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Por que o pETDuet-1 tem apenas um terminador T7, mas dois promotores T7?


Por que o pETDuet-1 tem apenas um terminador T7, mas dois promotores T7 (mapa de vetor abaixo)? Existe alguma vantagem em ter apenas um terminador? Haverá dois mRNAs transcritos desse vetor: um policistrônico (com dois genes) e um monocistrônico. Além disso, presumivelmente, haverá mais RNA para o gene expresso do segundo promotor em comparação com o gene expresso do primeiro. Isso poderia levar a uma maior expressão da segunda proteína, desde que os RBSs sejam os mesmos. Existem evidências experimentais que confirmam / refutam essa hipótese?

Existe alguma vantagem sobre o uso de mRNA policistrônico versus moncystrônico? Os vetores Duet foram usados ​​para a expressão heteróloga de vias biossintéticas longas (> 40kb)?


Acho que a presença de um único terminador está relacionada à alta processabilidade da T7 RNA polimerase.

A polimerase de RNA T7 irá transcrever um plasmídeo circular repetidamente antes de se dissociar. O terminador T7 após ORF2 garante que a transcrição termina de forma eficiente.

Com base em seu esquema, estes são os potenciais transcritos de mRNA dessa construção:

Transcrição do promotor T7 # 1

5 '--- RBS --- ORF1 --- STOP ---- RBS --- ORF2 --- STOP --- [terminador T7] --- 3'

Transcrição do promotor T7 # 2

5 '--- RBS --- ORF2 --- STOP --- [terminador T7] --- 3'

É duvidoso que esse vetor vá produzir concentrações precisamente equimolares de cada produto proteico, no entanto, a topologia garante que haja pelo menos parte de cada proteína produzida. Claro, isso pode ser testado empiricamente.

Espero que ajude!


RNA polimerase

Polimerases de RNA bacterianas

As bactérias têm uma única RNA polimerase celular (RNAP), cuja forma de 'holoenzima' tem cinco subunidades: duas cópias da relativamente pequena subunidade α (cada uma com cerca de 36 kDa), uma cópia de cada uma das subunidades β e β′ grandes (151 kDa e 155 kDa, respectivamente), e uma cópia da subunidade σ, também chamada de 'fator sigma'. A enzima 'central', de cerca de 400 kDa, contém todas as subunidades exceto σ e pode realizar a reação de alongamento de polimerização usando um molde de DNA e os quatro substratos ATP, CTP, GTP e UTP. As subunidades conservadas evolutivamente são aquelas que constituem o núcleo. No entanto, a iniciação específica do local requer a subunidade σ, o que permite que RNAP reconheça o promotor. A maioria das bactérias codifica vários fatores σ alternativos (Escherichia coli codifica sete, Bacillus subtilis codifica 17), que podem variar amplamente em tamanho e que permitem ao RNAP reconhecer vários tipos diferentes (sequências) de promotores. Se houver vários fatores σ diferentes em uma célula, deve haver vários holoenzimas diferentes e, portanto, pode-se dizer que há vários RNAPs diferentes em uma determinada bactéria. No entanto, isso seria enganoso, porque o fator σ (de qualquer tipo) só está ligado à enzima durante a iniciação. Além disso, em uma determinada bactéria, a maioria dos genes normalmente requer apenas uma única espécie de fator sigma e, portanto, uma forma da holoenzima predomina. No E. coli o fator σ primário, e o primeiro descoberto, tem uma massa de 70 kDa e é frequentemente referido como σ 70.

A iniciação da transcrição por RNAP no promotor é um processo complexo que envolve muitas etapas diferentes. Em primeiro lugar, é claro, a enzima central deve se ligar ao fator σ apropriado. A holoenzima então se liga ao DNA do promotor a montante do local de início da transcrição. A RNAP então interage com o DNA, levando à fusão de cerca de 14 pb do DNA do promotor, incluindo o local de início da transcrição. Há também uma mudança conformacional da RNAP durante este processo. RNAP pode então iniciar a síntese de RNA, mas o alongamento da cadeia geralmente é interrompido, resultando em cadeias curtas de menos de 10 nucleotídeos. No entanto, RNAP permanece no promotor e pode passar por mais rodadas de síntese abortiva ou alongamento verdadeiro. Se a cadeia atingir cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, o fator σ é liberado e o núcleo RNAP começa a se mover ao longo do molde de DNA, sintetizando a cadeia de RNA. O antibiótico rifampicina inibe especificamente a iniciação pela RNAP bacteriana, na primeira ou segunda ligação fosfodiéster. O antibiótico se liga à subunidade β e os mutantes resistentes apresentam mutações no gene que codifica essa subunidade. Após a iniciação, a subunidade σ é liberada do RNAP e a fase de alongamento começa.

O alongamento pelo RNAP bacteriano é inibido pelo antibiótico estreptolidigina, que também se liga à subunidade β. Durante a iniciação, o RNAP pode abranger 70-90 bp de DNA (alguns dos quais estão envolvidos em torno da enzima), mas isso é reduzido para cerca de 35 bp durante o alongamento. O RNA recém-sintetizado forma pares de bases com o molde de DNA para aproximadamente 8 ou 9 nucleotídeos. A cadeia recém-sintetizada sai do RNAP por meio de um canal. A taxa de alongamento de uma cadeia de RNA na Vivo pode ser cerca de 50 nucleotídeos por segundo, mas esta taxa é a média do alongamento rápido em algumas sequências e pausas em outras. O complexo de alongamento é bastante estável (moléculas de RNA de mais de 10.000 nucleotídeos podem ser sintetizadas), mas o RNAP também termina em sequências de DNA específicas, denominadas "terminadores de transcrição". Algumas dessas sequências podem ser reconhecidas pelo próprio RNAP, mas outras requerem proteínas acessórias, chamadas 'fatores de terminação'.


Conteúdo

O Prêmio Nobel de Química de 2006 foi concedido a Roger D. Kornberg pela criação de imagens moleculares detalhadas da RNA polimerase durante vários estágios do processo de transcrição. [3]

Na maioria dos procariotos, uma única espécie de RNA polimerase transcreve todos os tipos de RNA. O "núcleo" da RNA polimerase de E. coli consiste em cinco subunidades: duas subunidades alfa (α) de 36 kDa, uma subunidade beta (β) de 150 kDa, uma subunidade beta principal (β ′) de 155 kDa e um pequeno ômega (ω) subunidade. Um fator sigma (σ) se liga ao núcleo, formando a holoenzima. Após o início da transcrição, o fator pode se desvincular e permitir que a enzima central prossiga com seu trabalho. [4] [5] O complexo do núcleo da RNA polimerase forma uma estrutura de "garra de caranguejo" ou "mandíbula de pinça" com um canal interno percorrendo todo o comprimento. [6] As RNA polimerases eucarióticas e arqueadas têm uma estrutura central semelhante e funcionam de maneira semelhante, embora tenham muitas subunidades extras. [7]

Todos os RNAPs contêm cofatores metálicos, em particular cátions de zinco e magnésio que auxiliam no processo de transcrição. [8] [9]

O controle do processo de transcrição gênica afeta os padrões de expressão gênica e, assim, permite que uma célula se adapte a um ambiente em mudança, desempenhe funções especializadas dentro de um organismo e mantenha os processos metabólicos básicos necessários para a sobrevivência. Portanto, não é surpreendente que a atividade da RNAP seja longa, complexa e altamente regulada. No Escherichia coli bactérias, mais de 100 fatores de transcrição foram identificados, que modificam a atividade da RNAP. [10]

RNAP pode iniciar a transcrição em sequências de DNA específicas conhecidas como promotores. Em seguida, ele produz uma cadeia de RNA, que é complementar à fita molde do DNA. O processo de adição de nucleotídeos à fita de RNA é conhecido como alongamento em eucariotos. RNAP pode construir cadeias de até 2,4 milhões de nucleotídeos (o comprimento total do gene da distrofina). RNAP irá preferencialmente liberar seu transcrito de RNA em sequências de DNA específicas codificadas no final dos genes, que são conhecidos como terminadores.

