Em formação

2.5: Técnicas de coloração diferencial - Biologia


Visualizando Células Bacterianas

O microscópio é uma ferramenta muito importante em microbiologia, mas existem limitações quando se trata de usá-lo para observar células em geral e células bacterianas em particular. O contraste, no entanto, pode ser melhorado usando um tipo diferente de sistema óptico, como contraste de fase ou um microscópio de contraste de interferência diferencial, ou colorindo as células (ou o fundo) com um corante cromogênico que não apenas adiciona contraste, mas dá eles também têm uma cor.

Existem muitos procedimentos de coloração e coloração diferentes usados ​​em microbiologia. Alguns envolvem uma única mancha e apenas algumas etapas, enquanto outros usam várias manchas e um procedimento mais complicado. Antes de iniciar o procedimento de coloração, as células devem ser montadas (manchadas) e fixadas em uma lâmina de vidro.

Um esfregaço bacteriano é simplesmente isso - uma pequena quantidade de cultura espalhada em uma película muito fina na superfície da lâmina. Para evitar que as bactérias saiam durante as etapas de coloração, o esfregaço pode ser química ou fisicamente “fixado” na superfície da lâmina. A fixação por calor é um método fácil e eficiente, e é realizada passando a lâmina brevemente pela chama de um queimador de Bunsen, o que faz com que o material biológico fique mais ou menos permanentemente fixado na superfície do vidro.

Os esfregaços fixados por calor estão prontos para a coloração. Em uma coloração simples, corantes que são atraídos por carga (um corante catiônico como azul de metileno ou violeta cristal) ou repelidos por carga (um corante aniônico como eosina ou tinta nanquim) são adicionados ao esfregaço. Corantes catiônicos ligam as células bacterianas que podem ser facilmente observadas contra o fundo brilhante. Os corantes aniônicos são repelidos pelas células e, portanto, as células são brilhantes contra o fundo manchado. Consulte as Figuras 1 e 2 para exemplos de ambos.

Figura 1. Coloração negativa de Cyptococcus neoformans, uma levedura encapsulada

Figura 2. Coloração positiva de Staphylococcus aureus.

Provavelmente, a característica mais importante que fica óbvia quando você mancha as células bacterianas é a sua celular morfologia (não deve ser confundido com a morfologia colonial, que é o aparecimento de colônias bacterianas em uma placa de ágar). A maioria das bactérias heterotróficas e cultiváveis ​​vêm em algumas formas básicas: células esféricas (cocos / cocos), células em forma de bastonete (bacilo / bacilo) ou células em forma de bastonete com curvas ou torções (vibrios e espirila, respectivamente). Há uma maior diversidade de formas entre Archaea e outras bactérias encontradas em ecossistemas diferentes do corpo humano.

Freqüentemente, as bactérias criam arranjos de células, que se formam como resultado da fissão binária pelas bactérias à medida que se reproduzem. Os arranjos são particularmente óbvios com bactérias não móveis, porque as células tendem a permanecer juntas após a conclusão do processo de fissão. Tanto a forma quanto a disposição das células são características que podem ser usadas para distinguir as bactérias. As formas bacterianas mais comumente encontradas (cocos e bacilos) e seus arranjos possíveis são mostrados nas Figuras 3 e 4.

Figura 3. Possíveis arranjos de células bacterianas para cocos

Figura 4. Possíveis arranjos de células de bactérias para bacilos

Técnicas de coloração diferencial

Em microbiologia, técnicas de coloração diferencial são usadas com mais frequência do que colorações simples como meio de reunir informações sobre bactérias. Os métodos de coloração diferencial, que normalmente requerem mais de uma coloração e várias etapas, são referidos como tal porque permitem a diferenciação de tipos de células ou estruturas celulares. O mais importante deles é a coloração de Gram. Outros métodos de coloração diferencial incluem a coloração de endosporo (para identificar bactérias formadoras de endosporo), a coloração ácido-resistente (para discriminar Mycobacterium espécies de outras bactérias), uma coloração metacromática para identificar grânulos de armazenamento de fosfato e a coloração de cápsula (para identificar bactérias encapsuladas). Estaremos realizando os procedimentos de coloração de Gram e de endosporo em laboratório, e veremos as lâminas preparadas que destacam algumas das outras estruturas celulares presentes em algumas bactérias.

HomeGram Stain

Figura 5. Bactérias coradas com coloração de Gram.

Em 1884, o médico Hans Christian Gram estudava a etiologia (causa) de doenças respiratórias como a pneumonia. Ele desenvolveu um procedimento de coloração que lhe permitiu identificar uma bactéria no tecido pulmonar retirado de pacientes falecidos como o agente etiológico de um tipo fatal de pneumonia. Embora tenha feito pouco no tratamento da doença, o método de coloração de Gram tornou muito mais fácil diagnosticar a causa da morte de uma pessoa na autópsia. Hoje usamos as técnicas de coloração de Gram para auxiliar na identificação de bactérias, começando com uma classificação preliminar em um dos dois grupos: Gram positivo ou Gram negativo.

A natureza diferencial da coloração de Gram é baseada na capacidade de algumas células bacterianas de reter uma coloração primária (cristal violeta) resistindo a um processo de descoloração. A coloração de Gram envolve quatro etapas. As primeiras células são coradas com violeta cristal, seguido pela adição de um agente de fixação para a mancha (iodo). Em seguida, é aplicado álcool, que remove seletivamente a mancha apenas das células Gram negativas. Finalmente, um corante secundário, safranina, é adicionado, que contrai o rosa das células descoloridas.

Embora Gram não soubesse na época, a principal diferença entre esses dois tipos de células bacterianas são suas paredes celulares. As paredes das células Gram negativas têm uma membrana externa (também chamada de envelope) que se dissolve durante a lavagem com álcool. Isso permite que o corante violeta cristal escape. Apenas as células descoloridas absorvem o corante rosa safranina, o que explica a diferença de cor entre os dois tipos de células. Na conclusão do procedimento de coloração de Gram, as células Gram positivas aparecem roxas e as células Gram negativas aparecem em rosa.

Ao interpretar um esfregaço com coloração de Gram, você também deve descrever a morfologia (forma) das células e sua disposição. Na Figura 5, existem dois tipos distintos de bactérias, distinguíveis pela reação de coloração de Gram, e também por sua forma e arranjo. Abaixo, descreva essas características para ambas as bactérias:

Bactéria Gram positiva:Bactéria Gram negativa:
Morfologia
Arranjo

HomeAcid Fast Stain

Algumas bactérias produzem a substância cerosa micólico ácido quando eles constroem suas paredes celulares. O ácido micólico atua como uma barreira, protegendo as células da desidratação, bem como da fagocitose pelas células do sistema imunológico de um hospedeiro. Esta barreira cerosa também impede que as manchas penetrem na célula, razão pela qual a coloração de Gram não funciona com micobactérias, como Mycobacterium, que são patógenos de humanos e animais. Para essas bactérias, o ácidovelozes mancha técnica é usada.

Figura 6. Bacilos álcool-ácido resistentes na expectoração

Para realizar a coloração ácido-resistente, um esfregaço fixado por calor é inundado com a coloração primária de carbol-fucsina, enquanto a lâmina é aquecida em banho-maria. O calor “derrete” a parede celular cerosa e permite a absorção do corante pelas células. Em seguida, a lâmina é deixada esfriar e uma solução de ácido e álcool é adicionada como um descolorante. As células que são “ácido-resistentes” por causa do ácido micólico em sua parede celular resistem à descoloração e retêm a coloração primária. Todos os outros tipos de células serão descoloridos. O azul de metileno é então usado como contraste. No final, as bactérias ácido-resistentes (AFB) serão coradas com uma cor rosa brilhante e todos os outros tipos de células aparecerão em azul.

Métodos de coloração para destacar estruturas celulares específicas

Cápsula: A gosma polissacarídica que envolve algumas espécies de bactérias e alguns tipos de micróbios eucarióticos é melhor visualizada quando as células são coradas negativamente. Nesse método, as bactérias são primeiro misturadas com a mancha e, em seguida, uma gota da mistura é espalhada pela superfície de uma lâmina no filme fino. Com este método, as cápsulas aparecem como uma camada transparente em torno das células bacterianas, com o fundo manchado de escuro.

Metacromático grânulos ou de outros intracitoplasmático corpos: Algumas bactérias podem conter corpos de armazenamento que podem ser manchados. Um exemplo são os bacilos Gram positivos Corynebacterium, que armazena fosfato em estruturas chamadas “volutina” ou grânulos metacromáticos que estão alojados dentro da membrana celular. Vários métodos de coloração são usados ​​para visualizar corpos intracitoplasmáticos em bactérias, que muitas vezes fornecem uma pista de identificação quando observados em células.

Endospore Stain

Endosporos são formas dormentes de bactérias vivas e não devem ser confundidos com esporos reprodutivos produzidos por fungos. Essas estruturas são produzidas por alguns gêneros de bactérias Gram-positivas, quase todos bacilos, em resposta a condições ambientais adversas. Duas bactérias comuns que produzem endosporos são Bacilo ou Clostridum. Ambos vivem principalmente no solo e como simbiontes de plantas e animais, e produzem endosporos para sobreviver em um ambiente que muda rápida e frequentemente.

O processo de endosporulação (a formação de endosporos) envolve vários estágios. Depois que a célula bacteriana replica seu DNA, camadas de peptidoglicano e proteína são produzidas para envolver o material genético. Uma vez totalmente formado, o endosporo é liberado da célula e pode permanecer dormente por dias, semanas ou anos. Quando condições ambientais mais favoráveis ​​prevalecem, os endosporos germinar e retornar ao serviço ativo como células vegetativas.

Os endosporos maduros são altamente resistentes às condições ambientais, como calor e produtos químicos, e isso permite a sobrevivência das espécies bacterianas por períodos muito longos. Os endosporos formados há milhões de anos foram trazidos de volta à vida com sucesso, simplesmente fornecendo-lhes água e comida.

