Em formação

11.E: Biologia Molecular (Exercícios) - Biologia


Múltipla escolha

Com qual das seguintes alternativas a citosina se emparelha?

A. guanina
B. timina
C. adenina
D. uma pirimidina

UMA

Os procariotos contêm um cromossomo ________ e os eucariotos contêm ________ cromossomos.

A. circular de fita simples; linear de fita simples
B. linear de fita simples; circular de fita simples
C. circular de fita dupla; linear de fita dupla
D. linear de fita dupla; circular de fita dupla

C

Resposta livre

Descreva a organização do cromossomo eucariótico.

O DNA é enrolado em proteínas chamadas histonas. As histonas então se empilham em uma forma compacta que cria uma fibra com 30 nm de espessura. A fibra é ainda mais enrolada para maior compactação. Durante a metáfase da mitose, o cromossomo está mais compacto para facilitar o movimento do cromossomo. Durante a interfase, existem áreas mais densas de cromatina, chamadas heterocromatina, que contêm DNA que não é expresso, e eucromatina menos densa que contém DNA que é expresso.

Descreva a estrutura e o emparelhamento de bases complementares do DNA.

Uma única fita de DNA é um polímero de ácidos nucléicos unidos covalentemente entre o grupo fosfato de um e o açúcar desoxirribose do próximo para formar uma "espinha dorsal" a partir da qual as bases nitrogenadas se projetam. Em seu estado natural, o DNA tem duas fitas enroladas em uma dupla hélice. As bases de cada fita estão ligadas entre si por pontes de hidrogênio. Apenas bases específicas se ligam entre si; a adenina liga-se à timina e a citosina liga-se à guanina.

Múltipla escolha

O DNA se replica por qual dos seguintes modelos?

A. conservador
B. semiconservador
C. dispersivo
D. nenhuma das opções acima

B

O mecanismo inicial para reparar erros de nucleotídeos no DNA é ________.

A. reparo de incompatibilidade
B. Revisão de DNA polimerase
C. reparo de excisão de nucleotídeo
D. dímeros de timina

B

Resposta livre

Como os cromossomos lineares em eucariotos garantem que suas extremidades sejam replicadas completamente?

A telomerase tem um modelo de RNA embutido que estende a extremidade 3 ', então um primer é sintetizado e estendido. Assim, os fins são protegidos.

Múltipla escolha

Um promotor é ________.

A. uma sequência específica de nucleotídeos de DNA
B. uma sequência específica de nucleotídeos de RNA
C. uma proteína que se liga ao DNA
D. uma enzima que sintetiza RNA

UMA

Porções da sequência de mRNA eucariótica que são removidas durante o processamento de RNA são ________.

A. exons
B. caps
C. caudas poli-A
D. introns

D

Múltipla escolha

Os componentes do RNA dos ribossomos são sintetizados no ________.

A. citoplasma
B. núcleo
C. nucléolo
D. retículo endoplasmático

C

Quanto tempo teria o peptídeo que é traduzido a partir desta sequência de MRNA: 5'-AUGGGCUACCGA-3 '?

A. 0
B. 2
C. 3
D. 4

D

Resposta livre

Transcrever e traduzir a seguinte sequência de DNA (fita não-modelo): 5'-ATGGCCGGTTATTAAGCA-3 '

O mRNA seria: 5'-AUGGCCGGUUAUUAAGCA-3 '. A proteína seria: MAGY. Mesmo que haja seis códons, o quinto códon corresponde a uma parada, então o sexto códon não seria traduzido.

Múltipla escolha

O controle da expressão gênica em células eucarióticas ocorre em que nível (is)?

A. apenas o nível transcricional
B. níveis epigenéticos e transcricionais
C. níveis epigenéticos, transcricionais e translacionais
D. níveis epigenéticos, transcricionais, pós-transcricionais, translacionais e pós-traducionais

D

O controle pós-tradução refere-se a:

A. regulação da expressão gênica após a transcrição
B. regulação da expressão gênica após tradução
C. controle da ativação epigenética
D. período entre a transcrição e tradução

B

Resposta livre

Descreva como o controle da expressão gênica alterará os níveis gerais de proteína na célula.

A célula controla qual proteína é expressa e em que nível essa proteína é expressa na célula. As células procarióticas alteram a taxa de transcrição para ativar ou desativar genes. Este método aumentará ou diminuirá os níveis de proteína em resposta ao que a célula necessita. As células eucarióticas alteram a acessibilidade (epigenética), a transcrição ou a tradução de um gene. Isso irá alterar a quantidade de RNA e o tempo de vida do RNA, para alterar a quantidade de proteína existente. As células eucarióticas também alteram a tradução da proteína para aumentar ou diminuir seus níveis gerais. Os organismos eucarióticos são muito mais complexos e podem manipular os níveis de proteína alterando muitos estágios do processo.


Polímeros em Biologia e Medicina

Resumo

Resilina, a proteína altamente elastomérica encontrada em compartimentos especializados da maioria dos artrópodes, exibe resiliência superior e excelente capacidade de resposta de alta frequência em comparação com muitas outras proteínas estruturais. Facilitado por meio de estratégias biossintéticas, polipeptídeos repetitivos semelhantes à resilina (RLPs) derivados das sequências de consenso de principalmente Drosophila melanogaster, e mais recentemente de outros insetos, foram produzidos e caracterizados. Com a manutenção das propriedades mecânicas da resilina natural, os RLPs foram estendidos ainda mais com a incorporação de domínios biológicos, com o objetivo de gerar biomateriais responsivos a células na engenharia de tecidos mecanicamente ativos, como tecidos cardíacos, pregas vocais e vasos sanguíneos.


1. Introdução

1.1. Segmentos de proteína não caracterizados são uma fonte de novidade funcional

Na última década, observamos um grande aumento na quantidade de informações que descrevem sequências de proteínas de uma variedade de organismos. 1,2 Embora isso possa refletir a diversidade no espaço de sequência e, possivelmente, também no espaço de função, 3 uma grande proporção das sequências carece de qualquer anotação de função útil. 4,5 Muitas vezes, essas sequências são anotadas como proteínas putativas ou hipotéticas, e para a maioria suas funções ainda permanecem desconhecidas. 6,7 Sugestões sobre a função potencial da proteína, principalmente a função molecular, muitas vezes vêm da análise computacional de suas sequências. Por exemplo, a detecção de homologia permite a transferência de informações de segmentos de proteína bem caracterizados para aqueles com sequências semelhantes que carecem de anotação de função molecular. 8 & # x0221210 Outros aspectos da função, como os processos biológicos dos quais as proteínas participam, podem vir de estudos de associação genética e de doenças, dados de rede de expressão e interação e abordagens genômicas comparativas que investigam o contexto genômico. 11 & # x0221217 Espera-se que a caracterização de segmentos de proteína não anotados e não caracterizados leve à descoberta de novas funções, bem como forneça informações importantes sobre os processos biológicos existentes. Além disso, é provável que lance uma nova luz sobre os mecanismos moleculares de doenças que ainda não são totalmente compreendidos. Assim, segmentos de proteína não caracterizados são provavelmente uma grande fonte de novidades funcionais relevantes para a descoberta de nova biologia.

1.2. Estrutura e # x02013 Paradigma de função melhora a previsão de função

Tradicionalmente, a função da proteína tem sido vista como criticamente dependente da estrutura tridimensional bem definida e dobrada da cadeia polipeptídica. Esta estrutura clássica & # x02013 paradigma de função (Figura & # x200B (Figura 1 1 painel esquerdo) foi principalmente baseada em conceitos que explicam a especificidade de enzimas e em estruturas de proteínas dobradas que foram determinadas principalmente usando difração de raios-X em cristais de proteínas. conceito clássico implica que a sequência de proteínas define a estrutura, que por sua vez determina a função, isto é, a função pode ser inferida a partir da sequência e sua estrutura. Mesmo quando as sequências de proteínas divergem durante a evolução, por exemplo, após a duplicação do gene, a dobra geral de suas estruturas permanece aproximadamente o mesmo. Portanto, a similaridade estrutural entre proteínas pode revelar relações evolutivas distantes que não são facilmente detectáveis ​​usando métodos baseados em sequência. 18,19 Esforços de genômica estrutural, como a Protein Structure Initiative (PSI), foram criados para ampliar o espaço de conhecidas dobras de proteínas e suas funções, complementando assim os métodos baseados em sequência na tentativa de preencher o intervalo de sequências para as quais não há anotação de função. 20,21 Especificamente, a fase dois do PSI teve como objetivo caracterizar estruturalmente proteínas e domínios proteicos de função desconhecida, muitas vezes fornecendo a primeira hipótese sobre sua função e servindo como ponto de partida para sua posterior caracterização.

Domínios estruturados e regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são duas classes fundamentais de blocos de construção funcionais de proteínas. A sinergia entre regiões desordenadas e domínios estruturados aumenta a versatilidade funcional das proteínas. Adaptado com permissão da ref (50). Copyright 2012 Associação Americana para o Avanço da Ciência.

1.3. A classificação facilita ainda mais a previsão da função

Os esquemas de classificação fornecem uma diretriz para a atribuição sistemática de funções às proteínas. Geralmente, as proteínas são constituídas por um único ou múltiplos domínios que podem ter funções moleculares distintas. Esses domínios, que são chamados de domínios estruturados, muitas vezes se dobram de forma independente, fazem contatos terciários precisos e adotam uma estrutura tridimensional específica para cumprir sua função. As sequências que compõem domínios estruturados podem ser organizadas em famílias de sequências homólogas, cujos membros provavelmente compartilham uma relação evolutiva e função molecular comuns. O banco de dados Pfam classifica sequências de proteínas conhecidas e contém quase 15 & # x02009000 dessas famílias, para a maioria das quais há algum entendimento sobre a função. 22 No entanto, Pfam também contém mais de 3.000 famílias anotadas como domínios de função desconhecida, ou DUFs. 23 Essas famílias são compostas em grande parte por proteínas hipotéticas e aguardam a anotação de função. Outro exemplo poderoso de um esquema de classificação de proteínas é a Classificação Estrutural de Proteínas (SCOP), que fornece um meio de agrupar proteínas com estrutura conhecida, com base em suas relações estruturais e evolutivas. 24,25 O SCOP utiliza uma classificação hierárquica que consiste em quatro níveis, (i) família, (ii) superfamília, (iii) dobra e (iv) classe, com cada nível correspondendo a diferentes graus de similaridade estrutural e parentesco evolutivo entre os membros. Usando este esquema, a função de estruturas ou sequências recém-resolvidas pode ser inferida de sua similaridade com classes de proteínas existentes por meio de comparações de estruturas ou sequências, por exemplo, disponíveis através do banco de dados SUPERFAMILY. 10 Nesse sentido, outra iniciativa importante é o Genome3D, que é um projeto colaborativo para anotar sequências genômicas com estruturas 3D previstas com base nos domínios CATH 26 (Classe, Arquitetura, Topologia, Homologia) e SCOP 24,25 para inferir a função da proteína. 27