    (mRNA) - modelo para a síntese de proteínas pelos ribossomos. ou "genes de RNA" - uma ampla classe de genes que codificam o RNA que não é traduzido em proteína. Os exemplos mais proeminentes de genes de RNA são o RNA de transferência (tRNA) e o RNA ribossômico (rRNA), ambos envolvidos no processo de tradução. No entanto, desde o final da década de 1990, muitos novos genes de RNA foram encontrados e, portanto, os genes de RNA podem desempenhar um papel muito mais significativo do que se pensava anteriormente.
      (tRNA) - transfere aminoácidos específicos para cadeias polipeptídicas em crescimento no sítio ribossômico da síntese de proteínas durante a tradução (rRNA) - um componente dos ribossomos - regula a atividade do gene
    • RNA catalítico (ribozima) - moléculas de RNA enzimaticamente ativas

    RNAP realiza de novo síntese. É capaz de fazer isso porque as interações específicas com o nucleotídeo de iniciação mantêm RNAP rigidamente no lugar, facilitando o ataque químico no nucleotídeo de entrada. Essas interações específicas explicam por que RNAP prefere iniciar transcrições com ATP (seguido por GTP, UTP e CTP). Em contraste com a DNA polimerase, a RNAP inclui atividade helicase, portanto, nenhuma enzima separada é necessária para desenrolar o DNA.

    Edição de iniciação

    A ligação da RNA polimerase em bactérias envolve o fator sigma que reconhece a região central do promotor contendo os elementos −35 e −10 (localizados antes o início da sequência a ser transcrita) e também, em alguns promotores, o domínio C-terminal da subunidade α que reconhece os elementos a montante do promotor. [11] Existem vários fatores sigma intercambiáveis, cada um dos quais reconhece um conjunto distinto de promotores. Por exemplo, em E. coli, σ 70 é expresso em condições normais e reconhece promotores para genes necessários em condições normais ("genes de manutenção"), enquanto σ 32 reconhece promotores para genes necessários em altas temperaturas ("genes de choque térmico"). Em arquéias e eucariotos, as funções do fator de transcrição geral bacteriano sigma são realizadas por vários fatores de transcrição gerais que trabalham juntos. O complexo de RNA polimerase-promotor fechado é geralmente referido como o "complexo de pré-iniciação da transcrição". [12] [13]

    Depois de se ligar ao DNA, a RNA polimerase muda de um complexo fechado para um complexo aberto. Essa mudança envolve a separação das fitas de DNA para formar uma seção desenrolada de DNA de aproximadamente 13 pb, conhecida como "bolha de transcrição". O superenrolamento desempenha um papel importante na atividade da polimerase por causa do desenrolamento e retrocesso do DNA. Como as regiões do DNA na frente do RNAP são desenroladas, existem supercoils positivos compensatórios. As regiões atrás de RNAP são rebobinadas e superenroladas negativas estão presentes. [13]

    Edição de escape do promotor

    A RNA polimerase então começa a sintetizar o heteroduplex inicial DNA-RNA, com ribonucleotídeos emparelhados com a fita de DNA molde de acordo com as interações de emparelhamento de Watson-Crick. Como observado acima, a RNA polimerase faz contato com a região do promotor. No entanto, esses contatos de estabilização inibem a capacidade da enzima de acessar o DNA mais a jusante e, portanto, a síntese do produto de comprimento total. Para continuar a síntese de RNA, a RNA polimerase deve escapar do promotor. Ele deve manter contatos com o promotor enquanto desenrola mais DNA a jusante para a síntese, "amassando" mais DNA a jusante no complexo de iniciação. [14] Durante a transição de escape do promotor, a RNA polimerase é considerada um "intermediário estressado". Termodinamicamente, o estresse se acumula nas atividades de desenrolamento e compactação do DNA. Uma vez que o heteroduplex DNA-RNA é longo o suficiente (

    10 bp), a RNA polimerase libera seus contatos a montante e atinge efetivamente a transição de escape do promotor para a fase de alongamento. O heteroduplex no centro ativo estabiliza o complexo de alongamento.

    No entanto, a fuga do promotor não é o único resultado. A RNA polimerase também pode aliviar o estresse ao liberar seus contatos a jusante, interrompendo a transcrição. O complexo de transcrição em pausa tem duas opções: (1) liberar o transcrito nascente e começar de novo no promotor ou (2) restabelecer um novo 3'OH no transcrito nascente no sítio ativo por meio da atividade catalítica da RNA polimerase e reiniciar a compressão do DNA para atingir fuga do promotor. A iniciação abortiva, o ciclo improdutivo da RNA polimerase antes da transição de escape do promotor, resulta em fragmentos curtos de RNA de cerca de 9 pb em um processo conhecido como transcrição abortiva. A extensão da iniciação abortiva depende da presença de fatores de transcrição e da força dos contatos do promotor. [15]

    Edição de alongamento

    O complexo transcricional de 17 pb possui um híbrido DNA-RNA de 8 pb, ou seja, 8 pares de bases envolvem o transcrito de RNA ligado à fita molde de DNA. [ citação necessária À medida que a transcrição progride, os ribonucleotídeos são adicionados à extremidade 3 'do transcrito do RNA e o complexo RNAP se move ao longo do DNA. As taxas de alongamento características em procariotos e eucariotos são cerca de 10–100 nts / s. [16]

    Os resíduos de aspartilo (asp) no RNAP reterão os íons Mg 2+, que, por sua vez, coordenarão os fosfatos dos ribonucleotídeos. O primeiro Mg 2+ reterá o α-fosfato do NTP a ser adicionado. Isso permite o ataque nucleofílico do 3'OH do transcrito do RNA, adicionando outro NTP à cadeia. O segundo Mg 2+ reterá o pirofosfato do NTP. [17] A equação geral da reação é:

    Edição de fidelidade

    Ao contrário dos mecanismos de revisão da DNA polimerase, os da RNAP foram investigados apenas recentemente. A revisão começa com a separação do nucleotídeo incorporado incorretamente do molde de DNA. Isso pausa a transcrição. A polimerase então retrocede em uma posição e cliva o dinucleotídeo que contém o nucleotídeo incompatível. Na RNA polimerase, isso ocorre no mesmo local ativo usado para a polimerização e, portanto, é marcadamente diferente da DNA polimerase, onde a revisão ocorre em um local ativo de nuclease distinto. [18]

    A taxa de erro geral é de cerca de 10 −4 a 10 −6. [19]

    Edição de rescisão

    Em bactérias, a terminação da transcrição de RNA pode ser rho-dependente ou rho-independente. O primeiro depende do fator rho, que desestabiliza o heteroduplex DNA-RNA e causa a liberação de RNA. [20] Este último, também conhecido como terminação intrínseca, depende de uma região palindrômica do DNA. A transcrição da região causa a formação de uma estrutura em "grampo" a partir do loop de transcrição do RNA e ligação sobre si mesmo. Esta estrutura em gancho é frequentemente rica em pares de bases G-C, tornando-a mais estável do que o próprio híbrido DNA-RNA. Como resultado, o híbrido de DNA-RNA de 8 pb no complexo de transcrição muda para um híbrido de 4 pb. Esses últimos 4 pares de bases são pares de bases A-U fracos, e todo o RNA transcrito cairá do DNA.