Como o revestimento do endosporo é altamente resistente a manchas, um método especial foi desenvolvido para torná-los mais fáceis de serem vistos com um microscópio de campo claro. Este método, chamado de endosporomancha, usa tanto o calor quanto o longo tempo de exposição para induzir os endosporos a absorver a mancha primária, geralmente um corante solúvel em água, como o verde malaquita, uma vez que os endosporos são permeáveis ​​à água. Após uma etapa de descoloração que remove o corante das células vegetativas no esfregaço, a safranina contracolorada é aplicada para fornecer cor e contraste. Quando corados por este método, os endosporos são verdes e as células vegetativas coram de rosa, como mostrado na Figura 7.

Figura 7. Células bacterianas com endosporos, coradas com a coloração de endosporos.

Figura 8. Bacilos com endosporos vistos por microscopia de contraste de fase.

Embora os próprios endosporos sejam resistentes à técnica de coloração de Gram, as células bacterianas capturadas no processo de criação dessas estruturas podem ser coradas. Neste caso, os endosporos são vistos como áreas ovais ou esféricas claras dentro da célula corada. Os endosporos também podem ser observados diretamente nas células usando microscopia de contraste de fase, como mostrado na Figura 8.

Como muitos métodos de coloração diferencial requerem várias etapas e demoram muito para serem concluídos, não realizaremos todos os métodos de coloração diferencial discutidos acima.

Lâminas pré-coradas serão usadas para visualizar cápsulas bacterianas, grânulos metacromáticos e bacilos álcool-ácido resistentes. Obtenha uma lâmina de cada uma das três bactérias listadas na tabela abaixo. Ao visualizar esses slides, anote as estruturas “destacadas”. Seu isolado ambiental pode ter um ou mais desses recursos celulares, e aprender a reconhecê-los ajudará na identificação. Todos eles devem ser vistos usando as lentes objetivas de imersão em óleo.

BactériaManchaDescrição ou esboço de células com o recurso especificado
Flavobacterium capsulatumColoração da cápsula
Corynebacterium diphtheriaeAzul de metileno (grânulos metacromáticos)
Mycobacterium tuberculosisColoração rápida de ácido

Gram Stain

Todos os procedimentos de coloração devem ser feitos em uma pia. O procedimento de coloração de Gram será demonstrado e uma visão geral é fornecida na Tabela 1.

Tabela 1. Etapas do procedimento da coloração de Gram.
EtapaProcedimentoResultado
Mancha primária (violeta de cristal)Adicione várias gotas de violeta cristal ao esfregaço e deixe descansar por 1 minuto. Lave a lâmina com água.As células Gram-positivas e Gram-negativas serão coradas de roxo pelo corante violeta cristal.
Mordant (iodo)Adicione várias gotas de iodo ao esfregaço e deixe descansar por 1 minuto. Lave a lâmina com água.O iodo “fixa” o cristal violeta, então os dois tipos de bactérias permanecerão roxos.
Descoloração (etanol)Adicione gotas de etanol 1 no uma Tempo até que o escoamento esteja limpo. Lave a lâmina com água.As células Gram-positivas resistem à descoloração e permanecem roxas. O corante é liberado das células Gram-negativas.
Contracoloração (safranina)Adicione várias gotas de safranina ao esfregaço e deixe-o repousar por um minuto. Enxágüe a lâmina com água e seque.As células Gram-negativas serão coradas de rosa pela safranina. Este corante não tem efeito nas células Gram-positivas, que permanecem roxas.

Um voluntário de sua bancada de laboratório deve obter culturas das bactérias que você usará neste laboratório, conforme orientação de seu instrutor. Uma das culturas será uma bactéria Gram positiva e a outra será Gram negativa. Abaixo, escreva os nomes das bactérias que você usará, junto com o BSL para cada cultura:

__________________________________________________________________________________

Obtenha duas lâminas de vidro e prepare um esfregaço de cada uma das duas culturas bacterianas, uma por lâmina, conforme demonstrado. Deixe secar COMPLETAMENTE ao ar e fixar por calor. Corar ambos os esfregaços usando o método de coloração de Gram. Observe as lâminas com um microscópio de luz a 1.000X e registre suas observações na tabela abaixo.

Nome da culturaReação à coloração de GramMorfologia celularArranjo

“Exame final” da coloração de Gram: prepare um esfregaço que contenha uma mistura de bactérias Gram-positivas E Gram-negativas adicionando uma pequena quantidade de cada bactéria a uma única gota de água em uma lâmina. Aqueça o esfregaço e faça a coloração de Gram. Você deve ser capaz de determinar a reação à coloração de Gram, a morfologia celular e o arranjo de AMBAS as bactérias neste esfregaço misto. Seu instrutor pode pedir para ver este slide e oferecer comentários construtivos.

HomeEndospore Stain

Apenas alguns gêneros de bactérias produzem endosporos e quase todos são bacilos Gram-positivos. Mais notáveis ​​são Bacilo e Clostridium espécies, que vivem naturalmente no solo e são contaminantes comuns em superfícies. O crescimento de Clostridium spp. é normalmente limitado a ambientes anaeróbicos; Bacilo spp. pode crescer aerobicamente e anaerobicamente. As bactérias formadoras de endosporos são distintas de outros grupos de bacilos Gram positivos e distinguíveis por seus endosporos.

Uma visão geral do procedimento de coloração do endosporo é fornecida na Tabela 2.

Tabela 2. Etapas do procedimento de coloração do endosporo.
EtapaProcedimentoResultado
Mancha primária (verde malaquita)Adicione várias gotas de verde malaquita ao esfregaço e deixe descansar por 10 minutos. Se a mancha começar a secar, adicione mais gotas.As células vegetativas assumem imediatamente a mancha primária. Os endosporos são resistentes à coloração, mas eventualmente absorvem o corante.
Descoloração (água)Enxágüe a lâmina em um jato suave de água por 10-15 segundos.Uma vez que os endosporos estão manchados, eles permanecem verdes. Uma lavagem completa com água descolorirá as células vegetativas.
Contracoloração (safranina)Adicione várias gotas de safranina ao esfregaço e deixe descansar por 1 minuto. Enxágüe a lâmina e seque.As células vegetativas descoloridas assumem a contracoloração e aparecem rosa; endosporos são verdes claros.

Após a coloração, os endosporos geralmente aparecem como estruturas ovais ou esféricas verde-claras, que podem ser vistas dentro ou fora das células vegetativas, que aparecem em rosa.

A forma e a localização dos endosporos dentro das células bacterianas, juntamente com se o esporângio está distendendo (D) ou não (ND) os lados da célula, são características importantes que ajudam na diferenciação entre as espécies (ver Figura 9).

Figura 9

  1. Oval, central, não distendido (ND)
  2. Oval, terminal, ND (e cristal parasporal)
  3. Oval, terminal, distendido (D)
  4. Oval, central, D
  5. Esférico, terminal, D
  6. Oval, lateral, D

Os endosporos são bastante resistentes à maioria dos procedimentos de coloração; no entanto, em um esfregaço corado de rotina, eles podem ser visíveis como “contornos” com espaço livre dentro. Se você observar “contornos” ou o que parecem ser “fantasmas” de células em um esfregaço de bacilos Gram-positivos com coloração de Gram, então a coloração do endosporo também deve ser realizada para confirmar a presença ou ausência de endosporos.

Um voluntário de sua bancada de laboratório deve obter culturas bacterianas para coloração de endosporos, conforme orientação de seu instrutor. Observe que essas serão todas espécies de Bacilo. Prepare esfregaços e corar cada um usando a técnica de coloração de endosporo. Observe as lâminas e observe a forma e localização do endosporo e a aparência do esporângio (inchado ou não) na tabela abaixo:

Nome da culturaForma de endosporoLocalizaçãoEsporângio

Além disso, escolha UMA das culturas acima e faça a coloração de Gram. Registre seus resultados abaixo nos espaços fornecidos:

Nome da cultura corada de Gram: __________________________________________________

Reação à coloração de Gram e morfologia celular: ______________________________________

Os endosporos são visíveis no esfregaço com coloração de Gram? _________________ Se você vir endosporos, descreva como eles aparecem na preparação corada de Gram e como isso é semelhante e diferente do que você vê na preparação corada com endosporos.


Experimento de laboratório # 5 coloração diferencial

Através do processo de coloração diferencial, existem diferenças distintas entre as paredes celulares de bactérias gram-positivas e gram-negativas. No caso de bactérias gram-positivas, a parede celular é composta por 60-90% de peptidoglicano e é muito espessa. Existem numerosas camadas de ácido teicóico ligadas ao peptidoglicano, criando assim membranas celulares muito espessas que fazem com que a parede celular absorva grandes quantidades de corante básico e pareça roxa. (Laboratórios práticos. (2012)).Por outro lado, as paredes celulares das bactérias gram-negativas são muito mais finas com uma membrana celular externa composta de fosfolipídios e apenas 10-20% de peptidoglicano. Portanto, parece rosa por meio do processo de coloração diferencial. A diferença de cor pode ser atribuída à parede celular mais fina e ao processo de descoloração que ocorre com a aplicação da mistura de álcool etílico e acetona.

A utilização da solução mordente de iodo de Gramas nas bactérias gera um complexo insolúvel, atuando como um agente de ligação. Mordante é definido como uma substância, normalmente um óxido orgânico que se combina com um corante ou mancha e, assim, o fixa em um material (Wikipedia. (2013)). Quando o mordente foi aplicado, um descolorante (acetona / álcool) foi aplicado para diferenciar as estruturas de paredes celulares mais espessas (aquelas que permaneceram roxas) das estruturas de paredes celulares mais finas (aquelas que ficaram rosa).

O método de coloração diferencial permitiu a visualização das bactérias gram-positivas Staphylococcus e Lactobacillus de paredes celulares mais espessas, bem como a coloração roxa da levedura S. cerevisiae. A cor de S. cerevisiae é notável, pois se trata de um fungo. As regras de coloração diferencial não se aplicam. O fungo simplesmente pega a primeira cor / mancha utilizada, neste caso o roxo (McCarthy, Tom. (2014)). No procedimento de coloração diferencial, E. coli Gram-negativa foi visualizada e apareceu rosa.

