Em formação

Deinococcus radiodurans - Biologia


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Modelo: Categoria


Sistema antioxidante de Deinococcus radiodurans

Deinococcus radiodurans é famoso por sua extrema resistência a diversos estresses, como radiação ionizante (IR), dessecação e estresse oxidativo. O mecanismo subjacente de resistência excepcional desta bactéria robusta ainda permaneceu obscuro. Porém, o sistema antioxidante de D. radiodurans tem sido considerado o fator determinante para sua resistência incomparável e protege o proteoma durante o estresse, então o sistema de reparo do DNA e o sistema metabólico exercem suas funções para restaurar a célula ao estado fisiológico normal. O sistema antioxidante não só é equipado com as enzimas de eliminação de espécies reativas comuns de oxigênio (ROS) (por exemplo, catalase e superóxido dismutase), mas também armado com uma variedade de antioxidantes não enzimáticos (por exemplo, carotenóides e espécies de manganês). E os pequenos complexos de manganês desempenham um papel importante no sistema antioxidante de D. radiodurans. Estudos recentes caracterizaram vários reguladores (por exemplo, PprI e PprM) em D. radiodurans, que desempenham papéis críticos na proteção das bactérias de vários estresses. Nesta revisão, oferecemos um panorama do progresso em relação às características do sistema antioxidante em D. radiodurans e sua aplicação no futuro.

Palavras-chave: Sistema antioxidante Deinococcus radiodurans Manganês PprI PprM Espécies reativas de oxigênio.

Copyright © 2019 Institut Pasteur. Publicado por Elsevier Masson SAS. Todos os direitos reservados.

Declaração de conflito de interesse

Declaração de Concorrência de Interesses Os autores declaram que não publicaram ou submeteram o manuscrito em outro lugar.


Estrutura celular e metabolismo

D. radiodurans é uma bactéria gram-positiva que geralmente se forma em pares esféricos ou tétrades. [4] O aspecto mais interessante sobre a estrutura celular de D. radiodurans é que ele mantém de 4 a 10 cópias de todos os seus genes a qualquer momento, dependendo de seu estágio atual de crescimento. Muitos pesquisadores acreditam que isso está relacionado ao motivo pelo qual ele pode suportar tanta radiação. Esta habilidade não depende de algum gene "mágico" que a protege da radiação, ao contrário, parece que D. radiodurans é capaz de reparar mais eficientemente quebras de fita dupla em seu DNA que resultam de danos por radiação graças a essas cópias extras e algumas outras proteínas especiais. [2]


MATERIAIS E MÉTODOS

Mídia e produtos químicos

Ágar nutriente (NA, Oxoid) foi usado para a seleção de rotina e manutenção de Escherichia coli Deformação. Para experimentos, E. coli as células foram cultivadas usando meio Luria – Bertani (LB). Suplementos foram adicionados conforme necessário: 100 μg / ml de ampicilina. H. pylori A cepa 26695 foi adquirida da National Collection of Type Cultures of Public Health England e mantida em placas de Columbia Blood Agar (CBA) contendo 5% de sangue de ovelha desfibrinado (Thermo Fisher Scientific) em câmaras microaerofílicas (Oxoid) nas quais a atmosfera foi mantida com CampyGen 2.5 Sachê L (Oxoid). Suplementos foram adicionados conforme necessário: 5 μg / ml de cloranfenicol, 10 μg / ml de canamicina. Salvo indicação em contrário, todos os produtos químicos e reagentes foram obtidos da Sigma-Aldrich.

Helicobacter pylori transformação

Para gerar H. pylori mutantes, as cepas receptoras foram revitalizadas a partir de estoques de glicerol em placas de CBA frescas a 37 ° C. As colônias de cada cepa foram expandidas em série em placas CBA até que uma camada confluente foi alcançada. Essas células foram compactadas em uma esfera e deixadas por 5 horas a 37 ° C para promover o desenvolvimento natural da competência genética. A massa das células foi então transferida para uma placa CBA pré-aquecida e deixada durante 1 hora a 37 ° C. Cinco μg de DNA em um volume de & lt10 μl foram adicionados suavemente no topo da esfera e misturados usando uma alça de inoculação. As células foram então compactadas e incubadas durante a noite a 37 ° C. Finalmente, as células foram então espalhadas em uma placa CBA pré-aquecida contendo antibiótico e incubadas a 37 ° C. Os transformantes geralmente aparecem após 4-5 dias.

Expressão e purificação de proteínas

o dnaA gene de cada espécie foi amplificado por PCR usando DNA genômico ou um gene sintético (GenScript) e clonado em pSP015 contendo um His14-SUMO-FLAG3 marcação. Os plasmídeos foram amplificados em DH5α e depois transformados em BL21 (DE3) -pLysS. As cepas foram cultivadas em meio LB a 37 ° C. No UMA600 0,6, IPTG 1 mM foi adicionado e as culturas foram incubadas durante 4 h a 30 ° C. Para B. subtilis DnaA, as células foram colhidas por centrifugação a 7000 g por 20 min, ressuspendidas em 40 ml de Tampão de ligação Ni 2+ (HEPES 30 mM [pH 7,6], glutamato de potássio 250 mM, acetato de magnésio 10 mM, sacarose 20%, imidazol 30 mM ) contendo 1 comprimido inibidor de protease sem EDTA (Roche # 37378900) e congelado rapidamente em nitrogênio líquido. As suspensões de peletes celulares foram descongeladas e incubadas com 0,5 mg / ml de lisozima em gelo durante 1 hora. As células foram interrompidas por sonicação (5 ciclos de 3 min a 30 W com intervalo de pulsos / descanso de 2 s). Para remover os resíduos celulares, o lisado foi centrifugado a 24.000 g por 30 min a 4 ° C e, em seguida, passado por um filtro de 0,2 μm para esclarecimento adicional. Todas as etapas de purificação adicionais foram realizadas a 4 ° C usando um FPLC com uma taxa de fluxo de 1 ml / min.