    A terminação da transcrição em eucariotos é menos bem compreendida do que em bactérias, mas envolve a clivagem do novo transcrito seguido pela adição independente de modelo de adeninas em sua nova extremidade 3 ', em um processo chamado poliadenilação. [21]

    Dado que as polimerases de DNA e RNA realizam polimerização de nucleotídeos dependente de molde, pode-se esperar que os dois tipos de enzimas sejam estruturalmente relacionados. No entanto, estudos cristalográficos de raios-X de ambos os tipos de enzimas revelam que, além de conter um íon Mg 2+ crítico no sítio catalítico, eles são virtualmente não relacionados entre si, de fato, as enzimas de polimerização de nucleotídeos dependentes de modelo parecem ter surgido independentemente duas vezes durante a evolução inicial das células. Uma linhagem levou às modernas DNA polimerases e transcriptases reversas, bem como a algumas RNA polimerases de subunidade única (ssRNAP) de fagos e organelas. [2] A outra linhagem multi-subunidade RNAP formou todas as modernas RNA polimerases celulares. [22] [1]

    Edição de bactérias

    Em bactérias, a mesma enzima catalisa a síntese de mRNA e RNA não codificante (ncRNA).

    RNAP é uma molécula grande. A enzima central tem cinco subunidades (

    • β ': A subunidade β' é a maior subunidade e é codificada pelo gene rpoC. [24] A subunidade β 'contém parte do centro ativo responsável pela síntese de RNA e contém alguns dos determinantes para interações não específicas de sequência com DNA e RNA nascente. É dividido em duas subunidades em cianobactérias e cloroplastos. [25]
    • β: A subunidade β é a segunda maior subunidade e é codificada pelo gene rpoB. A subunidade β contém o resto do centro ativo responsável pela síntese de RNA e contém o resto dos determinantes para interações não específicas de sequência com DNA e RNA nascente.
    • α: A subunidade α é a terceira maior subunidade e está presente em duas cópias por molécula de RNAP, α I e α II (uma e duas). Cada subunidade α contém dois domínios: αNTD (domínio do terminal N) e αCTD (domínio do terminal C). αNTD contém determinantes para montagem de RNAP. αCTD (domínio C-terminal) contém determinantes para interação com DNA promotor, tornando interações não-sequência-não-específicas na maioria dos promotores e interações-sequência-específicas em promotores contendo elemento a montante, e contém determinantes para interações com fatores reguladores.
    • ω: A subunidade ω é a menor subunidade. A subunidade ω facilita a montagem do RNAP e estabiliza o RNAP montado. [26]

    A fim de ligar os promotores, o núcleo RNAP se associa ao fator de iniciação da transcrição sigma (σ) para formar a holoenzima da RNA polimerase. Sigma reduz a afinidade de RNAP para DNA inespecífico enquanto aumenta a especificidade para promotores, permitindo que a transcrição inicie nos locais corretos. A holoenzima completa, portanto, tem 6 subunidades: β'βα I e α II ωσ (

    Editar Eucariotos

    Os eucariotos têm vários tipos de RNAP nuclear, cada um responsável pela síntese de um subconjunto distinto de RNA. Todos estão estruturalmente e mecanicamente relacionados entre si e com a RNAP bacteriana:

      sintetiza um pré-rRNA 45S (35S em levedura), que amadurece em rRNAs 28S, 18S e 5.8S, que formarão as principais seções de RNA do ribossomo. [27] sintetiza precursores de mRNAs e da maioria dos snRNA e microRNAs. [28] Este é o tipo mais estudado e, devido ao alto nível de controle necessário sobre a transcrição, uma variedade de fatores de transcrição são necessários para sua ligação aos promotores. sintetiza tRNAs, rRNA 5S e outros pequenos RNAs encontrados no núcleo e no citosol. [29] sintetiza siRNA em plantas. [30] sintetiza RNAs envolvidos na formação de heterocromatina dirigida por siRNA em plantas. [31]

    Os cloroplastos eucarióticos contêm uma RNAP muito semelhante à RNAP bacteriana ("polimerase codificada por plastídio, PEP"). Eles usam fatores sigma codificados no genoma nuclear. [32]

    O cloroplasto também contém uma segunda RNAP de subunidade única estrutural e mecanicamente não relacionada ("polimerase codificada pelo núcleo, NEP"). Mitocôndrias eucarióticas usam POLRMT (humano), uma RNAP de subunidade única codificada por núcleo. [2] Essas polimerases semelhantes a fagos são referidas como RpoT em plantas. [32]

    Archaea Edit

    As Archaea possuem um único tipo de RNAP, responsável pela síntese de todo o RNA. Archaeal RNAP é estrutural e mecanisticamente semelhante ao RNAP bacteriano e RNAP I-V nuclear eucariótico, e está especialmente relacionado estruturalmente e mecanicamente ao RNAP II nuclear eucariótico. [7] [33] A história da descoberta da archaeal RNA polimerase é bastante recente. A primeira análise do RNAP de um archaeon foi realizada em 1971, quando o RNAP do halófilo extremo Halobacterium cutirubrum foi isolado e purificado. [34] Estruturas de cristal de RNAPs de Sulfolobus solfataricus e Sulfolobus shibatae defina o número total de subunidades arqueadas identificadas em treze. [7] [35]

    Archaea tem a subunidade correspondente a Rpb1 eucariótica dividida em duas. Não há homólogo para Rpb9 eucariótico (POLR2I) no S. shibatae complexo, embora o TFS (homólogo do TFIIS) tenha sido proposto como um baseado na similaridade. Há uma subunidade adicional chamada Rpo13 junto com Rpo5 que ocupa um espaço preenchido por uma inserção encontrada nas subunidades β 'bacterianas (1.377-1.420 em Taq) [7] Um estudo anterior de baixa resolução sobre S. solfataricus A estrutura não encontrou Rpo13 e apenas atribuiu o espaço a Rpo5 / Rpb5. Rpo3 é notável por ser uma proteína ferro-enxofre. A subunidade AC40 da RNAP I / III encontrada em alguns eucariotos compartilha sequências semelhantes, [35] mas não se liga ao ferro. [36] Este domínio, em ambos os casos, tem uma função estrutural. [37]

    A subunidade Archaeal RNAP usava anteriormente uma nomenclatura "RpoX", onde cada subunidade é atribuída a uma letra de uma forma não relacionada a nenhum outro sistema. [1] Em 2009, uma nova nomenclatura baseada na numeração da subunidade "Rpb" de Pol II eucariótica foi proposta. [7]

    Edição de vírus

    Os ortopoxvírus e alguns outros grandes vírus de DNA nucleocitoplasmático sintetizam RNA usando um RNAP de múltiplas subunidades codificado por vírus. Eles são mais semelhantes aos RNAPs eucarióticos, com algumas subunidades minimizadas ou removidas. [38] Exatamente com qual RNAP eles são mais semelhantes é um tópico de debate. [39] A maioria dos outros vírus que sintetizam RNA usam mecanismos não relacionados.