No caso de coloração Gram-positiva, os bastonetes Lactobacillus Gram-positivos foram vistos. Essa bactéria existe em muitos alimentos populares, incluindo iogurte, queijo e na fermentação de cerveja e vinho. Alternativamente, a bactéria pode ter impacto negativo no corpo humano na forma de infecções, geralmente envolvendo o trato urinário. Outra bactéria gram-positiva, o Staphylococcus, existe no nariz e na pele dos humanos. Encontrado nesses locais, geralmente é benigno, até que haja rompimento ou lesão na pele que o introduz sistemicamente. (Stoppler, Melissa Conrad MD). O estafilococo pode ser insidioso e potencialmente fatal se não tratado, causando sepse se deixado para crescer. Uma levedura delineada como S. cerevisiae apareceu roxa nesta experiência. Isso levaria a crer que também é gram-positivo. Porém, como fungo, as regras não se aplicam, pois sua estrutura celular é diferente e assume qualquer cor que seja introduzida pela primeira vez. A única fonte rastreável de infecção ligada a S. cerevisiae é por meio do uso de S. saccromyces como probiótico durante o curso de tratamento intensivo com antibióticos e a subsequente proliferação de S. cerevisiae.

Finalmente, no caso de bactérias gram-negativas, E. coli é visualizada como colônias capsulares rosa nas lâminas de coloração diferencial. Utilizado como principal agente fermentador com enorme diversidade genética, tem sido historicamente utilizado na fabricação de cerveja, pão e vinho de arroz. (US National Library of Medicine. Maio de 2010)). Embora a E. coli exista no corpo humano, a introdução de variantes prejudiciais por meio da ingestão de alimentos contaminados, por exemplo, pode causar diarreia (com sangue), desidratação e insuficiência renal.

Laboratórios práticos. (2012). A Laboratory Manual of Small-Scale Experiments for the Independent Study of Microbiology. Englewood, CO.


Laboratório 5: Estrutura celular e coloração usando microscopia 1

Instruções: Baixe este documento MSWord para o seu computador e responda às perguntas conforme solicitado. Em seguida, salve o documento e carregue-o no Bb usando o recurso de Atribuição fornecido. Esta tarefa vale um total de 100 pontos - são 20 questões que valem 5 pontos cada.

No Laboratório 3, você foi apresentado à microscopia. Neste laboratório, você aumentará essa experiência revisando as diferenças na estrutura celular de procariontes e eucariotos (abordadas anteriormente na Unidade de aula nº 1) e aprendendo sobre a coloração de micróbios.

Parte I. Preparação do esfregaço no domínio da microbiologia.
Faça login no MM, vá para a Área de Estudo e, em seguida, para o Microlab Tutor “Preparação do esfregaço”. Depois de assistir ao vídeo curto, responda à seguinte pergunta: 1. Liste as principais etapas na preparação do esfregaço

Se a lâmina não estiver limpa, limpe-a.
Rotule o slide.
Faça um círculo do tamanho de uma moeda de dez centavos
Coloque uma gota de solução salina na lâmina.
Esterilize a alça / ou use uma alça estéril e obtenha a cultura das bactérias da placa de Petri ou tubo. Colha cultura apenas o suficiente. (use apenas uma pequena quantidade de cultura para preparar um esfregaço) Espalhe as bactérias na lâmina de vidro. Defina o slide para secar ao ar. Correção de calor ou correção de metanol. (não conserte dos dois jeitos)

Mancha as lâminas.
Descarte adequadamente todos os resíduos. (Resíduos de metanol, materiais contaminados com bactérias, vidros quebrados)

Parte II. Seções Atlas
Em seu Atlas de laboratório, você precisará ler a Seção 5: Morfologia celular bacteriana e manchas simples e a Seção 6: Estruturas celulares bacterianas e manchas diferenciais e, em seguida, responder às seguintes perguntas: 2. Qual é a terceira característica importante da microscopia? Porque?

A terceira característica importante da microscopia é o contraste. Para ser visível, a amostra deve contrastar com o fundo do campo do microscópio.

3. Uma coloração simples ajudará a determinar estas 3 características da amostra na lâmina: a morfologia celular, o tamanho e a disposição podem então ser determinados.

4-A. Qual parte da mancha é responsável por sua COR?

O cromóforo é responsável pela cor da mancha.

4-B. Cite 3 exemplos de manchas básicas:
Azul de metileno, violeta cristal e safranina.

5. Liste as três coisas que a fixação por calor atinge um esfregaço antes da coloração: A fixação por calor mata a maioria das bactérias, faz com que elas adiram à lâmina e coagule as membranas citoplasmáticas para torná-las mais visíveis. Também distorce as células até certo ponto.

6. Quais são os três tipos de morfologia celular em bactérias?

Esferas (cocos, cocos singulares)
Bastonetes (bacilos, bacilo singular)
Espirais (espirila, espirilo singular)

7. O arranjo celular é uma característica importante que auxilia na identificação de bactérias. Qual é a diferença entre estafilococos e estreptococos?

Se a célula continuar a se dividir no mesmo plano e permanecer ligada, ela exibirá um arranjo de estreptococo. Se os planos de divisão de um coco são irregulares, um agrupamento de células é produzido para formar um estafilococo.

8. Qual é o propósito da mancha negativa? Que exemplo é citado em seu Atlas?

A técnica de coloração negativa é usada para determinar a morfologia e o arranjo celular em bactérias que são delicadas demais para resistir à fixação por calor. Um exemplo principal é a espiroqueta.

9. Qual é o propósito da coloração de Gram? Que parte das células bacterianas determina o resultado?

O objetivo da coloração de Gram é distinguir células Gram-positivas e Gram-negativas. Diferentes construções de parede celular de células Gram-negativas e Gram-positivas determinam a capacidade de resistir à descoloração ou não.

10. Liste as 4 etapas da coloração de Gram nomeando o produto químico usado em cada etapa:

uma. Coloração primária - violeta de cristal e.
b. Adicionar iodo como mordan (formar um complexo de cristal violeta-iodo)
c. Descoloração - (álcool ou acetona)
d. Contra-coloração - Safranin

11. Qual é o propósito dessas técnicas de coloração diferencial:
uma. Acid-fast É usado como coloração diferencial para detectar células capazes de reter uma coloração primária quando tratadas com álcool ácido. É uma coloração diferencial importante usada para identificar bactérias do gênero Mycobacterium., Parasitas coccidianos, bacilos álcool-ácido resistentes.

b. Coloração da cápsula É uma coloração diferencial usada para detectar células capazes de produzir uma cápsula extracelular. A produção de cápsulas aumenta a virulência em alguns micróbios, como o bacilo do antraz e o pneumococo.

c. Coloração de esporos A coloração de esporos é uma coloração diferencial usada para detectar a presença e localização de esporos em células bacterianas. Apenas alguns gêneros produzem esporos.

Parte III. Coloração em Mastering Microbiology.
Voltando ao Mastering Microbiology, vá para a Área de Estudo, Microlab Tutor e veja o vídeo sobre “Gram Staining”. Em seguida, vá para “Animações de microbiologia com questionários” e trabalhe em “Coloração”. Em seguida, responda às seguintes perguntas circulando a letra da resposta correta: 12. Que tipo de método de coloração você usaria para determinar células formadoras de endosporos a partir de células não formadoras de endosporos?

uma. Especializado b. Diferencial c. Regular d. Simples

13. Qual das seguintes é uma característica de manchas simples?
uma. Eles coram estruturas específicas de uma célula bacteriana.
b. Eles coram estruturas específicas de uma célula bacteriana E podem ser enxaguados com água.
c. Eles podem ser enxaguados com água.
d. Eles são uma mancha básica.
e. Eles são uma mancha básica E podem ser enxaguados com água.

Parte IV. Estrutura e Microscopia - Laboratório 5 do Manual do Laboratório de eScience. Leia as informações básicas na pág. 76-79. Seguindo as instruções, prepare sua placa de ágar e inocule-a com amostras de duas superfícies diferentes, conforme as instruções. 14. Fotografia de sua placa após a inoculação e incubação. Você pode inserir sua fotografia aqui ou pode enviá-la como um anexo separado no Bb.

15. Quais 2 superfícies você esfregou para suas amostras? Qual amostra proporcionou o maior crescimento?

Queria aproveitar esta oportunidade e experimentar diferentes superfícies. Eu limpei minha lata de lixo e meu celular. Eu esperava que a lata de lixo contivesse maior quantidade de bactérias. Ambas as superfícies que esfreguei não tiveram o crescimento que eu esperava. No entanto, observei 3 tipos diferentes de colônias crescendo na lata de lixo. (Meu tempo de incubação foi de 6 dias)

Parte V. Para simular o processo de coloração de Gram, acesse o site listado em Bb para o “Virtual Gram Stain.” Para executar o processo, clique em “Ver Exemplo” e depois comece clicando no 1º Tubo de Ensaio a ser usado no processo de Coloração de Gram. Para cada etapa subsequente, clique no próximo tubo a ser usado no processo.

Concluí esta prática divertida. Isso ajudou a esclarecer o procedimento de coloração.

Parte VI. Voltando ao Manual do Laboratório de eScience, prepare seus três slides conforme indicado na pág. 81-83. Na ausência de um microscópio para visualizar suas lâminas, consulte as fotografias coloridas de bactérias nas Seções 5 e 6 em seu Atlas de Laboratório.

16. Fotografe seus slides e insira as fotografias claramente rotuladas ou carregue-as como anexos separados no Bb.

17. Na coloração de Gram, quais características diferentes existem entre os dois grupos que permitem as diferentes condições de coloração?

Os envelopes celulares da maioria das bactérias se enquadram em um de dois grupos principais. As bactérias Gram-negativas são circundadas por uma fina parede celular de peptidoglicano, que por sua vez é circundada por uma membrana externa contendo lipopolissacarídeo. As bactérias Gram-positivas não têm membrana externa, mas são circundadas por camadas de peptidoglicano muitas vezes mais espessas do que as encontradas nos Gram-negativos.