1.4. Regiões e proteínas intrinsecamente desordenadas

Embora muitas proteínas precisem adotar uma estrutura bem definida para realizar sua função, uma grande fração do proteoma de qualquer organismo consiste em segmentos polipeptídicos que provavelmente não formarão uma estrutura tridimensional definida, mas que são funcionais. 28 & # x0221242 Esses segmentos de proteína são referidos como regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs Figura & # x200B Figura1 1 painel direito). 43 Como os IDRs geralmente carecem de aminoácidos hidrofóbicos volumosos, eles são incapazes de formar o núcleo hidrofóbico bem organizado que compõe um domínio estruturado 31,44 e, portanto, sua funcionalidade surge de uma maneira diferente em comparação com a estrutura clássica & # x02013 visualização da função do globular , proteínas estruturadas. Neste quadro, as sequências de proteínas em um genoma podem ser vistas como modulares porque são compostas de combinações de regiões estruturadas e desordenadas (Figura & # x200B (Figura 1 1 painel inferior). Proteínas sem IDRs são chamadas de proteínas estruturadas, e proteínas com inteiramente sequências desordenadas que não adotam nenhuma estrutura terciária são referidas como proteínas intrinsecamente desordenadas (IDPs). A maioria das proteínas eucarióticas é composta de regiões estruturadas e desordenadas, e ambas são importantes para o repertório de funções que uma proteína pode ter em uma variedade de contextos celulares. 43 Tradicionalmente, os IDRs eram considerados segmentos passivos em sequências de proteínas que & # x0201 clinked & # x0201d domínios estruturados. No entanto, agora está bem estabelecido que os IDRs participam ativamente de diversas funções mediadas por proteínas. Por exemplo, desordenado regiões são frequentemente sujeitas a modificações pós-tradução (PTMs) que aumentam os estados funcionais em que uma proteína pode existir na célula. 45,46 Além disso, eles expõem motivos peptídicos lineares curtos de cerca de 3 & # x0201310 aminoácidos que permitem a interação com domínios estruturados em outras proteínas. 47,48 Essas duas características, isoladas ou em combinação, permitem a interação e o recrutamento de diversas proteínas no espaço e no tempo, facilitando a regulação de praticamente todos os processos celulares. 47 A prevalência de IDRs em qualquer genoma (ver, por exemplo, o banco de dados D 2 P 2, 49 Quadro 1) em combinação com suas características únicas significa que essas regiões estendem a visão clássica da estrutura & # x02013 paradigma de função e, portanto, da proteína função. Assim, as regiões funcionais nas proteínas podem ser estruturadas ou desordenadas e precisam ser consideradas como duas classes fundamentais de blocos de construção funcionais de proteínas. 50

Box 1

Bancos de dados de regiões e proteínas intrinsecamente desordenadas

Existem vários recursos que coletam informações experimentais ou computacionais sobre regiões desordenadas em proteínas. O Banco de Dados de Desordem de Proteínas (DisProt, http://www.disprot.org/) foi desenvolvido para facilitar a pesquisa sobre desordem de proteínas, organizando o conhecimento cada vez maior sobre a caracterização experimental e as funcionalidades de IDRs e IDPs. 203.400 O banco de dados inclui a localização da (s) região (ões) desordenada (s) determinada (s) experimental (is) em uma proteína e os métodos usados ​​para a caracterização do distúrbio. Além disso, quando conhecidas, as entradas listam a função biológica de um IDR e como ele executa essa função. Na versão mais recente (6.02, 24 de maio de 2013), o DisProt continha 694 entradas de IDP e 1 & # x02009539 IDRs.

O banco de dados IDEAL (http://www.ideal.force.cs.is.nagoya-u.ac.jp/IDEAL/) também coleta anotações de IDPs verificados experimentalmente. 388 Este banco de dados se concentra em regiões que sofrem dobramento acoplado e ligação mediante interação com outras proteínas (regiões para as quais há evidência para um estado isolado desordenado e um estado ligado ordenado), como MoRFs e certos motivos lineares (ver seção 3). Também sugere sequências putativas para as quais há apenas evidência de um estado ligado ordenado, mas que se pensa sofrer dobramento induzido com base, por exemplo, na presença de um elemento de dobramento após ligação verificado em um homólogo. A versão mais recente (30 de agosto de 2013) continha 340 proteínas com IDRs anotados, dos quais 148 contêm elementos verificados ou putativos que sofrem dobramento após a ligação.

MobiDB (http://mobidb.bio.unipd.it/) coleta dados experimentais sobre IDRs de DisProt, 203 IDEAL, 388 e Protein Data Bank 147 (resíduos ausentes em estruturas cristalinas e regiões estruturalmente móveis em conjuntos de NMR). 401 Ele também armazena dados de previsão de transtorno de três métodos. O total de informações sobre o transtorno é resumido em um consenso ponderado. A versão mais recente (1.2.1, 28 de agosto de 2012) continha 26 & # x02009933 proteínas para as quais existem dados experimentais sobre a presença ou ausência de desordem e previsões de desordem para 4 & # x02009662 & # x02009776 proteínas de 297 proteomas.

pE-DB (http://pedb.vib.be/) é a primeira base de dados para a deposição de conjuntos estruturais (ver seção 4.2) de proteínas intrinsecamente desordenadas. 398 As entradas contêm os dados experimentais primários (principalmente NMR e SAXS, Caixa 2), os algoritmos usados ​​em seu cálculo e as coordenadas dos conjuntos estruturais, que são fornecidos como um conjunto de modelos no formato Protein Data Bank 147. O desenvolvimento do pE-DB pretende apoiar a evolução de novas metodologias para as descrições estruturais do estado desordenado. O pE-DB armazenou 45 conjuntos em 10 entradas em 17 de janeiro de 2014.

Finalmente, o Banco de Dados de Predição de Proteína Desordenada (D 2 P 2, http://d2p2.pro/) armazena predições de desordem (Quadro 3) feitas por nove preditores diferentes para proteínas de genomas completamente sequenciados. 49 Juntamente com as previsões de distúrbios, ele contém informações sobre MoRFs (ANCHOR 386), sites PTM (PhosphoSitePlus 402) e domínios (SCOP 24 e Pfam 22). Em janeiro de 2014, D 2 P 2 continha previsões de distúrbios para 10 & # x02009429 & # x02009761 sequências em 1 & # x02009765 genomas de 1 & # x02009256 espécies distintas.

1,5. A necessidade de classificação de regiões e proteínas intrinsecamente desordenadas

IDRs e IDPs são prevalentes em genomas eucarióticos. Por exemplo, 44% dos genes codificadores de proteínas humanas contêm segmentos desordenados de & # x0003e30 aminoácidos de comprimento 49 (dados semelhantes mostrados na Figura & # x200B Figura 2A). 2 A). No genoma humano, 6,4% de todos os genes codificadores de proteínas não têm nenhuma anotação de função em sua descrição no Ensembl 1 (Figura & # x200B (Figura 2B). 2 B). Uma investigação adicional usando o banco de dados D 2 P 2 de transtorno nos genomas 49 revelou que a maioria desses genes sem anotação de função codifica pelo menos algum transtorno (Figura & # x200B (Figura 2B) 2 B) e que os genes sem anotação contêm proporcionalmente mais IDRs (Figura & # x200B (Figura 2C). 2 C). Dada a ausência de restrições estruturais, os IDRs tendem a evoluir mais rapidamente do que os domínios de proteína que adotam estruturas definidas. 51 & # x0221256 Como resultado, identificar regiões homólogas é mais difícil para IDRs e IDPs do que para domínios estruturados. Isso complica a transferência de informações sobre a função entre homólogos e, portanto, a previsão da função de IDRs e IDPs. Além disso, muitas das anotações de proteínas são baseadas em informações sobre famílias de sequências e domínios estruturados. No entanto, menos da metade de todos os resíduos no proteoma humano se enquadram em tais domínios (Figura & # x200B (Figura 3). 3). Não apenas a maioria dos resíduos de proteínas humanas caem fora dos domínios, uma grande fração desses resíduos também estão desordenados (Figura & # x200B (Figura 3A 3 A e B, barras da direita). Além disso, embora seja esperado que os domínios da SUPERFAMÍLIA com base em proteínas conhecidas as estruturas têm muito pouca desordem (Figura & # x200B (Figura 3A, 3 A, barra esquerda), os domínios Pfam com base no agrupamento de sequência não contêm muito mais (Figura & # x200B (Figura 3B, 3 B, barra esquerda).Essas observações sugerem que há um grande pool de segmentos de proteínas que não são considerados pelos métodos convencionais de anotação de proteínas, porque as sequências de regiões desordenadas são difíceis de alinhar ou porque os métodos não consideram explicitamente regiões desordenadas e não-dominantes da sequência de proteínas. Juntas, essas considerações levantam a necessidade de conceber um esquema de classificação especificamente para regiões desordenadas em proteínas que podem aumentar a função de previsão e anotação para esta importante classe de segmentos de proteína.

O número de genes codificadores de proteínas no genoma humano com vários níveis de distúrbio. Histogramas do número de genes humanos com anotação (A) e sem anotação (B), agrupados pela porcentagem de resíduos desordenados. (C) Uma comparação da fração de genes humanos anotados e não anotados com diferentes quantidades de transtorno. Os resíduos em cada proteína são definidos como desordenados quando há um consenso entre & # x0003e75% dos preditores na base de dados D 2 P 2 49 naquela posição. O conjunto de genes humanos foi retirado do Ensembl release 63, 1 e a proteína representativa codificada pelo transcrito mais longo foi usada em cada caso. A anotação foi retirada do campo de descrição com & # x0201copen read frame & # x0201d, & # x0201chypothetical & # x0201d, & # x0201cuncaracterized & # x0201d, and & # x0201cputative protein & # x0201d tratada como nenhuma anotação.