    Muitos vírus usam um RNAP dependente de DNA de subunidade única (ssRNAP) que é estrutural e mecanicamente relacionado ao RNAP de subunidade única de cloroplastos eucarióticos (RpoT) e mitocôndrias (POLRMT) e, mais distantemente, a polimerases de DNA e transcriptases reversas. Talvez a RNAP de subunidade única mais amplamente estudada seja a ARN polimerase do bacteriófago T7. ssRNAPs não podem revisar. [2]

    B. subtilis profago SPβ usa YonO, um homólogo das subunidades β + β 'de msRNAPs para formar um RNAP monomérico (ambos os barris na mesma cadeia) distinto do ssRNAP "à direita" usual. Provavelmente divergiu há muito tempo do msRNAP canônico de cinco unidades, antes da época do último ancestral comum universal. [40] [41]

    Outros vírus usam um RNAP dependente de RNA (um RNAP que emprega RNA como molde em vez de DNA). Isso ocorre em vírus de RNA de fita negativa e vírus dsRNA, os quais existem por uma parte de seu ciclo de vida como RNA de fita dupla. No entanto, alguns vírus de RNA de fita positiva, como o poliovírus, também contêm RNAP dependente de RNA. [42]

    A RNAP foi descoberta independentemente por Charles Loe, Audrey Stevens e Jerard Hurwitz em 1960. [43] Nessa época, metade do Prêmio Nobel de Medicina de 1959 foi concedido a Severo Ochoa pela descoberta do que se acreditava ser RNAP, [44] mas, em vez disso, acabou sendo polinucleotídeo fosforilase.


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    Estudo longitudinal Avon de pais e filhos

    Gene de polipose coli adenomatosa

    Projeto europeu de obesidade infantil

    Gene semelhante à proteína 2 associado à contactina

    Gene A1 do membro da família 1 do citocromo P450

    Região diferencialmente metilada

    Gene de DNA metiltransferase 3 alfa

    Gene de DNA metiltransferase 3 beta

    Origens do desenvolvimento de saúde e doença

    Outliers de variáveis ​​epigenéticas para análise de predição de risco

    Gene semelhante ao receptor 3 do fator de coagulação II (trombina)

    Gene da proteína 10 ligada ao receptor do fator de crescimento

    Câncer colorretal hereditário sem polipose

    Gene da molécula de adesão intercelular-1

    Gene do fator de crescimento semelhante à insulina

    Elemento nuclear longo intercalado-1

    Gene transcrito específico do mesoderma

    Gene da subunidade II da citocromo c oxidase

    Gene metilenotetrahidrofolato redutase

    Gene 12S RNA codificado mitocondrialmente

    Gene fenilalanina TRNA codificado mitocondrialmente

    Gene da proteína 1 de ligação ao nucleossomo

    Sequências de DNA mitocondrial nuclear

    Gene do receptor olfativo 151

    Gene da variante 4 da fosfodiesterase tipo 4

    Gene da isoforma A da família 1 do domínio de associação Ras


    Um mecanismo tripartido de entrada do DNA T7 nas células

    A Gp16 também desempenha um papel direto na translocação do DNA do vírion fago para a célula. A elucidação do processo pelo qual o DNA de T7 é transportado para o citoplasma bacteriano foi possível em grande parte porque é um processo relativamente lento. Cerca de 10 min, um terço do período latente a 30 ° C, passou antes que o genoma infectante fosse completamente internalizado.

    Os primeiros estudos sobre a entrada do genoma T7 foram experimentos de Hershey-Chase: as células infectadas foram sonicadas para interromper o complexo fago-bactéria (as forças de cisalhamento geradas pela combinação são insuficientes para separar os vírions de cauda curta da célula infectada). Os vírions liberados foram purificados e o DNA marcado com 3H foi analisado por fluorografia de fragmentos de restrição separados (Zavriev e Shemyakin, 1982). Em função do tempo após a infecção, os fragmentos mais próximos da extremidade esquerda genética do genoma (a extremidade esquerda sempre entra na célula primeiro) foram sequencialmente perdidos dos vírions liberados. Ao tratar as células com rifampicina, a perda de todos, exceto o fragmento de restrição mais à esquerda mostrou ser dependente da transcrição por E. coli RNA polimerase. Sabe-se agora que apenas cerca de 850 bp do genoma T7 entram com eficiência na célula (García e Molineux, 1996). Este DNA contém três promotores para E. coli RNA polimerase e um promotor T7 (Fig. 2).

    Esquema do genoma T7 de 39 937 bp (fora da escala) mostrando elementos genéticos relacionados à entrada do genoma. O genoma é inicialmente translocado para a célula pela enzima do vírion dependente da força motriz do próton (PMF), que para depois de cerca de 850 pb terem entrado na célula. Este DNA inclui o E. coli promotores A1, A2 e A3 (localizados nos nucleotídeos 498, 626 e 750 respectivamente) e o promotor T7 øOL (nucleotídeo 405). Transcrição do E. coli promotores internalizam os próximos ~ 7 kb do genoma para o terminador TE no nucleotídeo 7588. Estes transcritos incluem, em particular, os promotores T7 ø1.1A, ø1,1B e ø1.3 (nucleotídeos 5848, 5923 e 6409 respectivamente) e os RNAs que levam à síntese de gp0.3 e gp1, T7 RNA polimerase. Usando um ou mais dos promotores T7 para iniciar a transcrição, a T7 RNA polimerase completa então a internalização do genoma.

    It has been hypothesized that the reason why T7 is not subject to restriction by type I enzymes is that gp0.3, the first gene product made after infection, inactivated the host enzyme before sites on the T7 genome had entered the cell. As a test of that idea, Moffatt and Studier (1988) placed restriction sites close to the leading end of the genome and determined when an infecting genome began to be degraded. One surprising finding was that the infecting T7 genome somehow remained inaccessible to host restriction enzymes for several minutes after infection, even though the genome could be transcribed and was thus accessible to RNA polymerase. Preventing transcription did not result in immediate degradation, and sites for the type III enzyme EcoPI, some of which lie upstream of all promoters, could not be accessed immediately after infection. Thus, transcription per se is not responsible for protection. Dam methylase also cannot access the leading 850 bp of the T7 genome immediately after infection ( García and Molineux, 1996 ), and we now think it likely that one or both of the ejected proteins, gp15 and gp16, hinder binding of most cellular proteins to the leading end of the infecting DNA.

