Em formação

Ligação de cátion divalente à calmodulina


Realizei um PAGE nativo com 4 misturas de reação. A cada I foi adicionado um volume igual de EDTA (1 µl / 1 mM) para sequestrar quaisquer íons divalentes e um volume igual de calmodulina (5 µl / 0,5 mg / ml). Eu adicionei 2 µl de íons cálcio (2 mM), magnésio (2 mM) e manganês (2 mM) respectivamente a três misturas de reação e tive um controle que foi feito até um volume igual com Tris-HCl. Todas as misturas de reação foram feitas até 10 µL com Tris-HCl. Aqui eu tive um problema com os banhos de água e as reações não puderam ser incubadas a 37 graus Celsius.

Depois de adicionar o tampão de carga a cada um, adicionei as 4 misturas de reação ao gel de poliacrilamida e fiz a eletroforese por 45 minutos a 150 V. Depois disso, coloquei o gel em corante Coomassie Blue por 20 minutos.

Após o processo de descoloração, revisei o gel para descobrir que a calmodulina nas 4 pistas havia migrado na mesma distância. Eu esperava que o controle EDTA tivesse migrado mais longe no gel, com Ca2 + e Mn2 + migrando em distâncias semelhantes devido a seus raios iônicos semelhantes; tornando-o um bom substituto para a ligação à calmodulina. Eu não tinha certeza de quão longe o Mg2 + iria viajar, pois pensei que ele teria uma afinidade menor com a calmodulina devido à sua ligação ao terminal N em vez do terminal C. No entanto, eu queria saber se isso era insignificante na ausência de Ca2 +, embora agora eu não possa ter certeza devido aos resultados do gel.

Gostaria de saber quais erros no projeto experimental ou processo podem ter resultado nisso? E se o experimento fosse executado corretamente, quais resultados seriam esperados?

A primeira imagem é o resultado que esperava. O segundo são os resultados da minha eletroforese em gel.


A mudança na distância de migração do gel é devido às mudanças conformacionais devido à ligação do íon, e não tem nada (detectável) a ver com o raio iônico do íon.

A imagem da esquerda mostra calmodulina sem ligante ligado, e a imagem da direita mostra com cálcio e peptídeo ligados a ela.

Como você pode ver claramente, a calmodulina não ligada é significativamente mais fina e, portanto, pode migrar mais rápido através do gel. A mudança na carga da proteína devido à ligação de cátions na PAGE nativa também pode afetar o resultado.

Uma vez que a mudança conformacional da calmodulina é aumentada por um peptídeo e cátions de cálcio, bem como seu estado de fosforilação, seria razoável investigar as contribuições desses fatores para o seu resultado. Ler o artigo original novamente para ver o que você perdeu da primeira vez também pode ser útil.


Calmodulin

A calmodulina, ou proteína modulada pelo cálcio, é uma proteína de ligação ao cálcio encontrada no citoplasma de todas as células eucarióticas. Ele interage com muitas outras proteínas na célula e atua como um regulador ou uma molécula efetora em uma ampla variedade de funções celulares. Essas funções incluem coisas tão diversas como regulação do ciclo celular, sinalização intracelular, fertilização e contração muscular. A calmodulina está em uma família de proteínas junto com a troponina C, outra proteína essencial de ligação ao cálcio envolvida na contração muscular. A calmodulina é uma proteína essencial com mutações em qualquer um dos genes que codificam a calmodulina ou danos aos locais de ligação da calmodulina costumam ser letais.