A fração de resíduos desordenados localizados em domínios em genes codificadores de proteínas humanas: (A) resíduos dentro (esquerda) e fora (direita) dos domínios SCOP, 24 e (B) resíduos dentro (esquerda) e fora (direita) dos domínios Pfam (apenas domínios Pfam com curadoria foram considerados, ou seja, Pfam-A). 22 Os domínios SCOP em proteínas humanas são definidos pelo banco de dados SUPERFAMILY. 10 Resíduos desordenados foram retirados da base de dados D 2 P 2 49 (quando há um consenso entre & # x0003e75% dos preditores de desordem). O conjunto de genes humanos foi retirado da versão 63 do Ensembl. 1

Nesta revisão, sintetizamos e fornecemos uma visão geral das várias classificações de regiões e proteínas intrinsecamente desordenadas que foram apresentadas na literatura desde o início dos estudos sistemáticos sobre sua função, cerca de 15 anos atrás. Discutimos abordagens baseadas em função, elementos funcionais, estrutura, sequência, interações de proteínas, evolução, regulação e propriedades biofísicas (Tabela 1). Finalmente, discutimos os recursos que estão atualmente disponíveis para obter informações sobre a função de IDR (Tabela 2), sugerimos áreas onde o aumento dos esforços provavelmente aumentará nossa compreensão das funções do distúrbio protéico e especulamos como as combinações de vários esquemas de classificação existentes poderiam alcançar previsão de função de alta qualidade para IDRs, o que deve levar a uma cobertura de função aprimorada e um entendimento mais profundo da função da proteína.

Tabela 1

base para classificaçãoAulasDescriçãoexemplos
função(33,39,57,58)& # x02022 cadeias entrópicasIDRs que realizam funções que se beneficiam diretamente de sua desordem conformacional, por exemplo, ligantes flexíveis e espaçadoresDomínio de projeção MAP2, domínio PEVK de titina, RPA70, MDA5
& # x02022 sites de exibiçãoflexibilidade de IDRs facilita a exposição de motivos e fácil acesso para proteínas que introduzem e lêem PTMsp53, cauda de histona, p27, domínio indutível de CREB quinase
& # x02022chaperonessuas propriedades de ligação (muitos parceiros diferentes, associação / dissociação rápida e dobramento após ligação) tornam os IDPs adequados para funções de acompanhanteshnRNP A1, GroEL, & # x003b1-cristalina, Hsp33
& # x02022effectorso dobramento sobre a mecânica de ligação permite que os efetores modifiquem a atividade de suas proteínas parceirasp21, p27, calpastatina, domínio de ligação WASP GTPase
& # x02022assemblersa montagem de IDRs tem grandes interfaces de ligação que estruturam múltiplos parceiros de ligação e promovem a formação de complexos de proteínas de ordem superiorproteínas ribossomais L5, L7, L12, L20, Tcf 3/4, domínio transativador CREB, Axin
& # x02022 scavengersnecrófagos desordenados armazenam e neutralizam pequenos ligantescromogranina A, glicoproteínas ricas em Pro, caseínas e outras SCPPs
características funcionaismotivos lineares 47.125 & # x02022 modificação estruturallocais de alteração conformacional de uma estrutura peptídicalocais de peptidilprolil cis & # x02013trans isomerase Pin1
& # x000a0& # x02022 clivagem proteolíticalocais de eventos de processamento pós-tradução ou locais de cisão de clivagem proteolíticaCaspase-3 / -7, separase, sítios de cisão taspase1
& # x000a0& # x02022 Remoção / adição de PTMsequências de ligação específicas que recrutam enzimas que catalisam a adição ou remoção da fração PTMlocal de fosforilação de quinase dependente de ciclina, local de SUMOilação, local de N-glicosilação
& # x000a0& # x02022 promoção complexamotivos que medeiam proteínas e # x02013 interações de proteínas importantes para a formação de complexos frequentemente associados à transdução de sinalmotivo de ligação a SH3 rico em prolina, caixa de ciclina, motivo de ligação a pY SH2, motivo de ligação a PDZ, motivos de ligação a TRAF em MAVS
& # x000a0& # x02022dockingmotivos que aumentam a especificidade e eficiência dos eventos de modificação, fornecendo uma superfície de ligação adicionalDegron de caixa KEN, locais de encaixe MAPK
& # x000a0& # x02022segmentação ou tráfegolocais de sinalização que localizam proteínas dentro de organelas subcelulares particulares ou atuam para trafegar proteínassinal de localização nuclear, motivo de caixa de clatrina, motivos de tráfego de adaptador de endocitose
recursos de reconhecimento molecular (MoRFs) 121 & # x02022alphamotivos desordenados que formam hélices & # x003b1 após a ligação ao alvop53 & # x0223c Mdm2, p53 & # x0223c RPA70, p53 & # x0223c S100B (& # x003b2 & # x003b2), RNase E & # x0223c enolase, inibidor IA3 & # x0223c proteinase & # x000a0A
& # x000a0& # x02022betamotivos desordenados que formam & # x003b2-strands após a ligação ao alvoRNase E & # x0223c polinucleotídeo fosforilase, Grim & # x0223c DIAP1, pVIc & # x0223c adenovírus 2 proteinase
& # x000a0& # x02022iotamotivos desordenados que formam uma estrutura secundária irregular após a ligação ao alvop53 & # x0223c Cdk2-ciclina A, anfifisina & # x0223c & # x003b1-adaptina C
& # x000a0& # x02022complexmotivos desordenados que contêm combinações de diferentes tipos de estrutura secundária após ligação ao alvoamilóide & # x003b2 A4 & # x0223c X11, WASP & # x0223c Cdc42
domínios intrinsecamente desordenados (IDDs) 158,159 & # x000a0alguns domínios de proteína identificados usando abordagens baseadas em sequência são total ou amplamente desordenadosDomínios WH2, RPEL, BH3, KID
coocorrência de domínios de proteínas com regiões desordenadas 161,162 & # x000a0regiões desordenadas particulares frequentemente co-ocorrem na mesma sequência com domínios específicos de proteína& # x000a0
estruturacontinuum estrutural 37 & # x000a0as proteínas funcionam dentro de um continuum de conformações desordenadas diferentes, estendendo-se de totalmente estruturadas a completamente desordenadas, com tudo no meio e sem limites estritos entre os estados& # x000a0
quarteto de proteínas 32,34,166 & # x02022 bobina intrínsecaregiões flexíveis de conformação estendida com quase nenhuma estrutura secundária de alta carga líquida os diferencia dos glóbulos desordenadosproteínas ribossomais L22, L27, 30S, S19, protimosina & # x003b1
& # x000a0& # x02022 glóbulo pré-fundidoregiões de proteínas desordenadas com estrutura secundária residual, muitas vezes posicionadas para dobrar em eventos de ligação, carga líquida mais baixa torna-as mais compactas do que as bobinasMax, proteínas ribossomais S12, S18, L23, L32, calsequestrina
& # x000a0& # x02022 glóbulo fundidoconformação globalmente colapsada com regiões de estrutura secundária flutuantedomínio de ligação do coativador nuclear da proteína de ligação CREB
& # x000a0& # x02022 dobradoproteínas estruturadas com uma estrutura tridimensional definidaa maioria das enzimas, domínios transmembrana, hemoglobina, actina
seqüênciasequência & # x02013 relações de conjunto estrutural 166.204 & # x02022 tratos polarestrechos de sequência enriquecidos em aminoácidos polares frequentemente formam glóbulos que geralmente são desprovidos de preferências significativas de estrutura secundáriaSequências ricas em Asn e Gly, ligantes ricos em Gln em fatores de transcrição e proteínas de ligação a RNA
& # x000a0& # x02022 polieletrólitoscomposições de aminoácidos tendenciosas para resíduos carregados de um tipo de polieletrólitos fortes (carga líquida alta) formam bobinas expandidasProtaminas ricas em Arg, protimosina rica em Glu / Asp & # x003b1
& # x000a0& # x02022polianfolitossequências com números aproximadamente iguais de conformações de cargas positivas e negativas de polianfolitos são governadas pela distribuição linear de resíduos com cargas opostas, com a segregação de cargas opostas levando a glóbulos, enquanto sequências carregadas bem misturadas adotam conformações de bobinas aleatórias ou globulares, dependendo do carga totalChaperones de RNA, fatores de splicing, domínio PEVK de titina, príon de levedura Sup35
sabores de previsão 205 & # x02022Vprevisto melhor pelo preditor VL-2V, para o qual os aminoácidos hidrofóbicos são os atributos mais influentesE. coli proteínas ribossomais
& # x000a0& # x02022CVL-2C é o melhor preditor para o sabor C, que tem mais resíduos de histidina, metionina e alanina do que os outros saboresdomínios de ligação de poli- e oligossacarídeo
& # x000a0& # x02022Ssabor com menos histidina que os outros, melhor previsto pelo preditor VL-2S, que tem uma medida de complexidade de sequência como o atributo mais importanteproteínas que facilitam a ligação e interação
desordem & # x02013 complexidade de sequência 206 & # x000a0IDPs de diferentes classes funcionais mostram desordem e distribuições de complexidade de sequência distintasproteínas com ligantes desordenados entre domínios estruturados povoam regiões DC compactas e desordenadas
grau geral de distúrbio 35,51,68,161,208,209 & # x02022fraçãocategorização de proteínas com base na fração de resíduos prevista para ser desordenada0 & # x0201310 / 10 & # x0201330 / 30 & # x02013100% desordem
& # x000a0& # x02022 pontuação geralpontuações gerais de desordem para a proteína inteirapontuação média mínima de desordem dependendo do preditor
& # x000a0& # x02022 alongamentos contínuospresença ou ausência de trechos contínuos de resíduos desordenadostipicamente & # x0003e30 resíduos
comprimento das regiões desordenadas 211 & # x02022 & # x0003e500 resíduosproteínas que contêm regiões desordenadas de diferentes comprimentos são enriquecidas para diferentes tipos de funçõestranscrição
& # x000a0& # x02022300 & # x02013500 resíduos& # x000a0funções quinase e fosfatase
& # x000a0& # x02022 & # x0003c50 resíduos& # x000a0(metal) ligação de íons, canais de íons, atividade reguladora de GTPase
posição das regiões desordenadas 211 & # x02022N-terminalproteínas que contêm regiões desordenadas em diferentes locais na sequência são enriquecidas para diferentes tipos de funçõesLigação ao DNA, canal iônico
& # x000a0& # x02022 interno& # x000a0regulador de transcrição, ligação ao DNA
& # x000a0& # x02022C-terminal& # x000a0repressor / ativador da transcrição, canal iônico
tandem repete 217.218 & # x02022Q / NAs regiões de proteínas ricas em glutamina e asparagina são importantes para a função celular normal e propensas a causar agregação prejudicialHuntingtin, Sup35p, Ure2p, Ccr4, Pop2
& # x000a0& # x02022S / Rrepetições em tandem compostas de resíduos de arginina e serina são fosforiladas e desordenadas e desempenham um papel na montagem do spliceossomoASF / SF2, SRp75, SRSF1
& # x000a0& # x02022K / A / Prepetições em tandem compostas de lisina, alanina e prolina funcionam na ligação do DNA ligante de nucleossomohistona H1
& # x000a0& # x02022F / Gdomínios desordenados com repetições de fenilalanina-glicina influenciam o comportamento de bloqueio de NPCnucleoporinas
& # x000a0& # x02022P / T / Sregiões amplamente glicosiladas ricas em resíduos de prolina, treonina e serina estão envolvidas na formação de mucomucinas
& # x000a0& # x000a0& # x02022outros& # x000a0& # x000a0
interações de proteínascomplexos difusos por topologia 242 & # x02022polimórficouma forma de desordem estática, com conformações ligadas alternativas servindo funções distintas por ter efeitos diferentes no parceiro de ligação& # x003b2-catenin & # x0223c Tcf4, NLS & # x0223c importin - & # x003b1, actin & # x0223c domínio WH2
& # x000a0& # x02022clampformação complexa por meio de dobramento após a ligação de dois segmentos de proteína desordenados, conectados por um ligante que permanece desordenadoSte5 & # x0223c Fus3, filamento de actina de miosina VI & # x0223c, DNA de outubro-1 & # x0223c
& # x000a0& # x02022 flanqueandoformação complexa por meio de dobramento após a ligação de um segmento de proteína central desordenado, flanqueado por duas regiões que permanecem desordenadasFator de splicing SF1 & # x0223c U2AF, peptídeos ricos em prolina & # x0223c domínios SH3, p27 Kip1 & # x0223c ciclina-Cdk2
& # x000a0& # x02022 aleatórioregiões desordenadas que permanecem altamente dinâmicas mesmo no estado ligadoauto-montagem de elastina, Sic1 & # x0223c Cdc4
complexos difusos por mecanismo 176.251 & # x02022 seleção conformacionala região difusa facilita a formação da forma competente de ligação, mudando o equilíbrio conformacionalMax & # x0223c DNA, MeCP2 & # x0223c DNA
& # x000a0& # x02022 modulação de flexibilidadea região difusa modula a flexibilidade da interface de ligação e altera a entropia de ligaçãoDNA Ets-1 & # x0223c, SSB & # x0223c DNA
& # x000a0& # x02022 vinculação competitivaa região difusa serve como um parceiro competitivo intramolecular para a superfície de ligação.HMGB1 & # x0223c DNA, RNase1 & # x0223c inibidor de RNase
& # x000a0& # x02022tetheringa região difusa aumenta a concentração local de um domínio de ligação de afinidade fraca perto do alvo, ou o ancora por meio de interações transitóriasRPA & # x0223c DNA, UPF1 & # x0223c UPF2, PC4 & # x0223c VP16
plasticidade de ligação 257 & # x02022staticcomplexos mono- / polivalentes, camaleões, penetradores, abraçospara exemplos, consulte a Figura & # x200B Figura 12 12
& # x000a0& # x02022 com base em bobina enroladacordas entrelaçadas, recipientes cilíndricos longos, conectores, armadura, pinças e fórceps, agarradores, tentáculos, extratores, empilhadores& # x000a0
& # x000a0& # x02022 dinâmicacontatos de nuvem e conjuntos de interação de proteínas& # x000a0
evoluçãoconservação de sequência 54 & # x02022flexívelregiões que requerem a propriedade de desordem para funcionalidade, independentemente da sequência exataproteínas de sinalização e regulatórias (Sky1, Bur1)
& # x000a0& # x02022 restritoregiões de distúrbio conservado que também têm sequências de aminoácidos altamente conservadasproteínas ribossomais (Rpl5), chaperonas de proteínas (Hsp90)
& # x000a0& # x02022não conservadonenhuma conservação do distúrbio, nem da sequência subjacente, nenhuma marca funcional claraDomínios A e B do retrotransposão Ty1 de levedura
conservação da composição de aminoácidos 260 & # x02022HRIDRs com alta conservação de resíduosregulação da transcrição e ligação ao DNA
& # x000a0& # x02022LRHTIDRs com baixa conservação de resíduos, mas alta conservação da composição de aminoácidos da regiãoATPase e atividades de nuclease
& # x000a0& # x02022LRLTIDRs sem conservação da sequência nem conservação da composição de aminoácidos(metal) proteínas de ligação a íons
linhagem e especificidade de espécie 159 & # x02022 procariotosespécies de diferentes reinos da vida parecem usar a desordem para diferentes tipos de funçõesinterações mais duradouras envolvidas na formação de complexos
& # x000a0& # x02022eukaryotes e vírus& # x000a0interações transitórias na sinalização e regulação
história evolutiva e mecanismo de expansão repetida 61 & # x02022 Tipo Irepetições que não mostraram diversificação de função após a expansãodomínio PEVK de titina, proteínas salivares ricas em prolina
& # x000a0& # x02022 Tipo IIrepete que adquiriu funções diversas por meio de mutação ou localização diferencial dentro da sequênciaRNA polimerase II (CTD)
& # x000a0& # x02022 Tipo IIIrepetições que ganharam novas funções como consequência de sua expansãooctarepeats de proteína de prião
regulamentopadrões de expressão 208 & # x02022constitutivoIDPs codificados por transcritos constitutivamente altamente expressos são quase totalmente desordenados e frequentemente proteínas ribossomaisproteínas L ribossomais
& # x000a0& # x02022altoTranscritos que codificam IDP mostrando altos níveis de expressão na maioria dos tecidos e pouca especificidade de tecidoinibidores de protease, fatores de splicing, montadores complexos
& # x000a0& # x02022mediumesses transcritos que codificam IDP são expressos em níveis médios, com alguma especificidade de tecidoLigação de DNA, regulação da transcrição
& # x000a0& # x02022 específico do tecidoTranscritos que codificam IDP com expressão altamente específica de tecidoreguladores de organização celular, desmontadores complexos
& # x000a0& # x02022baixo ou transienteTranscrições de codificação de IDP que estão presentes em quantidades indetectáveis ​​em mais da metade dos IDPs analisadosvariedade de funções
emenda alternativa 304.305.309.312.313 & # x000a0regulação e padrões evolutivos de inclusão e exclusão de exons que codificam IDR podem fornecer insights sobre se o IDR codificado funciona na regulação e interações de proteínasuma região específica de tecido com um fosfosito na proteína TJP1 em camundongo, uma região específica de mamífero no regulador de splicing PTB1
cinética de degradação 315.316.318.320.321 & # x02022aceleradores de degradaçãoIDRs que podem influenciar e acelerar a degradação proteassomal da proteína que o contém& # x000a0
& # x000a0& # x02022outrosIDRs que não têm influência na meia-vida da proteína ou a aumentam, por exemplo, por causa das composições de sequência que impedem a processabilidade do proteassomasequências de baixa complexidade, como repetições de glicina-alanina e repetições de poliglutamina
processamento pós-tradução e secreção 337.340 & # x000a0proteínas secretadas são esgotadas para IDPs, mas o distúrbio estrutural é importante em, por exemplo, pró-hormônios, a matriz extracelular e biomineralizaçãopré-pró-opiomelanocortina, proteínas de fibra elástica, SIBLINGs, mucinas
propriedades biofísicassolubilidade 209 & # x000a0as características de sequência de IDPs são geralmente associadas à solubilidade aquosa, embora alguns IDPs sejam termoestáveis, enquanto outros não, isso é provavelmente modulado por relações de conjunto estrutural de sequência & # x02013, como o grau de compactação4E-BP1, calpastatina, CREB, p21, p27, Sp1, stathmin, WASP
transição de fase 137.353 & # x000a0certos IDRs (como aqueles que contêm regiões específicas de baixa complexidade ou motivos de interação) podem sofrer transições de fase, como a formação de gotículas ou hidrogéis à base de proteínasmotivos multivalentes de ligação a SH3 na separação de fases, conjuntos semelhantes a grânulos de proteínas de ligação a RNA contendo IDRs de baixa complexidade, mucinas
biomineralização 117.341 & # x000a0distúrbio estrutural é comum em proteínas com papéis na biomineralização, como a formação de ossos e dentescaseínas, osteopontina, sialoproteína óssea 2, sialofosfoproteína dentinária