18. Por que o iodo Gram foi adicionado à técnica de coloração de Gram?

O iodo de Gram é adicionado à coloração de Gram como um mordente para melhorar a coloração com violeta de cristal.

19. Por que uma contracoloração (safranina) é adicionada ao procedimento de coloração de Gram?

Após o procedimento de descoloração, as células Gram-positivas permanecem roxas enquanto as células Gram-negativas são coloridas pela contracoloração Safranina. Após a conclusão bem-sucedida de uma coloração de Gram, as células Gram-positivas aparecem roxas e as células Gram-negativas aparecem em rosa avermelhado.

20. Quais são as vantagens de realizar uma coloração negativa em relação a uma coloração simples para visualizar bactérias?

Mesmo bactérias muito delicadas podem ser tratadas com coloração negativa. Além disso, quando o tamanho exato é crucial, uma coloração negativa pode ser usada porque produz o encolhimento mínimo das células. Ele fornece uma avaliação mais detalhada da morfologia de um micróbio do que a coloração simples, porque o beckground, em vez do micróbio, está manchado. A ultraestrutura do micróbio é preservada e delimita as células e torna-as altamente visíveis.


Engenheiro Associado - Civil (PE exigido - 2,5% de diferencial aplicável)

NOTA Sobre Salário: Um COLA de 4% (Ajuste de Custo de Vida) será aplicado a partir de 28/06/21
Unidade de entrega do projeto Pacheco (código de posição 0588)
Visão geral:O Projeto de Expansão do Reservatório de Pacheco (PREP) da Valley Water continua a se desenvolver por meio de planejamento, análise de impacto ambiental, projeto de engenharia e licenciamento com construção prevista para começar no final de 2024. O PREP inclui a expansão do Reservatório de Pacheco existente com nova construção de uma barragem a montante do barragem existente, uma estrutura de vertedouro, obras de entrada / saída, dutos, uma estação de bombeamento, estradas, fornecimento de energia e melhorias associadas. Esta posição de Engenheiro Associado (Civil) é uma parte importante da equipe PREP responsável por fornecer supervisão técnica e revisão de resultados, como planos, especificações e memorandos técnicos, organizando investigações de campo supervisionando as atividades de trabalho do consultor. coordenação com outras agências / organizações e comunicação entre grupos técnicos com a equipe e consultores da Valley Water. O suporte de engenharia durante a construção como um especialista no assunto PE incluirá as seguintes tarefas: revisões de envio completas, responder às solicitações de informações e interpretar os desenhos do projeto, especificações e documentos do contrato.

As principais responsabilidades incluem, mas não estão limitadas a:

  • Rever o trabalho de engenharia de consultores e / ou funcionários da Valley Water, fornecer revisão técnica, orientação e direção.
  • Consultores líderes e / ou equipe da Valley Water na preparação de documentos de planejamento, desenhos de projeto, entregas técnicas e gerenciamento de projetos de construção.
  • Coordenar e comunicar-se com agências externas para desenvolver elementos técnicos do projeto.
  • Representar a Valley Water em reuniões públicas, apresentar recomendações ao Conselho e outras coordenações interagências.

A experiência do candidato ideal inclui:
Candidatos cuja experiência e experiência melhor correspondam à experiência, conhecimento, habilidades, habilidades e educação ideais são considerados candidatos ideais para a posição. Para determinar os melhores candidatos, cada candidato será avaliado com base nos critérios de candidato ideal listados abaixo.

Experiência Ideal:
Mínimo de quatro (4) anos de experiência profissional em engenharia.

Habilidades e aptidões ideais:

  • Planejar, organizar, programar, atribuir, treinar, revisar e avaliar o trabalho da equipe.
  • Recomendar e implementar planos de trabalho e gerenciar com eficácia projetos de engenharia e equipes de projeto.
  • Aplicar princípios, práticas, conceitos e padrões de engenharia aos problemas de engenharia.
  • Aplicar princípios, práticas, conceitos e padrões de recursos hídricos ao planejamento, operação e gestão do abastecimento de água, monitoramento, contaminação e proteção de águas subterrâneas e problemas de qualidade da água.

Conhecimento Ideal:

  • Princípios, práticas, conceitos e padrões de engenharia civil aplicados ao campo / especialidade atribuída de engenharia, gestão de recursos hídricos, gestão e planejamento de recursos naturais, engenharia, hidrogeologia, geologia, hidrologia, hidráulica e / ou ciências ambientais.
  • Princípios e práticas de orçamento de projetos, estimativa de custos, financiamento, gerenciamento de projetos e administração de contratos.
  • Princípios e práticas de modelagem e análise numérica, previsão e análise de risco e análise estatística.
  • Práticas de pesquisa de questões de engenharia e design, avaliando alternativas, fazendo recomendações sólidas e preparando e apresentando relatórios técnicos e eficazes.
  • Uso, gramática, ortografia, vocabulário e pontuação do inglês.
  • Princípios e técnicas para fornecer atendimento ao cliente lidando de forma eficaz com o público, fornecedores, contratados e funcionários da Valley Water.

Treinamento e educação ideais:
Graduação em faculdade ou universidade credenciada de quatro anos com curso importante em engenharia civil ou um campo relacionado à (s) área (s) funcional (is) atribuída (s).
OU
Posse de um Certificado California Engineer-in-Training (EIT) válido com dois (2) anos de experiência em engenharia paraprofissional associada.

Licença ou certificado exigido

  • Possuir e manter uma Licença de Engenheiro Profissional (PE) emitida pelo Conselho de Engenheiros Profissionais, Topógrafos e Geólogos da Califórnia.
  • Posse ou capacidade de obter uma carteira de motorista válida na Califórnia. Indivíduos que não atenderem aos requisitos da carteira de motorista devido a uma deficiência serão considerados para uma acomodação razoável, caso a caso.

Para revisar a especificação de classificação, clique aqui (download do leitor de PDF)

Processo de seleção

(1) O processo de seleção pode incluir um ou mais dos seguintes: análise da candidatura, avaliação da candidatura, exercício de desempenho, exercício escrito e / ou entrevista.
(2) O Formulário de Candidatura a Emprego, as Perguntas de Informação de Qualificação e / ou Perguntas Suplementares serão avaliadas com base nos critérios do candidato ideal listados acima. Currículos são altamente recomendados.

NOTA: A posição e a data de início estão sujeitas à disponibilidade de fundos. A Valley Water reserva-se o direito de repassar esta posição conforme necessário.
Pode-se considerar os pools de candidatos existentes na mesma classificação.

A Política de Não Discriminação de Igualdade de Oportunidades da Valley Water está disponível para revisão mediante solicitação.

A Valley Water fará todos os esforços razoáveis ​​no processo de exame para acomodar pessoas com deficiência. Avise os Recursos Humanos com antecedência sobre quaisquer necessidades especiais, ligando para 408-630-2260.

Esteja ciente de que, uma vez enviado, todos os materiais de inscrição se tornam propriedade da Valley Water e não serão devolvidos. A equipe de Recursos Humanos não está autorizada a fazer cópias dos materiais de inscrição para os candidatos.


Conceitos Gerais de Próstata

Α-metilacil-CoA-racemase (AMACR, P504S)

Superexpresso em câncer de próstata com marcante coloração diferencial entre glândulas malignas (positivas) e benignas (expressão negativa ou fraca) ○

Identificado em estudos de matriz de expressão gênica

Altamente sensível, supostamente positividade em ∼ 75-95% dos carcinomas

Padrão de imunorreatividade semelhante visto em HGPIN (relatado 56-100%)

Negativo ou fracamente expresso em alguns carcinomas prostáticos: 5-25% típicos, 30% atróficos, 32-38% glândula espumosa, 23-30% pseudo-hiperplásico e até 29% carcinomas tratados com hormônios

Expressado em lesões benignas: 35-58% de adenoma nefrogênico, até 29% de coloração luminal em atrofia parcial e hiperplasia pós-atrófica, 2-36% de glândulas benignas, 18% de hiperplasia adenomatosa atípica

Não específico para origem prostática em cenário metastático -

Expresso por uma variedade de outras doenças malignas


Contribuições de partículas finas específicas da cidade (PM 2.5) às Implicações Diferenciais de Toxicidade e Estresse Oxidativo In Vitro entre Pequim e Guangzhou da China

A literatura crescente documentou potências tóxicas variáveis ​​de material particulado fino específico de fonte ou local (PM2.5), ao contrário da prática que trata a toxicidade das partículas como independentes da composição, devido ao entendimento incompleto da toxicidade dos constituintes. Quantificar a contribuição específica do componente é a chave para desbloquear as disparidades geográficas de toxicidade das partículas de uma perspectiva de mistura. Neste estudo, realizamos experimentos integrados de toxicidade de mistura e modelagem para quantificar a contribuição de metais e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs), dois grupos de componentes culpados padrão de PM2.5 toxicidade, ao estresse oxidativo in vitro causado por PM de inverno2.5 de Pequim e Guangzhou, duas megacidades na China. PM2.5 de Pequim exibiu maiores potências tóxicas em concentrações de massa iguais. A análise química direcionada revelou maior carga de metais e PAHs por unidade de massa de PM2.5 em Pequim. Esses produtos químicos juntos explicaram 38 e 24% em média de PM2.5- espécies reativas de oxigênio induzidas em Pequim e Guangzhou, respectivamente, enquanto & gt60% dos efeitos permaneceram por resolver em termos de contribuição de produtos químicos. Os PAHs contribuíram com aproximadamente o dobro da parcela do PM2.5 efeitos de mistura como metais. Fe, Cu e Mn foram os metais dominantes, constituindo & gt80% da proporção de metal compartilhado do PM2.5 efeitos. Dibenzo [a, l] pireno sozinho explicou & gt65% da proporção compartilhada de PAH do PM2.5 efeitos de toxicidade. A contribuição significativa da combustão do carvão e das emissões veiculares em Pequim sugeriu as principais disparidades de fontes de PAHs toxicologicamente ativos entre as duas cidades. Nosso estudo forneceu novos insights quantitativos sobre o papel dos vários perfis de componentes tóxicos na formação das potências tóxicas diferenciais de PM específico da cidade2.5 poluição.