O lisado clarificado foi aplicado a uma coluna HisTrap HP de 1 ml (GE), lavada com 10 ml de tampão de lavagem de alto sal Ni 2+ (HEPES 30 mM [pH 7,6], glutamato de potássio 1 M, acetato de magnésio 10 mM, sacarose 20%, Imidazol 30 mM) e 10 ml de tampão de eluição Ni 2+ a 10% (HEPES 30 mM [pH 7,6], glutamato de potássio 250 mM, acetato de magnésio 10 mM, sacarose 20%, imidazol 1 M). As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de 10 ml (10–100%) de tampão de eluição Ni 2+. As frações contendo a proteína foram aplicadas a uma coluna de afinidade HiTrap Heparin HP (GE) de 1 ml equilibrada em tampão de ligação H (HEPES 30 mM [pH 7,6], glutamato de potássio 100 mM, acetato de magnésio 10 mM, sacarose 20%). As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de 20 ml (20-100%) de tampão de eluição H (HEPES 30 mM [pH 7,6], glutamato de potássio 1 M, acetato de magnésio 10 mM, sacarose 20%). As frações contendo DnaA (geralmente 3 ml no total) foram reunidas e digeridas durante a noite com 10 μl de 10 mg / ml de His14Protease -Tev-SUMO (23).

A reação digerida foi aplicada a uma coluna HisTrap HP de 1 ml para capturar monômeros não clivados, His14-SUMO-tag e His-14Protease -TEV-SUMO. Proteínas DnaA clivadas foram coletadas no fluxo e sua pureza foi confirmada usando SDS-PAGE. Foi adicionado glicerol (20% final) e alíquotas de proteínas foram congeladas rapidamente em nitrogênio líquido antes de serem armazenadas a -80 ° C.

A purificação de homólogos de DnaA de Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis foi realizada conforme descrito acima com a exceção de que as amostras foram diluídas para uma concentração final de glutamato de potássio de 100 mM antes de serem aplicadas na coluna de heparina.

A purificação de homólogos de DnaA de Synechococcus elongatus, Helicobacter pylori e Deinococcus radiodurans foi executado conforme descrito acima com as seguintes exceções. Primeiro, a coluna heparina foi omitida. Em segundo lugar, antes de aplicar as proteínas digeridas a uma coluna HisTrap HP, as amostras foram diluídas para uma concentração final de imidazol de 50 mM.

Ensaio de ligação de análogo de ATP fluorescente

As proteínas (8 μM final) foram incubadas com 0,16 mM de (2 ′ - (ou-3 ′) -O- (t ri n itro fenil) adenosina trifosfato (TNP-ATP) (Thermo Fisher Scientific), em 50 μl de tampão de ligação (HEPES-KOH 10 mM [pH 8], glutamato de potássio 100 mM, acetato de magnésio 5 mM). Uma reação contendo 8 μM de lisozima foi usada como controle negativo. Todas as reações foram realizadas durante 10 min a 25 ° C em uma placa de 96 poços de poliestireno de fundo plano preto (Costar # CLS3694). O TNP-ATP foi excitado em 410 nm e a emissão de fluorescência foi detectada entre 500-650 nm usando um leitor de placas (CLARIOstar Plus, BMG Labtech).

Andaimes de DNA

Os andaimes de DNA foram preparados em uma reação de 20 μl com cada oligonucleotídeo (10 μM) misturado em tampão de recozimento de oligo (HEPES-KOH 30 mM [pH 8], acetato de potássio 100 mM e acetato de magnésio 5 mM). As amostras foram aquecidas em uma máquina de PCR a 95 ° C por 5 min e, em seguida, resfriadas 1 ° C / min a 20 ° C antes de serem mantidas a 4 ° C antes da diluição para 1 μM em tampão de recozimento de Oligo e armazenamento a -20 ° C. Os andaimes separados por eletroforese em gel de poliacrilamida (contendo fluoróforo Cy3 e Cy5) foram fotografados com um scanner a laser Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare) a 400 V com excitação a 532 ou 635 nm e filtro de emissão LPR (580BP ou 665LP respectivamente). As imagens foram processadas usando Fiji (https://doi.org/10.1038/nmeth.2019). As sondas de DNA que contêm Cy5 e Black Hole Quencher-2 (BHQ-2) foram analisadas usando um leitor de placas (CLARIOstar Plus, BMG Labtech) com filtros predefinidos para fluoróforo Cy5 (Excitation 610-30, Dicroic 637.5, Emission 675- 50) definir o ganho em 2800.

Na tentativa de manter o Tm de oligonucleotídeos, DnaA-trios foram mutagenizados, mantendo o conteúdo de base (ver Tabela Suplementar S3). Para medir a temperatura de fusão de substratos WT e DnaA-trios MUT relacionados a cada organismo, preparamos uma reação de 20 μl contendo 0,4 μM de sonda em tampão de reação diferente (veja abaixo o tampão de reação associado a cada sonda). Uma curva de fusão de 20 a 95 ° C foi então realizada na reação usando uma máquina Rotor-GenQ qPCR (QIAgen) com filtro de excitação 563 e filtro de emissão passa-alta 610 (ganho: 10). As curvas obtidas e o valor de fusão de cada pico são relatados na Tabela Suplementar S3.

Ensaio de separação de fita de DNA de inibidor de buraco negro (BHQ-SSA)

Cada andaime de DNA contendo um oligonucleotídeo com BHQ2, um com Cy5 e um não marcado (12,5 nM de concentração final) foi diluído em tampões apropriados (ver abaixo). As reações foram realizadas usando uma placa de 96 poços de poliestireno preto de fundo plano (Costar # CLS3694). Todas as reações foram feitas em triplicata e a fluorescência foi detectada a cada minuto por um total de 90 min. Para todas as reações foi realizado um controle negativo sem proteína (fundo). Em cada ponto de tempo, o valor médio de fundo é subtraído do valor experimental, relatando assim a atividade DnaA específica em um único substrato.