Conteúdo

A calmodulina é uma proteína pequena e altamente conservada com 148 aminoácidos de comprimento (16,7 & # 160KDa). A proteína tem dois domínios globulares aproximadamente simétricos, cada um contendo um par de motivos de mão EF (o N- e C-domain) separados por uma região ligante flexível para um total de quatro sítios de ligação de Ca 2+. & # 915 & # 93 Cada motivo da mão permite que a calmodulina detecte os níveis de cálcio intracelular ligando-se a um íon Ca 2+. As regiões de ligação do íon cálcio são encontradas nas seguintes posições na sequência de aminoácidos: 21–32, 57–68, 94–105 e 130–141 cada região à qual o cálcio se liga tem exatamente 12 aminoácidos de comprimento. Essas regiões estão localizadas entre duas hélices alfa nos motivos da mão EF, as duas primeiras regiões (21-32 e 57-68) estão em um lado da região do ligante e as outras duas (94-105 e 130-141) estão ligadas o outro lado. & # 914 e # 93

Importância da flexibilidade na calmodulina

A calmodulina se liga a uma grande variedade de proteínas-alvo, tornando-se especialmente importante para ela ter flexibilidade. Embora a flexibilidade da calmodulina seja mais evidente quando ela está ligada a uma proteína-alvo, estudos de RMN mostraram que a região de ligação da calmodulina é flexível, mesmo quando não está ligada a uma proteína-alvo. Outra característica importante da calmodulina que permite que ela se ligue a uma grande variedade de proteínas alvo é a forma genérica dos sulcos não polares nos locais de ligação. Como os sulcos não polares são genéricos, eles não exigem que as proteínas-alvo tenham qualquer sequência específica de aminoácidos, permitindo a ligação de uma variedade maior de proteínas-alvo. Juntas, essas duas características estruturais da calmodulina permitem que ela se ligue com flexibilidade às proteínas alvo com várias formas e sequências de aminoácidos. & # 915 & # 93 Por exemplo, a calmodulina liga-se aos receptores NMDA e aos canais de potássio, que diferem em comprimento em cerca de 50 resíduos de aminoácidos. & # 916 & # 93 & # 917 & # 93

Similaridade com a troponina C

A estrutura da calmodulina é muito semelhante à estrutura da troponina C (que é outra proteína de ligação ao cálcio). Ambos são membros da superfamília EFh. A troponina C, como a calmodulina, tem dois domínios globulares que são conectados por uma região de ligação. & # 918 & # 93 No entanto, a troponina C e a calmodulina diferem no comprimento da região de ligação; a região de ligação da calmodulina é menor do que a da troponina C. & # 918 & # 93 Essas estruturas notavelmente semelhantes são um exemplo de como o motivo da mão EF é altamente conservado em proteínas de ligação de cálcio. Embora tenham estruturas semelhantes, suas funções são muito diferentes. A troponina C tem uma função muito específica (para provocar uma mudança conformacional na troponina I), causando uma contração nos músculos esqueléticos. A calmodulina evoluiu para se ligar a uma ampla variedade de proteínas-alvo, permitindo que desempenhe um papel em muitos eventos fisiológicos. & # 915 & # 93 & # 918 & # 93


Ligação de cátions divalentes à espectrina de eritrócitos

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O uso de ESI-MS para investigar a ligação de cátions divalentes à calmodulina

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Resultado da pesquisa: contribuição para o jornal ›Artigo› revisão por pares

T1 - O uso de ESI-MS para investigar a ligação de cátions divalentes à calmodulina