Referências

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2. Procedimentos experimentais

2.1. Produtos químicos e reagentes

Todos os reagentes usados ​​na cultura de células foram testados em cultura de células. O meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com Glutamax & # x02122 e baixa glicose (1 & # x0202fg / L), soro fetal bovino (FBS), solução de tripsina 0,05% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), Fungizona & # x000ae Antimicótico (anfotericina B ), solução de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) e solução salina tamponada com fosfato Dulbecco & # x02032s (DPBS) (10 & # x000d7) foram obtidos da Invitrogen. O peróxido de hidrogênio (H2O2) usado na estimulação do estresse oxidativo foi obtido da Sigma-Aldrich.

Os reagentes usados ​​no procedimento de alquilação diferencial têm origens diferentes: a iodoacetamida foi obtida da Sigma-Aldrich, a solução 40% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1) da BioRad e o ditiotreitol (DTT) da GE Healthcare Life Sciences. Para a digestão do gel, os géis de poliacrilamida pré-moldados & # x0201c4 & # x0201320% TGX Stain-Free Gel & # x0201d e todos os tampões, incluindo o tampão Laemmli, usado na eletroforese foram obtidos da Bio-Rad, e o grau de sequenciação modificada com tripsina usado na digestão de proteínas, foi obtido na Roche Diagnostics.

Os reagentes usados ​​na análise de MS foram todos químicos ou reagentes de alta qualidade (ACS Reagent Chemicals & # x00026 Lab Grades). O ácido fórmico (FA) foi obtido da AMRESCO e água, metanol e acetonitrila (ACN) da Fisher. O ácido orto-fosfórico e o sulfato de amônio eram da MERK e o bicarbonato de amônio da Fluka.

2.2. Projeto experimental e lógica estatística

Dois tipos de experimentos foram realizados neste estudo: i) uma validação inicial do método por um em vitro ensaio usando uma proteína recombinante regulada por redox submetida à oxidação direta com H2O2 ii) aplicação do método em um contexto biológico avaliando o estado oxidativo das proteínas secretadas sob condições de controle e estresse oxidativo. Para o em vitro estudo, duas formas recombinantes da proteína DJ-1 foram utilizadas: o [WT] DJ-1 e [C106DD] DJ-1, para o tipo selvagem (não oxidado) e uma forma oxidada C106 constitutiva da proteína, respectivamente . Ambas as proteínas recombinantes foram analisadas sob condição reduzida (condição de controle) e após uma oxidação direta por H2O2 (controle positivo para oxidação de cisteína). Cada em vitro a reação foi realizada em um total de quatro repetições (cada reação foi realizada com uma alíquota diferente da proteína recombinante). Células & # x02019 secretomes foram coletados de células HeLa sob controle e condições de estresse oxidativo (induzido por estimulação com H2O2) em um total de quatro repetições biológicas cada. Cada secretoma (também conhecido como meio condicionado) foi dividido em três partes para ser submetido às três reações de alquilação (ver subtítulo & # x0201cAlquilação diferencial & # x0201d para detalhes). Uma proteína recombinante (MBP-GFP) foi adicionada ao meio após a coleta, para ser usada como padrão interno [20].

Diferentes abordagens estatísticas foram aplicadas dependendo dos dados sendo analisados. Os testes de comparação aplicados foram principalmente métodos paramétricos (Student's t-teste e ANOVA) com diferenças estatisticamente significativas sendo consideradas para valores de p abaixo de 0,05. Nenhuma correção de comparações múltiplas foi aplicada. A normalidade dos dados foi avaliada por diferentes métodos, incluindo gráficos Q-Q e teste de Shapiro-Wilk, e a homogeneidade das variâncias foi avaliada pelo teste de Levene. A detecção de outliers & # x02019 foi realizada pelo método ROUT.

Tanto o desenho experimental quanto a respectiva análise de dados serão detalhados nas subseções a seguir.

2.3. Produção de DJ-1 recombinante

2.3.1. Construções de DNA

O DNA sintético que codifica para a proteína humana DJ-1 com os códons otimizados para E. coli a expressão foi quimicamente sintetizada a partir de GeneArt & # x000ae Gene Synthesis (Invitrogen) e amplificada por PCR para incluir os locais de restrição para Nheeu e XhoI nas extremidades 5 & # x02032- e 3 & # x02032-, respectivamente usando o iniciador direto 5 & # x02019-GCTAGCAAACGTGCACTGGTTATTCTG-3 & # x02019 e o iniciador reverso 5 & # x02019-CTCGAGTCAATCTTTCAGAACCAGCG # x319 & x319. O produto purificado foi clonado no plasmídeo pGEM & # x000ae -T-Easy (Promega) e subclonado no vetor de expressão pSKB-3 (DJ-1_pSKB-3) após digestão de ambos com Nheeu e XhoI (New England Biolabs, Inc.), em quadro com uma etiqueta hexahistidina N-terminal e um TEV (vírus do tabaco etch) sítio de reconhecimento, para a expressão de um DJ-1 recombinante com uma etiqueta His clivável por TEV. O mutante C106 oxidado constitutivamente de DJ-1 foi gerado substituindo o resíduo de cisteína 106 por dois resíduos de ácido aspártico (C106DD) usando o kit Quick-Change Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) e os iniciadores 5 & # x02032-CGCAAAGGTCTGATTGCAGCAATT GATGACTGATCAG 3 & # x02032 (direto) e 5 & # x02032-GCAGTGCGGTCGGACCTGC ATCATC AATTGCTGCAATCAGACCTTTGCG-3 & # x02032 (reverso) (mutação sublinhada). Todos os clones positivos foram selecionados por análise de restrição e confirmados por sequenciação de DNA.

2.3.2. Expressão e purificação

As construções DJ-1_pSKB-3 (para ambos WT e mutante C106DD) foram transformadas em competentes E. coli A cepa BL21star (DE3) e as células transformadas cresceram a 37 & # x0202f & # x000b0C em LB suplementado com 50 & # x0202f & # x003bcg / mL de canamicina até uma densidade óptica de 600 & # x0202fnm de 0,5, após o qual a expressão da proteína foi induzida para 16 & # x0202fh pela adição de IPTG a uma concentração final de 1 & # x0202fmM. Após a expressão da proteína, o pellet de células foi ressuspenso em 20 & # x0202fmM fosfato de sódio, 500 & # x0202fmM NaCl, 10 & # x0202fmM Imidazole, pH 7,2 e interrompido. O extrato celular foi clarificado por centrifugação, o sobrenadante foi filtrado através de filtros de seringa de 0,2 & # x0202f & # x000b5m e a proteína foi aplicada a uma coluna 5 & # x0202fmL HisTrap HP (GE Healthcare) pré-equilibrada no mesmo tampão. A eluição da proteína foi obtida aumentando gradativamente a concentração de imidazol até 500 & # x0202fmM (50, 100, 300 e 500 & # x0202fmM) e a fração contendo a maior quantidade da proteína de interesse foi posteriormente purificada por cromatografia de exclusão de tamanho com um HiLoad 26 / 600 Superdex 200 coluna de grau de preparação (GE Healthcare Life Sciences) e eluída usando PBS (8 & # x0202fmM K2HPO4, 2 & # x0202fmM NaH2PO4& # x000b7H2O, 150 & # x0202fmM NaCl).

2.4. Coleta de meio condicionado

As células HeLa foram semeadas a 12 & # x0202f & # x000d7 & # x0202f10 3 células / cm 2 em placas de 148 & # x0202fcm 2 (Corning) em um total de 4 placas por réplica. Após 48 & # x0202fh em cultura (37 & # x0202f & # x000b0C com 5% de CO2/ 95% de ar e 95% de umidade) o meio de cultura (meio DMEM com 10% de FBS) foi descartado e as células foram lavadas duas vezes com PBS quente para remover o FBS restante. Em seguida, o meio de cultura foi alterado para DMEM sem FBS (condição de controle) ou para uma solução de 1 & # x0202fmM de H2O2 em DMEM sem FBS (condição de estresse) por 40 & # x0202fmin, após o que o meio foi alterado novamente para DMEM sem FBS. Os meios condicionados foram coletados 24 & # x0202fh após a estimulação. Os meios coletados foram centrifugados a 290g, por 5 & # x0202fmin a 4 & # x0202f & # x000b0C para remover resíduos celulares e, em seguida, divida em três partes para alquilação diferencial. Uma proteína recombinante (MBP-GFP) foi adicionada ao meio após a coleta, para ser usada como padrão interno na análise quantitativa [21]. Cada condição foi realizada em um total de quatro repetições.

2,5. Alquilação diferencial

2.5.1. Ensaio in vitro com as proteínas DJ-1 recombinantes

Dez microgramas de cada proteína recombinante ([WT] DJ-1 e [C106DD] DJ-1) foram usados ​​por reação (Fig. S1-A suplementar). As primeiras etapas de alquilação foram realizadas usando iodoacetamida (IAM) a uma concentração final de 66 & # x0202fmM (R1 e R2) e acrilamida (Acry) a 6% (v / v) (R3), e suas concentrações foram triplicadas nas segundas etapas (R3 no caso de IAM, e R1 e R2 para Acry) para compensar o excesso de DTT. O DTT foi adicionado a uma concentração final de 11 & # x0202fmM e as etapas de redução e alquilação foram realizadas usando ultra-som para 10 & # x0202fmin. A ultrassonicação foi realizada em um processador ultrassônico 750 & # x0202fW com cuphorn usando intensidade de 20% e pulsos ON / OFF de 1 & # x0202fs cada. Os reagentes da primeira alquilação foram removidos usando filtros de corte de 5 & # x0202fkDa (Vivaspin500, Sartorius) seguido por uma etapa de lavagem com 0,5 & # x0202fM TEAB, e esta etapa foi repetida antes da digestão da proteína para remover o excesso de redução e reagentes alquilantes. Para promover o em vitro oxidação das proteínas recombinantes antes da alquilação diferencial, elas foram incubadas com 1 & # x0202fmM de peróxido de hidrogênio por 30 & # x0202fmin em temperatura ambiente. Cada reação foi realizada em um total de quatro repetições e todas as amostras foram submetidas à digestão líquida. Além disso, mais reações foram realizadas usando um único reagente alquilante, com ou sem redução das amostras antes da alquilação. Estas reações foram utilizadas apenas para a identificação do peptídeo.