Mesa 2

base para o métodoDescriçãométodoLocal na rede Internet
motivos linearesanotação de motivos lineares bem caracterizados, que podem ser mapeados em outras sequências de proteínasELM 125 http://elm.eu.org/
MiniMotif 126 http://mnm.engr.uconn.edu/
identificação de motivos putativos não caracterizados em sequências de proteínasSLiMPrints 372 http://bioware.ucd.ie/slimprints.html
phylo-HMM 373 http://www.moseslab.csb.utoronto.ca/phylo_HMM/
DiliMot 374 http://dilimot.russelllab.org/
SLiMFinder 375 http://bioware.ucd.ie/slimfinder.html
Sites PTMrecursos de sites PTM experimentalmente verificados, principalmente fosforilaçãoPhospho.ELM 268 http://phospho.elm.eu.org/
PhosphoSite 376 http://www.phosphosite.org/
PHOSIDA 377 http://www.phosida.com/
identificação e coleta de motivos peptídicos que direcionam as modificações pós-traduçãoScanSite 380 http://scansite.mit.edu/
NetPhorest 381 http://netphorest.info/
NetworKIN 382 http://networkin.info/
PhosphoNET 383 http://www.phosphonet.ca/
características de reconhecimento molecularcoleção de elementos de sequência verificados que passam por dobramento e ligação acopladosIDEAL 388 http://www.ideal.force.cs.is.nagoya-u.ac.jp/IDEAL/
previsão de sequências que sofrem transições desordem para ordemMoRFpred 385 http://biomine.ece.ualberta.ca/MoRFpred/
ANCHOR 386 http://anchor.enzim.hu/
domínios intrinsecamente desordenadosanotação de domínios de proteínas desordenados, que podem ser detectados por perfis de sequênciaPfam 22 http://pfam.sanger.ac.uk/
de outrospredição de funções de ontologia gênica usando características de sequência de proteínas, como distúrbio intrínsecoFFPred 391 http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/
anotação de função de regiões de proteínas desordenadas verificadas experimentalmenteDisProt 203 http://www.disprot.org/
previsões de regiões desordenadas combinadas com informações sobre MoRFs, sites PTM e domíniosD 2 P 2 & # x02009 49 http://d2p2.pro/

Figura 11.7 Você acha que a deriva genética aconteceria mais rapidamente em uma ilha ou no continente?

Figura 11.7 Você acha que a deriva genética aconteceria mais rapidamente em uma ilha ou no continente?

A deriva genética aconteceria mais rapidamente em uma ilha ou no continente.