    Many of the T7 mutants described by Moffatt and Studier (1988) , in particular one that uncoupled genome entry from transcription, became invaluable in studies on T7 DNA internalization that were initiated in my laboratory several years later. Our initial interest was to ask whether the F plasmid pifA product inhibited genome entry ( García and Molineux, 1995a ). A presença de pifA causes exclusion of T7, and the abortive infection is accompanied by a plethora of physiological dysfunctions, many or most of which could have been explained by a stalled translocating phage genome.

    The assay we developed measures the time after infection when GATC sites on the infecting T7 genome become methylated by DNA adenine methylase na Vivo and thus become susceptible to digestion by Dpneu em vitro. This assay was found to provide more accurate data than the converse procedure, i.e. inhibition of a restriction enzyme by na Vivo methylation with the cognate methylase. Electrophoretic separation of DpnI fragments on an agarose gel followed by Southern analyses, using labelled random fragments of T7 DNA as a probe, reveals the extent of genome internalization. DNA inside the cell is methylated and appears as discrete DpnI fragments DNA that has not yet entered the cell is unmethylated, is thus insensitive to DpnI and appears as high-molecular-weight fragments ( García and Molineux, 1995b ). An experiment showing genome entry catalysed by E. coli RNA polymerase is shown in Fig. 3. The rate of transcription-mediated entry of the T7 genome is about 40 bp s −1 at 30°C, somewhat faster than the na Vivo rate of E. coli mRNA synthesis, but slower than that of rRNA synthesis. If T7 RNA polymerase is provided by the host cell before infection, the rate of genome entry is 200–300 bp s −1 at 30°C, comparable with the maximum rate of transcription obtained with that enzyme em vitro.

    Time course of T7 genome entry catalysed by E. coli RNA polymerase at 30°C in the presence of chloramphenicol to block phage gene expression. The assay measures the time at which GATC sites on the entering genome become methylated na Vivo by Dam methylase and thus susceptible to cleavage em vitro por DpnI ( García and Molineux, 1995b ). Knowing both the time when a specific DpnI fragment appears and the position of that fragment on the genome allows the rate of entry to be estimated. After agarose gel electrophoresis to separate fragments, they are detected by Southern hybridization using random fragments of T7 DNA as a 32 P-labelled probe. UMA DpnI map of the infecting phage genome is shown below the autoradiogram.

    The interesting problem, however, is to understand how the first 850 bp enter the cell. Obviously, no transcription can occur until a promoter enters the cell and is recognized by an RNA polymerase. The key lay in the mutant D502, which does not require transcription to internalize its genome ( Moffatt and Studier, 1988 ). D502 contains two mutations, a deletion that removes the three early E. coli promoters and the left-most T7 promoter øOL(Fig. 2), and a missense mutation in gene 16 ( García and Molineux, 1996 ). É o 16I754T mutation that uncouples genome entry from transcription. A search for comparable mutants allowed more than 20 gene 16 mutants to be isolated ( Struthers-Schlinke et al., 2000). Importantly, only gene 16 mutants satisfied the selection pressure that required extensive transcription-independent genome entry. In the absence of transcription, all mutant particles tested allowed the entire phage genome to enter the cell, and all promoted the same rate of DNA translocation. All mutations were shown to lie in a 130-amino-acid central region of gp16 and, together, they define either one or two domains of the wild-type protein that are thought to clamp on the entering DNA. Clamping prevents further transcription-independent DNA translocation. Transcription, by either E. coli or T7 RNA polymerase, is then normally necessary to bring the remainder of the phage genome into the cell. A transcribing RNA polymerase is the strongest molecular motor known ( Wang et al., 1998 ) and presumably over-rides the resistance to DNA translocation caused by the clamp. In the absence of an RNA polymerase, the 850 bp of DNA ejected from a wild-type virion appears to be released by the clamp after about 20 min at 30°C. However, only about 20% of infecting genomes completely enter the cell after 4 h ( Struthers-Schlinke et al., 2000 ), suggesting that gp16 can clamp down on the translocating DNA again.

    From a mutant virion containing gp16I754T at 30°C and in the absence of transcription, the 40 kb T7 DNA molecule enters the cell at ≈ 75 bp s −1 , constant over the entire genome (Fig. 4 see also García and Molineux, 1996 Struthers-Schlinke et al., 2000). This pseudo-zero-order reaction is not consistent with the idea that pressure within the T7 capsid expels the phage genome into the cell. Furthermore, rates of transcription-independent DNA internalization from a mutant virion have been shown to be temperature dependent with a Q10 of ≈ 3 between 20°C and 40°C (P. Kemp and I. J. Molineux, unpublished). These are not properties associated with physical processes however, they are those expected for an enzyme-mediated reaction.

    Kinetics of T7 genome entry at 30°C in the absence of transcription from a 16I754T mutant particle. Experimental details as for Fig. 3, except that cells were infected in the presence of both chloramphenicol and rifampicin.

    If an enzyme is indeed catalysing T7 DNA translocation, an energy source should be required. There are two energy sources potentially available to the enzyme: chemical energy, e.g. ATP, or the proton motive force. It has been shown earlier that either depleting intracellular ATP levels or collapsing the membrane potential of the cell before infection inhibited T7 DNA internalization ( Zimkus et al., 1986 ). These data do not distinguish between the formation of a channel for DNA transport and DNA translocation itself. Our assay for DNA translocation requires that ATP be present in order to maintain levels of S-adenosyl methionine, the methyl donor for DNA adenine methylase. We cannot therefore examine the effects on DNA translocation of depleting intracellular levels of ATP, but we have shown that the proton motive force is required. A mutant lacking the F1F0 ATPase (to uncouple the membrane potential from intracellular ATP levels) was treated with rifampicin to inhibit transcription and infected by mutant (gp16I754T) T7 particles. After infection, as the phage genome was actively being translocated into the cell, a protonophore was added to collapse the membrane potential rapid and complete arrest of genome translocation resulted (P. Kemp and I. J. Molineux, unpublished).

    The properties of several gene 15 mutants that have been isolated recently suggest that gp15 is also directly involved in the enzymatic translocation of T7 DNA into the cell (C. Chang and I. J. Molineux, unpublished). A highly speculative model is that gp16 and gp15 together form a molecular motor that ratchets the genome into the cell. In this model, the three copies of gp16 in each phage virion may be anchored to the peptidoglycan and form a transmembrane pore into the cytoplasm gp16 is thus imagined to be the stationary component of the motor. The 12 copies of gp15 ejected into the cell are further imagined to form a rotary component that, by tracking along the DNA helix, would cause its translocation from the phage head into the cell. The analogy between this model and the F1F0 ATPase ( Noji et al., 1997 ) is obvious.

    Few other phage types are likely to follow the T7 paradigm in their mode of DNA ejection. It is improbable that any circularly permuted phage genome would use a transcription-based mechanism for its internalization. Aside from members of the T7 family of phages, N4 seems most likely to use transcription as a means of getting its genome into the cell. The N4 virion contains an RNA polymerase that is also necessary for early gene expression ( Falco et al., 1977 ). The genomes of most phages are thought to enter the cell fast for example, the transfer rate of T4 DNA into the cell has been estimated to be between 3 kb and 10 kb s −1 ( Grinius, 1987 Letellier et al., 1999 ), much faster than any known RNA polymerase transcribes.

