotídeo ao pré-mRNA também pode ser explorada para mascarar os sinais de poliadenilação no pré-mRNA, forçando a célula a utilizar sítios poli A alternativos (Vickers et al., 2001).

Comparamos diretamente muitos dos mecanismos antisense descritos acima em ensaios baseados em células e descobrimos que, uma vez otimizados, os oligonucleotídeos que funcionam por cada mecanismo podem ser inibidores potentes e seletivos da expressão gênica. Como exemplo na comparação de oligonucleotídeos dependentes de RNase H com oligonucleotídeos de siRNA, descobrimos que eles exibiram potência, duração de ação, seletividade e eficiência de alvo semelhantes (Vickers et al., 2003). Também descobrimos que os oligonucleotídeos que modulam o splicing de RNA por mecanismos estéricos e oligonucleotídeos que impedem a tradução podem ser inibidores tão potentes e eficazes da expressão gênica quanto os oligonucleotídeos que funcionam por mecanismos catalíticos (Baker et al., 1997). Estes resultados sugerem que a renovação catalítica do RNA alvo não é a etapa limitante da taxa para os oligonucleotídeos antisense. Nossos resultados sugerem que, para experimentos baseados em células, nenhum mecanismo único é muito superior a outros mecanismos, portanto, deve-se adaptar o mecanismo para a aplicação biológica específica. Para na Vivo aplicações, o mecanismo dependente de RNase H tem sido amplamente explorado para inibir centenas, senão milhares de genes em tecidos de roedores, primatas não humanos e humanos. Como há muito menos informações disponíveis sobre a eficácia com que os outros mecanismos antisense funcionam na Vivo, é prematuro tirar quaisquer conclusões sobre seu potencial de longo prazo para na Vivo estudos.


Resumo

O alto nível de expressão de receptores para lipoproteína de baixa densidade (LDL) nas células tumorais torna o LDL um carreador atraente para a entrega seletiva de drogas a essas células. O objetivo deste estudo é permitir a incorporação de oligodeoxinucleotídeos antisense dirigidos por oncogene (ODNs) na porção lipídica da LDL. Portanto, os ODNs foram conjugados com ácido oleico, colesterol e vários outros lipídeos esteróides. Estes últimos lípidos esteróides foram sintetizados a partir de ácidos biliares e foram variados em lipofilicidade ligando estruturas de éster de ácido oleico. As estruturas lipídicas, ativadas como ésteres pentafluorofenílicos, foram conjugadas em fase de solução a ODNs de cauda 3'-amino. Os ODNs conjugados com ácido litocólico, ácido oleico e colesterol podem ser facilmente purificados por fase reversa (RP) -HPLC. No entanto, os ODNs conjugados com as estruturas de éster de oleoílo-esteróide se ligam irreversivelmente ao material da coluna. Estes ODNs altamente lipídicos foram separados do ODN não conjugado por eletroforese em um gel de agarose de baixo ponto de fusão a 1% contendo 0,1% de Tween 20. Este método foi considerado muito eficaz no isolamento dos ODNs conjugados com as estruturas de éster de oleoílo esteróide. Os ODNs conjugados com colesterol e os ésteres de oleoílo de ácido litocólico e colênico associaram-se prontamente e quase completamente com LDL. No entanto, os ODNs menos lipídicos e o ODN conjugado com o éster dioleoil do ácido quenodeoxicólico não se associaram e se associaram de forma incompleta, respectivamente. O ácido litocólico e o ácido oleico provavelmente não são suficientemente lipofílicos para induzir associação com o LDL, enquanto a estrutura do éster dioleoil é provavelmente muito volumosa e estendida para permitir a partição na porção lipídica do LDL. Concluímos que vários dos ODNs lipídicos podem se associar prontamente ao LDL, permitindo a entrega de ODNs antisense direcionados ao oncogene por meio da via do receptor de LDL.

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Receptores Sigma: biologia e potencial terapêutico

Mais de 20 anos após a identificação dos receptores sigma como um único local de ligação no cérebro e nos órgãos periféricos, várias questões em relação a esse receptor ainda estão em aberto. Apenas um dos subtipos do receptor foi clonado até o momento, mas o ligante endógeno ainda permanece desconhecido, e a possível associação do receptor com um sistema convencional de segundo mensageiro é controversa. Desde o início, os receptores sigma foram associados a vários distúrbios do sistema nervoso central, como esquizofrenia ou distúrbios do movimento. Hoje, depois de centenas de artigos lidando com a importância dos receptores sigma na função cerebral, é amplamente aceito que os receptores sigma representam um caminho novo e diferente no possível tratamento farmacológico de vários distúrbios relacionados ao cérebro. Nesta revisão, o que se sabe sobre a biologia do receptor sigma em relação à sua estrutura putativa e sua distribuição no sistema nervoso central é resumido primeiro. O papel dos receptores sigma que regulam as funções celulares e outros sistemas de neurotransmissores também é abordado, bem como uma breve visão geral dos possíveis ligantes endógenos. Finalmente, embora nenhum ligante de sigma específico tenha chegado ao mercado, são discutidas diferentes abordagens farmacológicas para o alívio e tratamento de vários distúrbios e déficits do sistema nervoso central, incluindo esquizofrenia, dor, déficits de memória, etc., com uma visão geral de diferentes compostos e seu uso terapêutico potencial.

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Senso, antisense e senso comum

O dogma central da biologia molecular estipula que as moléculas de DNA são o depósito genético que contém todo o repertório para construir as células e os tecidos de um organismo. Em eucariotos superiores, uma grande parte de todo o material genômico, talvez bem mais de 90%, não codifica nenhum precursor. As regiões de DNA que codificam proteínas, também chamadas de genes, ficam em meio a essa extensão de porção não funcional do genoma. As proteínas, moléculas de trabalho de uma célula que realizam os programas estruturais, regulatórios e outros de atividades codificadas por genes, são sintetizadas por meio de um processo molecular complexo de 2 etapas. A informação genética armazenada no DNA é primeiro copiada em moléculas de RNA mensageiro (mRNA) em um processo chamado transcrição. As moléculas de mRNA são então traduzidas em proteínas pela maquinaria ribossomal por meio de uma montagem incrivelmente precisa e em etapas de peptídeos e proteínas. Por meio desse processo, a sequência de ácido nucleico do mRNA é traduzida para a linguagem das moléculas de aminoácidos.

O DNA consiste em duas fitas polinucleotídicas de pares de bases antiparalelas e complementares que se enrolam juntas no espaço para formar uma dupla hélice. No processo de transcrição, uma das fitas de DNA (a fita modelo) é copiada em uma molécula complementar (mRNA), cuja sequência de bases é organizada em tripleto (grupo de 3 nucleotídeos), ou códon. Cada códon é então lido e traduzido em um aminoácido específico, que é incorporado ao polipeptídeo de alongamento. Como a sequência de bases ao longo do mRNA determina a série de aminoácidos que se enroscarão para formar uma proteína, diz-se que a sequência de mRNA faz sentido. Para produzir uma molécula que reconhece e se liga à fita sense, uma cadeia de nucleotídeos que são complementares à sequência sense deve ser construída. Daí o nome anti-sentido é dado a uma fita curta de DNA ou molécula de RNA que é complementar a uma sequência específica de mRNA.

A ideia de usar oligodeoxinucleotídeos antisense (ODNs) foi proposta em 1967 para inibir especificamente a expressão do gene através da formação de um duplex mRNA-DNA suprimindo ou impedindo a tradução da mensagem direcionada em proteína (1). Na época, nenhum método automatizado estava disponível para produzir oligômeros de mais de 4 bases e em quantidades suficientes. Nos últimos 20 anos, o progresso na química de nucleotídeos, a automação de sínteses e o desenvolvimento de uma estrutura de DNA resistente a nuclease tornaram as moléculas antisense de DNA (e RNA) prontamente disponíveis. Moléculas antisense têm sido usadas para regular, derrubar ou expressar genes em cultura (2) para manipular plantas (3) e para projetar agentes quimioterápicos contra vírus (4,5).

Com a identificação dos genes responsáveis ​​pelo crescimento, desenvolvimento e transformação maligna das células (oncogenes e genes supressores de tumor) surgiu o desejo de traduzir essas informações em novas estratégias para o tratamento do câncer, doenças cardiovasculares e outras enfermidades comuns. O conceito de “silenciar” a expressão de oncogene em doenças malignas está agora sendo testado em vários ensaios clínicos. Oligonucleotídeos antisense direcionados a Ha-ras, c-raf, bcl-2, c-myb, bcr-abl, e erbOncogenes -B2 estão sendo testados em vários tipos de câncer (6). A modulação da hiperplasia do músculo liso da íntima após angioplastia da artéria coronária e aloenxerto cardíaco também está sendo testada in vivo com ODNs (7,8). Pacientes com doença de Crohn experimentaram remissão bem-sucedida com um ODN de fosforotioato que inibe a molécula de adesão endotelial humana ICAM-1 (9). A aplicação potencial mais importante do antisense em doenças virais é a infecção pelo HIV. Um estudo recente de fase I em pacientes infectados pelo HIV usando um ODN direcionado ao local gag do gene do HIV mostrou efeitos colaterais mínimos (10). ODNs anti-sentido também estão sendo direcionados contra a retinite por citomegalovírus, uma doença gravemente incapacitante observada em pacientes com AIDS (11).

Moléculas de DNA anti-sentido também foram propostas por alguns pesquisadores como uma ferramenta para a imagem de tumores que expressam vários oncogenes (12,13). Os requisitos para o uso de moléculas antisense na terapia do câncer são bem definidos (14) e têm servido como critérios para seu uso em exames de imagem (15). Em contraste com as aplicações terapêuticas, nas quais uma única molécula antisense pode eventualmente derrubar a expressão de um oncogene, as técnicas de imagem requerem uma alta concentração de moléculas antisense dentro das células alvo. Para obter imagens antisense bem-sucedidas, as células-alvo devem ter uma quantidade suficiente de produto oncogene mRNA e devem reter de forma específica e seletiva as sondas antisense de DNA. Vários métodos para rotular moléculas antisense com fótons únicos e emissores de pósitrons foram publicados (16,17).

Em um estudo de ponta relatado nesta edição da The Journal of Nuclear Medicine, Zhang et al. (18) investigaram o efeito do grupo mercaptoacetiltriglicina / ligante na hibridização de um antisense de DNA de fosforotioato 18mer para a molécula reguladora de crescimento intracelular subunidade Iα (RIα) da proteína quinase A dependente de monofosfato de adenosina cíclica, tipo I. Eles também tentaram mostram um efeito antisense em várias linhas celulares que expressam diferentes níveis de RIα.

Vários fatores desempenham um papel crítico no projeto de moléculas antisense para geração de imagens. O primeiro fator é a especificidade da molécula de DNA antisense para seu mRNA alvo. Com a suposição de que uma célula eucariótica contém cerca de 10 4 espécies diferentes de mRNA de comprimento médio de 2 kb, a complexidade da sequência de RNA total é de cerca de 2 × 10 7 bases. O número esperado de ocorrências para uma dada sequência de bases N dentro do pool de RNA é dado dividindo a complexidade do pool por 4 N. Portanto, a menor sequência provável de ser única entre um pool de RNA de 2 × 10 7 é de 13 bases (19).

O segundo parâmetro é a otimização da formação do duplex entre a molécula antisense e seu mRNA alvo, variando a sequência da sonda de DNA. Para inibir a expressão do gene, muitos investigadores optaram por alvejar o local de início da tradução de um mRNA na suposição de que esta região é importante e acessível. Embora a inibição eficiente da tradução geralmente ocorra com sequências de oligonucleotídeos de DNA complementares a esta região, a maioria das regiões de uma molécula de mRNA são de fato acessíveis aos ODNs, exceto aqueles com muitas estruturas duplex antiparalelas, chamadas grampos de cabelo. As etapas nas quais as moléculas antisense demonstraram inibir o mRNA também incluem capeamento 5 ', splicing e estabilidade do mRNA. A extensão geral do emparelhamento de bases é refletida nas propriedades biofísicas de cada molécula de RNA e pode, eventualmente, ser prevista por regras que governam a interação de pares de bases. Algoritmos termodinâmicos estão agora disponíveis para prever a estrutura secundária de um determinado RNA e podem ser usados, até certo ponto, para selecionar locais-alvo ideais no mRNA a ser visualizado (20).