As proteínas N2 - evoluíram com locais distintos para a ligação de íons metálicos específicos. Isso permite que as metaloproteínas executem uma miríade de tarefas especializadas com conformações feitas sob medida pela combinação de sua sequência primária e o efeito sobre ela do íon metálico ligado. Aqui nós investigamos a seletividade da proteína desencadeadora de cálcio calmodulina para íons metálicos divalentes. Esta proteína ubíqua e altamente abundante existe em equilíbrio entre sua apo e sua forma holo, onde quatro íons de cálcio estão ligados. Dentre suas diversas funções, a calmodulina modula a concentração de cálcio presente nas células, mas essa propriedade funcional a torna alvo de competição com outros íons metálicos. Nós estudamos a competição representada por quatro outros cátions divalentes para os sítios de ligação de cálcio na calmodulina usando espectrometria de massa de ionização por eletrospray (ESI-MS). Escolhemos dois outros cátions do grupo II Mg (2+), Sr (2+) e dois metais pesados ​​Cd (2+), Pb (2+). A facilidade com que cada um desses metais se liga à apo e ao holo CaM [4Ca] é descrita. Descobrimos que cada íon metálico tem propriedades diferentes com relação à ligação da calmodulina e competição com o cálcio. A ordem de afinidade para apo CaM é Ca (2+) & gt & gt Sr (2+) aproximadamente Mg (2+) & gt Pb (2+) aproximadamente Cd (2+). Na presença de cálcio, a afinidade se altera para Pb (2+) & gt Ca (2+) & gt Cd (2+) & gt Sr (2+) & gt Mg (2+). Uma vez que os complexos foram formados entre os íons metálicos e a proteína (CaM: [xM]), investigamos se a mudança estrutural que deve acompanhar a ligação de cálcio para permitir a ligação ao alvo ocorre para um determinado sistema CaM: [xM]. Usamos um peptídeo alvo de 20 resíduos, que forma o sítio de ligação CaM dentro da enzima óxido nítrico sintase neuronal. Nosso trabalho anterior (Shirran et al. 2005) [1] demonstrou a seletividade particular deste sistema para CaM: 4Ca (2+). Descobrimos que junto com Ca (2+) apenas Pb (2+) forma complexos da forma CaM: 4M (2 +): nNOS. Este trabalho demonstra a afinidade pelo cálcio acima de todos os outros metais, mas também alerta sobre a capacidade do chumbo de substituir o cálcio com aparente facilidade.

AB - As proteínas evoluíram com locais distintos para a ligação de íons metálicos específicos. Isso permite que as metaloproteínas realizem uma miríade de tarefas especializadas com conformações feitas sob medida pela combinação de sua sequência primária e o efeito sobre ela do íon metálico ligado. Aqui nós investigamos a seletividade da proteína desencadeadora de cálcio calmodulina para íons metálicos divalentes. Esta proteína ubíqua e altamente abundante existe em equilíbrio entre sua apo e sua forma holo, onde quatro íons de cálcio estão ligados. Dentre suas diversas funções, a calmodulina modula a concentração de cálcio presente nas células, mas essa propriedade funcional a torna alvo de competição com outros íons metálicos. Nós estudamos a competição representada por quatro outros cátions divalentes para os sítios de ligação de cálcio na calmodulina usando espectrometria de massa de ionização por eletrospray (ESI-MS). Escolhemos dois outros cátions do grupo II Mg (2+), Sr (2+) e dois metais pesados ​​Cd (2+), Pb (2+). A facilidade com que cada um desses metais se liga à apo e ao holo CaM [4Ca] é descrita. Descobrimos que cada íon metálico tem propriedades diferentes com relação à ligação da calmodulina e competição com o cálcio. A ordem de afinidade para apo CaM é Ca (2+) & gt & gt Sr (2+) aproximadamente Mg (2+) & gt Pb (2+) aproximadamente Cd (2+). Na presença de cálcio, a afinidade se altera para Pb (2+) & gt Ca (2+) & gt Cd (2+) & gt Sr (2+) & gt Mg (2+). Uma vez que os complexos foram formados entre os íons metálicos e a proteína (CaM: [xM]), investigamos se a mudança estrutural que deve acompanhar a ligação de cálcio para permitir a ligação ao alvo ocorre para um determinado sistema CaM: [xM]. Usamos um peptídeo alvo de 20 resíduos, que forma o sítio de ligação CaM dentro da enzima óxido nítrico sintase neuronal. Nosso trabalho anterior (Shirran et al. 2005) [1] demonstrou a seletividade particular deste sistema para CaM: 4Ca (2+). Descobrimos que junto com Ca (2+) apenas Pb (2+) forma complexos da forma CaM: 4M (2 +): nNOS. Este trabalho demonstra a afinidade pelo cálcio acima de todos os outros metais, mas também alerta sobre a capacidade do chumbo de substituir o cálcio com aparente facilidade.