Para visualizar diretamente os produtos da reação (Figura 2B), amostras de 20 μl foram removidas e adicionadas a 3,7 μl de solução de parada contendo competidor não marcado 250 nM (mesma sequência do oligonucleotídeo contendo Cy5), 0,4% de SDS e 1 mg / ml de proteinase K. As reações foram armazenadas em gelo e depois carregadas em um gel de poliacrilamida a 4% (19: 1) e corridas a 100 V por 3 h em tampão contendo Tris 45 mM, ácido bórico 45 mM e cloreto de magnésio 5 mM.

Ensaio de desenrolamento de BUS específico usando B. subtilis DnaA. (UMA) Sequências de andaime de DNA para B. subtilis e representação esquemática do ensaio de separação de fita Black Hole Quencher (BHQ-SSA). (B) BHQ-SSA usando B. subtilis DnaA indica que o ATP é necessário para o desenrolamento do andaime. Um gel de poliacrilamida mostrando a separação específica do oligonucleotídeo marcado com Cy5 do andaime. (C) BHQ-SSA usando B. subtilis As proteínas DnaA indicam que o dedo de arginina (DnaA R264A, em violeta) e o resíduo de ligação de ssDNA (DnaA I190A, em laranja) são necessários para o desenrolamento do andaime. (D) BHQ-SSA usando B. subtilis DnaA indica que tanto as caixas DnaA quanto os trios DnaA são necessários para o desenrolamento do andaime. Os dados representam a média e o desvio padrão de três experimentos independentes. O eixo Y mostra a unidade arbitrária de fluorescência (AU).

Ensaio de desenrolamento de BUS específico usando B. subtilis DnaA. (UMA) Sequências de andaime de DNA para B. subtilis e representação esquemática do ensaio de separação de fita Black Hole Quencher (BHQ-SSA). (B) BHQ-SSA usando B. subtilis DnaA indica que o ATP é necessário para o desenrolamento do andaime. Um gel de poliacrilamida mostrando a separação específica do oligonucleotídeo marcado com Cy5 do andaime. (C) BHQ-SSA usando B. subtilis As proteínas DnaA indicam que o dedo de arginina (DnaA R264A, em violeta) e o resíduo de ligação de ssDNA (DnaA I190A, em laranja) são necessários para o desenrolamento do andaime. (D) BHQ-SSA usando B. subtilis DnaA indica que tanto as caixas DnaA quanto os trios DnaA são necessários para o desenrolamento do andaime. Os dados representam a média e o desvio padrão de três experimentos independentes. O eixo Y mostra a unidade arbitrária de fluorescência (AU).

Para B. subtilis, S. aureus e E. faecalis o tampão de reação era HEPES-KOH 10 mM (pH 8), glutamato de potássio 100 mM, acetato de magnésio 2 mM, glicerol 30%, DMSO 10% e nucleotídeo 1 mM (ADP ou ATP).

Para L. monocytogenes, S. elongatus, H. pylori e D. radiodurans o tampão usado foi HEPES-KOH 10 mM (pH 8), glutamato de potássio 100 mM, acetato de magnésio 2 mM, glicerol a 30% e nucleotídeo 1 mM (ADP ou ATP).

Todas as reações foram preparadas em gelo para garantir a estabilidade da sonda de DNA, em seguida, deixou-se equilibrar à temperatura da reação (20 ° C para L. monocytogenes, E. faecalis e S. aureus 25 ° C para B. subtilis, S. elongatus e H. pylori 32 ° C para D. radiodurans) A proteína DnaA foi adicionada à concentração final de 130 nM para B. subtilis e D. radiodurans e 650 nM para L. monocytogenes, E. faecalis, S. aureus, S. elongatus e H. pylori. Para B. subitlis em DnaA-Box # 7 MUT e DnaA-Box # 6 MUT proteína foi adicionada na concentração final de 650 nM para permitir o deslocamento de todas as sondas.

Immunoblotting

A proteína purificada eluída de 1 ml de coluna de afinidade HiTrap Heparin HP (GE) foi fixada em tampão de amostra NuPAGE LDS (Thermo Fisher Scientific) a 98 ° C por 5 min e os complexos foram resolvidos executando 8 μl de cada amostra em um NuPAGE Novex 4- Gel Tris-acetato a 12% (Thermo Fisher Scientific). As proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF usando o aparelho de transferência Turbo-Blot e os pacotes de transferência Trans-Blot TurboTM Midi PVDF (Bio-Rad). A membrana foi bloqueada com PBS + 5% de leite por 1 h em temperatura ambiente e então incubada com PBS + 1% de solução de leite contendo um anticorpo monoclonal anti-FLAG 1: 2000 (Sigma-Aldrich # F3165) por 1 h em temperatura ambiente. A membrana foi lavada três vezes com PBS + Tween-20 a 0,05% e depois incubada com PBS + solução de leite a 1% contendo um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano anti-rato 1:10 000 (Sigma-Aldrich # A9044). A membrana foi lavada três vezes com PBS + Tween-20 a 0,05% e depois incubada durante 5 min com substrato Pierce ECL Plus (Thermo Scientific). A quimioluminescência foi detectada usando um gerador de imagens ImageQuant LAS 4000 (GE Healtcare). As imagens foram processadas usando Fiji (https://doi.org/10.1038/nmeth.2019).