2.5.2. Mídia condicionada

O meio condicionado de cada amostra foi dividido em três partes, uma delas a ser imediatamente submetida à etapa de alquilação usando iodoacetamida (para bloquear as cisteínas reduzidas, Fig. 1 A & # x02013 R1) enquanto as outras duas partes foram submetidas à redução com DTT antes da etapa de alquilação (R2 e R3). Todas as reações, exceto a alquilação com iodoacetamida em R1, foram realizadas após a concentração do meio para 600 & # x0202f & # x000b5L usando os filtros cut-off de 5 & # x0202fkDa (Vivaspin20, Sartorius). Antes da concentração da mídia, acetonitrila foi adicionada a todas as amostras a uma concentração final de 20% (v / v) [2] para promover alguma desnaturação da proteína, e iodoacetamida foi adicionada à parte R1 em uma concentração final de 66 & # x0202fmM. Após a concentração do meio, as cisteínas foram reduzidas pela adição de DTT a uma concentração final de 11 & # x0202fmM e alquiladas com 66 & # x0202fmM de IAM (R2), 6% (v / v) de Acrilamida em R3 e 12% ( v / v) de acrilamida em R1. Todas as reações foram realizadas em banho ultrassônico (USC 1200 THD & # x00026 THD / HF) na potência máxima por 45 & # x0202fmin.

Alquilação diferencial combinada com aquisição SWATH-MS: oxSWATH. A) Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental usado para avaliar o método proposto de alquilação diferencial livre de marcadores. Neste método, a alquilação diferencial (R1) é realizada usando dois agentes alquilantes amplamente utilizados, iodoacetamida (IAM) e acrilamida (Acry), para bloquear as cisteínas oxidadas reduzidas e reversíveis, respectivamente. Esta reação é comparada com duas reações adicionais onde a amostra é completamente reduzida antes da alquilação (R2 e R3 com IAM e acrilamida, respectivamente) para acessar o nível total dos peptídeos de cisteína. Tanto os peptídeos contendo cisteína quanto os peptídeos sem cisteínas são monitorados por SWATH-MS, para medir as mudanças no estado redox de cisteína e nos níveis de proteína total, respectivamente. B) Reação de iodoacetamida com tióis livres. C) Reação de acrilamida com tióis livres. D) Detecção de pares de peptídeos alquilados por cisteína adquiridos em diferentes e na mesma janela SWATH-MS.A seletividade do método é verificada por meio da análise de cromatogramas LC-MS / MS representativos de dois pares de peptídeos DJ-1 DVVIC [IAA] PDASLEDAKK / DVVIC [Acryl] PDASLEDAKK (adquirido em janelas diferentes & # x02013 ver Tabela Suplementar S2) e DVVIC [IAA] PDASLEDAK / DVVIC [Acryl] PDASLEDAK (adquirido na mesma janela) no R2 (amostras apenas alquiladas com IAA) e R3 (amostras apenas alquiladas com Acril). Para cada grupo de pico é apresentado o valor de FDR obtido usando o plug-in de processamento SWATH & # x02122 para PeakView. Tempo de retenção (TR) foi ajustado para cada amostra e os XICs foram obtidos em uma janela de 4 & # x02009min centrada no tempo de retenção alinhado. Consulte a Fig. S4 suplementar para obter informações detalhadas sobre as áreas integradas no par de peptídeos adquiridos na mesma janela.

Após a alquilação diferencial, o meio condicionado concentrado foi precipitado usando ácido tricloroacético (TCA) & # x02013 acetona. Resumidamente, o TCA foi adicionado a cada amostra para uma concentração final de 20% (v / v), seguido por uma incubação em & # x02212 & # x0200980 & # x02009 & # x000b0C e centrifugação a 20.000g por 20 e # x02009min. Pelotas de proteína foram lavadas e solubilizadas com acetona gelada (& # x0221220 & # x02009 & # x000b0C), seguido por uma centrifugação a 20.000g por 20 e # x02009min [22]. Os peletes lavados foram ressuspensos em tampão Laemmli 2 & # x000d7, auxiliado por ultrassonicação e desnaturação a 95 & # x02009 & # x000b0C por 5 & # x02009min [23].

2.6. Digestão de proteínas

Amostras de DJ-1 recombinante foram submetidas à digestão de líquido, conforme descrito em Anjo et al. [24], sem a etapa de alquilação. As digestões foram realizadas com tripsina na proporção de 1:50, durante a noite a 37 & # x02009 & # x000b0C.

Os secretomas foram submetidos à digestão em gel usando a abordagem curta de GeLC [24]. Setenta microlitros de cada amostra foram usados ​​para análise SWATH-MS, e 20 & # x02009 & # x000b5L de cada réplica foram combinados para criar pools representativos de cada grupo de amostras a serem usados ​​para identificação de proteínas. Um total de 6 pools (duas condições experimentais de 3 reações de alquilação diferentes) foram feitos e submetidos à abordagem de GeLC curto. Os peptídeos de cada amostra agrupada digerida foram separados por cromatografia de fase reversa de alto pH, conforme apresentado em Silva et al. [21] e as 28 frações coletadas ao longo da corrida cromatográfica foram unidas em 6 amostras por pool, a fim de aumentar o número de proteínas e peptídeos identificados (em particular, peptídeos contendo cisteína) [25].

2.7. Análise de espectrometria de massa pelo modo SWATH

2.7.1. Aquisição

As amostras foram analisadas em um AB Sciex & # x000ae 5600 TripleTOF em dois modos: aquisição dependente de informação (IDA) para identificação de proteínas e geração de biblioteca, e aquisição SWATH para análise quantitativa. A separação de peptídeos foi realizada usando cromatografia líquida (nanoLC Ultra 2D, Eksigent & # x000ae) em uma coluna de fase reversa MicroLC ChromXP & # x02122 C18CL (300 & # x02009 & # x000b5m & # x000d7 15 & # x02009cm, 3 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x000b5m, 120 & # x2009 x000c5, Eksigent & # x000ae) a 5 & # x02009 & # x000b5L / min com um gradiente de várias etapas: 0 & # x020132 & # x02009min gradiente linear de 5% a 10%, 2 & # x0201345 & # x02009min gradiente linear de 10% a 30% e 45 & # x0201346 & # x02009min a 35% de acetonitrila em 0,1% FA. Os peptídeos foram eluídos no espectrômetro de massa usando uma fonte de ionização por eletrospray (DuoSpray & # x02122 Source, AB Sciex & # x000ae) com um emissor de aço inoxidável de 50 & # x02009 & # x000b5m de diâmetro interno (ID) (AB Sciex & # x000ae).

Os experimentos de aquisição dependente de informação (IDA) foram realizados nas amostras alquiladas únicas no caso do DJ-1 recombinante e para cada fração das amostras reunidas representativas do meio condicionado. O espectrômetro de massa foi configurado para varrer o espectro completo (350 & # x020131250 & # x02009m / z) por 250 & # x02009ms, seguido por até 100 varreduras MS / MS (100 & # x020131500 & # x02009m / z de um tempo de acumulação dinâmica & # x02013 mínimo 30 & # x02009ms para o precursor acima do limite de intensidade de 1000 & # x02013, a fim de manter um tempo de ciclo de 3,3 & # x02009s). Íons candidatos com um estado de carga entre + & # x020092 e + & # x020095 e contagens acima de um limite mínimo de 10 contagens por segundo foram isolados para fragmentação e um espectro de MS / MS foi coletado antes de adicionar esses íons à lista de exclusão para 25 & # x02009s (espectrômetro de massa operado por Analyst & # x000ae TF 1.7, AB Sciex & # x000ae). A colisão de rolamento foi usada com uma propagação de energia de colisão de 5.

Para experimentos baseados em SWATH-MS, o espectrômetro de massa foi operado em um modo de íon de produto em loop com as mesmas condições cromatográficas usadas na execução de IDA descrita acima. A configuração do SWATH-MS foi projetada especificamente para as amostras a serem analisadas (Tabelas Suplementares S1 e S2 para DJ-1 recombinante e experimentos de mídia condicionada, respectivamente). Um conjunto de 45 ou 60 janelas de largura variável (para DJ-1 recombinante ou meio condicionado, respectivamente) foi construído cobrindo a faixa de massa do precursor de 350 & # x020131250 & # x02009m / z. Uma varredura de pesquisa de 200 & # x02009ms (350 & # x020131250 & # x02009m / z) foi adquirido no início de cada ciclo para calibração do instrumento e os espectros SWATH MS / MS foram coletados de 100 a 1500 & # x02009m / z para 70 ou 50 & # x02009ms (para DJ-1 recombinante ou meio condicionado, respectivamente) resultando em um tempo de ciclo de 3,25 & # x02009s, que é compatível com a aquisição de pelo menos 8 pontos por pico cromatográfico. A energia de colisão para cada janela foi determinada de acordo com o cálculo para uma carga +2 íon centrado na janela com uma propagação de energia de colisão de 15.