Ligação de cátions divalentes à calmodulina - Biologia

Geoffrey Hoops (Butler University)

Descrição

A tuberculose é uma das principais causas de morte em todo o mundo hoje, causada pela bactéria Mycobaterium tuberculosis. Múltiplas enzimas, incluindo esterase Rv0045c de M. tuberculosis, auxiliam na persistência da doença. Eu investiguei a inibição do Rv0045c por metais divalentes e os componentes estruturais do Rv0045c responsáveis ​​por sua regulação. Ensaios cinéticos de estado estacionário foram executados usando substratos de éster fluorogênico para analisar o efeito de cátions de metal divalente na catálise Rv0045c. Com base nos resultados dos dados cinéticos, diversos metais divalentes parecem servir como inibidores alostéricos de Rv0045c, pois o valor KM permaneceu estável ao longo dos ensaios, apesar da presença de metais divalentes, enquanto o valor kcat diminuiu drasticamente. Os seguintes metais inibiram Rv0045c com diferentes especificidades, conforme medido pelos valores de IC50: Cobre (Cu2 + 10-5,9M), Zinco (Zn2 + 10-5,6M), Níquel (Ni2 + 10-4,6M) e Cobalto (Co2 + 10-3,5M) . A remoção do marcador 6X His pela enzima trombina falhou em remover o efeito inibitório dos íons de metal divalente, indicando que o marcador de purificação de afinidade não é o local de ligação do metal divalente. Em uma tentativa de localizar o sítio de ligação alostérico desses cátions metálicos divalentes, mudei os resíduos de ligação de aminoácidos potenciais para alanina por meio de mutagênese dirigida ao sítio. A cinética de inibição de metal do Rv0045c de tipo selvagem foi comparada com nove variantes do Rv0045c. Um resíduo diferente com potencial significativo de ligação foi mutado para glutamina em vez de alanina, para reter a estrutura e função da proteína para comparação com WT.

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Sítio de ligação de cátions metálicos de transição divalentes na Esterase Rv0045c de Mycobacterium tuberculosis

A tuberculose é uma das principais causas de morte em todo o mundo hoje, causada pela bactéria Mycobaterium tuberculosis. Múltiplas enzimas, incluindo esterase Rv0045c de M. tuberculosis, auxiliam na persistência da doença. Eu investiguei a inibição do Rv0045c por metais divalentes e os componentes estruturais do Rv0045c responsáveis ​​por sua regulação. Ensaios cinéticos de estado estacionário foram executados usando substratos de éster fluorogênico para analisar o efeito de cátions de metal divalente na catálise Rv0045c. Com base nos resultados dos dados cinéticos, diversos metais divalentes parecem servir como inibidores alostéricos de Rv0045c, pois o valor KM permaneceu estável ao longo dos ensaios, apesar da presença de metais divalentes, enquanto o valor kcat diminuiu drasticamente. Os seguintes metais inibiram Rv0045c com diferentes especificidades, conforme medido pelos valores de IC50: Cobre (Cu2 + 10-5,9M), Zinco (Zn2 + 10-5,6M), Níquel (Ni2 + 10-4,6M) e Cobalto (Co2 + 10-3,5M) . A remoção do marcador 6X His pela enzima trombina falhou em remover o efeito inibitório dos íons de metal divalente, indicando que o marcador de purificação de afinidade não é o local de ligação do metal divalente. Em uma tentativa de localizar o sítio de ligação alostérico desses cátions metálicos divalentes, mudei os resíduos de ligação de aminoácidos potenciais para alanina por meio de mutagênese dirigida ao sítio. A cinética de inibição de metal do Rv0045c de tipo selvagem foi comparada com nove variantes do Rv0045c. Um resíduo diferente com potencial significativo de ligação foi mutado para glutamina em vez de alanina, para reter a estrutura e função da proteína para comparação com WT.