Terceiro, para ser usada como um agente de imagiologia in vivo, uma sequência ODN deve ser capaz de reconhecer e ligar-se fortemente à sua sequência complementar no ácido nucleico alvo a 37 ° C. Isso significa, por um lado, que a temperatura necessária para a dissociação do híbrido (ou seja, a temperatura de fusão do híbrido [Tm]) deve ser bem acima de 37 ° C e, por outro lado, que a 37 ° C a constante de dissociação do complexo deve ser baixo. Como a Tm do híbrido é altamente dependente da natureza das bases envolvidas no emparelhamento da ligação, é essencial que o local alvo e, conseqüentemente, a sequência ODN sejam selecionados em relação à Tm (21).

Os ODNs contendo ligações fosfodiéster são rapidamente degradados no soro pelas enzimas exo e endonuclease, com meia-vida de aproximadamente 20 minutos. Na última década, os maiores sucessos no desenvolvimento de ODNs resistentes à nuclease foram alcançados substituindo um átomo de enxofre por um átomo de oxigênio - um não envolvido na ponte açúcar-açúcar - do grupo fosfato (fosforotioato ODN). Essa substituição aumenta a estabilidade das nucleases, retém a solubilidade em água e melhora a captação celular (22,23). Várias estratégias estão sendo desenvolvidas para produzir análogos de ODN com melhor biodisponibilidade e melhores propriedades metabólicas, terapêuticas e de imagem por meio da modificação da estrutura das ligações internucleotídicas, bases e açúcares (24,25).

Zhang et al. (18) deve ser elogiado por usar as técnicas de biologia molecular mais avançadas, como espectrofotometria, ressonância de plasmon de superfície, reação de polimerase de transcriptase reversa e microautoradiografia para comparar a hibridização, temperaturas de fusão e acúmulo celular de sentido marcado e não marcado, antisense e sequências ODN codificadas. A ausência de mudanças significativas na hibridização da sequência ODN marcada versus não marcada, a retenção específica das fitas antisense e a diminuição no conteúdo de mRNA direcionado sugerem que as moléculas antisense marcadas com rádio podem ser usadas com sucesso para imagiologia e, eventualmente, para terapia. Os ODNs anti-sentido interferem na expressão do gene por vários mecanismos. Dímeros de RNA-DNA formados dentro da célula atraem imediatamente a nuclease endógena RNase-H, que catalisa a clivagem das espécies de RNA do duplex, deixando a sequência de DNA intacta e capaz de interagir com a mesma sequência em outras moléculas de mRNA. Este mecanismo provavelmente resulta na diminuição do crescimento e proliferação celular observada in vitro e em ensaios pré-clínicos e clínicos. A observação, neste estudo, de que a síntese do mRNA direcionado é aumentada sugere um mecanismo de feedback negativo entre a quantidade de mRNA na célula e a síntese de mRNA. Este é um novo conceito interessante e intrigante.

Os ácidos nucléicos nus têm uma forte carga negativa, que pode impedir sua passagem pela camada bilipídica da membrana celular. No entanto, a captação celular de ODNs parece ser um fenômeno natural e um mecanismo semelhante a um receptor provavelmente está envolvido. Modificações químicas para tornar ODNs mais neutros eletricamente, sua associação com transportadores, como vesículas lipídicas, lipossomas e vetor de adenovírus, e a preparação de nanopartículas antisense (26-29) parecem melhorar significativamente a absorção celular de ODNs.

Como a entrega específica de repórteres de genes às células-alvo, a entrega de antisense às células-alvo precisará ser refinada em maiores detalhes (30). Esse fator também pode interferir potencialmente na hibridização e exigirá mais estudos. A metodologia de Zhang et al. (18) pode servir de modelo para validação dessas novas sondas ODN.

Um novo caminho para explorar a requintada especificidade dos pares de bases de ácido nucléico de Watson-Crick está sendo desenvolvido na medicina nuclear. A tecnologia de DNA anti-sentido, embora ainda esteja em sua infância para terapia, agora está sendo ativamente conceituada e investigada para imagens. Acredito que essa abordagem inovadora amadurecerá rapidamente e resultará em uma nova classe de agentes radiofarmacêuticos exclusivos que podem caracterizar o fenótipo e o genótipo de células e órgãos.


Uma revisão das intervenções terapêuticas anti-sentido para alvos biológicos moleculares em várias doenças

O princípio das tecnologias antisense é baseado na inibição específica de indesejáveis expressão genetica bloqueando a atividade do mRNA. Há muito tempo parece ser uma estratégia ideal para alavancar novos conhecimentos genômicos para a descoberta e desenvolvimento de medicamentos. Durante os últimos 20 anos, a tecnologia associada ao desenvolvimento do antisense melhorou dramaticamente e as químicas emergentes transformaram os oligonucleotídeos antisense em ferramentas poderosas e versáteis para estudar a função das proteínas em células vivas. Nos últimos anos, tecnologias antisense têm sido amplamente utilizadas como ferramentas potentes e promissoras para esse fim. Há um rápido aumento no número de moléculas antisense que progridem nos ensaios clínicos. As tecnologias antisense fornecem uma abordagem simples e eficiente para a descoberta e o desenvolvimento de medicamentos e espera-se que se tornem uma realidade em um futuro próximo.

Jasbir Singh, Harmeet Kaur, Aditi Kaushik e Sapna Peer, 2011. Uma revisão das intervenções terapêuticas anti-sentido para alvos biológicos moleculares em várias doenças. International Journal of Pharmacology, 7: 294-315.

Os agentes antisense são medicamentos que interferem no processo de comunicação que diz a uma célula para produzir uma proteína indesejada. As proteínas desempenham um papel central em quase todos os aspectos do metabolismo humano. Quase todas as doenças humanas são o resultado da produção inadequada de proteínas ou desempenho desordenado de proteínas (Chan et al., 2006). Os medicamentos tradicionais são projetados para interagir com moléculas de proteínas em todo o corpo que suportam ou causam doenças, mas os medicamentos antisense são projetados para inibir a produção de proteínas causadoras de doenças ligando-se ao projeto de uma proteína e especificamente evitando sua conversão em um fator patogênico, por exemplo que causa um crescimento tumoral descontrolado (Aboul-Fadl, 2006). Eles podem ser projetados para tratar uma ampla gama de doenças, incluindo infecciosas, inflamatórias, câncer, doença cardiovascular se têm o potencial de ser mais seletivos, como resultado, mais eficazes e menos tóxicos do que os medicamentos tradicionais. Em contraste com a terapia gênica, os medicamentos antisense não alteram os genes humanos nem têm qualquer efeito na informação genética humana. As aplicações terapêuticas de técnicas antisense estão atualmente sob investigação em muitos campos diferentes (Galderisi et al., 1999). O primeiro medicamento antisense Fomiversen, para o tratamento da retinite por citomegalovírus em pacientes com AIDS, foi aprovado em 1998 (Calvez et al., 2004 Van Aerschot, 2006). O uso de agentes antisense como agentes terapêuticos gerou um entusiasmo considerável na comunidade médica e de pesquisa. Nos últimos anos, assistimos a um rápido aumento no número de moléculas antisense que progridem em ensaios clínicos de fase I, II e III (Aboul-Fadl, 2005). A ISIS Pharmaceuticals é a líder com 11 estudos de fase I, 7 de fase II e 3 de fase III. Genta é ativo com Genasense, um antisense para Bcl 2 para tratamento de células antitumorais que está na fase III. AVI Biopharm tem uma plataforma de oligonucleotídeo antisense de terceira geração e, em torno disso, está testando 4 ensaios de fase I, 5 de fase II e 2 de fase III. Hybridon conduziu 2 fases I e tem dois ensaios de fase 2 planejados (Phillips, 2004). Esta revisão descreve o conceito básico da tecnologia antisense, seu desenvolvimento e aplicações terapêuticas potenciais recentes.

MECANISMO MOLECULAR DE AGENTES ANTI-SENSOS

Na maioria dos casos, os agentes antisense são sequências curtas de cadeia simples sintéticas de bases de DNA projetadas para hibridizar com sequências específicas de mRNA formando um duplex. Este acoplamento DNA-RNA atrai uma nuclease endógena, RNase H, que destrói o RNA ligado e libera o antisense do DNA para re-hibridizar com outra cópia do mRNA (Crooke, 1998). Desta forma, o efeito não é apenas altamente específico, mas prolongado devido à reciclagem da sequência de DNA anti-sentido. O mecanismo geral para a inibição da síntese da molécula de proteína é dado na Fig. 1.

A redução do mRNA reduz a quantidade total de proteína especificada pelo mRNA. Também é teorizado que a hibridização impede estericamente os ribossomos de traduzir a mensagem do mRNA em proteína. Portanto, existem pelo menos duas maneiras pelas quais os antissensos podem funcionar eficazmente para reduzir a quantidade de proteína sendo elaborada: degradação de RNA baseada em RNase H (por exemplo, fosfodiéster, fosforotioato) e impedimento de montagem ribossômica e tradução (por exemplo, peptídeo ácidos nucleicos , morfolino oligonucleotídeos) (Bennett e Swayze, 2009 Dryselius et al., 2003 Maguire, 2009).

Existem algumas classes principais de agentes antisense: sequências antisense, comumente chamadas de ribozimas de oligonucleotídeos antisense (ASONs) e RNA de interferência (RNAi).

Oligonucleotídeos antisense: Os oligonucleotídeos antisense como agentes terapêuticos foram propostos por Zamecnik e Stephenson, 1978. No entanto, levou quase um quarto de século para que esse potencial fosse realizado. Um comprimento mínimo para os oligonucleotídeos antisense a fim de obter uma ligação específica é de 11 bases, mas a maioria sendo testada está na faixa de 15-25 bases. Os oligonucleotídeos sintéticos são estranhos às células nas quais são introduzidos e imediatamente se tornam presas de nucleases endógenas. Se os oligonucleotídeos sintéticos atingissem o nível de persistência na célula que seria necessário para cumprir suas tarefas, eles teriam que ser protegidos dessas nucleases endógenas. De modo a cumprir todos estes requisitos, é necessário que os oligonucleótidos normais (Fig. 2a) sejam modificados quimicamente de uma maneira adequada. Existem três locais possíveis em um nucleotídeo onde modificações de proteção podem ser introduzidas (Kurreck, 2003). Em ambos os nucleotídeos de DNA e RNA, a base pode ser alterada ou mudanças podem ser efetuadas na estrutura de fosfato. Nos nucleotídeos do RNA, o grupo hidroxila 2 'que está faltando nos nucleotídeos do DNA também pode ser modificado. O truque & # 147 & # 148 envolvido nas modificações de proteção de nucleotídeos é introduzir uma alteração que é protetora contra a degradação da nuclease que não elimina, ao mesmo tempo, o efeito desejado da sequência de oligonucleotídeo bloqueando a hibridização complementar ou danificando a célula. De acordo com suas gerações, eles foram classificados em três tipos.

Oligonucleotídeos antisense de primeira geração: A primeira geração de agentes antisense contém modificações de estrutura, como a substituição do átomo de oxigênio da ligação fosfato por enxofre (fosforotioatos) (Fig. 2b), grupo metil (metilfosfonatos) (Fig. 2c) ou aminas (fosforamidatos ) (Fig. 2d). Destes, os fosforotioatos têm sido os mais bem-sucedidos e usados ​​para silenciamento de genes devido à sua resistência suficiente a nucleases e capacidade de induzir funções RNase H (Campbell et al., 1990 Zon, 1995). Os oligonucleotídeos fosfororoato foram sintetizados pela primeira vez na década de 1960 por Eckstein e colegas e foram usados ​​pela primeira vez como oligonucleotídeos anti-sentido (ASONs) para a inibição da replicação do HIV por Matsukura e colaboradores (Matsukura et al., 1987). No entanto, seus perfis de afinidade de ligação às sequências alvo, especificidade e captação celular são menos satisfatórios (Chen et al., 2005).