    The idea that phage DNA is ‘injected’ into cells because it is packaged under pressure, a staple of molecular genetics text books for almost a half century, cannot apply to T7. It is interesting to note that, for 30 of those years, it has been known that the rate of Bacillus subtilis phage SP82G DNA transfer into the cell is constant over the whole genome and is also highly temperature dependent ( McAllister, 1970 ). Equally interesting, and almost equally old an observation, is that second-step transfer of T5 DNA occurs normally even when that DNA is no longer encapsidated and is fully exposed to the growth medium ( Labedan and Legault-Demare, 1973 ). These observations are hard to reconcile with the classic syringe mechanism neither T5 nor SP82G can follow the standard phage DNA injection model.

    However, the genomes of both λ and T5 have been shown to enter energy-poisoned cells ( Maltouf and Labedan, 1983 1985 ), and they can also be transferred from the particle into liposomes em vitro ( Roessner et al., 1983 Novick and Baldeschwieler, 1988 Lambert et al., 1998 ). Thus, these phages do not use cellular energy for DNA transport. Nevertheless, unless one posits that the λ and T5 genomes diffuse from the phage head into the cell through a frictionless fluid, energy is required for DNA translocation. Whether this energy is stored as, for example, pressure of closely packed DNA helices or electrostatic repulsion between DNA phosphates, whether it is supplied by an increase in entropy or whether yet another process is operative is unknown. What is clear is that there is not a ‘one size fits all’ mechanism that applies to all phages.


    Discussão

    Previous studies on snRNA gene transcription have not resolved whether the 3′ box functions in the nascent RNA as a processing element or as a DNA element to terminate transcription. The 3′ box is necessary for efficient 3′ end formation of snRNA gene transcripts ( Hernandez, 1985 Yuo et al., 1985 Ciliberto et al., 1986 Neuman de Vegvar et al., 1986 Ach and Weiner, 1987 reviewed in Hernandez, 1992 ), and the function of this element cannot be separated readily from the process of transcription. Notably, transcripts containing a copy of the 3′ box do not undergo processing when reinjected into Xenopus oocytes ( Ciliberto et al., 1986 ) and although U1 transcripts that include the 3′ box are detected in HeLa cells, these do not seem to be processing substrates ( Lobo and Marzluff, 1987 ). In addition, recognition of the U1 3′ box em vitro appears to be co-transcriptional and only occurs if transcription is initiated from a class II snRNA promoter ( Gunderson et al., 1990). Although these findings do not rule out that the 3′ box is a processing signal, they support the notion that this element is a transcription terminator. The demonstration by Kunkel and Pederson (1985) that transcription terminates very close to the 3′ box in the U1 genes provided the most compelling argument to date that the 3′ box is a termination element. However, the results presented here show that the 3′ box is not sufficient for efficient termination of transcription. Instead, we implicate a novel element immediately downstream of the 3′ box in termination of transcription of the U1 gene. Termination may be effected directly by proteins binding to the sequence within the na Vivo-footprinted region, perhaps in conjunction with a high proportion of T residues. Interestingly, the results of our nuclear run-on analysis indicate that the human U2 genes do not have an efficient termination element within the 250 bp downstream of the 3′ box. Our results also suggest that termination is coupled to recognition of the 3′ box.

    Why does the U1 gene have a terminator close to the 3′ box?

    It is not clear why termination of transcription of the U1 genes should occur very close to the 3′ box while transcription of the U2 genes continues further downstream. The U1 gene repeat unit is >45 kb long and repeated 15–30 times on chromosome 1 ( Lindgren et al., 1985b ). This is an extraordinarily large repeat unit considering that the size of the RNA-coding region of the U1 gene is <200 bp. Unlike the U2 repeat units which are arranged tandemly, the U1 genes are loosely clustered and organized in an irregular and highly polymorphic manner ( Manser and Gesteland, 1982 Lund and Dahlberg, 1984 Bernstein et al., 1985 ). In addition, there are multiple genes present in the RNU1 locus. These genes include tRNA genes ( Van der Drift et al., 1994 , 1995 ) and several putative neuroblastoma suppressor genes including human Kruppel-related 3 (HKR3) ( Maris et al., 1997 ) and human Elk-related kinase (ERK) ( Saito et al., 1995). Since not all the genes in this region have been identified, or their precise locations determined, it is unclear whether any of these genes lie close to the U1 genes. Perhaps termination of transcription of the U1 genes is more critical than for the U2 genes, in order to prevent polymerases reading into downstream genes and causing inhibition of initiation by transcriptional interference [see Greger et al. (1998) for a discussion of this phenomenon].

    How might initiation, 3′ box function and termination be linked?

    It is possible that only a fraction of the nascent transcripts from the human U2 genes are terminated at the 3′ box and processed properly. However, this seems unlikely as these genes encode very abundant RNAs. In common with Yuo et al. (1985) and Neuman de Vegvar et al. (1986) , we favour the hypothesis that the 3′ box is an RNA processing element present in the nascent RNA and that the 3–16 nucleotide extended precursors detected na Vivo are produced directly by an RNA processing event mediated by the 3′ box. Yuo et al. (1985) have speculated further that such a processing reaction may involve snRNAs in analogy to 3′ end processing of histone mRNAs (see below).

    The 3′ ends of all other pol II transcripts (mRNAs) are produced by cleavage of nascent RNA. The replication-activated histone mRNAs are produced from precursors by a cleavage event that requires base pairing between the nascent RNA and the U7 snRNA (reviewed by Marzluff, 1992 ). In the case of the remaining mRNAs, cleavage of the nascent RNA and subsequent polyadenylation of the resulting 3′ end are directed by the polyadenylation signal in the transcribed RNA (reviewed by Colgan and Manley, 1997 ). Processing at the poly(A) site is also linked intimately to both initiation and termination of transcription. Factors required for polyadenylation associate with the C-terminal domain (CTD) of pol II before the poly(A) signal is transcribed, possibly at initiation ( Dantonel et al., 1997 ), and removal of the CTD dramatically decreases the efficiency of polyadenylation na Vivo ( McCracken et al., 1997 ). In addition, termination of transcription of vertebrate mRNA genes requires that splicing of the terminal intron and polyadenylation take place, even though termination can occur hundreds of base pairs downstream from the coding region ( Dye and Proudfoot, 1999 , and references therein). Exactly how termination occurs in these genes is not well understood, but Birse et al. (1998) have shown recently that the function of cleavage factors in the polyadenylation apparatus is required for termination of transcription of mRNA genes in Saccharomyces cerevisiae. Processing of the RNA at the poly(A) site is likely to influence directly the association of processing factors with the CTD of the transcribing polymerase. Thus, transcribing a poly(A) signal may convert the polymerase to a more easily terminated form as suggested by McCracken et al. (1997) and Dye and Proudfoot (1999) . In the case of the closely spaced genes encoding the mammalian complement proteins, C2 and factor B, however, it has been shown that binding sites for the protein Maz are required in addition to a functional poly(A) site for efficient termination to occur ( Ashfield et al., 1994 ). Thus, a combination of processing and binding of factors to elements in the DNA can work together to terminate pol II relatively close to the poly(A) site.