2.7.2. Identificação de proteínas e geração de biblioteca

A identificação da proteína foi realizada no software ProteinPilot & # x02122 (v5.0, AB Sciex & # x000ae) usando o algoritmo Paragon & # x02122 (5.0.0.0, 4767, AB Sciex & # x000ae). Proteínas DJ-1 recombinantes foram pesquisadas no banco de dados completo do SwissProt (lançado em fevereiro de 2015, composto por 547.351 entradas) e o meio condicionado foi pesquisado em um banco de dados composto pelo Homo sapiens banco de dados da SwissProt (lançado em fevereiro de 2015, composto por 20.200 registros) e as sequências das proteínas recombinantes utilizadas como padrão interno (IS). As pesquisas foram realizadas com os seguintes parâmetros: digestão com tripsina e iodoacetamida ou acrilamida como reagente alquilante de cisteína, para amostras R2 e R3, respectivamente, e uma opção de foco especial para abordagens baseadas em gel foi utilizada na análise do meio condicionado. Nos experimentos de mídia condicionada, os arquivos adquiridos das condições de controle e estresse foram combinados em uma única busca por reação de alquilação (R2 ou R3). Tolerâncias de massa e exceções às regras de clivagem, como clivagens perdidas ou semiespecíficas, foram definidas automaticamente de acordo com probabilidades predefinidas. Resumidamente, as probabilidades de 0,75 e 0,00001 foram definidas para clivagem perdida e clivagens não específicas, respectivamente, e as tolerâncias de massa foram definidas em 0,05 & # x02009 & # x000b1 & # x020090.0011 & # x02009Da e 0,1 & # x02009 & # x000b1 & # x020090.01 & # x02009Da para íons precursores e fragmentos, respectivamente. Uma análise independente de False Discovery Rate (FDR), usando a abordagem alvo-engodo fornecida pelo ProteinPilot & # x02122, foi usada para avaliar a qualidade das identificações. As identificações positivas foram consideradas quando as proteínas e os peptídeos identificados atingiram um FDR local de 5%.

Uma biblioteca específica de massas precursoras e íons de fragmento foi obtida de cada arquivo de identificação usando o plug-in de processamento SWATH & # x02122 para PeakView & # x02122 (v2.0.01, AB Sciex & # x000ae). As bibliotecas foram exportadas como arquivos de texto para serem adaptadas manualmente para a análise redoxômica. Para cada biblioteca, os peptídeos contendo cisteínas alquiladas foram isolados e posteriormente combinados com os peptídeos do padrão interno, esta etapa gera bibliotecas específicas de cisteína (uma para os peptídeos alquilados de iodoacetamida e uma para peptídeos alquilados de acrilamida). Além disso, outra biblioteca é criada usando apenas peptídeos sem cisteínas, para serem usados ​​para determinar os níveis totais das proteínas. No total, três bibliotecas são usadas por ensaio redoxômico.

2.7.3. Processamento de arquivo de dados SWATH

Os peptídeos foram selecionados automaticamente da biblioteca usando os critérios descritos em Anjo et al. [24]. Até 15 peptídeos foram escolhidos por proteína para a determinação dos níveis totais de proteína, e todos os peptídeos contendo cisteínas foram usados ​​no caso das bibliotecas específicas de cisteína. A quantificação SWATH foi tentada para todas as proteínas nos arquivos da biblioteca que foram identificados abaixo de 5% do FDR local da pesquisa do ProteinPilot & # x02122. Para cada peptídeo, até 5 íons de fragmento alvo (correspondendo a um grupo de pico) foram automaticamente selecionados e avaliados [24]. O limite de confiança do grupo de pico foi determinado com base em uma análise de FDR usando a abordagem alvo-isca e o peptídeo que atingiu o limite de 1% de FDR em todas as réplicas (no caso de IS), ou pelo menos três réplicas foram retidas para análise posterior. As áreas de pico dos íons do fragmento alvo desses peptídeos foram extraídas ao longo do experimento usando uma janela de cromatograma de íons extraídos (XIC) de 4 & # x02009min ajustada para acomodar todos os picos cromatográficos. O tempo de retenção foi ajustado para cada amostra usando os peptídeos IS.

Os níveis de proteína total foram estimados somando todas as transições de todos os peptídeos [24] sem cisteína de uma dada proteína, e para cada proteína os níveis de seus peptídeos alquilados de cisteína foram determinados pela soma de todas as transições desse grupo de peptídeos. Os peptídeos alquilados com iodoacetamida e acrilamida foram analisados ​​separadamente.

Os dados de proteômica de espectrometria de massa foram depositados no ProteomeXchange Consortium [26] através do repositório parceiro PRIDE [27] com o identificador de conjunto de dados PXD006802 e PXD006803 (para mídia condicionada e dados de DJ-1 recombinante, respectivamente, e também está disponível como um recurso público na base de dados SWATHAtlas (www.SWATHAtlas.org) com o depósito nº PASS01210.

2.8. Western blot

Os meios condicionados foram enriquecidos com a mesma quantidade de solução de IS antes da concentração do meio de cultura. As amostras foram desnaturadas por fervura a 95 & # x02009 & # x000b0C por 5 & # x02009 min, e todo o volume foi carregado por pista e separado em 12,5% de géis de SDS-poliacrilamida usando um sistema mini-PROTEAN & # x000ae Tetra Eletroforese (Bio-Rad) . As proteínas foram transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de baixa fluorescência (TBT RTA TRANSFER KIT, Bio-Rad) usando um Trans-Blot Turbo Transfer System (BioRad) durante 30 & # x02009min a uma tensão constante de 25 & # x02009V (com a corrente limitada a 1 e # x02009A). Após a transferência, as membranas foram bloqueadas por 1 & # x02009h à temperatura ambiente (RT) com 5% (p / v) de leite em pó desnatado em PBS-Tween 20 (PBS-T) [0,1% (v / v)]. A membrana foi incubada sequencialmente com anti-DJ-1 (1: 1000 ADI-KAM-SA100-E, Enzo Life Sciences, Inc.) e anti-GFP (1: 1000 SICGEN & # x02013 Research and Development in Biotechnology Ltd.) durante a noite a 4 & # x02009 & # x000b0C seguido por 1 & # x02009h à temperatura ambiente, preparado na solução de bloqueio. Os anticorpos primários foram removidos e as membranas foram extensivamente lavadas com PBS-T (3 vezes, 15 & # x02009 min sob agitação de cada vez). Os blots foram então incubados por 1 & # x02009h à temperatura ambiente com os respectivos anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina (anti-camundongo e anti-cabra para DJ-1 e GFP, respectivamente) em 5% (p / v) de leite em pó desnatado dissolvido em PBS -T seguido de lavagens extensas como acima. A membrana foi inicialmente incubada com o anticorpo específico de DJ-1, seguido por uma nova sondagem da membrana com anticorpo contra um anticorpo específico de GFP.

As bandas imunorreativas de proteínas foram desenvolvidas usando o sistema de detecção & # x0201cEnhanced Chemifluorescence (ECF) & # x0201d (GE Healthcare) e visualizadas em um Molecular Imager FX System (Bio-Rad). Os volumes ajustados (intensidades totais em uma determinada área com subtração de fundo local) para cada banda foram obtidos usando o software Image Lab (versão 5.1, Bio-Rad). Os níveis de DJ-1 foram normalizados para os níveis de GFP (usados ​​como padrão interno) e as diferenças na secreção de DJ-1 foram avaliadas por um aluno t-teste realizado no GraphPad Prism (versão 6.01).

2.9. Análise de dados

2.9.1. Análise proteômica diferencial do secretoma

A análise do secretoma diferencial foi realizada usando os resultados dos níveis totais das proteínas. Os níveis totais de proteína foram normalizados para os valores do padrão interno, e os valores normalizados das três reações (R1, R2 e R3) foram combinados em um único valor por réplica. As proteínas alteradas entre as duas condições foram identificadas por um teste ANOVA realizado no InfernoRDN (versão 1.1.5581.33355) usando o log10 valores transformados e diferenças estatisticamente significativas foram consideradas para os valores de p & # x0003c & # x020090.05. A normalidade dos dados foi avaliada pela análise dos gráficos Q & # x02013Q [28] obtidos no InfernoRDN [29].

2.9.2. Determinação da fração oxidada reduzida e reversível das proteínas

Os peptídeos alquilados de iodoacetamida (de R1 e R2) são usados ​​para determinar a fração reduzida de uma determinada proteína e os peptídeos alquilados de acrilamida (R1 e R3) são usados ​​para determinar os níveis oxidados reversíveis das proteínas (Fig. Suplementar S2). Os níveis dos peptídeos alquilados de cisteína são primeiramente normalizados para os níveis totais da proteína correspondente dentro da mesma reação de alquilação, isto é, os valores calculados a partir de R1 são comparados com os níveis de proteína total em R1 e assim por diante. Os valores normalizados são usados ​​para determinar a proporção relativa da fração reduzida calculando a razão entre os peptídeos alquilados por IAM em R1 e os peptídeos alquilados por IAM em R2 (correspondente à quantidade total de cisteínas disponíveis livres). Para determinar os níveis da fração oxidada reversível, uma proporção semelhante é realizada, mas usando os peptídeos alquilados Acry de R1 e os peptídeos alquilados Acry de R3. A combinação desses dois valores deve ser mais próxima de um, portanto, valores menores que um podem ser uma indicação de oxidações irreversíveis. Para determinar os níveis totais de cada oxoforma (fração oxidada reduzida e reversível expressa em unidade definida pelo procedimento, pdu), as proporções relativas obtidas em cada réplica são multiplicadas pelos níveis totais de proteína correspondentes (peptídeos somados & # x02019 intensidade) na reação R1 (o reação comum aos dois tipos de agentes alquilantes). Consulte a Fig. S2 suplementar para uma representação esquemática desses cálculos.

2.9.3. Análise comparativa do estado oxidativo de DJ-1

As frações reduzidas e oxidadas foram comparadas entre as condições experimentais ([WT] DJ-1 vs [C106DD] DJ-1 e condições de controle vs estresse) usando as condições de estudante t-testes com significância estatística considerados para valores de p abaixo de 0,05. Os pressupostos paramétricos (normalidade dos dados e homogeneidade da variância) foram testados com o teste de Shapiro-Wilk e o teste de Levene, respetivamente. Todos os testes foram realizados no IBM & # x000ae SPSS & # x000ae Statistics versão 22. A detecção de outliers & # x02019 foi realizada no GraphPad Prism (versão 6.01) usando o método ROUT.