Oligonucleotídeos antisense de segunda geração: Os problemas associados aos oligodesoxinucleotídeos fosforotioato são até certo ponto resolvidos em oligonucleotídeos de segunda geração contendo nucleotídeos com modificações alquil na posição 2 'da ribose. 2'-O-metil e 2'-O-metoxietil RNA são os membros mais importantes desta classe. Os derivados 2'-O-metilo e 2'-O-metoxietilo podem ainda ser combinados com a ligação fosforotioato (Fig. 3) (Manoharan, 1999). Os oligonucleotídeos antisense feitos desses blocos de construção são menos tóxicos do que ASONs de fosforotioato e têm uma afinidade ligeiramente aumentada para seus RNAs complementares. Questões relacionadas à sua eficiência em induzir a clivagem por RNase H do RNA alvo são motivo de preocupação em relação a esses oligonucleotídeos de segunda geração. Uma vez que a clivagem de RNase H é o mecanismo mais desejável para o efeito antisense e uma vez que modificações de 2-O-alquil são desejáveis ​​para resistência de nuclease, um construto de oligonucleotídeo híbrido incorporando ambas as características apareceu na forma do oligonucleotídeo antisense & # 147gapmer & # 148. Um gapmer contém um bloco central de desoxinucleotídeos suficiente para induzir a clivagem da Rnase H flanqueada por blocos de ribonucleotídeos modificados com 2'-O-metil que protegem o bloco interno da degradação da nuclease (Monia et al., 1993).

Oligonucleotídeos antisense de terceira geração: Foi desenvolvida uma variedade de análogos de ácido nucleico que exibem estabilidades térmicas aumentadas quando hibridizados com DNAs ou RNAs complementares em comparação com DNA: DNA e DNA: duplexes não modificados. Estas são as modificações de oligonucleotídeos antisense de terceira geração. A terceira geração contém elementos estruturais, como oligonucleotídeos zwitteriônicos (possuindo cargas positivas e negativas na molécula) Ácidos Nucleicos Peptídicos (PNAs) (com uma estrutura de pseudopeptídeo) (Fig. 4a), Ácidos Nucleicos Bloqueados (LNAs) / Ácidos Nucleicos em Ponte (BNAs) (Fig. 4b), Hexitol Nucleic Acids (HNA) (Fig. 4c) e Morpholino oligonucleotides (Fig. 4d) (Hyrup e Nielson, 1996 Elayadi e Corey, 2001 Declercq et al., 2002). Os PNAs são alterações dramáticas nas quais a estrutura do açúcar fosfato é substituída completamente por ligações de poliamida. Embora esses construtos proporcionem estabilidade aumentada e cinética de hibridização favorável, eles sofrem por estarem indisponíveis para o mecanismo de clivagem de RNase H, solubilidades problemáticas e dificuldades de entrega (Pensato et al., 2007). A modificação de terceira geração mais recente e mais promissora são os ácidos nucléicos bloqueados (LNAs). Os nucleotídeos de LNAs são uma classe de análogos de ácido nucleico em que o anel de ribose é & # 147lock & # 148 por uma ponte de metileno conectando o átomo 2'-O e o átomo 4'-C. Os LNAs foram vistos imediatamente para exibir estabilidade termodinâmica notavelmente aumentada e reconhecimento de ácido nucleico aprimorado. LNAs provou ser uma ferramenta poderosa em muitas aplicações biológicas moleculares nas quais oligonucleotídeos de DNA padrão ou ribossondas de RNA não mostram afinidade ou especificidade suficiente (Veedu e Wengel, 2009 Stein et al., 2010).

Nos ácidos nucléicos hexitol (HNAs), a porção de açúcar furanose de uma ASON é substituída por um componente hexitol de seis membros (De Bouvere et al., 1997). A substituição da desoxirribose conformacionalmente flexível pelo anel anidrohexitol restrito resulta em uma pré-organização estrutural de HNA para formar hélices de tipo A. Eles mostraram um aumento significativo na afinidade de ligação para o RNA complementar (aproximadamente 3 ° C por modificação). Além disso, os HNAs foram considerados estáveis ​​contra a degradação enzimática (Kolb et al., 2005 D & # 146Alonzo et al., 2009). No entanto, o efeito antisense dessas modificações pode ser atribuído apenas ao bloqueio estérico do mRNA alvo, uma vez que não ativam a RNase H (Hendrix et al., 1997). Nos oligonucleotídeos Morpholino (MFs), a ribose é substituída por uma fração morfolino e ligações de fosforodiamidato são usadas (Abramova et al., 2009). Semelhante aos PNAs, essas modificações não ativam RNase H e podem ser usadas apenas como bloqueadores estéricos para inibir expressão genetica no sistema biológico. Eles são estáveis ​​contra nucleases e têm afinidade de alvo semelhante à das ASONs não modificadas isossequenciais. Como o backbone em MFs não tem carga, é improvável que tenham interações indesejadas com proteínas, mas, por outro lado, isso afeta sua captação celular (Amantana e Iversen, 2005 Iversen et al., 2009).

Ribozimas são enzimas de RNA que foram descritas pela primeira vez em Tetrahymena thermophilia por Cech et al. (1981). Eles são RNAs catalíticos que clivam ligações covalentes em um RNA alvo. O sítio catalítico é o resultado da conformação adotada pelo complexo RNA-RNA na presença de cátions divalentes. As ribozimas são verdadeiros catalisadores e podem realizar o fatiamento do RNA por transesterificação (splicesome) e transferência de peptidil (em ribossomos) (Doudna e Lorsch, 2005). Essas moléculas, com vantagens potenciais ainda maiores do que os oligodesoxinucleotídeos antisense, são capazes de se ligar especificamente e clivar um substrato de mRNA. Existem vantagens em usar ribozimas em vez de oligodeoxinucleotídeos antisense. As ribozimas podem inativar o RNA alvo sem depender da maquinaria da célula hospedeira e têm a capacidade de clivar mais de uma cópia do RNA alvo por dissociação dos produtos de clivagem e ligação a outra molécula alvo. Existem vários tipos de ribozimas, as duas mais comumente usadas para fins terapêuticos e de pesquisa são a ribozima cabeça de martelo e a ribozima em gancho (Fedor e Westhof, 2002, Bevilacqua e Yajima, 2006). A maioria dos estudos realizados até o momento descreveu o uso de ribozimas como agentes terapêuticos para doenças virais e cancerígenas (Khan, 2006 Spizzo et al., 2009). No entanto, alguns distúrbios genéticos dominantes também podem se beneficiar dessa abordagem. É o caso de algumas doenças do tecido conjuntivo, como a osteogênese imperfeita, a síndrome de Marfan e as síndromes craniossinostóticas (Wood et al., 2007). Uma maior compreensão de como as ribozimas funcionam e os métodos para otimizar sua função aumentará sua atratividade como potenciais agentes terapêuticos.

Apenas recentemente, a pesquisa no campo antisense aumentou seu impacto com a descoberta da interferência de RNA (RNAi) (Downward, 2004). Este fenômeno de ocorrência natural como um potente mecanismo específico de sequência para o silenciamento do gene pós-transcricional foi descrito pela primeira vez para o verme nematóide Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998). A interferência do RNA é iniciada por moléculas de RNA de fita dupla longa (dsRNA) que são processadas em RNAs de 21-23 nucleotídeos chamados RNA de interferência curto (siRNA) pela enzima Dicer (Bernstein et al., 2001 Hammond, 2005). Esses pequenos RNAs de interferência (siRNAs) são então incorporados ao Complexo de Silenciamento Induzido por RNA (RISC), um complexo de RNA de proteína e guiam uma nuclease que degrada o RNA alvo (Chen et al., 2005). Portanto, acredita-se que ele forneça uma potência significativamente maior em comparação com as abordagens antisense tradicionais. Em princípio, a interferência de RNA pode ser usada para tratar qualquer doença associada à expressão elevada de um gene identificado. Isso pode torná-lo adequado para combater doenças virais, cânceres e doenças inflamatórias. Na verdade, em cultura de tecido Em modelos, resultados impressionantes foram alcançados contra várias células cancerosas usando interferência de RNA para alvejar oncogenes e contra vírus HIV, influenza e poliomielite por alvejamento de genes virais (Damm-Welk et al., 2003). Os siRNAs atuam contra uma variedade de vírus, HIV, vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite B, papilomavírus, herpesvírus, rotavírus e vírus influenza foram testados em culturas de células e apresentaram alta eficiência na inibição da infecção viral e replicação (Jacque et al. , 2002 Yokota et al., 2003 Hamasaki et al., 2003 Hall e Alexander, 2003 Jia e Sun, 2003 Dector et al., 2002 Ge et al., 2003 Zamore e Aronin, 2003).

VANTAGENS DA TERAPIA ANTI-SENSO SOBRE A TERAPIA COM MEDICAMENTOS TRADICIONAIS

Existem vários aspectos da terapia antisense usando oligonucleotídeos que são potencialmente vantajosos sobre os mecanismos tradicionais de drogas (Askari e McDonnell, 1996 Malik e Roy, 2008 Guanghui e Agarwal, 2009).

Os oligonucleotídeos podem ser fabricados rapidamente, alguns dentro de uma semana, a sequência do mRNA é tudo o que é necessário
O alvo é muitas vezes unidimensional (em contraste com vários domínios dimensionais frequentemente alvejados com proteínas), a sensibilidade pode ser medida por meio de varredura de banco de dados para genes conhecidos ou mancha norte / sul para genes desconhecidos
A inibição da expressão de mRNA produzirá uma resposta clínica mais rápida e duradoura do que a inibição da proteína formada pelo ribossomo, direcionada pela terapia medicamentosa convencional
A ligação de hidrogênio entre o oligonucleotídeo e o mRNA alvo excede em várias ordens de magnitude em comparação com Van der Waals e outras forças necessárias para ligar os alvos proteicos
ASONs se acumulam em órgãos e tecidos específicos, como fígado, baço, rins, medula óssea e células de gordura. Eles podem ser administrados por várias vias, ou seja, oral, retal, subcutânea, intravenosa, intratecal, intravítrea, aerossol e tópica

APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS DE AGENTES ANTISENSE

As aplicações potenciais para oligonucleotídeos antisense são limitadas apenas pela informação genética disponível. Os oligonucleotídeos anti-sentido podem ser desenvolvidos contra qualquer alvo no qual a inibição da produção de proteínas ou a inibição do processamento de RNA produza o resultado terapêutico. Atualmente, ensaios clínicos estão em andamento usando oligonucleotídeos antisense para tratar artrite reumatóide, psoríase, rejeição de transplante renal e doença inflamatória intestinal (doença de Crohn & # 146s) (Fig. 5) (Fichou e Ferec, 2006).

No entanto, os alvos primários continuam sendo as doenças virais refratárias e os cânceres para os quais as informações genéticas alvo necessárias estão normalmente disponíveis. A seguir estão alguns dos principais agentes antisense em ensaios clínicos para várias doenças (Tabela 1).