Reticulação de proteína

Os andaimes de DNA foram preparados pela mistura de cada oligonucleotídeo (concentrações finais de 50 nM) em HEPES-KOH 10 mM (pH 7,6), NaCl 100 mM e EDTA 1 mM, aquecimento a 98 ° C por 5 min em um bloco de calor e, em seguida, resfriamento lento até temperatura do quarto. Proteínas DnaA CC (250 nM) foram combinadas com uma estrutura de DNA (25 nM) em HEPES-KOH 10 mM (pH 8), glutamato de potássio 100 mM, cloreto de sódio 100 mM, acetato de magnésio 10 mM, glicerol 25%, Tween 0,01% Nucleotídeo -20 e 2 mM (ADP ou ATP). As reações foram incubadas a 37 ° C por 6 min, então 2,5 μl de 20 mM bismaleimidoetano (BMOE) (4 mM final) (Thermo Fisher Scientific # 803561) foram adicionados para reticular proteínas DnaA CC. Após 6 min, a reação foi extinta pela adição de 5 μl de cisteína 200 mM (60 mM final) por 10 min. As amostras foram fixadas em tampão de amostra NuPAGE LDS (Thermo Fisher Scientific) a 98 ° C por 5 min e os complexos foram resolvidos e visualizados executando 8 μl de cada reação seguindo o método descrito acima. A interpretação das espécies reticuladas foi baseada em sua migração em relação aos marcadores de peso molecular. Todos os experimentos foram realizados de forma independente pelo menos três vezes, e os dados representativos são mostrados.

O programa para pesquisar a sequência do BUS

Um programa foi desenvolvido para identificar as sequências BUS em origens de replicação bacteriana com base no padrão de regiões de desenrolamento experimental e previsto (22). Durante o processo de treinamento, o programa foi ajustado para produzir as mesmas sequências previstas como aquelas identificadas pela análise anterior de vinte oriCs, para gerar os parâmetros e regras exigidos pelo programa (Tabela Complementar S1 e Figura S2). Em geral, a sequência BUS consiste em três partes: DnaA-box, espaçador e repetição de motivos DnaA-trios. Os parâmetros determinados das três partes durante o processo de treinamento são apresentados a seguir:

Motivo padrão da caixa DnaA. Se a espécie tem uma DnaA-box divergente em DoriC (21, 24), o motivo padrão da DnaA-box era o específico da espécie, enquanto nos outros casos era o E.coli motivo DnaA-box de maior afinidade (5′-TTATCCACA-3 ′).

Incompatibilidades da caixa DnaA prevista. Se o comprimento do motivo padrão for 9 bp e houver apenas uma caixa DnaA presente, a incompatibilidade máxima foi definida como 2. Se o comprimento do motivo padrão for 9 bp e houver um par de caixas DnaA presente, então a incompatibilidade máxima não é mais do que 2 (a caixa DnaA mais conservada) ou 4 (a caixa DnaA menos conservada). Se o comprimento do motivo padrão for maior que 9 bp, a incompatibilidade máxima da sola (se singular) ou a mais conservada (se tandem) é aumentada em 3.

Comprimento do espaçador entre oDnaA-box localizado pela primeira vez e os primeiros trios DnaA. De acordo com a Tabela Suplementar S1, assumimos que o espaçador mais longo pode incluir: a sequência entre duas caixas DnaA (máx. 3 pb), uma caixa DnaA menos conservada (geralmente 9 pb) e a segunda região de lacuna anteriormente denominada região rica em GC (4 bp em média). Portanto, o comprimento máximo predefinido do espaçador é definido como 16 bp, que é a soma das três partes.

Padrão dos trios DnaA. A base no meio de cada motivo trinucleotídico DnaA-trios é uma adenina conservada. Análise do B. subtilis Os trios DnaA sugeriram que um conjunto de três motivos era minimamente necessário para a atividade de origem (22). Portanto, o padrão geral de trios DnaA foi definido como (.A.) <3,>, o que significa que não menos do que três motivos de NAN (N é qualquer base) são permitidos.

O processo de busca é dividido em duas etapas (Figura Suplementar S2B). Primeiro, o programa procura a sequência candidata com o padrão geral da sequência do BUS (Figura Suplementar S2D). Nesta etapa, ele localiza um DnaA-box (o primeiro DnaA-box localizado) (incompatibilidade ≤2) com uma distância de 0–16 bp do DnaA-trio. Depois, a segunda caixa DnaA (incompatibilidade ≤4) é pesquisada a montante ou a jusante da caixa DnaA identificada na primeira etapa. Deve-se notar que se esta última caixa DnaA for identificada a montante da primeira e parecer ter menos incompatibilidades, o comprimento real do espaçador é contado a partir da segunda caixa DnaA localizada e, portanto, será maior que 16 bp.

O processo de triagem é dividido em três etapas (Figura Suplementar S2C). Primeiro, o programa conserva as sequências candidatas com a pontuação DnaA-trios mais alta. Então, as sequências candidatas contendo o número mínimo de incompatibilidades na caixa DnaA (a única se singular ou a mais conservada se tandem) são retidas. Após essas duas etapas, & gt94% dos genomas têm uma única sequência candidata. Terceiro, as sequências candidatas com o comprimento do espaçador mais próximo de 13 pares de bases são mantidas, uma vez que é o comprimento do espaçador mais comum. Após esta etapa, quase todos (& gt99%) os genomas têm uma única sequência candidata restante.


Sobre este site

Este site foi criado como uma tarefa para minha aula de biologia de organismos na primavera de 2008. Fomos obrigados a criar uma página da web em qualquer organismo de nossa escolha.

Informações de contato

Achou o site legal? Tem informações extras? Acha que precisa haver uma correção? Por favor entre em contato comigo.

Agradecimentos especiais!

Quero aproveitar este momento para enviar um agradecimento especial a Michael Daly pelo uso de suas fotos e por todas as pesquisas incríveis que ele me forneceu. Além disso, Dennis Kunkel gentilmente me permitiu o uso de suas micrografias eletrônicas. A Dra. Bonnie Bratina fez o possível para me fornecer fotos de sua viagem à Antártica. Claro, o site não teria sido criado com a ajuda do Dr. Volk e do Dr. Sandland.