2.9.4. Análise redoxômica diferencial

A análise redoxômica comparativa do secretoma foi realizada usando os resultados das frações oxidadas reduzidas e reversíveis, tanto para as proporções relativas quanto para as totais. No caso dos níveis totais, os dados foram posteriormente normalizados usando o padrão interno para acomodar possíveis erros de processamento da amostra. As proteínas alteradas entre as duas condições experimentais (controle vs estresse) foram identificadas como indicado acima para a análise diferencial do proteoma do secretoma. A análise foi repetida para cada tipo de resultado relacionado ao estado oxidativo das proteínas secretadas.

2.9.5. Análise funcional

A análise de enriquecimento do domínio de proteína foi realizada com FunRich (versão 3.1.3) usando banco de dados de domínio de proteína, e analisada estatisticamente com teste hipergeométrico usando banco de dados de genoma humano FunRich como base [30]. Um valor p corrigido de Bonferroni & # x02009 & # x0003c & # x020090.05 indica os subgrupos de domínios de proteína que são significativamente enriquecidos na amostra em relação ao banco de dados de fundo (9952 entradas). Reactome (versão 57) [31] (disponível em http://www.reactome.org/) foi usado para realizar a análise de enriquecimento da via da lista total de proteínas alteradas (considerando seus níveis de secreção ou alteração no estado redox) no presente estude. As vias foram consideradas enriquecidas para análise de FDR abaixo de 5%.

2.9.6. Mapas de calor agrupados por linha

Os mapas de calor foram feitos usando GPRroX (versão 1.1.15) usando os níveis padronizados das proteínas quantificadas dentro de todas as réplicas das duas reações.


Métodos

Amostras de tecido

Analisamos uma coorte de 36 amostras de cólon congeladas rapidamente, obtidas do Banco de Tumores do Instituto de Oncolog & # x000eda Asturias (IUOPA, Asturias, Espanha). 18 das amostras eram de LSCRCs, enquanto as 18 restantes foram usadas como controle e eram do tecido saudável circundante correspondente dos mesmos pacientes. Os diagnósticos foram realizados de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS) usando lâminas coradas com hematoxilina-eosina e os tecidos congelados foram armazenados em & # x02212 & # x0200980 & # x000a0 & # x000b0C antes do isolamento do RNA. O consentimento informado por escrito de todos os pacientes foi obtido e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Investigação Clínica do Hospital Universitario Central de Asturias.

Isolamento de RNA total e síntese de cDNA

Fragmentos de tecido (20 & # x0201330 & # x000a0mg) foram homogeneizados usando um polytron PT 2100 (Kinematica Inc. Bohemia, NY), e o RNA foi isolado usando o kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha) e processado conforme descrito anteriormente [21]. A síntese de cDNA foi realizada usando o High Capacity cDNA Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As reações foram realizadas e os produtos limpos e armazenados conforme descrito anteriormente [21].

Reações em cadeia da polimerase quantitativas em tempo real (qRT-PCR)

As reações de qRT-PCR e a análise de produtos de amplímero foram realizadas de acordo com os métodos já detalhados [21]. A actina foi usada como o gene de controle para normalizar a expressão gênica individual.

Análise de dados

A análise estatística dos dados e a expressão dos valores da transcrição diferencial foram realizadas conforme descrito anteriormente [21].

As análises de sobrevida global (OS) e de probabilidade cumulativa foram realizadas usando o método Kaplan & # x02013Meier e as curvas de sobrevivência foram comparadas pelo teste de log Rank, usando IBM & # x000ae SPSS & # x000ae Statistics V.21.

Construção de microarray de tecido e imunohistoquímica

As regiões representativas do tumor foram identificadas em cada amostra e selecionadas para fazer um microarray de tecido contendo três núcleos de tecido de cada amostra de LSCRC. Após 5 & # x000a0min a 60 & # x000a0 & # x000b0C, os blocos de microarranjos de tecido foram cortados em seções de 4 & # x000a0 & # x003bcm de espessura, prontos para as técnicas de imunohistoquímica. Seções de tecido foram tratadas, preparadas e imunocoradas conforme descrito anteriormente [21]. Para a detecção de condroitina 6-sulfotransferase-2, syndecan 1, CD117, NDST1 e glypican-4, as seções foram aquecidas em solução de recuperação alvo Envision FLEX de alto pH a 65 & # x000a0 & # x000b0C por 20 & # x000a0min e depois incubadas por 20 & # x000a0min à temperatura ambiente na mesma solução. Para detectar perlecan, CS, HS2ST1, UST, CS, CS4ST, o mesmo procedimento foi seguido, exceto que a etapa final foi omitida e as seções foram incubadas durante a noite a 4 & # x000a0 & # x000b0C em uma câmara úmida com anticorpos primários. Os anticorpos e a diluição são detalhados no Additional & # x000a0file & # x000a01.

Após a primeira incubação, as seções foram enxaguadas no mesmo tampão e incubadas com os seguintes anticorpos secundários anti-coelho, polímero marcado com sistema EnVision anti-camundongo (DakoCytomation) e anti-cabra diluído 1: 100 (Santa Cruz Biotechnology) por 1 & # x000a0h à temperatura ambiente. Finalmente, as seções foram lavadas e a imunorreação visualizada usando 3 & # x020133 & # x02019DAB como cromógeno. As seções foram estudadas e fotografadas em microscópio de luz (Eclipse 80i Nikon Corporation, Tóquio, Japão).


Isolamento de bactérias em cultura pura | Microbiologia

O artigo abaixo mencionado fornece uma breve nota sobre o isolamento de bactérias em cultura pura. Os métodos usados ​​para isolar as bactérias em cultura pura são: 1. Riscando ou Plating 2. Diluição e Plating 3. Uso de Meio Seletivo 4. Esterilização Diferencial por Produtos Químicos 5. Esterilização diferencial por calor e 6. Inoculação de um animal suscetível.

Para determinar com precisão o agente causador específico da doença por seus caracteres diagnósticos, o microbiologista deve isolar uma única bactéria, na forma pura, de outras bactérias com as quais está misturada, como um alquimista purifica o metal de outros metais ou impurezas. Em amostras clínicas (expectoração, fezes, urina etc.), os microrganismos mistos são comuns, podem mascarar e confundir os resultados diagnósticos.

Para evitar essa confusão, uma cultura pura é necessária. Os organismos estranhos podem alterar o pH, podem danificar ou matar os microorganismos desejados. Uma cultura pura é aquela que contém apenas um tipo de microrganismo, enquanto uma cultura mista contém dois ou mais tipos de microrganismos.

A cultura pura pode ser comparada a um mar de rosas obtido na cultura pura de rosas. Os métodos, usados ​​para isolar a bactéria em cultura pura, consistem em separar uma única célula bacteriana viva e permitir que ela se multiplique em um meio de cultura adequado, geralmente em meio sólido, para formar uma colônia pura.

As bactérias se multiplicam muito rapidamente, de modo que uma única célula bacteriana depositada em um meio sólido dá origem a uma massa que é chamada de colônia.

1. Estrias ou chapeamento (inoculação de meios de cultura):

Se o material que contém bactérias for espalhado várias vezes na superfície de um meio sólido com uma alça de platina, sem recarregar, cada vez menos células bacterianas permanecerão na alça à medida que estrias sucessivas são feitas e, finalmente, pode depositar uma única célula bacteriana no superfície. Este procedimento dará, portanto, colônias separadas dos organismos presentes no material.

2. Diluição e galvanização:

Quando se espera que o conteúdo bacteriano do material seja alto (por exemplo, fezes), ele é diluído com caldo nutriente estéril ou solução salina antes do plaqueamento.

3. Uso de meio seletivo:

Os meios que promovem o crescimento de um tipo de organismo e inibem ou retardam o crescimento de outros são conhecidos como & # 8220Selective Media & # 8221. Substâncias inibidoras como verde brilhante, violeta de genciana, sais biliares, telurito de potássio e penicilina são amplamente utilizadas na preparação de tais meios.

4. Esterilização diferencial por produtos químicos:

Um exemplo desse método é o cultivo de bacilos tuberculosos do escarro (que contém vários outros organismos) após o tratamento preliminar com ácido mineral diluído ou álcali. No método Petroff & # 8217s, a amostra de escarro é misturada com três ou quatro vezes o seu volume de solução de hidróxido de sódio a 4 por cento, incubada por meia hora a 37 ° C e centrifugada.

O depósito é neutralizado, na presença de um indicador, por ácido clorídrico diluído e, em seguida, semeado em meio adequado. Este tratamento mata todos os outros organismos, exceto os bacilos da tuberculose, que são resistentes à ação de ácidos minerais diluídos, álcalis e outros produtos químicos. & # 8221Antiformina & # 8221 (hidróxido de sódio) também pode ser usado em vez de um álcali diluído.

5. Esterilização diferencial por calor:

Este método é empregado onde os organismos a serem obtidos em cultura pura são mais resistentes ao calor do que outros presentes no material, por exemplo, separação de bacilos portadores de esporos (que são mais resistentes ao calor) dos não portadores de esporos. O material é aquecido a 60 ° C por 30 minutos, resfriado e então inoculado em meio adequado. Apenas os portadores de esporos que sobreviveram irão crescer.

6. Inoculação de um animal suscetível:

Este método é empregado para isolar microorganismos patogênicos que não são facilmente cultivados em meios de cultura ou que são facilmente supercrescidos pelos organismos contaminantes. Como exemplo, podemos citar o isolamento de bacilos da tuberculose de pus, fluidos peritoneais e pleurais pela inoculação de uma cobaia e o isolamento de pneumococos pela inoculação de um camundongo. No último caso, os organismos contaminantes são rapidamente mortos no corpo do animal, enquanto os organismos patogênicos se multiplicam e podem ser recuperados em cultura pura dos tecidos.


Assista o vídeo: Western blotting, técnicas usadas en genética microbiana, biología molecular, entre otras (Janeiro 2022).