V. NSCCs bloqueados por aminoácidos

As condutâncias iônicas ativadas por aminoácidos, especificamente por glutamato e glicina, são críticas para a transmissão sináptica e outros fenômenos fisiológicos complexos em animais (Dingledine et al., 1999). As condutâncias ativadas por aminoácidos são mediadas por receptores ionotrópicos de glutamato. Após a ligação do glutamato ou da glicina, os receptores ionotrópicos do glutamato (iGluRs) formam canais catiônicos com seletividade, condutância, cinética e farmacologia variáveis ​​(Dingledine et al., 1999). Genes com semelhanças com aqueles que codificam receptores de glutamato ionotrópicos animais foram encontrados em plantas (Lam et al., 1998). Vinte genes semelhantes ao receptor de glutamato (denominados GLRs Fig. 5) são encontrados no genoma de Arabidopsis thaliana e são divididos em três subgrupos com base na similaridade de sequência (Lacombe et al., 2001 Chiu et al., 2002). A familia de GLR genes em plantas mostram uma grande divergência de sua contraparte animal, particularmente na região dos poros (Davenport, 2002). Como a análise funcional está faltando, ainda não se sabe que tipo de canal é codificado por GLRs, mas com base na homologia geral com suas contrapartes animais, acredita-se que os GLRs sejam uma subclasse de NSCC controlada por ligante (Davenport, 2002).

Em animais, muitos iGluRs são NSCCs. Alguns deles formam NSCCs permeáveis ​​a Ca 2+ com propriedades semelhantes aos VI-NSCCs constitutivos de plantas superiores. Dennison & Spalding (2000) relataram que a aplicação extracelular de glutamato gerou aumentos transitórios na [Ca 2+]cyt no Arabidopsis mudas. Os lantanídeos inibiram esse efeito, assim como a remoção do banho de Ca 2+, sugerindo que o Ca 2+ entrou no citosol através dos canais de cátions ativados por glutamato. Usando o mesmo sistema experimental, Dubos et al. (2003) descobriram que a adição de glicina também pode elevar [Ca 2+]cyt. Eles também mostraram que a glicina tem efeitos sinérgicos quando adicionada simultaneamente ao glutamato, provavelmente porque aumenta a afinidade da ligação do glutamato ao receptor. Demidchik et al. (2004) obtiveram dados sobre protoplastos isolados de diferentes tecidos radiculares e demonstraram que quantidades semelhantes de glutamato induziram maiores aumentos na [Ca 2+]cyt em células epidérmicas e corticais maduras em comparação com células de tecidos mais profundos. Esses autores também realizaram a primeira caracterização eletrofisiológica de correntes ativadas por glutamato em plantas e descobriram que a probabilidade de observar condutâncias ativadas por glutamato é baixa e aumenta com o aumento das concentrações de glutamato. As condutâncias ativadas por glutamato registradas foram não seletivas para cátions monovalentes, Ca 2+ -permeável, voltagem independente e revelaram cinética de ativação instantânea. A atividade do canal foi sensível a quinino e lantanídeos, assemelhando-se à farmacologia dos VI-NSCCs constitutivos.

A funcionalidade dos receptores de glutamato ionotrópicos de plantas tem sido questionada, principalmente no que diz respeito à disponibilidade do ligante no compartimento extracelular. No entanto, vários estudos mostraram que as concentrações apoplásticas de glutamato e glicina podem variar de 0,01 a 1 m m (Lohaus et al., 1995, 2001 Lohaus & Heldt, 1997). Tais concentrações são altas o suficiente para ativar os receptores ionotrópicos de glutamato, e o glutamato apoplástico e a glicina poderiam, portanto, funcionar na captação de Ca 2+ pela planta e/ou sinalização.