Sobre o autor

Meu nome é Meagan Arnold e sou um júnior na Universidade de Wisconsin-LaCrosse. Eu sou um especialista em ciências biomédicas com especialização em química. Minhas raízes estão na pequena cidade agrícola de Evansville, WI. Como a grande maioria dos estudantes universitários, meus planos futuros estão no ar. Quer se trate de medicina, fisioterapia ou pesquisa, meu amor por aprender ciências é inabalável. Outras paixões minhas são bastante diversas. Cozinhar, tocar trompete, nadar, correr, amigos e família ocupam muito do meu tempo, às vezes mais do que deveriam :). Sou o melhor em procrastinação e orgulho-me da minha capacidade de fazer uma torta de maçã incrível.

Por que Deinococcus ?

Então você provavelmente está se perguntando sobre cada organismo em tseu planeta, por que eu escolheria Deinococcus radiodurans? Em minha introdução às aulas de microbiologia, foi necessário aprender uma série de microrganismos. Deinococcus radiodurans sempre grudou em mim. Quer dizer, vamos lá, ele pode sobreviver à radiação ionizante do lixo nuclear, fica muito mais frio do que isso?

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2 respostas 2

De acordo com a seção "Adaptação funcional" desta página, Deinococcus radiodurans usa proteínas de reparo para costurar DNA após dano por radiação. Ou seja, após uma explosão de radiação, o DNA estará em pedaços e as proteínas de reparo o recomporão. Parece que esse mecanismo não entraria em ação durante outras formas de mutação do DNA que acontecem durante a replicação, como mutações pontuais ou inversões.

Deinococcus radiodurans não "desenvolveu resistência a mutações".

É capaz de reparar seu cromossomo quando dilacerado em pedaços por radiações ou dessecação, enquanto outras bactérias morreriam em tais condições.

Portanto, isso é adaptável em ambientes extremos, como desertos (onde evoluiu) ou carne enlatada em lata (onde foi descoberto).


Materiais e métodos

Cepas, condições de crescimento e tratamento.

As cepas e plasmídeos usados ​​neste estudo são descritos na Tabela 2. Todos os genes são identificados conforme descrito na sequência do genoma publicada (http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/GenomePage3.spl?database=gdr). Todas as cepas derivadas de D. radiodurans foram cultivadas a 30 ° C em caldo TGY (0,5% de triptona, 0,3% de extrato de levedura e 0,1% de glicose) ou em ágar TGY (ágar 1,5%). As cepas de E. coli foram cultivadas em caldo Luria-Bertani (LB) ou em placas LB a 37 ° C. Os plasmídeos foram propagados rotineiramente na cepa DH5αMCR de E. coli. As culturas de D. radiodurans foram avaliadas quanto à sua capacidade de sobreviver à exposição a agentes que danificam o DNA em crescimento exponencial (OD600 = 0,08 - 0,15, 5 × 10 6 - 1 × 10 7 cfu / ml). Todas as culturas foram tratadas a 25 ° C. A irradiação gama foi conduzida usando um irradiador modelo 484R 60 Co (J. L. Shepherd and Associates, San Fernando, Califórnia, Estados Unidos) a uma taxa de 30 Gy / min. A resistência à mitomicina C foi determinada pela adição de 1 mg de mitomicina C (Sigma, St. Louis, Missouri, Estados Unidos) a culturas de caldo de 1 ml da cepa de D. radiodurans. Alíquotas da cultura tratada foram removidas em intervalos de meia hora ao longo das 2 horas seguintes, lavadas em MgSO4 10 mM e semeadas em ágar TGY para determinar a viabilidade.

Construção de TNK104, TNK106 e TNK110.

Os genes ddrA e recA foram interrompidos por mutagênese direcionada usando técnicas descritas anteriormente (Funayama et al. 1999). Um cassete de deleção foi criado para cada locus e transformado em uma cultura R1 de D. radiodurans em fase exponencial. Os recombinantes foram selecionados em placas TGY contendo um antibiótico apropriado. Uma vez que D. radiodurans é multigenômica, as colônias individuais foram rastreadas para determinar se eram homozigotas para a interrupção, isolando o DNA genômico de supostos recombinantes e usando uma análise baseada em PCR para determinar se o gene de interesse havia sido excluído. Os detalhes de como cada cepa foi gerada são fornecidos abaixo.

A construção de TNK104 começou com a criação de um cassete de droga capaz de conferir resistência à higromicina em D. radiodurans. The hygromycin B phosphotransferase gene (hyg) from pHP45omega-hyg (Blondelet-Rouault et al. 1997) was spliced to the 120 bp of sequence immediately upstream of the initiation codon of the D. radiodurans katA gene (DR1998) (Funayama et al. 1999), using primers whose sequences overlapped. Subsequently, the katA–hyg fusion product was joined to PCR fragments (Horton et al. 1989) derived from the sequence 1.0 kbp immediately upstream and 0.9 kbp immediately downstream of ddrA. This hybrid fragment was cloned into pGEM-T (Promega, Madison, Wisconsin, United States), creating pTNK205. pTNK205 was propagated in E. coli DH5α-MCR. A exclusão de ddrA was accomplished by transforming (Earl et al. 2002b) an exponential-phase R1 culture with linear pTNK205. Hygromycin-resistant recombinants were selected on TGY plates containing 37.5 μg/ml hygromycin.

To confirm gene replacement, primers, which anneal outside the coding sequence of ddrA, were used to generate PCR fragments from genomic DNA from hygromycin-resistant colonies and R1. The purified PCR products were restricted with EcoRI and EcoRV. o hyg gene contains an EcoRI site, but ddrA não. ddrA contains an EcoRV site, but hyg não. In the recombinant, designated TNK104, a single 1.3-kbp fragment, corresponding to the katA–hyg cassette was amplified, whereas there was no trace of the 0.85-kbp fragment, indicative of ddrA amplification (see Figure 1A). EcoRI cleaved the product amplified from TNK104 into 0.2-kbp and 1.1-kbp fragments, while the R1-derived product remained intact (Figure 1B). EcoRV digested the amplicon from R1 into fragments of 0.4 kbp and 0.45 kbp, but it did not affect the TNK104-derived product (Figure 1C). We conclude that TNK104 carries a deletion of the ddrA coding sequence marked by the katA–hyg cassette and that the strain is homozygous for the deletion.