Tabela 1: Alguns dos agentes antisense em ensaios clínicos em hematologia e oncologia
CMV: Citomegalovírus, HCV: Vírus da Hepatite C, HSP: Proteína de choque térmico, IGFBP: Proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina, NHL: Linfoma não Hodgkin, NSCLC: Carcinoma pulmonar de células não pequenas, CML: Leucemia mieloide crônica

AGENTES ANTISENSE NA TERAPIA DO CÂNCER

Novas estratégias emergentes de tratamento do câncer são baseadas na regulação seletiva de alvos moleculares específicos envolvidos no processo de desenvolvimento e progressão neoplásica (Elsayed e Sausville, 2001). Como o objetivo da terapêutica do câncer está se tornando simplificado para atingir vias biológicas mais específicas, componentes genéticos e / ou proteínas celulares, o papel da terapia antisense utilizando oligonucleotídeos está evoluindo como uma estratégia de tratamento potencial na luta contra o câncer. Vários oligonucleotídeos antisense contra diferentes genes que codificam para proteínas celulares importantes envolvidas na sinalização, proliferação e sobrevivência de células cancerosas, incluindo proteína quinase A, proteína quinase C, c-raf, bcl-2 etc., foram testados na fase I / II ensaios clínicos (Cho-Chung, 1999 Tamm et al., 2001 Gewirtz, 2000). Embora nenhum agente antisense tenha sido aprovado para o tratamento do câncer, seu movimento em direção ao uso potencial em futuros cenários de oncologia clínica é aparente. Os vários alvos proteicos e agentes antisense em ensaios clínicos no tratamento do câncer são os seguintes:

Bcl-2: A regulação da morte celular (apoptose) é freqüentemente afetada no desenvolvimento de doenças malignas e todas as etapas moleculares de receptores de sinalização extracelular através de vias intracelulares, reostatos de morte celular e algozes de morte celular podem estar envolvidos. Bcl-2 é um membro antiapoptótico de uma família de proteínas anti e pró-apoptóticas que é regulada positivamente em uma variedade de cânceres e especificamente superexpressa por meio de translocação cromossômica em alguns linfomas não Hodgkin (Gross et al., 1999 Kang e Reynolds , 2009). Um dos oligonucleotídeos antisense mais promissores em desenvolvimento clínico é um Fosporotioato (PS) -oligonucleotídeo 18-mero direcionado ao mRNA de bcl-2 humano é G3139, Genasense (oblimersen de sódio). O G3139 foi avaliado em uma série de estudos de fase II / III em diferentes doenças malignas, incluindo melanoma, Linfoma não Hodgkin e # 146s (NHL) e câncer de próstata, em que a atividade antitumoral foi demonstrada (Jansen et al., 2000 Gjertsen et al. ., 2007 Tarhini e Kirkwood, 2007 Shah et al., 2009). O Genasense demonstrou sinergia com vários agentes quimioterapêuticos, radioterapia e imunoterapia e geralmente é administrado alguns dias antes das terapias padrão. Além disso, o Genasense foi avaliado ou está sendo avaliado em combinação com os seguintes agentes: Gleevec, Rituxan, Paclitaxel, Camptosar, Fludara, Ciclofosfamida, Taxotere, Mylotarg, Dexametasona e Citosina arabinosídeo (Chanan-Khan et al., 2004 Benimetskaya et al., 2004 Benimetskaya et al. , 2005 Knox et al., 2008).

c-raf: Raf quinases são serina / treonina quinases que regulam as vias de sinalização mitótica, mais notavelmente a via de proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK) que transmite sinais de ras (Skolnik et al., 1993). Foi relatado que c-raf se liga a bcl-2 e está envolvido na regulação da apoptose (Wang et al., 1996).A via da quinase regulada por sinal extracelular Raf / MAPK tem efeitos profundos nas vias proliferativa, apoptótica e de diferenciação, bem como na sensibilidade e resistência a drogas quimioterápicas (McCubrey et al., 2009 Kaur et al., 2010). Isis desenvolveu um 20mer Phosporo-oligonucleotide, ISIS 5132, que tem como alvo a região 3'-não traduzida (UTR) de c-raf-1 (Monia et al., 1996). Estudos in vitro de ISIS 5132 usando células pulmonares A549 mostraram inibição de mRNA de c-raf-1. Os resultados de outros ensaios clínicos de fase I do ISIS 5132, conduzidos em pacientes com uma variedade de tumores sólidos avançados, mostraram que a droga é geralmente bem tolerada com apenas efeitos colaterais leves que geralmente são os mesmos atribuídos ao tratamento com fosforotioato ASON (Rudin et al ., 2001). ISIS 5132 pode ser combinado com segurança com doses padrão de carboplatina e paclitaxel no tratamento de câncer de pulmão de células não pequenas (Fidias et al., 2009). Outra ASON raf-1, LErafAON (Neo-Pharm) é um oligodeoxinucleotídeo antisense de 15-mer (ASON) direcionado ao local de iniciação da tradução do mRNA de c-raf-1 também entrou em ensaios clínicos. LErafAON é também o primeiro ASON contendo fármaco lipossomal testado em humanos. A modificação PS desta ASON é limitada apenas à base do terminal nas extremidades 3 'e 5'. LErafAON foi encapsulado em um lipossoma catiônico para proteger as ASONs da degradação e para melhorar sua meia-vida sérica. Estudos pré-clínicos com esta droga mostraram inibição do crescimento tumoral, mais de 50% de inibição da expressão de raf-1 em xenoenxertos tumorais e aumento da sensibilização de células tumorais à radiação e aos agentes quimioterápicos. O estudo de fase I do LErafAON mostrou que a administração i.v. da droga é bem tolerada juntamente com a radioterapia paliativa (Pei et al., 2004 Dritschilo et al., 2006).

Proteína Quinase C - & # 945: A Proteína Quinase C (PKC) é uma família de serina / treonina quinases que está envolvida na transdução de sinais para proliferação e diferenciação celular. O importante papel do PKC em processos relevantes para a transformação neoplásica, carcinogênese e invasão de células tumorais torna-o um alvo potencialmente adequado para terapia anticâncer (Mackay e Twelves, 2003). Isis / Eli Lilly desenvolveram um 20mer Fosforoligonucleotídeo ISIS 3521 (também referido como LY900003 ou Affinitak ou Aprinocarsen) que tem como alvo a 3'-UTR de PKC - & # 945 (Roychowdhury e Lahn, 2003). Os ensaios de fase I do ISIS 3521 foram realizados com sucesso em pacientes com tumores sólidos resistentes ao tratamento. Em estudos de cultura de células, o Affinitak demonstrou inibir a expressão de mRNA e proteína em células A549 de pulmão e de carcinoma de bexiga T24 com a inibição resultante da proliferação em concentrações de 100-200 nM (Cripps et al., 2002 Holmlund, 2003). Estudos de fase I / II, avaliando a terapia de combinação de ISIS 3521 e agentes quimioterápicos, foram iniciados em pacientes com carcinoma pulmonar de células não pequenas (NSCLC) estágio III B ou IV (Villalona-Calero et al., 2004 Ritch et al., 2006 Luis et al., 2006).

H-ras: a expressão anormal de proteínas Ras é frequentemente encontrada com a transformação oncogênica, tornando o ras um alvo terapêutico promissor (Saxena et al., 2008, Kaur et al., 2010). Um ASON de fosforotioato de 20 bases (ISIS 2503) que se liga à região de iniciação da tradução do mRNA de H-ras humano reduziu seletivamente a expressão de mRNA de H-ras e proteína em cultura de células (Cunningham et al., 2001). A expressão de outros membros da família, incluindo N-ras, Ki-rasA e Ki-rasB, não foi afetada por ISIS 2503 em vitro . Em um estudo de fase I, ISIS 2503 não causou toxicidade limitante de dose em doses de até 10 mg / kg / d por 14 dias contínuos iv., Infusão a cada 3 semanas. ISIS 2503 em combinação com quimioterapia está agora em ensaios clínicos de fase II para o tratamento de metástases câncer de mama , câncer pancreático e NSCLC (Adjei et al., 2003 Alberts et al., 2004).

DNA Metiltransferase: A hipermetilação pela enzima DNA metiltransferase foi postulada para inativar genes supressores de tumor, resultando em transformação neoplásica e tumorigênese (Reid et al., 2002 Gore, 2009 Issa e Kantarjian, 2009). Agentes que previnem ou revertem a metilação do DNA podem, portanto, restaurar o controle normal do crescimento das células cancerosas (Ibrahim, 2010). MG 98 é um fosforotioato ASON que é um inibidor altamente específico da tradução do mRNA para DNA metiltransferase humano com valores de IC 50 de 50-70 nM em linhas celulares (Amato, 2007). O retardo e a regressão do crescimento do tumor foram observados com MG 98 em xenoenxertos de câncer de cólon e pulmão humano. Os ensaios de Fase II estão sendo conduzidos atualmente em pacientes com câncer renal metastático e de cabeça e pescoço (Davis et al., 2003 Winquist et al., 2006 Plummer et al., 2009).

Clusterina: a clusterina é uma glicoproteína com expressão tecidual quase onipresente e aparente envolvimento em vários processos biológicos. Clusterin atua como uma proteína de sobrevivência celular que é superexpressada em resposta a estratégias de eliminação de tumores, como quimioterapia, ablação hormonal e radioterapia. A superexpressão da clusterina prolonga a sobrevivência celular e leva a um potencial metastático aprimorado de células cancerosas em vitro (Wei et al., 2009). OGX-011 (OncoGeneX Technologies Inc.) é um ASON de segunda geração complementar ao local de iniciação da tradução do mRNA da Clusterina humana. OGX-011 incorpora um esqueleto de fosforotioato com modificações de 2-metoxietil (MOE) para as quatro bases em cada extremidade da molécula de 21-mer (Chi et al., 2008a). Essas modificações de gapmer mantêm o perfil farmacocinético de tecido melhorado da química de segunda geração, mas preservam a alta afinidade para o mRNA alvo e o recrutamento de RNase H necessário para a atividade. Os ensaios de fase II da combinação de OGX-011 e quimioterapia estão em andamento em pacientes com câncer de próstata, mama e pulmão (Chi et al., 2008b Chia et al., 2009).

Fator de transformação de crescimento - & # 9462: A superexpressão do fator de transformação de crescimento beta 2 da citocina (TGF - & # 9462) é uma marca registrada de vários tumores malignos, incluindo carcinoma pancreático, glioma maligno, melanoma metastático e carcinoma colorretal metastático. Isso se deve ao papel central do TGF - & # 9462, pois regula os principais mecanismos de desenvolvimento do tumor, a saber, imunossupressão, metástase, angiogênese e proliferação (Flanders e Burmester, 2003 BonaFoux e Lee, 2009). O ASONs mais avançado para a terapia de gliomas de alto grau é um ASON modificado com fosforotioato, AP 12009 (trabedersen), que tem como alvo o mRNA que codifica TGF - & # 9462. O AP 12009 é administrado por via intratumoral usando a entrega intensificada por convecção. Uma série de ensaios clínicos de fase I e II avaliaram o perfil de toxicidade e a dose ideal da substância (Hau et al., 2007 Hau et al., 2009 Schlingensiepen et al., 2008).

Survivin: Survivin é uma das proteínas mais específicas do câncer identificadas até o momento, sendo regulada positivamente em quase todos os tumores humanos. Biologicamente, a survivina demonstrou inibir a apoptose, aumentar a proliferação e promover a angiogênese. Por causa de sua regulação positiva na malignidade e seu papel principal na apoptose, proliferação e angiogênese, a survivina está atualmente atraindo atenção considerável como um novo alvo para terapias anticâncer. Em vários sistemas de modelos animais, a regulação negativa da survivina ou a inativação de sua função têm demonstrado inibir o crescimento do tumor (Ambrosini et al., 1997 Mita et al., 2008). Survivin é altamente expresso em uma ampla variedade de tipos de câncer humano, incluindo pulmão, cólon, pâncreas, próstata, mama e tumores gástricos. Curiosamente, a survivina é expressa de uma maneira dependente do ciclo celular com níveis mais elevados em G2 / M e rápida regulação negativa após a parada do ciclo celular. No início da mitose, a survivina se associa ao fuso mitótico e a interrupção dessa interação resulta na perda de sua função antiapoptótica. No entanto, LY2181308 / ISIS 23722 é um ASON 2-MOE de segunda geração que regula de forma potente e específica a expressão de survivina em uma ampla gama de células cancerosas humanas, incluindo pulmão, cólon, pâncreas, mama e próstata (Pennati et al., 2007 Ryan et al., 2009).