Apesar da falta de caracterização eletrofisiológica, efeitos dos aminoácidos exógenos na fisiologia da célula vegetal e propriedades fenotípicas de glr mutantes knockout têm sido objeto de intensas investigações durante os últimos 5 anos. Vários estudos mostraram que a exposição ao glutamato extracelular modifica os processos fisiológicos dependentes de Ca 2+, como despolimerização de microtúbulos, alongamento celular e respostas ao alumínio (Sivaguru et al., 2003), ramificação da raiz (Walch-Liu et al., 2006) e detecção de açúcar (Dubos et al., 2005). Perda de mutações de função em Oryza sativa GLR3.1 (Li et al., 2006) e AtGLR3.2 (Kim et al., 2001 Turano et al., 2002) mostraram seu envolvimento no acúmulo de Ca 2+ e reações mediadas por Ca 2+, por exemplo, respostas ao estresse, morte celular programada, divisão e diferenciação celular. AtGLR 1.1 podem estar envolvidos na germinação de sementes e processos mediados por ABA (Kang & Turano, 2003 Kang et al., 2004). Superexpressão de um rabanete GLR (Kang et al., 2006) em Arabidopsis transiente ativado por glutamato intensificado [Ca 2+]cyt elevação e mecanismos alterados mediados por Ca 2+, como necrose, crescimento e desenvolvimento. Além disso, resultou em maior resistência a um patógeno fúngico, possivelmente devido à regulação positiva dos genes da defensina responsivos ao ácido jasmônico. Fortes evidências de que GLR3.3 forma canais permeáveis ​​de Ca 2+ foram recentemente obtidas por Qi et al. (2006). Despolarização e elevação de [Ca 2+]cyt induzidos por glutamato foram evitados em glr3.3 mutantes nocaute. Curiosamente, além do glutamato, cinco outros aminoácidos (glicina, alanina, serina, asparagina e cisteína) e glutationa (g-glutamil-cisteinil-Gly) demonstraram ser agonistas das respostas induzidas por GLR3.3. No geral, esses dados sugerem fortemente que o glutamato causa efeitos fisiológicos por meio de um aumento na [Ca 2+]cyt catalisado por iGluRs. Alguns desses efeitos, por exemplo, sinalização ABA alterada, também podem ser mediados por ROS, porque um aumento na [Ca 2+]cyt ativa as NADPH oxidases ligadas à membrana (Sagi & Fluhr, 2001).


Fontes:

Bertini, Gray, Steifel, Valentine. Biological Inorganic Chemistry, Fifth Edition, W.H. Freeman and Co., Nova York, 2010.

& ldquoCalmodulin. & rdquo Wikipedia: The Free Encyclopedia. Wikimedia Foundation, Inc. 29 de julho de 2016. Web. 7 de setembro de 2016.

Kuboniwa, H., N. Tjandra, S. Grzesiek, H. Ren, C. B. Klee e A. Bax. & ldquoEstrutura da solução da calmodulina sem cálcio. & rdquo Nature Structural Biology 2, não. 9 (setembro de 1995): 768 e ndash76. (Código PDB 1CFD)

Babu, Y.Sudhakar, Charles E. Bugg e William J. Cook. & ldquoEstrutura da calmodulina refinada na resolução 2.2 & Aring. & rdquo Journal of Molecular Biology 204, não. 1 (5 de novembro de 1988): 191 e ndash204. doi: 10.1016 / 0022-2836 (88) 90608-0. (Código PDB 3CLN)