Introdução:

A deriva genética explica as flutuações aleatórias em todos os tipos de variantes de genes em uma população. Quando uma variante em um gene é conhecida como alelos, ocorre a deriva genética. Essas variações nos alelos são medidas com as mudanças nas frequências dos alelos. Essas variações nos alelos são aumentos e diminuições ao longo do tempo. Uma vez que a deriva genética começa, o alelo é perdido por uma população ou o alelo presente em uma população. Essas duas possibilidades reduzem a diversidade genética de uma população.

Explicação da solução

A área geográfica de uma ilha é muito menor do que o continente, portanto, a deriva genética ocorre mais rapidamente em uma ilha. O continente também foi afetado por outros fatores em sua variação na frequência dos genes. Isso aconteceu devido à seleção natural, mutação, migração e mudanças mediadas pela deriva genética.

Portanto, o tamanho da população das espécies no continente é muito mais em comparação com o tamanho de uma ilha. Conseqüentemente, a frequência do gene é muito baixa e difícil de rastrear. Em contraste, as espécies da ilha cruzam entre si e não requerem a introdução de novos genes. Conseqüentemente, a deriva genética pode ser rastreada facilmente.

Assim, a área geográfica de uma ilha tem muito menor do que o continente. Portanto, a deriva genética ocorre mais rapidamente em uma ilha. As espécies da ilha cruzam entre si e não requerem a introdução de novos genes. Conseqüentemente, a deriva genética pode ser rastreada facilmente.

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RESULTADOS

Construção de um mutante SKD1

Para definir a possível função de SKD1 na rota endocítica, construímos o mutante SKD1 E235Q . A mutação pontual E235Q está situada dentro de um motivo Walker-tipo B no módulo AAA conservado entre AAA-ATPases (consulte a Figura 1A) e é equivalente à mutação dominante em Vps4p (E233Q), que causa um defeito na classificação de proteína vacuolar (Finken- Eigen et al., 1997). Além disso, o mutante análogo de NSF (E329Q) demonstrou exercer um efeito negativo dominante no transporte intra-Golgi in vitro (Whiteheartet al., 1994). Ambos Vps4p E233Q e NSF E329Q são inativos na hidrólise de ATP. Esperamos que a superexpressão de SKD1 E235Q em células cultivadas exerça um efeito negativo dominante na (s) função (ões) celular (s) em que SKD1 está envolvido. Para visualizar o SKD1 de tipo selvagem e mutante expresso, seus cDNAs foram fundidos à extremidade C-terminal de GFP (Figura 1A).

Fig. 1. Construção e expressão de SKD1 e SKD1 E235Q fundido com GFP. (A) Construções esquemáticas de proteínas utilizadas neste estudo. GFP marcado nos terminais N de SKD1 e SKD1 E235Q, e Walker-tipo A, Walker-tipo B e motivos SRH no domínio AAA são indicados. Para construir SKD1 E235Q , uma única mutação de ponto foi introduzida no SKD1, que leva à troca de aminoácidos do ácido glutâmico para a glutamina na posição 235 no motivo Walker B (seta). (B) As células HeLa foram transfectadas com GFP-SKD1 (pistas 1 e 4), GFP-SKD1 E235Q (pistas 2 e 5), ou apenas o vetor (pistas 3 e 6). Seus extratos foram analisados ​​por immunoblot usando o anticorpo contra SKD1 (pistas 1–3) ou anticorpos contra GFP (pistas 4–6).

Usando o anticorpo contra o peptídeo sintético correspondente ao terminal carboxila de SKD1, detectamos o SKD1 endógeno como uma banda única no immunoblot de lisados ​​de várias linhas celulares, incluindo células HeLa, células CHO e células HEK293. Quando pGFP-SKD1 ou pGFP-SKD1 E235Q foi transfectado para células HeLa, a expressão transiente após 18 h foi confirmada para cada proteína de fusão por ambos os anticorpos para SKD1 e para GFP no immunoblot (Figura 1B). Quantidades aproximadamente iguais de GFP-SKD1 e GFP-SKD1 E235Q, 2–3 vezes mais do que o SKD1 endógeno, foram sintetizadas em células transfectadas. Estimamos que as proteínas de fusão foram superexpressas em uma célula individual transfectada 5–30 vezes em relação ao nível endógeno com eficiência de transfecção de 10–40%.

A superexpressão de SKD1 E235Q causa diminuição da TfR da superfície

Para avaliar a possibilidade de que a superexpressão de SKD1 E235Q tenha um efeito negativo dominante na endocitose, as células HeLa transfectadas com GFP-SKD1 ou GFP-SKD1 E235Q foram examinadas quanto à sua capacidade de internalizar Tf conjugado com Texas Red. Após a transfecção, as células foram deixadas internalizar Texas Red-Tf durante 15 min a 37 ° C. A Tf internalizada era visível como fluorescência pontilhada fina nas células que expressam GFP-SKD1, bem como em células não transfectadas, como mostrado na Figura 2c. Em contraste, as células que expressam GFP-SKD1 E235Q aparentemente não conseguiram internalizar Texas Red-Tf (Figura 2d, setas). As células mutantes que expressam SKD1 mostraram não apenas defeito na internalização de Tf, mas também distribuição característica da proteína mutante. A maior parte do SKD1 endógeno foi distribuído difusamente sobre o citoplasma (ver abaixo), assim como seu homólogo de levedura, Vps4p (Babst et al.,1997). O GFP-SKD1 expresso em células HeLa também se espalhou no citoplasma e no nucleoplasma (Figura 2a). (O motivo da coloração nucleoplasmática é desconhecido. Não era, entretanto, específico para SKD1, porque foi visto mesmo quando GFP sozinho foi expresso.) Por outro lado, GFP-SKD1 E235Q exibiu um padrão pontilhado proeminente concentrado no perinuclear região além do padrão difuso (Figura 2b). Distribuição semelhante de GFP-SKD1 E235Q foi observada em todas as outras linhas celulares examinadas.

Fig. 2. Células HeLa que superexpressam GFP-SKD1 E235Q não conseguem internalizar Tf. Células HeLa transfectadas com GFP-SKD1 (a, c e e) ou GFP-SKD1 E235Q (b, d e f) foram incubados na presença de Texas Red-Tf 100 nM a 37 ° C durante 15 min. As células foram então fixadas para microscopia confocal de fluorescência. (a e b) Micrografias de fluorescência mostrando a rotulagem de proteína fundida com GFP (c e d) micrografias de fluorescência mostrando Texas Red-Tf rotulando (e e f) micrografias de contraste de interferência diferencial. Cada coluna (a, c e e ou b, d e f) representa o mesmo campo. As células que expressam as proteínas fundidas com GFP são indicadas por setas. Bar, 20 μm.

O efeito na endocitose não se limitou à captação de Tf nas células HeLa. A internalização de LDL marcado com R18 por 10 min a 37 ° C em células CHO também foi prejudicada pela superexpressão de GFP-SKD1 E235Q (Figura 3c, setas). Novamente, GFP-SKD1 não mostrou nenhum efeito (nossos dados não publicados).

Fig. 3. As células CHO que superexpressam GFP-SKD1 E235Q não se ligam nem internalizam LDL. Células CHO transfectadas com GFP-SKD1 E235Q foram cultivadas em meio LPDS / F12 a 5%. Após 18 h, as células foram incubadas na presença de R18-LDL 10 μg / ml no mesmo meio a 37 ° C por 10 min (a e c) ou a 4 ° C por 1 h (b e d). Em seguida, as células foram fixadas para microscopia confocal de fluorescência. (a e b) Micrografias de fluorescência mostrando rotulagem GFP-SKD1 E235Q (c e d) micrografias de fluorescência mostrando rotulagem R18-LDL. Os pares de a e c e b e d representam o mesmo campo. As células que expressam GFP-SKD1 E235Q são indicadas por setas. Bar, 20 μm.

A perda da internalização do ligante nos levou a determinar se a endocitose de seus receptores está bloqueada ou ausentes na superfície celular. Primeiro examinamos a ligação de LDL na superfície celular por 1 hora a 4 ° C. As células HeLa que expressam GFP-SKD1 E235Q não mostraram ligação de LDL às suas superfícies (Figura 3d, setas). Isso sugere que seu receptor desapareceu da superfície da célula. Em seguida, examinamos a expressão de superfície de TfR. As células HeLa transfectadas com GFP-SKD1 E235Q foram incubadas durante 1 h a 4 ° C na presença do anticorpo monoclonal anti-TfR. Depois de lavar o excesso de anticorpo não ligado, as células foram fixadas e processadas para microscopia confocal de imunofluorescência. A expressão de superfície de TfR foi claramente observada nas células não transfectadas, bem como nas células transfectadas com GFP-SKD1 (Figura 4c). Surpreendentemente, nenhuma coloração de superfície TfR foi observada nas células transfectadas com GFP-SKD1 E235Q (Figura 4d, setas). A partir dessas observações, supomos que o comprometimento da internalização do ligante seja devido à redução dos receptores de superfície. A expressão de GFP por si só não exerceu nenhum efeito na internalização de Tf ou LDL, ou na ligação de superfície de LDL ou do anticorpo anti-TfR (nossos dados não publicados).

Fig. 4. TfR desaparece da superfície das células HeLa superexpressando GFP-SKD1 E235Q. Células HeLa transfectadas com GFP-SKD1 ou GFP-SKD1 E235Q foram incubados na presença do anticorpo contra TfR a 4 ° C durante 1 h. As células foram então fixadas e incubadas com um segundo anticorpo conjugado com Cy5 para microscopia confocal de imunofluorescência. (a e b) Micrografias de fluorescência mostrando a rotulagem de proteína fundida com GFP (c e d) micrografias de fluorescência mostrando a coloração de superfície TfR (e e f) micrografias de contraste de interferência diferencial. Cada coluna (a, c e e ou b, d e f) representa o mesmo campo. As células que expressam as proteínas fundidas com GFP são indicadas por setas. Bar, 20 μm.