XIAP: O inibidor da proteína da apoptose de mamífero ligado ao X (XIAP) foi o primeiro IAP identificado e demonstrou se ligar a vários parceiros. O XIAP é altamente expresso em leucemia mieloide aguda (AML), glioblastoma, tumores de próstata, pancreáticos, gástricos e colorretais (Salvesen e Duckett, 2002 Sasaki et al., 2000). AEG35156 / GEM640 (Aegera Therapeutics Inc.) é um ASON 19-mer direcionado para o mRNA XIAP humano que incorpora a química 2'-O-metil com uma estrutura de fosforotioato. Estudos de prova de conceito pré-clínicos in vitro e in vivo demonstraram que a inibição da expressão da proteína XIAP por AEG35156 / GEM640 aumenta a atividade antitumoral da quimioterapia em vários modelos de xenoenxerto (Hu et al., 2003). Um estudo de tolerância de escalonamento de dose de fase I do AEG35156 como um agente único está atualmente em andamento no Reino Unido como uma infusão intravenosa contínua de 7 dias em pacientes com tumores avançados e estudos de fase I avaliando esquemas de infusão mais curtos em combinação com docetaxel ou quimioterapia de reindução para AML (Leucemia mieloide aguda) (Lacasse et al., 2005 Cummings et al., 2005 Lacasse et al., 2006).

Timidilato Sintase (TS): A Timidilato Sintase (TS) é uma enzima chave na síntese de DNA e um alvo para agentes quimioterápicos de câncer (Rose et al., 2002 Bertino, 2009). Os oligodesoxinucleotídeos (ODNs) têm como alvo diferentes regiões do mRNA de TS, inibem a proliferação de células tumorais humanas como agentes únicos e aumentam a citotoxicidade de drogas direcionadas à proteína TS clinicamente úteis. ODN 491, um novo 20mer AS ODN complementar a uma porção previamente não direcionada da região de codificação do mRNA de TS. AS ODN 491 diminuiu os níveis de mRNA de TS em diferentes graus em um painel de linhas de células derivadas de tumor humano e induziu diferentes efeitos fisiológicos de uma maneira dependente da linha de células tumorais. ODN 491 (como ODN 83, anteriormente demonstrado ser eficaz) diminuiu os níveis de proteína TS em células HeLa com um aumento concomitante na sensibilidade a quimioterápicos direcionados a TS (Flynn et al., 2006 Jason et al., 2008).

Ribonucleotídeo redutase: Ribonucleotídeo redutase (RNR) é uma enzima importante para a divisão celular e crescimento tumoral que é necessária para a conversão redutiva de ribonucleotídeos em desoxirribonucleotídeos, que é uma etapa crucial na síntese e reparo de DNA (Fan et al., 1998). O RNR de mamíferos tem uma estrutura dimérica composta por duas subunidades diferentes, R1 e R2, codificadas em cromossomos diferentes e cada uma inativa por conta própria. Ambas as subunidades consistem em um local de ligação de nucleotídeo (M1) e um local de ligação de metal (M2). Os inibidores de RNR que afetam M1 são análogos de nucleosídeos, por exemplo, gencitabina. M2 contém ferro não heme e uma tirosina radical livre que são necessários para a redução enzimática de ribonucleotídeos. Os inibidores de M2 ​​agem destruindo o radical livre . A hidroxiureia é um inibidor de RNR clinicamente aprovado que atua no ferro radical livre local, mas a inibição é reversível devido à facilidade de regeneração da tirosina- radical livre por células de mamíferos (Cerqueira et al., 2007). Os níveis de proteína da subunidade R1 são constantes durante o ciclo celular, no entanto, a expressão da subunidade R2 aumenta no final da fase G1 / fase S inicial do ciclo celular, quando ocorre a replicação do DNA. A subunidade R2 também mostrou ser superexpressada em tecidos tumorais e parece influenciar a transformação e o potencial maligno de alguns oncogenes. GTI-2501 e GTI-2040 (Lorus Therapeutics Inc.) são moléculas antisense de fosforotioato de primeira geração que têm como alvo e inibem a expressão das subunidades R1 e R2 de RNR, respectivamente (Desai et al., 2005). Um ensaio clínico de fase I do GTI-2040 foi relatado e foi observada toxicidade limitante da dose de elevação das enzimas hepáticas (Yoon et al., 2006). A dose recomendada de fase II foi determinada em 185 mg m 2 d -1, administrada como uma infusão i.v. contínua de 21 dias. Os ensaios de fase I de GTI-2501 e GTI-2040 em combinação com docetaxel foram concluídos e os ensaios de fase II desses regimes de combinação estão em andamento (Leighl et al., 2009).

AGENTES PARA INFECÇÕES VIRAIS

Os oligonucleotídeos são uma promessa considerável para o tratamento de infecções virais. Embora muita atenção recente tenha se concentrado em pequenos RNAs de interferência, a maioria dos oligonucleotídeos que foram estudados como agentes antivirais até o momento são oligodeoxinucleotídeos (ODNs) modificados projetados para funcionar por meio de um mecanismo antisense.

Citomegalovírus: O citomegalovírus (CMV) pertence à família de vírus Herpes-viridae, que são vírus de DNA que exibem propriedades biológicas de latência e reativação. Nos países desenvolvidos, até 80% dos indivíduos desenvolvem infecções subclínicas por CMV (Mocarski, 1988). A retinite por CMV é uma das infecções oportunistas mais comuns em pacientes com Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Pacientes com AIDS infectados com retinite por CMV podem desenvolver intolerância ou resistência aos regimes de tratamento anti-CMV comumente usados, necessitando do desenvolvimento de opções de tratamento alternativas (Hoffman e Skiest, 2000). Grande parte da pesquisa sobre a inibição da replicação do CMV por ASONs tem se concentrado principalmente na inibição dos produtos do gene CMV Immediate-Early (IE). ISIS 2922 (Fomivirsen também denominado Vitravene ISIS Pharmaceuticals), um PS-ASON com uma sequência de 21 nucleotídeos complementar ao RNA de IE2, apresentou atividade antiviral pelo menos 30 vezes mais potente do que o gangciclovir análogo de nucleosídeo. Os resultados mostraram que ISIS 2922 inibe a produção viral de uma maneira específica e dependente da dose (Azad et al., 1993). Até o momento, apenas um composto, fomivirsen, o primeiro agente terapêutico baseado em genes, recebeu a aprovação do FDA. A aprovação do fomivirsen foi importante para a tecnologia antisense como um todo, pois demonstrou que os medicamentos antisense podem ser usados ​​com eficácia no tratamento de uma doença local. Os resultados dos estudos de fase I, II e III mostraram que as injeções intravítreas de ISIS 2922 são seguras e eficazes. A droga interrompeu a progressão da retinite aguda e crônica por CMV em pacientes com AIDS. Além disso, o tratamento local com o medicamento reduziu a incidência de efeitos colaterais sistêmicos. Os efeitos colaterais mais comumente relatados foram aumento da pressão intraocular e inflamação intraocular leve a moderada, ambas transitórias ou tratáveis ​​com tratamento esteróide tópico (Schreiber et al., 2009 Andrei et al., 2009). Após os testes clínicos bem-sucedidos, em 1998, o ISIS 2922 foi aprovado pelo FDA para o tratamento da retinite induzida por CMV em pacientes com AIDS e se tornou o primeiro medicamento ASON a ser comercializado (Haasnoot e Berkhout, 2009). Uma ASON de segunda geração com a sequência idêntica a fomivirsen, ISIS 13312, é uma ASON 2'-MOE que demonstrou ter atividade antiviral comparável a fomivirsen em fibroblastos e células epiteliais pigmentares da retina (Mansoor e Melendez, 2008 Detrick et al. , 2001). Ambos fomivirsen e ISIS 13312 demonstraram atividade antiviral comparável e consistente com o IC 50 entre 0,1 e 1,0 & # 956M (Henry et al., 2001). Outros vírus que se manifestam como uma condição ocular no segmento anterior incluem Herpes Simplex (HSV), Varicela-Zoster (VZV), Epstein-Barr (EBV) e adenovírus. Entre eles, o HSV-1 está comumente associado a infecções oculares e é a principal causa de cegueira da córnea. Ter como alvo o HSV-1 é mais uma oportunidade para ASONs como agentes terapêuticos que não foram totalmente desenvolvidos para oftalmologia.

Vírus da hepatite C: a infecção da hepatite C é uma inflamação do fígado causada pelo Hepatite C vírus. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, aproximadamente 170 milhões de pessoas em todo o mundo são cronicamente infectadas pelo HCV (Kamal, 2008). É a infecção crônica transmitida pelo sangue mais comum no mundo desenvolvido e a principal causa de transplantes de fígado nos Estados Unidos. No entanto, os compostos anti-HCV atualmente disponíveis não são amplamente eficazes, especialmente contra a infecção crônica por HCV. Portanto, esforços contínuos estão sendo feitos para desenvolver novas e melhores estratégias terapêuticas (Tan et al., 2002 O & # 146Leary e Davis, 2010). O RNA citosólico de fita simples (ssRNA) também é um alvo potencial vulnerável para oligonucleotídeos anti-sentido terapêuticos. O sítio interno de entrada ribossômica (IRES) na extremidade 5 'do RNA viral é esse alvo altamente conservado. O IRES é a plataforma de aterrissagem que direciona a fita positiva do HCV-RNA para o retículo endoplasmático (ER) para a tradução da proteína. Assim, a inibição da ligação de IRES às proteínas celulares e virais por oligonucleotídeos poderia inibir eficazmente a replicação do HCV. ISIS 14803 é um oligodeoxinucleotídeo antisense de fosforotioato de 5'-metilcitidina de 20 unidades que se liga ao RNA (HCV) na região de iniciação da tradução do sítio de entrada do ribossomo interno (IRES) e inibe a expressão de proteínas em cultura de células e modelos de camundongos (McHutchison et al. , 2006). Este ensaio de Fase II, aberto, de escalonamento de dose do ISIS 14803 foi realizado em pacientes com HCV crônico (Gordon et al., 2002).

Vírus da imunodeficiência humana (HIV): o HIV é um vírus de RNA de fita simples que usa a transcriptase reversa (RT) para criar uma cópia de DNA de seu genoma de RNA. O DNA viral é então integrado ao DNA do hospedeiro e é posteriormente transcrito e traduzido pela célula hospedeira. A infecção pelo HIV está se espalhando em todo o mundo a uma taxa alarmante, representando as dificuldades no controle da replicação viral. Muitas regiões do genoma do HIV foram alvejadas com ASONs, incluindo os genes rev, tat, gag, pol e env, a região 5 'não traduzida e as sequências psi. Várias ASONs têm se mostrado eficazes em infecções virais agudas e crônicas (Suzuki et al., 2002). GEM 91 (Hybridon), um 25-mer PS-ASON que se liga ao local de iniciação da tradução do mRNA gag do HIV, demonstrou reduzir efetivamente a replicação do HIV em vitro (Yamaguchi et al., 1997). Embora os relatórios iniciais dos ensaios clínicos do GEM 91 tenham mostrado que ele é bem tolerado (Sereni et al., 1999), seu uso foi descontinuado posteriormente por causa da trombocitopenia limitante da dose e níveis elevados de transaminases séricas. GEM 92 é um ASON de segunda geração administrado por via oral, sintetizado em uma sequência GEM 91 truncada (Zheng, 1999). O GEM 92 está atualmente em ensaios clínicos de fase I, com estudos pré-clínicos mostrando um perfil de estabilidade e segurança aprimorado (Pandey et al., 2009).

A asma é agora uma das doenças crônicas mais comuns do mundo, afetando cerca de 300 milhões de pessoas em todo o mundo. Esse número pode aumentar em mais 150 milhões até 2025, de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS). Além disso, as terapias atuais falham em restaurar o desequilíbrio imunológico, frequentemente não produzem um controle ideal de sintomas de asma e às vezes estão associados a efeitos adversos (Humbert et al. 2007). Apesar dos avanços significativos que foram feitos nos últimos anos, ainda há uma necessidade urgente de medicamentos para asma novos, mais eficazes e mais seguros. Um objetivo importante em farmacologia molecular é a manipulação de expressão genetica com novas moléculas de drogas. Estratégias de silenciamento de genes baseadas em RNA têm sido propostas não apenas como ferramentas de pesquisa, mas também como potenciais intervenções terapêuticas na asma alérgica (Mahato et al., 2005 Popescu, 2005 Pan e Clawson, 2006). No tratamento da asma alérgica, ASON pode ser usado para silenciar expressão genetica , no nível pós-transcricional, para muitos alvos moleculares, ou seja, receptores de membrana celular (receptores acoplados à proteína G, receptores de citocinas e quimiocinas), proteínas de membrana, canais iônicos, citocinas e fatores relacionados que sinalizam proteínas quinases não receptoras (tirosina quinases, como como Syk e serina / teonina quinases, como p38 MAP quinase) e reguladores de transcrição pertencentes ao dedo de zinco Cys4 do tipo de receptor nuclear (GATA-3) ou fatores de andaime beta com contatos de sulco menores (p65, STAT-6) classes / superclasses de fatores de transcrição (Popescu e Popescu, 2007 Adcock et al., 2008). As doenças respiratórias, incluindo asma, são bem adequadas para terapias inaladas e apresentam uma oportunidade atraente para estratégias antisense tópicas.Alguns alvos importantes para agentes antisense na asma são fornecidos abaixo.