Resumo

A melatonina foi sugerida como um antagonista fisiológico da calmodulina. Neste trabalho, caracterizamos os locais de ligação da melatonina em Xenopus laevis membranas oocitárias. Ligação de [125 I] melatonina por X. laevis as membranas do oócito preenchem todos os critérios de ligação a um local receptor. A ligação era dependente do tempo, temperatura e concentração da membrana e era estável, reversível, saturável e específica. O sítio de ligação também foi caracterizado farmacologicamente. Estudos estequiométricos mostraram um sítio de ligação de alta afinidade com um Kd de 1,18 nM. Esses dados estão em estreita concordância com os dados obtidos de estudos cinéticos (Kd= 0,12 nM). Em estudos de competição, observamos um sítio de ligação de baixa afinidade (Kd= 63,41 µM). Além disso, o sítio de ligação foi caracterizado como calmodulina. Assim, a ligação era dependente de cálcio e bloqueada por anticorpos anti-CaM de uma maneira dependente da concentração. O inibidor da calmodulina clorpromazina também inibiu a ligação do marcador. A partir desses resultados, sugere-se que a calmodulina ligada à membrana atua como um sítio de ligação da melatonina em Xenopus laevis oócitos, onde pode acoplar as atividades celulares aos níveis circulantes rítmicos de melatonina. Esta hipótese se correlaciona com as descobertas anteriores que descrevem a melatonina como um antagonista fisiológico da calmodulina. - Romero, M. P., Garcı´a-Pergan˜eda, A., Guerrero, J. M., Osuna, C. Calmodulina ligada à membrana em Xenopus laevis oócitos como um novo local de ligação para a melatonina. FASEB J. 12, 1401–1408 (1998)

Abreviações

A melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina), 2 o principal produto endócrino da glândula pineal, desempenha um papel importante na regulação dos ritmos circadianos, bem como em muitas funções fisiológicas em mamíferos (1). Esta indolamina exibe um ritmo secretor circadiano que transmite informações ambientais ao organismo. Quatro mecanismos de ação foram descritos para a melatonina: ligação a receptores de membrana (2, 3) e possivelmente a sítios de ligação nuclear (4, 5), como um eliminador de radicais livres de oxigênio (6), ou ligação a proteínas de ligação de Ca 2+ tal como calmodulina (Ca 2+ / CaM) (7) ou proteína quinase C (8).

CaM é uma proteína de ligação a Ca 2+ de 17 kDa altamente conservada encontrada em todas as células eucarióticas. É uma molécula multifuncional e ubíqua (9) que medeia muitos sistemas enzimáticos regulados por Ca 2+ e processos celulares quando complexada com este cátion divalente (10–13). CaM demonstrou ser essencial para a progressão do ciclo celular em muitos organismos eucarióticos. Assim, o CaM é conhecido por ser importante no controle da progressão em três pontos do ciclo celular: o início da síntese de DNA (limite G1 / S), o início da mitose (G2 / M) e na transição metáfase / anáfase da mitose para permitir a segregação cromossômica e a conclusão da mitose (14). Os dados disponíveis sugerem que o CaM também modula a transcrição gênica por meio de proteínas quinases dependentes de CaM (15), bem como a replicação do DNA por meio do controle das atividades das DNA polimerases (16, 17).

A mudança conformacional induzida por Ca 2+ permite que CaM interaja com enzimas, peptídeos e agentes farmacológicos como as fenotiazinas. Benítez-King et al. (18) e Antón-Tay et al. (19) demonstraram que a melatonina se liga ao CaM com alta afinidade, e este poderia ser o mecanismo pelo qual a melatonina modula muitas funções Ca 2+ intracelulares, como rearranjos do citoesqueleto (20), níveis celulares de CaM e atividade de fosfodiesterase dependente de CaM (21) , Ca 2+ / Mg 2+ ATPase (22), proteína quinase dependente de CaM II (23) ou, como previamente relatado por nosso grupo, atividade de óxido nítrico sintase (24–26). Por meio do CaM, a melatonina pode afetar diretamente a sinalização de Ca 2+ ao interagir com enzimas-alvo, como adenilato ciclase e fosfodiesterase, bem como com proteínas estruturais.