Além disso, quantificamos bioquimicamente a fração de TfR na superfície por um experimento de perseguição de pulso. Sob a dada eficiência de transfecção (10-40%), o efeito do mutante SKD1 não seria detectável se o TfR em massa presente em todas as células fosse medido. Portanto, aproveitamos a cotransfecção do mutanteSKD1 com TfR marcado com myc, porque se esperava que o TfR ectópico fosse expresso junto com o SKD1 mutante na mesma população da célula. Por microscopia de fluorescência, confirmamos que as células transfectadas coexpressam ambas as proteínas ectópicas. Após a cotransfecção, as células foram marcadas com [35 S] metionina / cisteína durante 15 minutos e depois perseguidas durante 3 horas. O TfR marcado com myc marcado foi detectado por imunoprecipitação usando um anticorpo anti-myc, e a quantidade dele na superfície celular foi determinada por biotinilação de superfície. A Figura 5A mostra um representante dos resultados em três experimentos feitos com pratos duplicados. A radioatividade nas bandas individuais foi determinada e a razão entre o TfR marcado com myc de superfície e o receptor marcado com myc total foi calculada (Figura 5B). Como resultado, descobrimos que a proporção foi significativamente reduzida nas células cotransfectadas com GFP-SKD1 E235Q, que foi ∼50% daquela nas células de controle. GFP-SKD1 não afetou a proporção do TfR marcado com myc de superfície. Nas células transfectadas com mutantes, o TfR marcado com myc parecia ser processado da forma de oligossacarídeos de alto teor de manose (o ER forma as bandas inferiores vistas na Figura 5A) para a forma complexa de Golgi (as bandas superiores) no proporção semelhante à das células de controle. Na verdade, o curso do tempo e o nível de conversão da forma ER para a forma Golgi nessas células eram dificilmente distintos daqueles nas células de controle (nossos dados não publicados). Assim, concluímos que o mutante SKD1 não afeta a glicosilação de TfR nem seu transporte através do complexo de Golgi. Além disso, a superexpressão do mutante SKD1 não afetou a estabilidade do TfR marcado com pulso durante o período de perseguição. Uma quantidade tênue da banda inferior foi detectada na superfície das células de controle e das células transfectadas com mutantes (Figura 5A). Embora a razão para isso não seja clara, uma pequena fração da forma ER pode ser transportada para a superfície da célula, consistente com um estudo anterior que mostra que parte do TfR não glicosilado é transportado para a superfície da célula (Omary e Trowbridge, 1981).

Fig. 5. A superexpressão de GFP-SKD1 E235Q reduz a proporção do TfR ectópico cotransfectado na superfície da célula em relação ao total. As células HeLa foram transfectadas apenas com o vetor, GFP-SKD1 E235Q ou GFP-SKD1, juntamente com TfR marcado com myc. As células foram marcadas com [35S] metionina / cisteína por 15 min, perseguidas a 37 ° C ou 4 ° C por 3 h, e a superfície biotinilada conforme descrito em MATERIAIS E MÉTODOS. (A) TfR marcado com myc (T) imunoprecipitado e o TfR marcado com myc ligado a estreptavidina-agarose (S) analisado por SDS-PAGE. TfR total e de superfície marcada com myc foram quantificados com um analisador de bioimagem, e a expressão de superfície foi normalizada por quantidades totais (B). Os valores são expressos em relação ao myc-TfR de superfície na célula co-transfectada apenas com o vetor e incubada a 37 ° C (Vetor 37 ° C: 100%). Cada coluna representa a média ± SEM de três experiências feitas com pratos em duplicado.

O resultado acima argumentou fortemente que a superexpressão de GFP-SKD1 E235Q altera a distribuição de TfR. Não podemos, no entanto, excluir a possibilidade de que a distribuição do TfR ectópico superexpresso foi afetada por seu nível de expressão global que variou entre as amostras, ou seja, seu nível de expressão mais alto poderia resultar em sua retenção mais longa na superfície celular. Foi difícil controlar ou normalizar os níveis de expressão nas células individuais no experimento de expressão transiente. Portanto, para provar que a diminuição do TfR depende da expressão de GFP-SKD1 E235Q nas células individuais, foi realizada uma análise de citometria de fluxo. Para eliminar o possível efeito da superexpressão de TfR, medimos o TfR endógeno na superfície celular. As células HeLa transfectadas com GFP-SKD1 E235Q ou GFP-SKD1 foram incubadas durante 1 h a 4 ° C com o anticorpo anti-TfR e depois com segundos anticorpos conjugados com PE. As intensidades de fluorescência de GFP e de PE em células individuais foram medidas por citometria de fluxo. Embora o nível de TfR de superfície fosse quase constante, independentemente da extensão da expressão de GFP-SKD1 nas células transfectadas com GFP-SKD1 (Figura 6A), encontramos nas células transfectadas por mutantes uma tendência de que quanto maior o GFP-SKD1 E235Q fosse expresso, menos TfR existia na superfície da célula (Figura 6B). A correlação linear entre o nível de expressão da proteína mutante e o efeito inibidor é clara em um gráfico logarítmico de TfR de superfície média contra cada intervalo do nível de expressão de SKD1 mutante (Figura 6C). A população de células que exibe o maior intervalo de fluorescência GFP-SKD1 E235Q (& gt250 U) mostrou uma diminuição média de ∼85% do TfR de superfície em comparação com as células transfectadas com GFP-SKD1 ou células não transfectadas. Este resultado mostra claramente uma correlação entre os níveis de expressão de GFP-SKD1 E235Q e a redução de TfR na superfície celular, corroborando a análise morfológica de TfR e captação de Tf.

Fig. 6. A análise de citometria de fluxo correlaciona a perda da expressão de TfR de superfície e GFP-SKD1 E235Q. As células HeLa transfectadas com GFP-SKD1 (A) ou GFP-SKD1 E235Q (B) foram processadas para corar a superfície TfR conforme descrito na Figura 4, exceto que um segundo anticorpo conjugado com PE foi usado. Vinte mil células foram analisadas para cada transfecção. As quantidades médias de TfR de superfície são representadas graficamente em C para cada subpopulação de células que expressam as proteínas fundidas com GFP na faixa de intensidade indicada. É mostrado um experimento representativo repetido duas vezes.

TfR e outras cargas endocíticas são acumuladas nos compartimentos positivos SKD1 E235Q

Os resultados anteriores sugeriram que a superexpressão de GFP-SKD1 E235Q pode perturbar o transporte intracelular de TfR. Esta explicação dá origem a uma possibilidade de que TfR seria acumulado no compartimento particular onde o mutante SKD1 inibe o tráfego. Para abordar essa possibilidade, examinamos a seguir a distribuição do receptor no interior das células transfectadas GFP-SKD1 E235Q. As células HeLa foram permeabilizadas após a fixação para tornar o anticorpo anti-TfR acessível ao antígeno tanto fora quanto dentro das células. Conforme indicado pelas pontas de seta na Figura 7b, nas células HeLa não transfectadas, uma grande fração de TfR existia na membrana plasmática e o resto estava em estruturas pontilhadas no interior, representando endossomos iniciais. Uma distribuição distinta de TfR foi, por outro lado, observada nas células transfectadas (Figura 7b, setas). O TfR estava claramente ausente da superfície celular novamente e estava acumulado dentro das células. O TfR interno foi notavelmente co-localizado com GFP-SKD1 E235Q (Figura 7a, setas).

Fig. 7. TfR, o dextrano endocitado e a lâmpada-1 estão acumulados nos compartimentos E235Q. As células HeLa transfectadas com GFP-SKD1 E235Q foram incubadas na presença de 1 mg / ml de TRITC-dextrano a 37 ° C durante 8 h. As células foram então fixadas, permeabilizadas e submetidas a microscopia confocal de imunofluorescência usando um segundo anticorpo conjugado com Cy5. Cada conjunto de a – d e e – h mostra micrografias de fluorescência do mesmo campo. Rotulagem GFP-SKD1 E235Q (a e e), coloração TfR (b), coloração lâmpada-1 (f), marcação TRITC-dextrano (c e g) e uma imagem mesclada (d e h) são mostradas.Setas, setas e asteriscos indicam as células não transfectadas, os compartimentos E235Q nas células transfectadas GFP-SKD1 E235Q e lamp-1, cuja distribuição é distinta dos compartimentos E235Q, respectivamente. Bar, 20 μm.

Dextran pode ser internalizado nas células por endocitose de fase fluida e entregue aos lisossomas por meio de endossomos (Ohkuma e Poole, 1978 Dunnet al., 1994). O dextrano é finalmente acumulado nos lisossomas porque é resistente à digestão lisossomal. Para determinar se as células HeLa transfectadas com mutantes ainda são capazes de internalizar dextrano conjugado com rodamina e se o compartimento que acumula GFP-SKD1 E235Q e TfR é acessível ao marcador endocítico, as células foram carregadas com rodamina-dextrano por 8 h a 37 ° C. Em células sem transfecção, confirmamos a distribuição de rodamina-dextrana em lisossomas pontilhados que poderiam ser marcados com anticorpos contra um marcador de membrana lisossomal, lamp-1 (Figura 7, por exemplo, ponta de setas) As células transfectadas (indicadas por setas) poderiam internalizar rodamina dextrano (Figura 7c), e o dextrano internalizado principalmente sobreposto com as estruturas pontilhadas nas quais o mutante SKD1 e TfR estavam localizados (Figura 7d). Portanto, raciocinamos que a superexpressão de GFP-SKD1 E235Q não inibe a endocitose de dextrana, mas causa seu acúmulo nos compartimentos GFP-SKD1 E235Q / TfR-positivos (compartimentos E235Q). Além disso, a maioria da lâmpada-1 também foi colocada nesses compartimentos (Figura 7, e – h, setas), embora algumas estivessem distribuídas em grânulos distintos dos compartimentos E235Q (Figura 7h, estrelas).

O acúmulo de cargas transportadas via endossomos, como TfR, dextran e lamp-1 nos compartimentos E235Q, sugere que a superexpressão do mutante SKD1 pode afetar algumas etapas do tráfego da membrana endossômica. Para fornecer dados funcionais de apoio a isso, monitoramos a endocitose do EGF, que é ligado ao seu receptor na superfície da célula, depois internalizado nos endossomos e entregue nos lisossomos para ser degradado (Yoshimori et al., 1991). Células HeLa ou A-431 transfectadas com o mutante SKD1 foram incubados com Texas Red-EGF a 4 ° C durante 1 h, lavados e depois deixados captar EGF a 37 ° C durante 30 min ou 3 h. Em ambas as linhas celulares, o EGF internalizado era visível como pontos brilhantes em 30 min em ambas as células não transfectadas e as células que expressam o mutante SKD1 (Figura 8, a – d e i – l), confirmando que a expressão do mutante não afeta o distribuição superficial e endocitose do receptor não reciclável, como o receptor EGF. A incubação prolongada de 3 h resultou em diminuição significativa da fluorescência do EGF nas células não transfectadas, indicando degradação do EGF internalizado nos lisossomas (Figura 8, e – he m – p). Ambas as células HeLa e A-431 que expressam o mutante SKD1, no entanto, retiveram uma quantidade substancial de EGF (Figura 8, e – he m – p, setas). Foi novamente acumulado nos compartimentos E235Q. O resultado defendeu que a expressão de GFP-SKD1 E235Q causa inibição do transporte de endossomos para lisossomas.