Receptor de adenosina A1: O receptor de adenosina A1 está envolvido na inflamação, broncoconstrição e depleção de surfactante observada na asma e outras doenças respiratórias (Spicuzza et al., 2006). ASONs respiráveis ​​(RASONs), em comparação com ASONs administrados sistemicamente, oferecem o potencial de diminuir seletivamente a expressão de AR-1 no pulmão em doses muito menores e também minimizar o risco de efeitos colaterais sistêmicos e toxicidade. EPI 2010 é um RASON de primeira geração projetado para atingir o códon de iniciação do mRNA do receptor A1 humano, um fosforotioato de 21-mer que inibe cada um desses aspectos da asma e é eficaz em vários modelos de asma humana, incluindo o primata (Zhang , 2002). Os resultados dos ensaios clínicos de fase I / IIa mostraram que o EPI-2010 é seguro e bem tolerado, com indicações modestas de eficácia em pacientes com asma leve (Ball et al., 2004). Outros ensaios clínicos estão em andamento para determinar sua eficácia clínica.

Proteína quinases ativadas por mitógenos (MAPK): Entre as várias famílias de MAPK, o p38 está principalmente implicado na biossíntese de citocinas, bem como no recrutamento de células inflamatórias (Pelaia et al., 2005). p38 MAPK é uma serina / treonina quinase dirigida por prolina não receptor com um papel central na ativação de células inflamatórias (Schindler et al., 2007). Em particular, o p38 MAPK contribui significativamente para o recrutamento de neutrófilos, regulando positivamente a expressão vascular da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e a liberação de TNF - & # 945 nos espaços aéreos. Os inibidores de p38 MAPK parecem ter um efeito inibitório preferencial na síntese de Th2 em comparação com citocinas Th1, indicando sua aplicação potencial no tratamento de doenças atópicas. p38 alfa MAPK ASON (ISIS 101757) é um 2 'MOE-ASON entregue como aerossol para inalação ou exposição apenas no nariz, em camundongos sensibilizados com Ovalbumina (OVA) com asma. Inibiu p38 alfa mRNA e expressão de proteína em células do fluido de Lavagem Broncoalveolar (BAL) e células de nódulos linfáticos peribrônquicos, reduziu a hipersecreção de muco, suprimiu a produção de citocinas Th2 (níveis de IL-4, IL-5 e IL-13 no fluido de BAL) e inibiu as vias aéreas eosinofilia Airway Hyperresponsiveness (AHR) (Duan et al., 2005). As questões de segurança continuam sendo uma preocupação para o uso a longo prazo, embora a aplicação nas vias aéreas por aerossol possa reduzir os efeitos colaterais. Curiosamente, a insensibilidade aos corticosteroides observada nas células do sangue periférico e macrófagos obtidos do líquido BAL em pacientes com asma grave pode ser superada pela combinação de um inibidor de p38 MAPK e dexametasona (Adcock et al., 2008).

Receptor de interleucina e receptor de quimiocina C-C tipo 3: A cadeia alfa do receptor de IL-4 desempenha papéis especiais na alergia, sendo uma subunidade comum do complexo de receptores de IL-4 e IL-13. A sinalização através dele por IL-4 é importante na diferenciação de Th2 e o bloqueio de sua produção inibe a atividade de IL-4 e IL-13, regulando a inflamação alérgica, superprodução de muco e hiperresponsividade das vias aéreas (AHR) (Isidoro-Garc & iacutea et al., 2005). A cadeia alfa do receptor de IL-4 foi estudada como um alvo para uma nova segunda ASON inalada. A droga, ISIS 369645, é um inibidor antisense de segunda geração da subunidade alfa do receptor da interleucina 4 (IL4R-alfa). A inibição da produção de IL4R-alfa inibe a atividade de duas citocinas importantes na asma, IL-4 e IL-13, que regulam a inflamação, a superprodução de muco e a hiperresponsividade das vias aéreas (Oh et al., 2010). ISIS 369645 está atualmente sendo avaliado em estudos de fase 1. Topigen Pharmaceuticals (Montreal, Quebec, Canadá) demonstrou recentemente a segurança, tolerabilidade e atividade farmacológica de TPI-ASM8, uma droga antisense de primeira geração que combina dois oligonucleotídeos em um único produto inalado, em pacientes com asma alérgica leve. TPI-ASM8 é uma combinação de duas ASONs que visa duas vias celulares distintas envolvidas na inflamação alérgica das vias respiratórias, inibindo o recrutamento de células inflamatórias alérgicas, por meio de um efeito no receptor CCR3 de cisteína-cisteína e reduzindo a persistência de células inflamatórias alérgicas por meio de interferência com a subunidade beta comum para os receptores de interleucina 3, interleucina 5 e fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) (Gauvreau et al., 2008). Espera-se que esta abordagem pioneira de múltiplos alvos de bloqueio da síntese de receptores específicos com tecnologia de silenciamento de RNA tenha vantagens sobre a terapêutica atual, fornecendo atividade farmacológica mais ampla, porém específica. TPI ASM8 é fornecido em uma formulação inalatória conveniente e econômica e a exposição sistêmica é mínima, resultando em um perfil de segurança favorável em ensaios clínicos até o momento. Agora TPI ASM8 está em fase II de desenvolvimento clínico para o tratamento da asma moderada a grave (S & eacuteguin e Ferrari, 2009).

AGENTES USADOS EM OUTRAS DOENÇAS INFLAMATÓRIAS

Os oligonucleotídeos anti-sentido foram explorados por seus benefícios terapêuticos em várias doenças inflamatórias, por exemplo, Artrite reumatóide , Doença de Crohn & # 146s (CD), Colite Ulcerativa (UC), Psoríase, etc. Alguns dos alvos importantes da terapia ASON para esses modelos de doença são discutidos abaixo.

Fator de necrose tumoral & # 945: Fator de necrose tumoral & # 945 (TNF - & # 945), também conhecido como caquectina, é uma citocina importante que desempenha um papel na defesa do hospedeiro. A citocina é produzida principalmente em macrófagos e monócitos em resposta à infecção, invasão, lesão ou inflamação. TNF - & # 945 interage com dois receptores diferentes, receptor de TNF I (TNFRI) e receptor de TNF II (TNFRII), a fim de transduzir seus efeitos, cujo resultado líquido é alterado expressão genetica . Fatores celulares induzidos por TNF - & # 945 incluem interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), interferon - & # 947 (IFN - & # 947), Fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e fator de crescimento epidérmico (EGF) e moléculas de adesão de células endoteliais, incluindo molécula de adesão de leucócitos endoteliais 1 (ELAM-1), molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e molécula de adesão de células vasculares-1 (VCAM -1) (Wajant et al., 2003). Apesar dos efeitos protetores da citocina, a superexpressão de TNF - & # 945 freqüentemente resulta em estados de doença, particularmente em doenças infecciosas, inflamatórias e autoimunes. Este processo pode envolver as vias apoptóticas (O & # 146Shea et al., 2002). Altos níveis de TNF - & # 945 plasmático foram encontrados em doenças infecciosas, como síndrome de sepse, meningite bacteriana, malária cerebral, AIDS e doenças autoimunes, como artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal (incluindo doença de Crohn), sarcoidose, esclerose múltipla, Kawasaki síndrome, doença enxerto-versus-hospedeiro e rejeição de transplante (aloenxerto) e condições de falência de órgãos, como síndrome de dificuldade respiratória do adulto, insuficiência cardíaca congestiva, insuficiência hepática aguda e infarto do miocárdio (Lin et al., 2008). ISIS 104838 (ISIS Pharmaceuticals), um gapmer de 20 nucleotídeos direcionado ao mRNA do TNF humano - & # 945, é a primeira ASON pertencente à segunda geração a ser testada em ensaios clínicos (Kennewell, 2003). Os estudos pré-clínicos com ISIS 104838 mostraram que é eficaz para o tratamento de artrite induzida por colágeno com atividade comparável à do anticorpo anti-TNF - & # 945 e que derruba com sucesso a expressão de TNF - & # 945 em 85% em queratinócitos estimulados . Na fase I dos ensaios clínicos, ISIS 104838 foi administrado por via i.v. ou s.c. (Sewell et al., 2002). ISIS 104838 está atualmente na fase II dos ensaios clínicos para o tratamento da artrite reumatóide (AR) e doença de Crohn (CD) (De Boer et al., 2007).

Molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1): As moléculas de adesão intercelular (ICAMs) são membros estruturalmente relacionados da família dos supergênios das imunoglobulinas e são ligantes das moléculas de integrina beta2 presentes nos leucócitos. Dos cinco ICAMs identificados, o ICAM-1 é o mais extensivamente estudado. Embora ICAM-1 seja expresso constitutivamente em níveis baixos nas células endoteliais e em alguns linfócitos e monócitos, sua expressão pode ser significativamente aumentada na presença de citocinas (TNF - & # 945, IL-1, IFN - & # 947) e espécies que reagem ao oxigênio . Dependendo do tipo de célula, ICAM-1 participa no tráfego de células inflamatórias, nas interações célula-célula durante a apresentação do antígeno, na patogênese microbiana e na transdução de sinal através de eventos de sinalização. Novamente, dependendo do tipo de célula examinada, o envolvimento de ICAM-1 foi documentado para ativar quinases específicas por meio de fosforilação, resultando na ativação do fator de transcrição e aumento da produção de citocinas, aumento da expressão da proteína da membrana celular, produção de espécies reativas de oxigênio e proliferação celular (Hubbard e Rothlein, 2000 Philpott e Miner, 2008). ISIS 2302 (Alicaforsen) é um oligonucleotídeo fosforotioato de 20 bases direcionado à molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), hibridiza com uma sequência na região 3 'não traduzida do mRNA de ICAM-1 humano. Alicaforsen oferece potencial para ampla eficácia no tratamento de doenças imunomediadas e inflamatórias (Barish, 2005 Baumgart e Sandborn, 2007).

Receptor do fator de crescimento semelhante à insulina tipo I (IGF-IR): O receptor do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) é um receptor transmembrana que é ativado pelo IGF-1 e pelo fator de crescimento relacionado IGF-2. Pertence à grande classe de receptores de tirosina quinase. Este receptor medeia os efeitos do IGF-1, que é um hormônio proteico polipeptídico semelhante em estrutura molecular à insulina (LeRoith et al., 1995 Rodon et al., 2008). O receptor do fator de crescimento semelhante à insulina tipo I (IGF1R) regula vários aspectos da malignidade e é o alvo de vários medicamentos atualmente em ensaios clínicos (Saxena et al., 2007). Enquanto a aplicação tópica e subsequente penetração de grandes oligonucleotídeos na pele normal são problemáticas, a função de barreira prejudicada das lesões psoriáticas permite a absorção de drogas antisense. ATL1101 é uma droga antisense de segunda geração projetada para bloquear a síntese do receptor IGF-1, uma proteína envolvida na regulação do crescimento excessivo de células na psoríase. O ATL 1101 é baseado na química antisense de segunda geração da Isis Pharmaceuticals chamada 2'-O-metoxietil e está sendo desenvolvido como um creme para o tratamento tópico de casos leves a moderados de psoríase (Sachdev et al., 2010 Ma et al. , 2009 White et al., 2004).