o recA deletion strain TNK106 was constructed in a manner similar to that of TNK104. Initially, the katA promoter of D. radiodurans was fused to the chloramphenicol acetyltransferase gene (cat) from pBC (Stratagene, La Jolla, California, United States). This drug cassette was then spliced to PCR products corresponding to genomic DNA sequences 1.6 kbp upstream and 1.2 kbp downstream of recA by overlap extension, before being cloned into pGEM-T. The resulting plasmid was designated pTNK210. An exponential-phase R1 culture was transformed with the replacement cassette from pTNK210, and chloramphenicol-resistant recombinants were selected on TGY plates containing 3 μg/ml chloramphenicol. Genomic DNA of each recombinant was amplified to determine if the recA coding region was deleted. Purified PCR products amplified using primers that anneal to sequences flanking recA were treated with PvuII and BglII. o gato gene carries a PvuII site, but recA não. recA contains a BglII site, but gato não. A 1.3-kbp fragment, corresponding to the katA–cat cassette, was obtained from a recombinant designated TNK106, but DNA from this recombinant did not generate the 1.5-kbp fragment corresponding to recA (Figure 1A). Amplifications of genomic DNA from R1 only produced the 1.5-kbp fragments (Figure 1A). The 1.3-kbp PCR product from TNK106 was cleaved by PvuII to 0.5-kbp and 0.8-kbp fragments, whereas the 1.5 kbp from R1 remained intact (Figure 1C). BglII cut the R1-derived 1.5 kbp to fragments of 0.45 kbp and 1.05 kbp, but not the product from TNK106 (Figure 1C). We conclude that recA has been replaced by katA–cat in TNK106 and that the strain is homozygous for this allele. TNK110 is a double mutant in which recA e ddrA are deleted. This strain was constructed by deleting recA from TNK104 using the protocol described for the creation of TNK106. The construct was verified by the scheme used to identify ddrA deletion in TNK104 and recA deletion in TNK106 (see Figures 1A and 1C).

Pulsed-field gel electrophoresis.

After irradiation at 5.0 kGy, cells were collected by centrifugation (6,000g, 15 min, 4 °C) and resuspended in either TGY broth or 10 mM MgSO4 solution, before being placed in a shaking incubator at 30 °C for 24 h. Aliquots of these cultures were removed at various time points, and cells were washed in 0.9% NaCl and suspended in 0.125 M EDTA (pH 8.0) at a density of 5 × 10 8 cells/ml. The suspensions were mixed with low-melting-point agarose (Sigma) to obtain a final concentration of 0.8% agarose. Agarose blocks containing the cell suspension were incubated overnight at 37 °C in 0.05 M EDTA (pH 7.5) containing 1 mg/ml of lysozyme. After lysozyme treatment, agarose plugs were placed in ESP buffer (EDTA 0.5 M [pH 9–9.5], 1% lauroyl sarcosine, 1 mg/ml proteinase K) at 50 °C for 6 h, followed by a 2-d incubation at 37 °C. Prior to digestion with restriction enzymes, agarose plugs were washed once with TE buffer (pH 7.5) containing 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and then four times with TE buffer (pH 7.5). DNA contained within the agarose plugs was digested with 10 U of NotI restriction enzyme (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, United States) overnight at 37 °C. Restriction digests were analyzed on 1% agarose gels in 0.5X TBE, using a CHEF-MAPPER electrophoresis system (Bio-Rad, Hercules, California, United States) at 6 V/cm for 22 h at 12 °C, with a linear pulse ramp of 10–60 s and a switching angle of 120°. Gels were stained with water containing 0.5 μg/ml ethidium bromide for 20 min and destained for 10 min in water.

Quantitative real-time PCR.

The protocol followed was the same as that described previously (Earl et al. 2002a). Total RNA was extracted from 1-l cultures of irradiated and nonirradiated exponential-phase D. radiodurans cultures using TRI Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio, United States) following manufacturer's instructions. Cell disruption was accomplished by adding 100 μ1 of 0.1-mm zirconia/silica beads (Biospec Products, Bartlesville, Oklahoma, United States) and TRI Reagent to the cell paste from 1 l of cells and vigorously agitating this mixture for 6 min with a vortex mixer. Two micrograms of each DNase I–treated, purified RNA sample was converted to cDNA using SUPERSCRIPT II RNase H − Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, California, United States) combined with 25 pmol of random hexamers to initiate synthesis. Conditions for this reaction followed the manufacturer's instructions.

Approximately 100 bp of unique sequence from the genes encoding DdrA (DR0423), RecA (DR2340), and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (DR1343) were amplified using the following primer sets: DR0423up (5′-GGTGCAGGACCGACTCGACGCCGTTTGCC-3′), DR0423down (5′-CCTCGCGGGTCACGCCGAGCACGGTCAGG-3′), DR2340up (5′-GTCAGCACCGGCAGCCTCAGCCTTGACCTC-3′), DR2340down (5′-GATGGCGAGGGCCAGGGTGGTCTTGC-3′), and DR1343up (5′-CTTCACCAGCCGCGAAGGGGCCTCCAAGC-3′), DR1343down (5′-GCCCAGCACGATGGAGAAGTCCTCGCC-3′). The PCR reaction (50 μ1) for amplifying these genes contained the appropriate primers at a final concentration of 0.2 μM, 1 μ1 of the cDNA template, and SYBR Green PCR Core Reagents (Applied Biosystems, Foster City, California, United States). Amplifications were carried out by incubating reactions at 95 °C for 3 min prior to 40 cycles of 30 s at 95 °C, followed by 30 s at 65 °C and 30 s at 72 °C. Data were collected and analyzed at each 72-°C interval. Each 96-well plate consisted of standard curves for each primer set run in duplicate. Standard curves were constructed using cDNA obtained from the unirradiated wild-type organism. A dilution series (1 to 1 × 10 −4 ) of each experimental sample was generated and run in duplicate. Negative controls without a cDNA template were run on every plate analyzed. All assays were performed using the iCycler iQ Real-Time Detection System (Bio-Rad). All data were PCR-baseline subtracted before threshold cycle values were designated and before standard curves were constructed. Mean concentrations of the transcripts in each sample were calculated from the standard curves generated using the recA primer set. Induction levels were determined by dividing the calculated concentration of transcript from the irradiated sample by the concentration of transcript from the unirradiated sample for each strain. The mean concentration of the Gap = Vão transcript, a housekeeping gene whose expression is unaffected by ionizing radiation, was also determined before and after irradiation for each strain.

