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Síntese de mRNA para injeção in vivo


Eu encontrei um reagente comercial chamado in vivo-jetPEI® da Polyplus-Transfection que é capaz de entregar mRNA in vivo. Estou planejando fazer um experimento com ele, mas estou preocupado em como sintetizar o mRNA e purificá-lo o suficiente para injetá-lo em um corpo vivo. Também encontrei um kit recomendado chamado HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit que pode me ajudar a sintetizar mRNA, mas não tenho certeza se posso usar o produto final para uma injeção in vivo. Alguém tem alguma experiência com isso?


Você deve purificar seu RNA após a transcrição de qualquer contaminante tampão / enzima. Existem vários kits disponíveis no mercado para isso. Um é o GeneJET DNA & RNA Cleanup and Concentration, que usa colunas de leito de sílica padrão para absorver os ácidos nucléicos. Você pode então eluí-los em água pura e deve estar pronto para começar. Assim que o RNA for purificado, você usará o vivo-jetPEI para a entrega.


Meu método preferido é usar o kit Ambion T7 Megascript, mas não fiz uma comparação completa com outros kits. Eles devem ser todos mais ou menos iguais. Mas a transcrição em si pode não ser suficiente.

Certifique-se de que o mRNA contém uma tampa de 5 '. Isso é necessário para ligar a máquina de tradução e produzir proteína. Você pode incluir isso de duas maneiras, um análogo de limite ou enzimas de limite. O cap analógico é mais fácil, porque você apenas coloca o analógico no mix de transcrição. Mas isso reduz o rendimento, porque normalmente você precisa substituir 80% do GTP pelo analógico. Você também não obterá um limite de 100%, o melhor cenário forneceria um limite de 80%, mas os resultados típicos costumam ser muito mais baixos do que isso. Se você usar um analógico de tampa mais antigo, metade das tampas será inserida de maneira incorreta, mas o ARCA evitará isso. As enzimas de cobertura são geralmente mais eficientes, mas não baratas, e adicionam uma reação extra e uma etapa de purificação ao seu protocolo.

Um bom mRNA também precisa de uma cauda PolyA de 3 '. Isso pode ser adicionado enzimaticamente ou pode ser incorporado ao modelo de DNA. O método enzimático não é difícil, ele apenas usa Polimerase E. Coli PolyA e ATP, e muitas vezes pode ser adicionado a uma reação de mRNA sem purificação adicional no meio. Mas o comprimento da cauda seria um pouco aleatório. Construir a cauda no DNA oferece mais controle sobre o comprimento e elimina uma etapa de reação adicional. Mas pedir um DNA com 100 a 200 A consecutivos é um pouco difícil, porque o controle de qualidade é difícil com bases consecutivas.

Finalmente, o RNA precisa ser purificado. O método que alec_djinn descreve não é ruim, mas eu prefiro usar fenol: extração com clorofórmio e precipitação com isopropanol. É rigoroso, mas leva mais tempo e usa clorofórmio potencialmente perigoso. Você pode encontrar detalhes na internet ou apenas me pedir instruções.

Fiz muito RNA dessa maneira e injetei esse RNA em muitos camundongos. Mas sou cético em relação ao JET-PEI, ou qualquer produto PEI, para uso in vivo. Proteger mRNA in vivo é muito difícil, e as interações iônicas simples entre PEI e mRNA se desfazem na corrente sanguínea. O PEI provavelmente é melhor do que nada, mas dê uma olhada nos dados dessa página. Todo o RNA vai para os pulmões. Esse comportamento é típico de uma partícula catiônica que se agrega no sangue, e esses agregados ficam presos nos estreitos capilares dos pulmões. Se este fosse um PEI normal, aquele rato morreria. Além disso, eles estão usando doses de 50 µg de mRNA. Eu estava fazendo meu trabalho com doses de 1 µg, mas estava usando um tipo diferente de reagente de transfecção e injeção hidrodinâmica. Eu também não vejo nenhum número relatado em seus dados de imagem bioluminescentes. É muito fácil fazer com que os dados pareçam melhores do que ajustando a escala.


Assista o vídeo: TIDES mRNA Therapeutics u0026 Vaccines Digital Week-Streamlined mRNA Synthesis with CleanCap Technology (Dezembro 2021).