AGENTES UTILIZADOS NA DOENÇA CARDIOVASCULAR

Hipercolestrolemia: A apolipoproteína B é uma proteína estrutural importante na superfície das lipoproteínas aterogênicas, como a lipoproteína de densidade muito baixa remanescente e a lipoproteína de baixa densidade e facilita a eliminação dessas partículas da circulação pela ligação ao receptor da lipoproteína de baixa densidade. A superprodução de apolipoproteína B ou redução da depuração de lipoproteínas mediada por receptor leva a níveis elevados de colesterol sérico e aterosclerose prematura (Krause, 2004 Chapman e Caslake, 2004). Mipomersen (ISIS301012) é o sal não adecossódico de um oligonucleotídeo fosforotioato de 20 bases, um medicamento antisense de segunda geração desenvolvido pela Isis Pharmaceuticals que inibe a produção de apolipoproteína B ao se ligar diretamente e reduzir a expressão do RNA mensageiro da apolipoproteína B (Kastelein et al., 2006 Fatima et al., 2007 Matthew, 2007). Em um ensaio clínico, ISIS 301012 50-400 mg administrado semanalmente por injeção subcutânea durante 4 semanas reduziu a apolipoproteína B em 14,3-47,4% e o colesterol de lipoproteína de baixa densidade em 5,9-40% em 55 dias. O evento adverso mais frequente foi eritema no local da injeção, que se resolveu espontaneamente. Estudos estão em andamento para definir melhor a segurança, eficácia e farmacocinética do ISIS 301012 como terapia adicional em pacientes com hipercolesterolemia familiar heterozigótica e homozigótica (Kastelein et al., 2007 Athyros et al., 2008). Nenhuma interação farmacocinética foi demonstrada com ezetimiba e sinvastatina para o tratamento da hipercolesterolemia com base em sua capacidade de inibir a apolipoproteína B-100 (apoB-100) (Yu et al., 2009). Os primeiros resultados de ensaios clínicos de fase II de ISIS-301012 em pacientes com colesterol alto demonstraram que produziu reduções rápidas, dependentes da dose e prolongadas em apoB-100, colesterol LDL, colesterol de lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL), colesterol total e níveis de triglicérides e era seguro e bem tolerado. Os ensaios clínicos de fase III de ISIS-301012 em pacientes com hipercolesterolemia estão em andamento. O mipomersen foi avaliado em vários estudos de fase 2 em uma variedade de fenótipos de pacientes inicialmente como monoterapia, seguido por combinações com estatinas em doses mais baixas e depois em doses altas de estatinas e outros agentes hipolipemiantes (Yoshitaka et al., 2008).

Reestenose: A reestenose significa literalmente a recorrência da estenose, um estreitamento de um vaso sanguíneo, levando à restrição do fluxo sanguíneo. A reestenose geralmente pertence a uma artéria ou outro grande vaso sanguíneo que se estreitou, recebeu tratamento para limpar o bloqueio e, subsequentemente, tornou-se restrito (Dangas e Kuepper, 2002). A inibição de c-myc também interfere na expressão de genes a jusante, como aqueles associados à adesão celular, ao ciclo celular e à remodelação da matriz do tecido conjuntivo (De Marisa et al., 2006). Específico para o desenvolvimento de doença vascular obstrutiva, c-Myc é rapidamente induzido na célula muscular lisa vascular (VSMC) após lesão arterial e ativado por sinais proliferativos, incluindo uma série de mediadores da biologia da célula endotelial vascular (EC), como LDL, trombina, endotelina e angiotensina II (Liang et al., 2007). A inibição de c-Myc demonstrou inibir a proliferação de células do músculo liso em vitro e em vários modelos animais. Introduzido recentemente, o AVI-4126 pertence a uma família de moléculas conhecidas como oligômeros fosforodiamidato morfolino (PMOs) com sequência complementar ao local de início da tradução do mRNA de c-myc. O mecanismo de ação de AVI-4126 envolve a interferência com a montagem ribossômica, evitando assim a tradução de c-myc e a interferência com o splicing do íntron 1-exon 2 do pré-mRNA de c-myc, impedindo a tradução apropriada do mRNA de c-myc (Hudziak et al., 2000). O IC 50 para a inibição de c-myc por AVI-4126 é 0,3 & # 956M em cultura de células. A resposta celular ao AVI-4126 é o crescimento celular diminuído associado à parada das células na fase G0 / G1 do ciclo celular (Stephens, 2004 Kipshidze et al., 2005). A amplificação e a superexpressão de c-Myc também foram correlacionadas com a progressão e a resistência à quimioterapia no câncer de pulmão. AVI-4126, um oligômero fosforodiamidato morfolino neutro (PMO) foi identificado para inibir especificamente a expressão de c-MYC em vários modelos de doença e identificado em estudos clínicos de fase I como seguro e biodisponível em tumores sólidos (Sekhon et al., 2008) .

AGENTES UTILIZADOS NA DOENÇA NEUROLÓGICA

Esclerose múltipla: a esclerose múltipla (EM), também conhecida como esclerose disseminada ou encefalomielite disseminata, é uma doença autoimune na qual o sistema imunológico ataca o Sistema Nervoso Central (SNC), levando à desmielinização. Pode causar vários sintomas físicos e mentais e muitas vezes progride para deficiência física e cognitiva (Sospedra e Martin, 2005 Taragh e Ilali, 2010). O antagonismo do tráfico de células T foi investigado como uma abordagem terapêutica para MS usando tecnologias de anticorpos e antisense (Sorbera et al., 2005). A evidência clínica do papel central do antígeno-4 muito tardio (VLA-4) (& # 9454 & # 947-integrina) na transmigração de linfócitos para o SNC foi recentemente confirmada com base na eficácia do mAb humanizado para a integrina & # 9454, natalizumab (Antegren, Tysabri, Elan Pharmaceuticals e Biogen / Idec) em pacientes com EM recorrente. A administração a longo prazo de natalizumab proporcionou benefícios significativos em ensaios clínicos, incluindo uma redução acentuada no risco de novas lesões e uma redução significativa no risco de exacerbações dentro de 2 meses do início da terapia (Comi, 2009). No início de 2005, a Biogen Idec e a Elan Corporation suspenderam voluntariamente a comercialização de Tysabri nos Estados Unidos com base em dois casos relatados de Leucoencefalopatia Multifocal Progressiva (PML) (Aksamit, 2006 Linda et al., 2009). VLA-4 é a integrina & # 945 4 & # 946 1 localizada em muitas células inflamatórias que participam da adesão, tráfego e ativação celular, por meio da ligação a VCAM-1 e fibronectina. Um inibidor antisense de segunda geração de VLA-4 (ATL1102, Antisense Therapeutics Limited) está atualmente sendo investigado como uma terapia subcutânea para EM recorrente-remitente. A farmacocinética e a segurança de ATL1102 foram investigadas em um estudo duplo-cego, controlado por placebo, em indivíduos saudáveis. Este produto é direcionado para inibir a expressão de CD49d (uma alfa integrina), uma subunidade do complexo VLA-4 integrina que é considerada responsável pela progressão da MS (Lofthouse et al., 2005 Tilley, 2008).

Myasthenbia gravis: Myasthenbia Gravis (MG) é uma doença crônica e debilitante que afeta cerca de 100.000 pessoas em todo o mundo, caracterizada por fraqueza muscular, especialmente incapacidade de abrir os olhos, problemas nos músculos das mãos e pernas. O sistema imunológico do corpo ataca os receptores de acetilcolina na junção neuromuscular (JNM), interferindo na função muscular normal (Conti-Fine et al., 2006). Em casos graves, a doença pode envolver os músculos respiratórios, causando insuficiência respiratória potencialmente fatal. O tratamento atual da MG inclui o uso de drogas anticolinesterásicas para melhora temporária da transmissão neuromuscular, remoção de anticorpos (Abs) do receptor anti-acetilcolina (AChR) por plasmaférese ou procedimentos específicos de imunoadsorção, uso de imunossupressores não específicos ou imunomoduladores para conter os Resposta AChR e timectomia (Keesey, 2004 Rasool et al., 2008). Uma nova abordagem para a inibição terapêutica de longo prazo da atividade da AChE em pacientes com MG é baseada na observação de que no NMJ de ambos os pacientes com MG e animais MG Autoimunes Experimentais (EAMG), há transcrição aprimorada e splicing alterado de pré-mRNA AchE, com acúmulo de uma variante AchE-R de readthrough normalmente rara (Brenner et al., 2003). A variante AChE-S sináptica de ocorrência comum forma multímeros de membrana. Em contraste, AChE-R existe como monômeros solúveis que não possuem a cisteína carboxiterminal necessária para a fixação à membrana. Assim, o AChE-R permeia o espaço sináptico e degrada a ACh antes de atingir a membrana pós-sináptica, comprometendo assim a ativação do AChR. Estas observações levaram ao projeto e uso de EN101 (Monarsen), oligonucleotídeo antisense sintético de 20 bases que suprime a expressão de AChE-R. EN101 normaliza a transmissão neuromuscular em MG Autoimune Experimental (EAMG) modulando a síntese de variantes de AChE, afetando assim a taxa de hidrólise de ACh e a eficácia da ativação de AchR (Argov et al., 2007 Sussman et al., 2008). A Food and Drug Administration concedeu o status de designação de medicamento órfão para Monarsen. EN101 está passando por testes em humanos. É modificado para atingir estabilidade para administração oral. Monarsen agora está sendo investigado em um estudo de fase II (Katzberg e Bril, 2009).

Diabetes mellitus define um grupo de distúrbios metabólicos caracterizados por hiperglicemia resultante de defeitos na secreção de insulina, ação da insulina ou ambos. É um dos mais comuns síndrome metabólica s, uma vez que existem 200 milhões de diabéticos no mundo, isso cria uma necessidade de compreender a etiologia da doença e os fatores que influenciam o seu aparecimento (Malecki e Klupa, 2005 Al-Zubairi e Eid 2010). Muitos pesquisadores e empresas estão empenhados em melhorar biodisponibilidade de insulina de forma fisiológica natural (Singh et al., 2011).A abordagem da biologia molecular baseada na Proteína Tirosina Fosfatase (PTP) -1B que antagoniza a sinalização da insulina é um potencial alvo terapêutico para a resistência à insulina associada à obesidade e diabetes tipo 2. Até o momento, os estudos de PTP-1B foram limitados pela disponibilidade de antagonistas específicos, no entanto, o tratamento de roedores com oligonucleotídeos anti-sentido (ASOs) direcionados contra PTP-1B melhora a sensibilidade à insulina e inibe a lipogênica expressão genetica e reduz o acúmulo de triglicerídeos no fígado e tecido adiposo. ISIS 113715 é um oligonucleotídeo antisense de fosforotioato (ASO) 20-mer que é complementar ao RNA mensageiro da proteína tirosina fosfatase 1B (PTP-1B) e subsequentemente reduz a tradução da proteína PTP-1B, um regulador negativo do receptor de insulina (Montalibet e Kennedy , 2005 Geary et al., 2006). ISIS 113715 está atualmente sendo estudado em estudos clínicos de fase II iniciais para determinar sua capacidade de melhorar ou restaurar a sensibilidade do receptor de insulina em pacientes com diabetes mellitus tipo 2. Trabalhos futuros investigarão a combinação de ISIS 113715 com compostos antidiabéticos (Swarbrick et al., 2009).

Drogas baseadas em antisense são opções potencialmente valiosas para novos tratamentos com drogas. Os compostos baseados em antisense podem oferecer vantagens para alvos e condições cuidadosamente selecionados, como aqueles de esclerose múltipla, psoríase, câncer de pulmão, carcinoma colorretal, carcinoma pancreático, glioma maligno e melanoma maligno, diabetes e doenças como asma e artrite com um componente inflamatório . A capacidade de usar compostos antisense para inibir a expressão de proteínas já conhecidas como alvos de drogas é uma estratégia valiosa e deve aumentar a probabilidade de desenvolver compostos clinicamente úteis. O rápido desenvolvimento da tecnologia antisense oferece escopo quase ilimitado para o desenvolvimento de novas terapêuticas altamente específicas.