DNA content measurement in TNK104 and R1 cells.

Overnight cultures growing in TGY medium were harvested at room temperature. Control culture aliquots were fixed with 1% toluene (final vol/vol), shaken vigorously, and stored at 4 °C. The fixed bacteria were diluted (1/10, 1/100, and 1/1,000) in 3 ml (final volume) of dilution buffer: 10 mM NaCl, 6.6 mM Na2TÃO4, 5 mM N′-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid (HEPES pH 7.0). The remaining cultures were centrifuged for 20 min at 4 °C at 7,000 rpm. Bacterial pellets were washed twice and resuspended in 10 mM MgSO4 for γ irradiation. Cell suspensions were irradiated at 5,000 Gy and incubated at 30 °C for 120 h. Aliquots were removed immediately following irradiation, at 48 h, and at 120 h postirradiation. Cells were toluene-fixed as described above 100 μ1 of DAPI (stock solution 3 μg/ml) was added to each dilution tube and mixed. The fluorescence intensity was determined after excitation at 350 nm by measuring emission at 450 nm.

Cloning, overexpression, and purification of DdrA.

o ddrA gene was amplified using the genomic DNA from D. radiodurans strain R1. PCR primers were designed according to the ddrA gene sequence annotated in the genomic bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). The gene was cloned in E. coli overexpressing plasmid pEAW298. DdrA-overproducing cells were lysed with lysozyme, and the protein was precipitated from the supernatant by adding ammonium sulfate to 30% saturation. The protein was purified with DEAE and hydroxyapatite chromatography to greater than 99% purity. The identity of the purified protein was confirmed by N-terminal sequencing (Protein and Nucleic Acid Chemistry Laboratory, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, United States) and accurate mass determination (Biotech Center, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin, United States). The protein was transferred into the storage buffer (20 mM Tris-acetate, 80% cation [pH 7.5]/50% glycerol [w/v], 0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, and 1 mM DTT) and stored at −80 °C.

Determination of the extinction coefficient for pure DdrA protein.

The extinction coefficient for DdrA protein was determined using a modification of a published procedure (Marrione and Cox 1995). UV absorbance spectra were measured with a Cary 300 dual-beam spectrophotometer (Varian, Palo Alto, California, United States). The temperature was maintained using a circulating water bath. Cell-path length and bandwidth were 1 cm and 0.5 nm, respectively. The extinction coefficient for native DdrA protein was determined in the storage buffer, by comparing the absorbance spectra of the native protein to the absorbance spectra of the protein denatured in 6 M guanidine hydrochloride (Gnd–HCl) in storage buffer. The extinction coefficients at 280 nm of glycyl- L -tyrosylglycine and N-acetyl- L -tryptophanamide in 6 M GND–HCl are 1,280 M −1 cm −1 and 5,690 M −1 cm −1 , respectively (Edelhoch 1948). In the DdrA protein there are five tyrosine, five tryptophan, and two cysteine residues in a protein with a total molecular mass of 23 kDa. Even if all cysteine residues were involved in disulfide bonds, the contribution of cystine to the absorbance of DdrA protein is predicted to be less than 1% and was neglected from our calculations. The extinction coefficient at 280 nm for denatured DdrA protein in εdenat, 280 nm = 5 × 5,690 + 5 × 1,280 = 3.485 × 10 4 M −1 cm −1 . Absorbance spectra of native and denatured (6 M GND–HCl) DdrA protein were scanned at 25 °C, from 320 to 240 nm, for five different dilutions and with two different protein preparations. DdrA protein was diluted in storage buffer or storage buffer plus 6 M GND–HCl (final concentration) in a total volume of 80 μ1 and was preincubated at 25 °C for 5 min before scanning. Each dilution was carried out in triplicate, and the absorbance values at 280 nm were averaged. The concentrations of native and denatured protein were equal to each other in each scan at each dilution. The extinction coefficient of native DdrA protein at 280 nm was determined according to the expression (Gill and von Hippel 1989): εnat, 280 nm = εdenat, 280 nm × Absnat, 280 nm/Absdenat, 280 nm. We used five determinations with two different protein preparations, yielding an average extinction coefficient of εnat, 280 nm = 2.8728 ± 0.1999 × 10 4 M −1 cm −1 in storage buffer at 25 °C. The A280/A260 ratio for the native DdrA protein is 1.575 ± 0.00091. The error in both cases is 1 s.d.

DNA binding assay.