    Efficient recognition of the 3′ box na Vivo e em vitro requires that transcription is initiated from a class II snRNA gene promoter, indicating that the pre-initiation complex formed on these genes influences the downstream RNA processing event(s) ( Hernandez and Weiner, 1986 Neuman de Vegvar et al., 1986 Gunderson et al., 1990). Thus, the initial 3′ end processing event of transcripts from both mRNA and snRNA genes appears to be influenced directly by events at initiation. The mechanism of co-ordinate promoter/3′ box-directed processing of snRNA gene transcripts may be analogous to the mechanism of polymerase-assisted 3′ end cleavage and polyadenylation of mRNA genes. As mentioned above, the structure of the promoters of class II snRNA genes is different from that of mRNA genes. The essential PSE element is both necessary and sufficient for initiation and 3′ box recognition na Vivo ( Hernandez and Lucito, 1988 Neuman de Vegvar and Dahlberg, 1989 Parry et al., 1989). The PSE is recognized by a multisubunit factor known variously as PTF, SNAPc and PBP ( Henry et al., 1998 , and references therein), which is critical for the formation of a specific pre-initiation complex containing TBP and TFIIB ( Bernues et al., 1993 Sadowski et al., 1993 ). This specialized complex may directly recruit a specialized polymerase associated with processing factors. Alternatively, the polymerase may become associated with specific processing factors after recruitment, as appears to happen in the interaction of the CTD of pol II with splicing and polyadenylation factors. An obvious scenario is one where snRNA processing factors rather than mRNA processing factors interact with pol II at initiation of transcription of snRNA genes, as already suggested by Neuman de Vegvar et al. (1986) . This would account for the finding that polyadenylation signals are not recognized efficiently in transcripts initiated from the promoters of the U1 or U2 genes ( Neuman de Vegvar et al., 1986 Dahlberg and Schenborn, 1988 Hernandez and Lucito, 1988 Lobo and Hernandez, 1989 ). However, recognition of poly(A) signals can be uncoupled readily from transcription, whereas recognition of the 3′ box cannot ( Lobo and Marzluff, 1987 Ciliberto et al., 1989 Gunderson et al., 1990 ), as noted above. This suggests that a promoter-dependent activity is also essential for any processing event directed by the 3′ box.

    Termination of transcription of both mRNA genes and snRNA genes may also occur by a common mechanism involving cleavage of the transcript/release of processing factors from the polymerase. Termination of transcription of the U2 gene would, then, resemble the process in those mRNA genes where termination occurs hundreds of base pairs downstream from the poly(A) site. In the U1 genes instead, factors bound to the DNA just downstream of the processing element terminate the ‘destabilized’ polymerase much sooner.


    RNA polymerase

    Biosynthesis of RNA

    …is performed by enzymes called RNA polymerases. In higher organisms there are three main RNA polymerases, designated I, II, and III (or sometimes A, B, and C). Each is a complex protein consisting of many subunits. RNA polymerase I synthesizes three of the four types of rRNA (called 18S, 28S,…

    The enzyme RNA polymerase catalyzes the chemical reactions that synthesize RNA, using the gene’s DNA as a template. Transcription factors control when, where, and how efficiently RNA polymerases function.

    …of RNA are synthesized via RNA polymerases (reaction [87]), the action of which is analogous to that of the DNA polymerases that catalyze reaction [86]. In reaction [87] the growing RNA chain is represented by 5′-RNA-polymer-3′-ΟΗ, and the ribonucleoside triphosphate by NTP. One product (5′-RNA-polymer-NMP-3′-OH) reflects the incorporation of ribonucleoside…

    Characteristics of archaea

    Complexity of RNA polymerase: transcription within all types of organisms is performed by an enzyme called RNA polymerase, which copies a DNA template into an RNA product. Bacteria contain a simple RNA polymerase consisting of four polypeptides. However, both archaea and eukaryotes have multiple RNA polymerases that…

    Function in DNA transcription

    …is catalyzed by the enzyme RNA polymerase. As with DNA replication, the two DNA strands must separate to expose the template. However, transcription differs from replication in that for any gene, only one of the DNA strands, the 3′ → 5′ strand, is actually used as a template. Synthesis of…

    …into RNA by the enzyme RNA polymerase, which achieves this copying in a strictly controlled process. The first step is to recognize a specific sequence on DNA called a promoter that signifies the start of the gene. The two strands of DNA become separated at this point, and RNA polymerase…


    MATERIAIS E MÉTODOS

    Strains and cloning.

    Bacterial strains used in this work are listed in Table ​ Table1. 1 Both the WT gyrB e a gyrB652 gene from Salmonella enterica serovar Typhimurium were cloned into pET21(a) in Escherichia coli DH5α. Then, plasmids were moved into E. coli BL121::� (67) for protein expression under control of the phage T7 RNA polymerase. Plasmid pRC06 contains the gyrB gene from WT Salmonella strain LT2, and pRC04 contains the gyrB652 gene with an A-C transversion that changes the Arg 436 codon to Ser.

    TABELA 1.

    TensãoGenótipoPlasmídeo
    NH2504cobT714::MudJr2 cobP712::Tn10dGnpJBREScI
    NH2585zeh-754::Tn10pUC19
    NH2589zib-6794::Tn10 gyrB652pUC19
    NH2598cobT714::MudJr2 cobP712::Tn10dGn zib-6794::Tn10 gyrB652pJBREScI
    NH2689hsdS gal attB::DE3pRC04
    NH2691hsdS gal attB::DE3pRC06
    NH3432SMT1556::MudJr2 (Mud547) zij-8267::Tn10dGnpJBREScI
    NH3435SMT1556::MudJr2 (Mud547) zij-8267::Tn10dGn zib-6794::Tn10 gyrB652pJBREScI
    NH2936zbj-8906::MudJr2 zbj-8907::Tn10dGnpJBREScI
    NH3440zbj-8906::MudJr2 zbj-8907::Tn10dGn zib-6794::Tn10 gyrB652pJBREScI
    NH3500(STM1553 ϏRT> STM1554)pCP20
    NH3501(smpB ϏRT> STM2689)pCP20
    NH3502(STM3261 ϏRT> STM3262)pCP20
    NH3503(atpI ϏRT> gidB)pCP20
    NH3504(STM1553 ϏRT res lacZYA gen res FRT> STM1554)pJBREScI
    NH3505(smpB ϏRT res lacZYA gen res FRT> STM2689)pJBREScI
    NH3506(STM3261 ϏRT res lacZYA gen res FRT> STM3262)pJBREScI
    NH3507(atpI ϏRT res lacZYA gen res FRT> gidB)pJBREScI
    NH3508zib-6794::Tn10 gyrB652 (STM1553 ϏRT res lacZYA gen res FRT> STM1554)pJBREScI
    NH3509zib-6794::Tn10 gyrB652 (smpB ϏRT res lacZYA gen res FRT> STM2689)pJBREScI
    NH3510zib-6794::Tn10 gyrB652 (STM3261 ϏRT res lacZYA gen res FRT> STM3262)pJBREScI
    NH3511zib-6794::Tn10 gyrB652 (atpI ϏRT res lacZYA gen res FRT> gidB)pJBREScI

    Enzyme purification.