O desenvolvimento de 2- [125 I] iodomelatonina ([125 I] melatonina), um agonista do receptor de melatonina de alta afinidade, como um radioligante permitiu que a distribuição e as características farmacológicas dos locais de ligação da melatonina fossem examinadas em vários tecidos de uma série de espécies (27-29). A existência de um receptor de melatonina em Xenopus laevis os melanóforos dérmicos são bem conhecidos. A capacidade do hormônio de causar agregação de melanina nessas células é uma das primeiras ações descritas da melatonina (para revisão, ver ref 30). Além disso, culto Xenopus melanóforos dérmicos foram recentemente usados ​​para clonar com sucesso um cDNA do receptor de melatonina de alta afinidade (31).

Aqui, demonstramos a presença de um sítio de ligação de alta afinidade para a melatonina em Xenopus laevis membranas oocitárias. A ligação da melatonina às membranas era dependente do tempo, temperatura e concentração da membrana e era estável, reversível, saturável e específica. Além disso, a ligação era dependente de cálcio e o local de ligação foi caracterizado como calmodulina. A ligação da melatonina às membranas foi bloqueada por anticorpos anti-CaM. Esses resultados apóiam a evidência da ligação específica da melatonina ao CaM em sistemas biológicos e enfatizam a importância da calmodulina como um modulador da ação hormonal (32).


Reconhecimento de alvo por calmodulina: Dissecando a cinética e a afinidade de interação usando sequências de peptídeos curtas

A interação entre a calmodulina (CaM) e o peptídeo M13, sua sequência de ligação ao alvo da cadeia leve quinase da miosina do músculo esquelético, envolve predominantemente dois conjuntos de interações, entre os resíduos alvo N-terminais e o domínio C da calmodulina, e entre os C- resíduos alvo terminais e o domínio N da calmodulina (Ikura M et al., 1992, Science 256: 632–638). Usando peptídeos sintéticos curtos com base nas duas metades da sequência alvo, as interações com a calmodulina e seu domínio C separado foram estudadas por fluorescência e espectroscopia de CD, ligação de cálcio e técnicas cinéticas. O peptídeo WF10 (resíduos 1-10 de M13) se liga ao CaM com Kd ≈︁ 1 μM de peptídeo FW10 (resíduos 9-18 de M13, com substituição Phe-17 → Trp) se liga a CaM com Kd ≈︁ 100 μM. O efeito do peptídeo WF10 na ligação do cálcio à calmodulina produz uma curva de saturação bifásica, com acentuado aumento da afinidade para a ligação de dois íons de cálcio ao domínio C, formando um complexo estável semissaturado, Ca2-CaM-peptídeo, e confirmando a importância funcional da interação desta sequência com o domínio C. Estudos de fluxo interrompido mostram que a dissociação induzida por EGTA de WF10 de Ca4-CaM procede por um mecanismo de relaxamento reversível de um estado intermediário cinético, envolvendo também meia saturação de CaM, e o mesmo mecanismo é evidente para o peptídeo alvo completo. A interação dos resíduos alvo N-terminal com o domínio C é energeticamente o componente mais importante, mas a interação da calmodulina com toda a sequência alvo é necessária para induzir a interação cooperativa total dos dois elementos contíguos da sequência alvo com ambos N- e domínios C da calmodulina. Assim, a interação da calmodulina com a sequência M13 pode ser dissecada em uma base estrutural e cinética em reações parciais envolvendo intermediários que compreendem regiões distintas da sequência alvo. Propomos um mecanismo geral para a regulação do cálcio da ativação da enzima dependente da calmodulina, envolvendo um complexo intermediário formado pela interação do domínio C da calmodulina e a parte correspondente da sequência alvo. Esta espécie intermediária pode funcionar para regular a sensibilidade geral ao cálcio da ativação e para determinar a afinidade da interação calmodulina alvo.