Fig. 8. A degradação do EGF internalizado é inibida nas células que expressam GFP-SKD1 E235Q. Células HeLa (a – h) e A-431 (i – p) transfectadas com GFP-SKD1 E235Q foram incubadas a 4 ° C por 1 h na presença de 3,3 e 0,1 μg / ml Texas Red-EGF, respectivamente. Após a lavagem, as células foram incubadas a 37 ° C por 30 min (a – d e i – l) ou por 3 h (e – he m – p). Em seguida, as células foram fixadas para microscopia confocal de fluorescência. Rotulagem GFP-SKD1 E235Q (a, e, i e m), rotulagem Texas Red-EGF (b, f, j, e n), uma imagem mesclada (c, g, k e o) e uma imagem de contraste de interferência diferencial (d, h, i e p) são mostradas. Cada linha representa o mesmo campo. As células que expressam GFP-SKD1 E235Q são indicadas por setas. Bar, 20 μm.

Em seguida, examinamos a distribuição de vários marcadores de organela nas células transfectadas com GFP-SKD1 E235Q por microscopia de imunofluorescência. A Figura 9, a – c, mostra a distribuição de EEA1, um marcador estabelecido para endossomos iniciais (Muet al., 1995). Como esperado, observamos que a coloração pontilhada de EEA1 se espalhou no citoplasma das células não transfectadas (Figura 9, ponta de seta). Notavelmente, nas células que expressam GFP-SKD1 E235Q, a coloração EEA1 mudou em direção a uma região perinuclear na qual GFP-SKD1 E235Q foi distribuído (Figura 9, setas). Assim, sugerimos que a expressão do mutante SKD1 afeta a distribuição dos endossomos iniciais. Também coramos as células com anticorpos contra Rab7, outro marcador endossômico localizado principalmente em endossomos tardios. Embora a distribuição de Rab7 não pareça ser alterada dramaticamente pela superexpressão de GFP-SKD1 E235Q, alguma co-localização com a proteína mutante foi observada (Figura 9, d e e). Em contraste com esses marcadores de endossomo, na microscopia de imunofluorescência para proteínas residentes no luminal ER (Figura 9, j – l), a cis- Proteína GM130 da matriz de Golgi (Figura 9, g – i) e Na, K-ATPase (Figura 9, m – o), não encontramos nem co-localização com o mutante SKD1 nem alteração perceptível na distribuição dos marcadores da via secretória em células HeLa que expressam GFP-SKD1 E235Q em comparação com as células não transfectadas. A distribuição de TGN38, que é conhecido por estar localizado predominantemente no TGN em células NRK, também foi distinta daquela de GFP-SKD1 E235Q nas células NRK transfectadas (Figura 9, p-r). Curiosamente, a superexpressão de GFP-SKD1 E235Q em células NRK causou a formação de grandes vacúolos com o SKD1 mutante (indicado por um asterisco). Ao todo, é muito concebível que os compartimentos E235Q sejam derivados da via endocítica em vez da via secretora.

Fig. 9. A superexpressão de GFP-SKD1 E235Q altera a distribuição do antígeno endossômico inicial EEA1, mas não a dos marcadores da via secretora. As células HeLa transfectadas com GFP-SKD1 E235Q foram submetidas a microscopia confocal de imunofluorescência usando anticorpos contra EEA1 para endossomos iniciais (a – c), Rab7 para endossomos tardios (d – f), GM130 para o aparelho de Golgi (g – i), o KDEL sequência para o ER (j – l) e Na, K-ATPase para as membranas plasmáticas (m – o). Para a coloração de Rab7, a permeabilização foi feita antes da fixação. As células NRK transfectadas também foram examinadas para TGN38 (p-r). Coluna da esquerda, micrografias de fluorescência da coluna do meio de rotulagem de GFP-SKD E235Q, micrografias de fluorescência de cada coloração do marcador usando uma coluna da direita do segundo anticorpo conjugado com Cy5, imagens mescladas. Cada linha representa o mesmo campo. Setas e pontas de seta em a – c indicam as células transfectadas com GFP-SKD1 E235Q e as células não transfectadas, respectivamente. Os asteriscos indicam os vacúolos aberrantes associados a SKD1 mutantes formados em células NRK. Bar, 20 μm.

Os compartimentos E235Q são vacúolos exagerados com membranas tubulo-vesiculares

Tendo estabelecido a formação dos compartimentos perinucleares E235Q acumulando as cargas de transporte, caracterizamos a morfologia dos compartimentos em nível ultraestrutural por microscopia eletrônica. Para este propósito, usamos células HEK293 porque a alta eficiência de transfecção (& gt50%) aumentaria a chance de encontrar as células transfectadas nas seções. Confirmamos que a superexpressão de SKD1 E235Q causou um defeito na internalização do ligante também nesta linha celular. Detectamos grandes compartimentos ligados à membrana no citoplasma, que nunca foram vistos nas células de controle (Figura 10a). Esses vacúolos aberrantes incluíam membranas internas. Vale ressaltar que sempre associam inúmeras estruturas túbulo-vesiculares. Na verdade, as membranas túbulo-vesiculares pareciam ser contínuas com os vacúolos (Figura 10b, setas). O tamanho dos túbulos era de 50-80 nm de diâmetro. A morfologia da pilha de Golgi (Figura 10a) e o ER pareceram intactos. Confirmamos definitivamente os vacúolos e as membranas túbulo-vesiculares como endocíticos por captação prévia de um marcador endocítico, HRP. Eles foram fortemente corados com HRP endocitosado (Figura 10, c – e). A coloração HRP forneceu imagens mais convincentes, apoiando a interconexão entre essas duas estruturas (Figura 10e, setas).

Fig. 10. Membranas endocíticas aberrantes são observadas por microscopia eletrônica nas células transfectadas com SKD1 E235Q. (a) As células HEK293 transfectadas com SKD1 E235Q foram fixadas e observadas por microscopia eletrônica. (b) Imagem de maior ampliação de a. (ce) As células HEK293 transfectadas com SKD1 E235Q foram incubadas a 37 ° C durante 1 h na presença de 10 mg / ml de HRP. As células foram fixadas e coradas com DAB para detectar o HRP endocitado em microscopia eletrônica. Foi observado um vacúolo multivesicular aberrante exagerado (V) acompanhado por muitas estruturas túbulo-vesiculares (T) emergindo no citoplasma. A morfologia do aparelho de Golgi (G) parecia normal. As membranas túbulo-vesiculares pareciam ser contínuas ao vacúolo (setas). Bar, 1 μm ..

Para avaliar se essas membranas aberrantes correspondem aos compartimentos E235Q vistos em microscopia de fluorescência, investigamos a localização de GFP-SKD1 E235Q expresso em células HEK293 por um método de imunogold e aumento de prata usando anticorpo anti-GFP. As partículas de ouro aprimoradas com prata que mostram a presença de GFP-SKD1 E235Q foram amplamente associadas ao lado citoplasmático das membranas aberrantes, especialmente na parte vacuolar (Figura 11a). Pouca ligação das partículas de ouro realçadas com prata à seção foi observada nas células de controle não transfectadas (nossos dados não publicados). Em contraste marcante com o mutante SKD1, o SKD1 endógeno estava localizado principalmente no citoplasma (Figura 11b). Alguns deles foram, entretanto, associados ocasionalmente com as membranas de vesículas ou alguns compartimentos semelhantes a endossomos localizados abaixo da membrana plasmática (setas).

Fig. 11. Microscopia imunoeletrônica para GFP-SKD1 E235Q, o SKD1 endógeno, TfR e EEA1. Células HEK293 transfectadas com GFP-SKD1 E235Q foram fixadas, e a localização de GFP-SKD1 E235Q (a), TfR (c) e EEA1 (eh) foi examinado por microscopia eletrônica de ouro imune intensificada com prata usando anticorpos contra GFP, TfR e EEA1, respectivamente. A distribuição do SKD1 endógeno em células H-4-II-E também foi examinada usando anticorpos contra SKD1 (b). (d) Coloração dupla de GFP-SKD1 E235Q (partículas de ouro aprimoradas com prata) e TfR (coloração HRP-DAB). V, vacúolo multivesicular aberrante exagerado T, estruturas túbulo-vesiculares. Setas em b, SKD1 endógeno associado a compartimentos de membrana / vesículas pontas de seta em f – h, EEA1 associado a saliências dos vacúolos. Bar, 1 μm ..

O TfR também foi encontrado para ser acumulado em compartimentos semelhantes por microscopia eletrônica de ouro imunológico (Figura 11c). De acordo com os resultados da microscopia de fluorescência, nas células de controle, muitas partículas de ouro foram encontradas na membrana plasmática (nossos dados não publicados), enquanto apenas muito poucas estavam nas células transfectadas (Figura 11c). Para confirmar que os mesmos compartimentos incluem TfR e GFP-SKD1 E235Q, realizamos um experimento de dupla marcação usando o anticorpo contra GFP junto com o anticorpo contra TfR. A Figura 11d mostra a distribuição exata de TfR (representado por coloração HRP-DAB) nas membranas aberrantes associadas com GFP-SKD1 E235Q (representado por partículas de ouro aprimoradas com prata). Finalmente, encontramos uma quantidade significativa de EEA1 nas membranas dos compartimentos aberrantes (Figura 11, e – h). As partículas de ouro indicando a localização EEA1 foram detectadas em ambas as partes vacuolar e tubulo-vesicular em alguns casos (Figura 11, g e h). As partículas de ouro, no entanto, frequentemente se distribuem preferencialmente na parte túbulo-vesicular (Figura 11, eef). As saliências dos vacúolos também foram frequentemente marcadas (Figura 11, f – h, pontas de seta). Frequentemente observamos na imunofluorescência que EEA1 e GFP-SKD1 E235Q se sobrepõem apenas parcialmente, mas estavam emaranhados de forma compacta (por exemplo, Figura 9c, seta para a direita). Com base nas observações por microscopia eletrônica de imunogold, presumimos que o padrão de coloração dupla exclusivo pode refletir a distribuição preferencial de EEA1 para a parte tubulo-vesicular e as saliências dos vacúolos nos compartimentos E235Q.

Essas observações estabelecem que a superexpressão de SKD1 E235Q causa a formação de vacúolos multivesiculares exagerados com numerosas extensões tubulo-vesiculares, contendo HRP endocitado, GFP-SKD1 E235Q, TfR e EEA1.