    WT and mutant GyrB proteins were expressed and purified using the same protocol. Five milliliters of an overnight culture was used to inoculate 500 ml of Luria broth (LB) containing 50 μg/ml ampicillin. The culture was agitated at 30ଌ, and cell density was monitored hourly. When the culture reached an optical density at 650 nm of 0.85, IPTG (isopropyl-β- d -thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 0.1 mM, and incubation at 30ଌ was continued for 2 h. Cultures were chilled to 4ଌ, and the cells were harvested by centrifugation and resuspended in 60 ml of TGED buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol [DTT]). Lysis was induced by addition of 20×-concentrated lysis buffer which made the solution (at final concentration) 2 mM DTT, 20 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.2% Brij 58, and 0.4 mg/ml egg white lysozyme. The mixture was placed in centrifugation tubes, incubated at 4ଌ for 30 min, and centrifuged at 35,000 rpm in a Beckman type 60 Ti ultracentrifuge rotor for 1 h at 4ଌ. Solid streptomycin sulfate was added to the supernatant at a final concentration of 4%, and the mixture was stirred at 4ଌ for 30 min. After centrifugation for 30 min in a Beckman J21 rotor at 7,000 rpm, solid ammonium sulfate was added to the supernatant at a final concentration of 50% saturation. After centrifugation in a Beckman J21 rotor at 7,000 rpm, the pellet was dissolved in 1× TGED buffer with 1 M NaCl. Dialysis was carried out overnight in TGED with 1 M NaCl.

    Novobiocin was covalently coupled to CNBr-activated Sepharose 4B according to instructions supplied by Amersham Biotech. Ten milliliters of a dialyzed protein solution was applied to a 5-ml (bed volume) novobiocin-agarose column, and the applied protein solution was recirculated through on the column for 1 h. Washing with 15 ml of solution containing 2 M urea in 1× TGED eluted most of the protein bound to the resin. GyrB protein was then eluted in 6 M guanidine-HCl in 1× TGED. Fractions with the highest protein concentration were identified by Bio-Rad protein assays and dialyzed for 12 h against 1× TGED at a maximum protein concentration of 1 mg/ml, which allowed the refolding of the purified GyrB protein. The dialyzed solution was clarified by centrifugation, and the supernatant was assayed for supercoiling activity after addition of GyrA protein. Renatured GyrB protein was applied to a 5-ml DEAE column equilibrated with 1× TGED buffer. Active GyrB protein eluted in a 100-ml TGED gradient that varied linearly from 0 to 0.5 M NaCl. Fractions with the highest specific activity were identified using GyrA-complemented DNA supercoiling assays (35). Active fractions were pooled and applied to a 200-ml Sephacryl S-200 column equilibrated in 0.2 M KPO4, pH 7.4, 10% glycerol, 1 mM EDTA, and 5 mM DTT. Sephacryl fractions (20 ml) near the void volume were assayed and concentrated by dialysis into 50% glycerol containing 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 50 mM KPO4, 1 mM DTT, and 0.1 mM EDTA, which reduced the volume by half. Both the WT and GyrB652 subunits were stable at �ଌ in this buffer.

    Genetic methods.

    PCR products were “sewn” into a 9-kb module containing a complete WT Lac operon (lacIZYA), the gentamicin resistance gene aacC1 [aminoglycoside-(3)-N-acetyltransferase] from Tn1696 flanked by a pair of res sites, and a pair of FLP recognition target (FRT) sites. The PCR product of the 9-kb module was cloned into plasmid pCR-XL-TOPO (Invitrogen) between nucleotides 336 and 337, generating the plasmid pPM1 (sequence available on request).

    To introduce a Lac-Gen-res module into a chromosome, a FRT site was first inserted into a specific location in the Salmonella chromosome using techniques and reagents described by Datsenko and Wanner (14). Strains containing a single chromosomal FRT site and the pCP20 plasmid, which expresses FLP recombinase at 42ଌ, were grown to late log phase at 30ଌ and incubated at 42ଌ for 10 min to induce FLP expression. After chilling in ice water, cells were made competent by 30 s of centrifugation and resuspension in ice-cold water and were electroporated with plasmid pPM1. FLP recombinase catalyzes the excision of a FRT circle from pPM1 and its reintegration into the chromosomal FRT site. Each culture was infected with P22 at low multiplicity and incubated at 30ଌ in a shaking incubator until cell lysis (37). Strains NH3514 (LT2/pJBREScI) or NH3515 (gyrB652/pJBREScI) were transduced with the resulting P22 phage to generate strains NH3504 to -3511. Gentamicin-resistant transductants that stained blue on X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- d -galactopyranoside) plates and were Kan sensitive were subsequently tested for the correct location of the Lac operon using primers in the bacterial chromosome and in the Lac-Gen-res module.


    T7 Promoter Transcription Start Site

    T7 promoter system is the most widely used promoter for Bioproduction in Escherichia coli. Classically this system is separated in two parts : an E. coli expression vector that carries a T7 promoter and an E. coli production strain DE3 that contain a lambda lysogen with an inducible T7/ RNA Polymerase (RNAP) gene on its chromosome.

    What is the promoter sequence of T7 RNA polymerase?

    T7 RNA Polymerase is a DNA-dependent RNA polymerase that exhibits high specificity for the bacteriophage T7 promoter sequence 5'-TAATACGACTCACTATA-3'. The enzyme can incorporate labeled or unlabeled nucleoside triphosphates into an RNA transcript.

    Is a promoter transcribed?

    A promoter is a sequence of DNA that initiates the process of transcription. A promoter has to be close to the gene that is being transcribed while an enhancer does not need to be close to the gene of interest. Both promoters and enhancers help to regulate genetic transcription.

    What is the promoter in transcription?

    In genetics, a promoter is a region of DNA that leads to initiation of transcription of a particular gene. Promoters are located near the transcription start sites of genes, upstream on the DNA (towards the 5' region of the sense strand). Promoters can be about 100–1000 base pairs long.


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    aids and a comprehensive environment where the youth feel that they have a place to turn to where it is they are, is what will really solve the roots problem. These were just some of the techniques and plans that have been drawn up. Many of them are similar. Where they differ is where to draw the lines.

    Problem Solution

    different options such as sand bags. Built 3 reservoirs, and stopped building new houses in flood zones it just seems like none of them work. o problem is that Findlay is getting more rain than the Blanchard River can hold water, which is making the city of Findlay flood. In my opinion we have a couple.

    Problem and solution

    student to do well, and without putting too much pressure on him/her. Procedures These are the procedures I have taken in order to find the solução to this problem: 1. Research I have created a poll for students in high school to take (30 people), and these were the results: Are parents and teachers.

    Biochemistry Report

    microcentrifuge to pellet the bacteria. Before lysing the bacteria, 500 L of DNase-free water was used. The bacterial pellet was resuspend in 350 L of STET solução (8 % w/v sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA (pH 8.0), 5 % w/v Triton X-100, 700 g/mL lysozyme, and 250 g/mL RNase A.). The 700 g/mL.

    Bioquímica

    kinetics E. The heme component of myoglobin binds copper instead of iron. 34. Which of the following peptides (at physiological pH) would have least problem crossing the cell membrane? A. Ser-Tyr-Arg-His B. Pro-Arg-lys-Glu C. Lys-Arg-Asp-Lys D. Trp-Leu-Thr-Phe E. Thr-Ser-Tyr-Arg 35. Which of.


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