The duplex oligonucleotide with a 3′ single-stranded extension was hairpin-forming oligonucleotide A (5′-TTA ACG ACC GTC GAC CTG CAG GTC GAC GGT CGT TAA CGT CTC TCA GAT TGT-3′), which was labeled at the 3′ terminus with [α- 32 P]ddATP, using terminal transferase. After labeling, hairpin formation generated an 18-bp duplex hairpin with a 16-nt 3′ extension. The duplex oligonucleotide with a 5′ single-stranded extension was hairpin-forming oligonucleotide B (5′-CGT CTC TCA GAT TGT TTA ACG ACC GTC GAC CTG CAG GTC GAC GGT CGT TAA-3′). The oligo was labeled at the 5′ end using [γ- 32 P] ATP and polynucleotide kinase. After labeling, hairpin formation generated a DNA with 18 bp in the hairpin duplex and a 15-nt 5′ extension. A blunt-ended duplex DNA fragment was prepared by annealing oligonucleotide C (5′-GGT CTT TCA AAT TGT TTA AGG AAG AAA CTA ATG CTA GCC ACG GTC CGA GCC-3′) 32 P-labeled at its 5′ end, with unlabeled oligonucleotide D (5′-GGC TCG GAC CGT GGC TAG CAT TAG TTT CTT CCT TAA ACA ATT TGA AAG ACC-3′). The single-stranded oligonucleotide was the end-labeled oligo C. EMSAs for DNA binding were carried out in 15-μl reaction mixtures containing the reaction buffer (40 mM Tris-acetate [pH 7.5],10% glycerol [w/v], 0.1 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) and 0.7 nM (60 nM nt) 32 P-labeled duplex DNA. The reaction was initiated by adding the DdrA protein to the required concentration. The reaction mixture was incubated at 30 °C for 30 min and loaded onto a 10% native polyacrylamide gel. The electrophoresis was performed in 1X TBE (89 mM Tris-borate [pH8.3], 2 mM EDTA) at room temperature. After the electrophoresis was completed, the gel was dried and exposed with a Phosphoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, United States).

Identification of DdrA protein in DNA–protein complex.

The general strategy of this experiment was to incubate a DNA duplex with a 3′ extension with DdrA protein, resolve the protein complex in native PAGE, excise the complex from the gel, extract the protein from the slice, and analyze the protein in SDS-PAGE. If the protein is DdrA, it will comigrate with DdrA protein in SDS-PAGE.

A 32 P-labeled oligonucleotide (30 nt 5′-GTG CGC TCC GAG CTC AGC TAC CGC GAG GCC-3′) was annealed with a longer unlabeled oligonucleotide (50 nt 5′-GGC CTC GCG GTA GCT GAG CTC GGA GCG CAC GAT TCG CAC TGC TGA TGT TC-3′). Annealing was carried out in a 40-μ1 solution containing 0.5 μM of each oligonucleotide in 25 mM Tris HCl (pH 8), 50 mM NaCl, and 12.5 mM MgC12. The solution was heated briefly at 100 °C, by transferring the closed tube to a beaker of boiling water, and allowed to cool slowly overnight. The tube was refrigerated for several hours and then stored at −20 °C until use.

The resulting labeled duplex DNA with a 3′ extension (0.7 nM) was incubated with 4 μM DdrA protein under the DNA binding conditions described above. The mixture was loaded onto a 10% native polyacrylamide gel. Electrophoresis was performed as described above. The gel was exposed with X-ray film to map the position of the protein–duplex complex. The complex was cut out of the gel. The gel slice was frozen in liquid nitrogen and crushed into a slurry with a plastic stick. The slurry was mixed with an equal volume of SDS-PAGE loading buffer and boiled for 3 min. The mixture was loaded onto a 12% SDS-PAGE gel and the protein present compared to molecular weight standards and purified DdrA protein.

Exonuclease assay.

The duplex with a 3′ extension was prepared by annealing oligonucleotide A (5′-CTA GCA TTA GTT TCT TCC TTA AAC AAT TTG AAA GAC C-3′), which was labeled at the 5′ terminus with [γ- 32 P]ATP, and cold oligonucleotide B (5′-GGT CTT TCA AAT TGT TTA AGG AAG AAA CTA ATG CTA GCC ACG GTC CGA GCC-3′). The annealing generated a 14-nt 3′ extension at one end of the short duplex. Before adding the exonuclease, the 32 P-labeled duplex (60 nM nt) was preincubated with the DdrA protein at the indicated concentration in 15 μl of the exonuclease reaction buffer (40 mM Tris-acetate [pH 7.5], 0.1 M NaCl, 10 mM MgC12, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol) at room temperature for 10 min. In the control experiment, the DdrA protein was replaced with bovine serum albumin. Exonuclease I was added to 200 U/ml and the reaction mixture was incubated at 37 °C for 30 min. After the incubation was complete, the reactions 5 and 6 were deproteinized with 0.2% SDS and 0.2 mg/ml proteinase K at 37 °C for 15 min. The DNA–protein complexes were resolved in the native polyacrylamide gel as above.


Structural and biochemical evidence supporting poly ADP-ribosylation in the bacterium Deinococcus radiodurans

Poly-ADP-ribosylation, a post-translational modification involved in various cellular processes, is well characterized in eukaryotes but thought to be devoid in bacteria. Here, we solve crystal structures of ADP-ribose-bound poly(ADP-ribose)glycohydrolase from the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans (DrPARG), revealing a solvent-accessible 2'-hydroxy group of ADP-ribose, which suggests that DrPARG may possess endo-glycohydrolase activity toward poly-ADP-ribose (PAR). We confirm the existence of PAR in D. radiodurans and show that disruption of DrPARG expression causes accumulation of endogenous PAR and compromises recovery from UV radiation damage. Moreover, endogenous PAR levels in D. radiodurans are elevated after UV irradiation, indicating that PARylation may be involved in resistance to genotoxic stresses. These findings provide structural insights into a bacterial-type PARG and suggest the existence of a prokaryotic PARylation machinery that may be involved in stress responses.

Declaração de conflito de interesse

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Figuras

Crystal structures of apo and…

Crystal structures of apo and ADP-ribose-bound forms of DrPARG. uma , b Structure…

Detailed view of the ADP-ribose…

Detailed view of the ADP-ribose binding pocket of DrPARG. UMA detailed comparison of…

Detection of endogenous poly-ADP-ribose (PAR)…

Detection of endogenous poly-ADP-ribose (PAR) in Deinococcus radiodurans . uma PAR formation assayed…

Structural model of DrPARG-PAR (poly-ADP-ribose)…

Structural model of DrPARG-PAR (poly-ADP-ribose) complex in endo-glycohydrolase mode. uma Solvent-accessible surface of…

Enzyme activity of DrPARG. uma…

Enzyme activity of DrPARG. uma Michaelis–Menten plots of wild-type (WT), T267R, T267K, and…


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