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RESULTADOS

Co-localização citoplasmática de ODN antisense e PFV em um tempo de incubação precoce

Em investigações anteriores, demonstramos em vitro captação celular de antisense pela entrega de PFV. Os presentes estudos tiveram, portanto, como objetivo caracterizar a distribuição intracelular e o tráfego do oligonucleotídeo e do portador de PFV. Isto foi investigado em duas linhas celulares: células HEK 293 e 518A2. Antisense livre, complexos catiônicos de lipossoma / antisense ou ODN antisense encapsulado em PFV foram adicionados às células em uma concentração final de 0,5 µM. O tráfego subcelular de ODN antisense e PFV foi examinado monitorando a distribuição de ODN marcado com FITC e PFV marcado com Rh-PE usando microscopia confocal. Conforme mostrado na Figura 1, a acumulação e distribuição antisense dentro das células era altamente dependente da entrega do transportador. Quando ODN antisense foram incubados com células por 4 h como o agente livre, a absorção celular foi geralmente muito pobre, embora as células 518A2 mostrassem uma intensidade de fluorescência ligeiramente maior do que as células HEK 293 (Fig. 1 A e D). Em contraste, as células exibiram internalização maciça de ambos transportador e ODN antisense quando os ODN antisense foram entregues por PFV (Fig. 1 B e E). Às 4 h, uma maioria substancial do ODN antisense foi co-localizada com PFV no citoplasma da célula como fluorescência pontilhada. Esta co-localização do fluoróforo FITC verde e fluoróforo vermelho da rodamina dá origem à cor amarela observada. Além disso, alguma fluorescência vermelha, principalmente distribuída em torno das membranas plasmáticas das células, também foi observada. No entanto, sua intensidade era muito fraca em comparação com a emissão fluorescente co-localizada. Da mesma forma, manchas verdes fluorescentes relativamente fracas foram vistas espalhadas no compartimento citoplasmático em algumas células. Isso pode representar um baixo nível de antisense livre, mesmo neste ponto de tempo de 4 horas. Em ambas as linhas celulares, a acumulação de transportador co-localizado e ODN foi predominantemente nas regiões perinucleares. Este padrão de distribuição intracelular foi distinto daquele observado quando ODN foi entregue na forma de complexos catiônicos de lipossoma-ODN. Como mostrado na Figura 1 C e F, usando complexos de lipossomas catiônicos, a maioria dos ODN antisense foram rapidamente acumulados no núcleo da célula e apenas uma pequena porcentagem ainda estava presente no citoplasma, particularmente na região perinuclear, em 4 h. Este padrão é consistente com observações anteriores na literatura e demonstra que os lipossomas catiônicos são um mediador eficaz para a entrega de ODN (22 - 25). A distribuição nuclear do ODN antisense não era homogênea. Conforme mostrado pela intensidade da fluorescência, os oligonucleotídeos estavam amplamente ausentes do compartimento do nucléolo. A internalização de ODN antisense mediado por PFV e o acúmulo subsequente em torno da região perinuclear foram ainda caracterizados por z Imagem de varredura a laser de posição (Fig. 2). Essas seções ópticas indicaram claramente que a fluorescência intensa exibida na Figura 1 E era predominantemente de FITC – ODN interno e não resultava da ligação à membrana plasmática.

Liberação dependente do tempo de ODN antisense de PFV

Para iniciar um efeito antisense, o ODN precisa ser liberado da portadora e, portanto, disponível para ligação de mensagem alvo. Obviamente, após 4 h de incubação, o transportador PFV mediou de maneira eficiente o acúmulo de antisense dentro de um compartimento citoplasmático. A próxima questão era se o ODN antisense acumulado poderia ser liberado do portador de PFV, sair do compartimento citoplasmático e acessar o núcleo. Isso foi explorado seguindo a distribuição intracelular de PFV-ODN por 24-48 h. Após 24 h de incubação, as células exibiram sinais de FITC – ODN livre (Fig. 3). Isso foi mais claramente exibido em células 518A2 (Fig. 3 B). Comparando a distribuição Rh ‐ PE (fluorescência vermelha) com a distribuição FITC ‐ ODN (fluorescência verde) na mesma célula (Fig. 3 B ‐ 1 e B ‐ 2), pode ser visto que os PFV estão amplamente distribuídos na célula citoplasma, enquanto o FITC – ODN se acumulam principalmente ao redor ou dentro do núcleo. Esta separação de ODN do portador PFV e subsequente migração para o núcleo foi ainda mais evidente após 48 h de incubação com PFV-ODN (Fig. 4). Conforme mostrado na Figura 4, fluorescência nuclear intensiva (FITC) é observada para entrega PFV-ODN (Fig. 4 B e D). Embora uma célula 518A2 na Figura 4 B mostre evidências de apoptose, as outras células ainda possuíam membranas celulares intactas, o que é uma forte evidência de sua viabilidade. Nessas células viáveis, o FITC-ODN foi distribuído no citoplasma e no núcleo, enquanto o marcador Rh-PE permaneceu exclusivamente no citoplasma (Fig. 4 B-1 e B-2). Um padrão semelhante foi observado em células HEK 293 (Fig. 4 D), mas com um nível muito mais baixo de intensidade de fluorescência. A razão pela qual as células HEK 293 mostram menos fluorescência nuclear não está clara. Conforme exibido após a entrega antisense usando lipossomas catiônicos, uma vez no núcleo da célula, a distribuição de FITC-ODN não era homogênea e o oligonucleotídeo parecia ser excluído dos nucléolos.

Efeito do PFV-ODN na citotoxicidade celular

É bem conhecido que os lipídios catiônicos são muito tóxicos para as células. Como o PFV contém o lipídio catiônico DODAC, conduzimos experimentos para investigar a toxicidade potencial do PFV-ODN em células 518A2 e HEK 293. As células foram tratadas com ODN de controle de PFV ou complexos ODN de controle de lipossoma catiônico em várias concentrações por 24 ou 48 h. Nestes momentos, as células foram processadas e a citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio XTT. Conforme mostrado na Figura 5, as células 518A2 e HEK 293 mostraram efeitos citotóxicos graves quando tratadas com complexos catiônicos de lipossoma-ODN. Esta toxicidade foi observada mesmo a uma concentração de lípidos tão baixa quanto 50 µM. Em ambas as linhas celulares, menos de 10% das células eram viáveis ​​após 24 horas de incubação e, após 48 horas, poucas células viáveis ​​foram observadas. Este resultado foi consistente com nossas observações de células tratadas com complexo lipossoma-OND catiônico sob microscopia confocal. Em contraste com os complexos catiônicos de lipossoma-ODN, a formulação PFV-ODN foi menos citotóxica para ambas as linhas celulares testadas. Como visto na Figura 5, após 24 h de incubação com PFV-ODN, ∼80% das células eram viáveis ​​em baixas concentrações de lipídios. À medida que a concentração de lipídios foi aumentada, uma redução gradual na viabilidade celular foi observada. No entanto, mesmo em concentrações de lipídios relativamente altas (600 µM) & gt60% de viabilidade celular foi observada. Durante períodos de exposição mais longos, uma redução adicional na viabilidade celular foi exibida quando as células foram incubadas com PFV-ODN. Na concentração lipídica testada mais alta (600 µM), a viabilidade celular caiu para 30-40% em 48 h.

Atividade biológica dependente do tempo de ODN antisense encapsulado por PFV

A liberação dependente do tempo de ODN antisense de PFV e a subsequente migração para o núcleo pode resultar em um atraso na regulação negativa do mRNA alvo. Portanto, conduzimos um estudo sobre a linha celular de melanoma humano 518A2 usando G3139, um ODN antisense de 18 mero direcionado ao humano bcl ‐ 2 gene. Estudos anteriores mostraram que esta construção antisense, entregue usando lipossomas catiônicos, é eficaz na regulação negativa de sua mensagem alvo e isso pode resultar em uma redução profunda nos níveis de expressão de proteínas (26). Em um estudo anterior, no entanto, observamos apenas uma redução leve, mas consistente, na expressão de mRNA quando as células foram tratadas com PFV-ODN a 1,0 µM por 48 h (16). Especulamos, com base em nossas observações atuais, que esta baixa atividade foi possivelmente devido ao ODN antisense, entregue usando PFV, não estar completamente disponível para ligação ao alvo subcelular, ou a concentração de ODN antisense liberado lentamente estar abaixo de um nível de limiar necessário para atingir atividade significativa. No presente estudo, portanto, examinamos uma concentração mais alta de PFV-ODN em períodos de exposição mais longos. As células (518A2) foram tratadas com antisense livre, PFV vazio, controle encapsulado por PFV ODN G3622 ou ODN G3139 antisense encapsulado por PFV por 24, 48 ou 72 h a uma concentração antisense de 3,0 µM (ou concentração equivalente de PFV). Em cada momento, as células foram colhidas e processadas para expressão de mRNA usando RT-PCR. Os dados são mostrados na Figura 6. Como pode ser visto, uma regulação negativa específica do antisense de bcl ‐ 2 O mRNA foi claramente observado quando as células foram expostas ao antisense encapsulado por PFV. Na concentração antisense testada, o nível de mRNA foi reduzido em ∼50% após 24 h de incubação, enquanto nenhum efeito de regulação negativa foi observado para células tratadas com antisense livre, PFV vazio ou ODN de controle encapsulado por PFV. Após 48 h de incubação, as células tratadas com PFV-antisense ODN mostraram uma redução adicional do nível de mRNA, em -65% em comparação com as células de controle. Finalmente, em 72 h, a expressão de mRNA nessas células foi reduzida em 80% quando comparada com as células tratadas com antisense livre, PFV vazio ou ODN de controle de PFV. Foi observado que os efeitos da citotoxicidade por si só podem resultar na inibição do gene alvo, o que não tem nada a ver com o ODN antisense (27). Desde o bcl ‐ 2 gene está envolvido na via de apoptose celular, existe a possibilidade de sua expressão ser afetada pela viabilidade celular. Com base nessa preocupação, usamos PFV vazio como um controle para monitorar qualquer efeito não específico potencial sobre bcl ‐ 2 Níveis de mRNA como consequência da citotoxicidade. Nossos resultados mostram que em todos os pontos de tempo testados as células não mostraram uma redução significativa no nível de mRNA quando tratadas com PFV vazio, que eram mais tóxicos para as células do que concentrações equivalentes de PFV-ODN (dados não mostrados). Da mesma forma, quando as células foram expostas ao ODN de controle encapsulado por PFV, que tem a mesma sequência de bases de G3139, mas na polaridade reversa, embora preservando os motivos CpG, a redução de mRNA também não foi evidente. Concluímos, portanto, que a redução observada na bcl ‐ 2 O nível de mRNA foi devido a um efeito específico de ODN antisense.


Os autores gostariam de agradecer os fundos FEDER através do Programa Operacional Factores de Competitividade & # x02014COMPETE e os fundos portugueses através da FCT & # x02014Funda & # x000E7 & # x000E3o para a Ci & # x000EAncia e a Tecnologia (PTDC / CTM-NAN / 115124/2009, HMSP- ICT / 0020/2010 e PEst-C / SAU / LA0002 / 2013) que apoiaram este trabalho. Pedro M. D. Moreno é apoiado por uma Ação Marie Curie da Comunidade Europeia & # x00027s Sétimo Programa-Quadro (PIEF-GA-2011-300485).

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Palavras-chave: antisense, oligonucleotídeos, câncer, terapêutica, nanomedicina

Citação: Moreno PMD e P & # x000EAgo AP (2014) Oligonucleotídeos anti-sentido terapêuticos contra o câncer: obstáculos à clínica. Frente. Chem. 2: 87. doi: 10.3389 / fchem.2014.00087

Recebido: 31 de agosto de 2014 Artigo com publicação pendente: 10 de setembro de 2014
Aceito: 23 de setembro de 2014 Publicado online: 14 de outubro de 2014.

Jo & # x000E3o Conde, Instituto de Tecnologia de Massachusetts, EUA

Juewen Liu, Universidade de Waterloo, Canadá
Ramon Eritja, Institut de Qu & # x000EDmica Avan & # x000E7ada de Catalunya - Consejo Superior de Investigaciones Cient & # x000EDficas, Espanha

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