Parte do SKD1 endógeno torna-se peletizável por superexpressão do SKD1 mutante

Finalmente, para entender melhor a base molecular do efeito do mutante SKD1, examinamos sua influência na localização subcelular do SKD1 endógeno. Homogenatos de células HeLa foram centrifugados a 100.000 × g, e o sobrenadante e o sedimento resultantes foram analisados ​​por análise de imunotransferência. O SKD1 endógeno em células não transfectadas foi encontrado principalmente no sobrenadante (Figura 12A). Isso é bastante consistente com o estudo morfológico. Como esperado, uma quantidade considerável de GFP-SKD1 E235Q ectópico foi recuperada no sedimento (Figura 12B). Curiosamente, a transfecção de GFP-SKD1 E235Q levou a um aumento na quantidade de SKD1 endógeno presente na fração de sedimento. Porque apenas uma pequena população de células estava expressando o mutante SKD1 no experimento de transfecção transiente, os dados indicaram que uma fração significativa do SKD1 endógeno mudou para o pellet nas células transfectadas. Em contraste, o GFP-SKD1 ectópico foi recuperado principalmente no sobrenadante e não afetou a localização do SKD1 endógeno (Figura 12B). Estes resultados implicam que o efeito do mutante SKD1 é mediado por afetar a função normal do SKD1 endógeno.

Fig. 12. Localização subcelular do SKD1 endógeno e ectópico. (A) Um homogenato de células preparado a partir de células HeLa (T) foi fracionado em sobrenadante (S) e sedimento (P) por centrifugação a 100.000 × g. Essas frações foram analisadas por immunoblot usando anticorpos contra SKD1, TfR (como um marcador de proteína de membrana) e aldolase (como um marcador citosólico). (B) células HeLa transfectadas com GFP-SKD1 ouGFP-SKD1 E235Q foram submetidos a fracionamento celular conforme descrito em A. As frações foram analisadas por imunotransferência usando o anticorpo contra SKD1.


Enzimas

(20) Enzimas são grandes estruturas de proteínas que requerem parâmetros específicos para operar. Desvios das condições ideais podem fazer com que eles parem de funcionar. Qual é a temperatura corporal e o pH ideais para eles se manterem operacionais? Se houver uma exceção a esta regra geral, por favor, cite um exemplo e como ele difere do funcionamento dentro das condições ambientais normalmente aceitas dentro do corpo.

(21) As enzimas, como outros catalisadores, facilitam a ocorrência de reações, mas não são "sequestradas" dentro da reação. Sabendo disso, complete as seguintes equações preenchendo os espaços em branco. (E significa enzima, S significa substrato, P significa produto.)

[E +? rightleftharpoons ES rightleftharpoons? + P ]

(22) Se uma enzima funciona como um catalisador, determine seu efeito (se houver) na reação que ela catalisa.

(23) Determine qual das seguintes opções permite a formação do complexo enzima-substrato.

  1. Pontes de sal
  2. Interações dipolo-dipolo
  3. Ligações de hidrogênio
  4. Ligações covalentes
  5. Forças de dispersão de Londres

(24) Seria possível, em geral, que reações bioquímicas ocorressem sem o auxílio de enzimas? Que tipo de reação (ões) bioquímica (s) não precisa de um catalisador?

(25) Como funciona um inibidor não competitivo? Um inibidor não competitivo é considerado um inibidor específico ou não específico? Se ambos os inibidores competitivos e não competitivos impedem a ligação de um substrato a uma enzima de maneiras diferentes, que outra diferença principal os separa?

(26) Estude o seguinte diagrama de energia para uma reação catalisada por enzima. Identifique Ea ou & # 8710H e indique se & # 8710H é positivo ou negativo.


(12) Observe a seguinte reação e responda às perguntas abaixo.

[CH_3COOH_ <(aq)> + H_2O_ <(l)> rightleftharpoons H_3O ^ + _ <(aq)> + CH_3COO ^ -_ <(aq)> ]

  1. Qual será o efeito no equilíbrio se a concentração de íons hidrônio aumentar?
  2. Qual será o efeito no equilíbrio se a concentração de acetato diminuir?
  3. Se você aumentar a concentração de água, o equilíbrio mudará para a esquerda ou para a direita?
  4. Se você diminuir a concentração de ácido acético, o equilíbrio mudará para a esquerda ou para a direita?

(13) Um exemplo genérico de uma reação de equilíbrio é mostrado abaixo. Responda às seguintes perguntas sobre qual direção de equilíbrio muda de acordo com o princípio de Le Chatelier & rsquos.

[A + B rightleftharpoons C + D + text]

  1. Removendo parte do composto (A )
  2. Aumentando a temperatura
  3. Adicionando mais composto (D )
  4. Aumento da concentração do composto (B )
  5. Diminuindo a temperatura

(14) Alguns processos envolvem múltiplas equações de equilíbrio juntas. Por exemplo, o efeito de carbonatação que cria a água com gás envolve mais de um conjunto de compostos separados por setas de equilíbrio, conforme mostrado abaixo.

[CO_ <2 (g)> + H_2O_ <(l)> rightleftharpoons H_2CO_ <3 (aq)> rightleftharpoons HCO ^ -_ <3 (aq)> + H ^ + _ <(aq)> ]

uma. Durante a hipoventilação, o que acontece com a concentração de íons de hidrogênio?

b. Durante a hiperventilação, o que acontece com a concentração de íons de hidrogênio?


Educação

O programa de Biologia Molecular e Genética da EMU oferece um diploma de Bacharel em Ciências após a conclusão de um currículo de 4 anos ministrado em Inglês. Os alunos são formados principalmente em biologia molecular e vários campos da genética. Além disso, os cursos incluem outras áreas da biologia, como imunologia e neurociência. A educação completa é alcançada por cursos de matemática, física, química, ciência da computação e outros campos incorporados ao currículo. No primeiro ano, os alunos são apresentados aos fundamentos das ciências biológicas em geral e da biologia molecular em particular. Em seguida, os cursos especializados proporcionam conhecimento aprofundado em vários aspectos da genética e da biologia molecular, tanto na teoria quanto na prática, por meio de experiência em laboratório. Os alunos também têm várias opções eletivas para se desenvolverem de acordo com seus próprios interesses, como nas áreas de nutrigenômica e epidemiologia genética.


INTRODUÇÃO

A divisão celular corretamente orientada em tecidos tridimensionais depende do posicionamento preciso do fuso mitótico antes da separação da cromátide irmã na anáfase (Rappaport, 1971). O fuso mitótico, por sua vez, responde a pistas espaciais, que o orientam em relação ao córtex celular (Ahringer, 2003 Thery e Bornens, 2006 Thery et al., 2007). Muito do nosso entendimento da orientação do fuso em populações de tecido vem de estudos de divisão celular assimétrica em Drosophila e Caenorhabditis elegans, onde os constituintes celulares são divididos desigualmente entre as células filhas (Doe e Bowerman, 2001 Kaltschmidt e Brand, 2002 Betschinger e Knoblich, 2004 Roegiers e Janeiro de 2004).Nesses casos, a orientação do fuso pode ser determinada pelo formato da célula, onde o equilíbrio das forças nos microtúbulos astrais do córtex celular centraliza o fuso ao longo do eixo longo. Alternativamente, pistas moleculares específicas que se localizam no córtex por meio de fatores de polaridade são hipotetizadas para atuar ligando microtúbulos astrais ou exercendo forças de tração ou empurrão no fuso.

As células em epitélios polarizados simples, no entanto, devem se dividir simetricamente dentro do plano da monocamada (Fleming et al., 2007) prevê-se que o fracasso em alcançar isso faça com que as células cresçam fora da monocamada, interrompendo a arquitetura do tecido (Baena-Lopez et al., 2005). A divisão simétrica requer que os fusos mitóticos sejam estritamente orientados no eixo Z, de modo que o plano de divisão entre as células filhas seja perpendicular ao plano da monocamada. No entanto, pouco se sabe sobre as pistas espaciais que podem instruir a orientação do fuso no eixo Z em células que se dividem simetricamente. Estudos usando células epiteliais de mamíferos isoladas identificaram papéis para a forma celular (O'Connell e Wang, 2000) e a matriz extracelular (ECM Thery et al., 2005) na orientação de eixos-árvore no plano XY. A adesão da integrina também afeta a orientação do eixo Z em células não polarizadas isoladas (Toyoshima e Nishida, 2007). Mas esses relatórios não abordam como os fusos se orientam no eixo Z quando as células polarizadas são organizadas em populações coerentes. Portanto, neste estudo, buscamos identificar pistas espaciais que orientam o fuso mitótico no eixo Z para, assim, garantir a formação de lâminas epiteliais organizadas.


Texto e figuras suplementares

Figuras suplementares 1–9 e tabelas suplementares 1 e 2 (PDF 4306 kb)

Filme Complementar 1

Uma visualização 3D de várias estruturas descritas nas figuras. A animação começa com uma renderização de superfície do mapa de densidade cryoEM, girando em torno de um eixo de 2 dobras. As unidades estruturais contendo proteínas de membrana E e M mostradas na mesma cor são equivalentes por simetria icosaédrica. As unidades estruturais de cores diferentes são quase equivalentes. Especificamente, as unidades verdes caem nos eixos icosaédricos de 5 vezes, as azuis nas 3 vezes e as vermelhas nas 2 vezes. Esta cena é seguida por uma visão de perto de um grupo em forma de losango de seis dímeros E-M, equipados com as representações de fitas de seu modelo atômico, girando em torno do eixo horizontal. Em seguida, os três heterotetrâmeros quase equivalentes E-M-M-E são calculados. Girado em torno do eixo horizontal, metade deste tetrâmero médio é renderizado como uma representação de superfície sombreada e a outra metade é mostrada em cinza semitransparente, sobreposta com as representações de fita de um monômero E e um monômero M, com o mesmo esquema de cores da Figura 2. (AVI 26509 kb)

Filme Complementar 2

Interações entre E (superfície molecular) e M (bastões). Primeiro, uma vista animada da Figura 4b. Em segundo lugar, uma vista animada da superfície molecular de E e o modelo de fita e bastão de M que compreende o bolso 1, como mostrado na Figura 4c e na Figura 8c suplementar. Um segundo bolsão 1 em uma posição relacionada à simetria também é visível na mesma vista. Terceiro, uma vista animada da superfície molecular de E e o modelo de fita e bastão de M que compreende o bolso 2, conforme mostrado na Figura 4d e na Figura Suplementar 8e. A histidina no centro deste filme é His7 de M que está envolvida no travamento sensível ao pH de E por M. Os dois átomos de nitrogênio contíguos em uma protuberância próxima acima e à direita deste His7 pertencem a His209 de E. Finalmente, uma vista animada da superfície molecular de E e o modelo de fita e bastão de M que compreende o bolso 3, conforme mostrado na Figura 4e e na Figura Suplementar 8g. O entorno do Trp19 central de M é altamente hidrofóbico, conforme indicado pelos tipos de átomos na superfície molecular de E. (AVI 12159 kb)


Assista o vídeo: Histologia da Folha - Aula 11 - Módulo V: Botânica. Prof. Guilherme (Novembro 2021).